1 Recebido em 1 de março de 2012.
Aceito para publicação em 8 de setembro de 2012.
2 Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade
Fede-ral RuFede-ral do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica, RJ 23890-000, Brasil. E--mail: vivifigueira@yahoo.com.br
3 Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, UFRRJ, Se
-ropédica, RJ. *Autor para correspondência: miliane@ufrrj.br
Análise fenotípica e genotípica da virulência de
Staphylococcus
spp.
e de sua dispersão clonal como contribuição ao estudo da
mastite bovina
1Viviane F. Marques2, Miliane M.S. de Souza3*, Elaine C.L. de Mendonça2, Tatiani Abreu de Alencar4, Bruno Rocha Pribul2, Shana de M. de O. Coelho3, Mirta Lasagno5 eElina B. Reinoso5
ABSTRACT.- Marques V.F., Souza M.M.S., Mendonça E.C.L., Alencar T.A., Pribul B.R., Coelho S.M.O., Lasagno M. & Reinoso E. 2013. [Phenotypic and genotypic analysis of virulence in
Staphylococcus spp. and its clonal dispersion as a contribution to the study of bovine
mastitis.] Análise fenotípica e genotípica da virulência de Staphylococcus spp. e de sua dis-persão clonal como contribuição ao estudo da mastite bovina. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(2):161-170. Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, Universidade Fede -ral Ru-ral do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ 23890-000, Brazil. E-mail: miliane@ufrrj.br
Mastitis is an inflammation of one or more mammary glands caused mainly by bacte
-ria, among which the genus Staphylococcus plays an important role. Bacteria belonging to this genus are known to express virulence factors which allow their persistence and spread in the host. This study aimed to evaluate the phenotypic and genotypic aspects of virulence factors in Staphylococci spp. isolates from bovine mastitis clinical cases. A total of 272 milk samples from 8 farms in the South-Fluminense region of Rio de Janei
-ro were analyzed. The samples underwent conventional bacterial identification, yielding
250 Staphylococci spp. isolates. These were tested for the phenotypic detection of slime production by the microplate and Congo Red Agar methods. The hemolysins production, hemolytic synergism, caseinase and DNaseproduction were also evaluated. The isolates were then assayed through the Polymerase Chain Reaction method to detect genes asso
-ciated with virulence factors such as: capsule (cap5, cap8), fibronectin (fnbA, fnbB), slime
(icaA, icaD) and hemolysins (hla e hlb). Regarding the number of isolates assessed, 58% (145/250) were identified as coagulase-negative Staphylococcus spp. and 42% (105/250) as coagulase-positive Staphylococcus spp. The latter comprised 36.2% (38/105) of isolates identified as S. aureus, 11.4% (12/105) as S. intermedius and 3.8% (4/105) belonging to the SIG group. The hemolisin production was not significant, whereas only 6,4% (16/250) produced alfa hemolysis, 4,8% (12/250) produced beta hemolysis and 1,6% (4/250) was able to produce both. Caseinase production was observed in 66.4% (166/250) and sli
-me production assayed through the microplate -method was positive in 76,8% (192/250). DNAse was detected in coagulase-negative Staphylococcus spp. (38/145) and in S. aureus (14/38). Low association between genetic detection of icaA (38/250) and icaD (54/250)
and slime phenotypic expression (192/250) suggest that others genetic markers can be involved in this expression. Regarding gene amplification, the isolates did not show sig
-nificant correlation between the genetic detection of icaA (38/250)and icaD (54/250)
and slime production (192/250), indicating that other genetic markers may be involved
4 Programa de Pós-Graduação em Ciência, Tecnologia e Inovação em Agropecuária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ 23890-000/Universid Nacional de Rio Cuarto (UNRC), 5800 Río Cuarto, Córdoba, Argentina.
in this trait expression. The frequency of the occurrence of the others studied genes was of 4% (10/250) for cap5 and cap8, 32,8% (82/250) for fnbA, 4,4% (11/250) for fnbB, 19,2% (48/250) for hla and 18% (45/250) for hlb. The major circulating strain profile on the farms encompassed slime and caseinase producer strains. The spaA gene was found in all of the S. aureus isolates, presenting varying amplicons sizes, with 300bp being the prevalent size. The amplification of the coa gene showed nine polymorphic variants, with 600bp being the prevalent amplicon. The agr gene was also detected in every S. aureus
isolate,with an amplicon of 200bp. It was noticed that the presence or absence of the vi
-rulence genes assayed in this study were not correlated with the 6 distinct electrophoretic profiles obtained by PFGE.
INDEX TERMS: Staphylococcus spp., mastitis, virulence factors.
RESUMO.- A mastite é uma inflamação da glândula mamá -ria causada principalmente por bacté-rias, dentre as quais
o gênero Staphylococcus ocupa um papel importante.
Bac-térias pertencentes a este gênero são caracterizadas por expressar fatores de virulência que permitem sua persis
-tência e disseminação no hospedeiro. O presente trabalho teve por objetivo avaliar fenogenotipicamente os fatores de
virulência de isolados de Staphylococcus spp. a partir de
ca-sos de mastite bovina. Foram analisadas 272 amostras de leite provenientes de oito propriedades da região Sul-Flu
-minense do Estado do Rio de Janeiro. Após identificação,
obteve-se um total de 250 isolados de Staphylococcus spp. Estes foram submetidos às provas fenotípicas de detecção da produção de “slime” em microplaca e em ágar vermelho congo; produção de hemolisinas e sinergismo hemolítico; produção de caseinase e DNase. Posteriormente foram sub
-metidos à técnica de PCR para detecção dos genes de pro -dução de cápsula (cap5 e cap8), fibronectina (fnbA,e fnbB), “slime” (icaA e icaD) e hemolisinas (hla e hlb). Do total
ava-liado, 58% (145/250) foi identificado como Staphylococcus spp. coagulase-negativos e 42% (105/250) como Staphylo-coccus spp. coagulase-positivos, destes 36,2% (38/105) fo -ram identificados como S. aureus, 11,4% (12/105) como S. intermedius e 3,8% (4/105) como pertencentes ao grupo SIG. Apenas 6,4% (16/250) dos isolados foram produto -res de a-hemólise, 4,8% (12/250) de b-hemólise e, 1,6%
(4/250) de a e b-hemólise. A produção de caseinase foi observada em 66,4% (166/250), e a produção de “slime” avaliada pela técnica da microplaca em 76,8% (192/250) dos isolados, respectivamente. A DNase foi detectada em
ECNs (38/145) e S. aureus (14/38). Os marcadores gené -ticos avaliados para a produção de slime, icaA e icaD
apre-sentaram nenhuma ou leve concordância com a produção fenotípica, respectivamente, utilizando o coeficiente Ka
-ppa. Tal dado parece indicar que outros marcadores gené
-ticos podem estar envolvidos com a expressão desta carac
-terística. Os demais genes detectados com frequência de 4% (10/250) para cap5 e para cap8, 32,8% (82/250) para fnbA, 4,4% (11/250) para fnbB, 19,2% (48/250) para hla e 18% (45/250) para hlb. O perfil circulante nas proprieda -des foi o 1: isolado produtor de “slime” e caseinase. O gene spaA foi positivo em todos os S. aureus, apresentando
am-plicons de tamanhos variados, sendo o tamanho prevalente o de 300pb. A amplificação do gene coa apresentou nove
tipos polimórficos distintos, sendo prevalente o amplicon de 600pb. O gene agr foi detectado em todos os S. aureus, com amplicon de 200pb. Foi observado que os genes de vi
-rulência estudados estavam distribuídos de modo aleatório entreos 6 distintos perfis eletroforéticos obtidos através da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE).
TERMOS DE INDEXAÇÃO:Staphylococcus spp., mastite, fatores de
virulência.
INTRODUÇÃO
As espécies de Staphylococcus spp. têm papel importante
na etiologia das infecções intramamárias do gado leitei -ro (Freitas et al. 2005). Destas, os Staphylococcus aureus, destacam-se entre os agentes etiológicos prevalentes neste tipo de infecção (Zafalon et al. 2008), porém, os estafiloco
-cos coagulase-negativos têm emergido como microrganis -mos causadores de mastite, sendo responsáveis pela
per-da per-da qualiper-dade do leite gerando prejuízos econômicos ao produtor e a indústria leiteira (Pyorala & Taponen 2009).
Os Staphylococcus spp. podem produzir uma série de fatores de virulência que contribuem para que a bactéria invada as defesas fagocíticas do hospedeiro, facilite a sua aderência às células epiteliais e a colonização no tecido, favorecendo a sua persistência extracelular e garantindo assim êxito em sua instalação e manutenção nos tecidos do hospedeiro (Coelho et al. 2011, Silva et al. 2007). Entre estes fatores está a produção de um mucopolissacarídeo extracelular (“slime”), que parece ajudar na aderência e colonização do microrganismo ao epitélio glandular ma
-mário. A habilidade dos S. aureus aderirem à superfície do epitélio tem sido associado à produção de biofilmes, que são descritos como aglomerações de células embebidas em matriz heterogênea extracelular, resultando em estruturas tridimensionais com características fisiológicas específicas (Cerca et al. 2007, Gad et al. 2009).
Algumas espécies estafilocócicas produzem hemolisi
-nas que são diferentes entre si de acordo com a ação lítica sobre os eritrócitos. As do tipo beta e alfa são as mais im
-portantes na patogênese das infecções intramamárias sen
-do que a beta toxina é uma esfingomielinase Mg2+-
depen-dente que degrada a esfingomielina presente na membrana celular (Linehan et al. 2003, Park et al. 2004). Elas podem ainda apresentar um efeito hemolítico sinérgico (SHA), no qual as cepas podem ter uma ação sinérgica com outros mi
-crorganismos aumentando o potencial patogênico (Demo
1996).
A detecção da atividade da desoxirribonuclease
estafilococos patogênicos de não patogênicos da microbio
-ta, sendo tão importante quanto à coagulase para a patogê
-nese do estafilococo (Citak et al. 2003).
O desenvolvimento das mastites pode estar também as
-sociado à colonização por microrganismos produtores de caseinase. A caseína é a mais importante proteína do leite, incapaz de penetrar na membrana celular dos microrga
-nismos, a não ser que haja a sua hidrólise pela caseinase. Logo é possível que esta enzima esteja relacionada ao início e desenvolvimento de processos inflamatórios envolvendo
bactérias causadoras de mastite (Zafalon et al. 2008). Alguns estafilococos podem apresentar a coagulase que é um importante fator de virulência, pois tem a capacidade de coagular a fibrina que se deposita ao redor da bactéria oferecendo-lhe proteção (Karahan & Cetinkaya 2007). Os S. aureus apresentam ainda a “proteína A” que tem a proprie
-dade de combinar-se ao fragmento Fc da imunoglobulina G,
bloqueando a via alternativa de ativação do complemento
e da subsequente opsonização e fagocitose (Gómez et al.
2007). A expressão destas proteínas extracelulares está su
-jeita à regulação coordenada de vários loci gênicos, onde o mais estudado é o regulador agr que envolve cinco genes
(agrA, agrB, agrC, agrD e hld). O sistema agr atua como
re-gulador positivo de proteínas secretoras (α e β hemolisi
-nas, proteases, DNAses e estafiloquinases) e pode reprimir a transcrição dos genes que codificam a proteína A, coagu
-lase e outras proteínas associadas à parede (Novick & Jiang
2003).
O presente trabalho teve por objetivo avaliar feno e ge
-notipicamente fatores de virulência em Staphylococcus spp. a partir de ambientes de produção leiteira na região Sul --Fluminense do estado do Rio de Janeiro, e observar uma
possível correlação com a distribuição clonal de modo a produzir dados que possam auxiliar no entendimento da dispersão da virulência nesta região.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas 272 amostras de leite de vacas, pertencentes a oito propriedades situadas em municípios localizados na região Sul Fluminense e metropolitana do Estado do Rio de Janeiro (Rio Claro, Piraí, Paracambi e Seropédica). Estas foram submetidas ao isolamento primário e posterior testes de identificação feno --genotípica das espécies (Sambrook et al. 2002, Koneman et al. 2008).
Todos os isolados foram testados quanto à produção dos fato -res feno-genotípicos de virulência.
A hidrólise da caseína foi testada em ágar contendo 1,5% de ágar-ágar e 10% de leite desnatado, incubado a 37ºC por 24 hs, no qual a presença de uma área clara rodeando a zona de cresci-mento bacteriano indicou reação positiva (Koneman et al. 2008).
A produção de DNase foi avaliada a partir da coloração rósea observada ao redor do crescimento bacteriano em ágar DNase, in -cubado a 37ºC por 24 hs (Koneman et al. 2008).
A produção de “slime” em microplaca foi avaliada quantita -tivamente através de modificações na metodologia proposta por Christensen et al. (1985) e Cucarella et al. (2001). Alíquotas de 0,2 mL da suspensão bacteriana obtida pela inoculação da cultura primária em caldo tripticase soja (TSA - Britania) contendo 0,24% de glicose e incubada a 37ºC por 24h, foram inoculadas em micro -placas de poliestireno estéreis com 96 poços contendo o mesmo caldo e incubadas por 24 horas à 37oC sem agitação. Após incu
-bação, os poços foram lavados 2 vezes com 200µL de solução sa -lina estéril, secos em estufa à 65ºC por 1h e corado com 200µL de safranina 1% por 15 min. Os poços foram lavados três vezes com água destilada e secos à temperatura ambiente. A absorbância foi determinada à 490nm em leitor de ELISA (BIO RAD MODEL 680). Poços não inoculados contendo caldo TSA com 0,24% de glicose serviram como controle negativos. Os testes foram realizados em triplicata, a leitura avaliada em momentos diferentes (no mesmo dia em que foi feita a coloração: 0DPC; um dia após a coloração: 1DPC; e sete dias após a coloração: 7DPC) e uma média foi retira -da dos valores obtidos em ca-da dia de leitura. Foram considera-das produtoras de biofilmes cepas que apresentaram valores de absorbância maiores que 0,1 (Vasudevan et al. 2003, Oliveira et al. 2006). A intensidade da produção - de “slime” foi escalonada da seguinte maneira: forte (> 0,3), moderada (>0,2 e < 0,3) e fraca (>0,1 e < 0,2). A produção de hemolisinas e SHA foi avaliada por cultivo em ágar sangue de carneiro (Demo, 1996).
A extração do DNA bacteriano foi realizada segundo protocolo padronizado em nosso laboratório. Colônias foram crescidas em 5mL de caldo BHI (MERCK) por 18hs a 37ºC, para posterior cen -trifugação a 14.000rpm por 1 min, e lavada com 500ml de tampão TE por duas vezes e recentrifugado. O pellet foi ressuspendido em 250ml de tampão de extração (NaCl 150mM; Tris-HCl 100mM e EDTA 20mM), adicionado lisostafina (SIGMA) para concentração final de 20mg/ml (5ml de lisostafina – 1mg/ml) e incubado à 37ºC por 30 minutos. A lise foi completada por adição de SDS 1% para concentração final de 3mg/ml, incubação em banho-maria a 50ºC por 1 hora e posteriormente -20ºC por 10 min. Após centrifuga -ção a 14.000 rpm por 10 min, o sobrenadante foi transferido para um novo microtubo. Foi adicionado a este o mesmo volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misturado por inversão por 5 min. Após nova centrifugação a 14.000 rpm por 1 min, o so -brenadante foi transferido para um novo microtubo, adicionado NaCl para concentração final de 0,3M e misturado por inversão, acrescentado 2 volumes de etanol 100% e também misturado por inversão, seguido de incubação a -20ºC por 2 horas ou overnight. Após isto, procedeu-se a centrifugação a 14.000 rpm por 30min e descarte do sobrenadante, o pellet foi lavado com 500ml de etanol 70% e colocado para secar à temperatura ambiente. O pellet foi ressuspendido em 30 ml de água mili-Q.
A análise da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi reali -zada utilizando os iniciadores e programas de amplificação des -critos no Quadro 1. A reação foi preparada para um volume final de 20 µL, contendo tampão 1X (10 mM Tris-HCl, 2,0 mM MgCl2,
50 mM KCl e 0,1% Triton X-100, pH 9.0), 0,5mM de cada iniciador (BIONEER), 0,2 mM de dNTP (FERMENTAS), 2 U de DreamTaq™ Green DNA Polimerase (FERMENTAS), 2ml do DNA extraído e água mili-Q para completar o volume (SAMBROOK et al., 2002) . Os am -plicons foram avaliados por eletroforese em gel de agarose 1,5% contendo corante SYBR Green (INVITROGEN) diluído. Os géis fo -ram visualizados em transiluminador ultra-violeta e documenta-dos pelo câmera fotográfica (SONY - Modelo DSC-HX1), utilizando marcador de peso molecular de 100 pb (FERMENTAS).
A técnica de Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) para obtenção dos perfis cromossômicos de S. aureus foi realizada
mediante modificações em metodologias descritas na literatura. Colônias puras foram ressuspendidas em tampão de suspensão (100mM Tris, 100mM EDTA, pH 7,6) até alcançar a turbidez refe -rente ao tubo 2 da escala de McFarland. Após, foi adicionado 20µl de lisostafina a 225µl da suspensão bacteriana e incubado a 370C
por 30 min. Em seguida, foi agregado 5µl de proteinase K (20mg/ ml) e 250µl de agarose de baixo ponto de fusão 1,5% a 50oC, para
confecção dos blocos, que foram solidificados a 4oC por 20 min. Os
EDTA pH9, 1% n-lauril-sarcosina e 75µl de proteinase K (20mg/ ml) durante 90 minutos em banho a 55oC. Após digestão, foram
efetuadas lavagens, inicialmente com água destilada estéril a 50oC
em banho-maria por 15 min, e depois três ciclos seguidos com tampão de lavagem (10mM Tris e 1mM EDTA, pH 7,6) por igual intervalo de tempo e temperatura. A digestão enzimática foi feita com a adição do bloco a microtubo contendo tampão de restrição (2µl de albumina, 20µl de Buffer J, 73 µl de água livre de nuclea -ses e 5µl da enzima de restrição SmaI). Após montagem do gel, a
corrida eletroforética foi efetuada em equipamento Chief III con -siderando pulso inicial de 5 seg.; pulso final de 25 seg.; ângulo de 120o; 6 V por 17 horas. A coloração do gel foi feita com brometo de
etídio a 0,1% em tampão de corrida para posterior visualização. Para a análise estatística foram utilizados os testes de qui-qua -drado, para análise de sensibilidade e especificidade da técnica de detecção de “slime” através da microplaca, de Shapiro-Wilk, para verificar a normalidade dos dados obtidos pelo teste de detecção de “slime” em microplaca, o teste de Friedman, para avaliar a di-ferença existente entre as leituras de detecção de “slime” realiza -das nos diferentes momentos (0DPC, 1DPC e 7DPC), o coeficiente KAPPA, para verificação de concordância entre os resultados dos testes fenotípicos e genotípicos de detecção de “slime” e o Teste McNemar, para verificação de associação entre os resultados dos testes fenotípicos e genotípicos de detecção de “slime”, com nível de significância de 5%.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dentre os 250 estafilococos obtidos a partir de amostras de leite mastítico, 58% (145/250) foram identificados
como Staphylococcus coagulase-negativos (ECN) e 42%
(105/250) como Staphylococcus coagulase-positivos, atra
-vés da amplificação dos genes Staph e coa. Dentre as
es-pécies coagulase-positivas identificadas obteve-se 36,2%
(38/105) de S. aureus, 11,4% (12/105) de S. intermedius e 3,8% (4/105) de Staphylococcus spp coagulase positivos do grupo SIG, de acordo com o perfil bioquímico e a ampli
-ficação dos genes específicos de caracterização (DNAr de S. aureus, nuc3, nuc4 e pta). Os demais 51 isolados foram fenotipicamente caracterizados como estafilococos coagu -lase-positivos.
A frequência de 58% (145/250) de ECNs em todos os rebanhos estudados neste trabalho fornece aporte aos re -sultados encontrados recentemente onde ECNs tem sido
identificados como causadores de mastite bovina subclíni
-ca em alguns países (Taponen et al. 2006, Santos 2008, Pyo
-rala & Taponen 2009). Na Finlândia, ECNs representaram
50% do total de bactérias isoladas em um estudo que ava
-liou 12661 amostras de leite de 216 fazendas no país (Pi
-Quadro 1 . Iniciadores e programas de amplificação para detecção de genes de identificação e virulência em Staphylococcus spp. de propriedades leiteiras da região Sul-fluminense no período
entre outubro/2009 e março/2011
Gene (fragmento) Espécies Iniciadores (5´ - 3´) Ciclos* Referências DNAr (930pb) S.aureus ACG GAG TTA CAA AGG ACG AC 1 Straub et al. 1999
AGC TCA GCC TTA ACG AGT AC
Staph (756pb) Staphylococcus spp. AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA 1 Zhang et al. 2004
CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC
nuc3 e 4 (431pb) S.intermedius CGC CGT TCT CTC TTT GG 2 Silva et al. 2003
CGC CTC TCA CAT CCG
pta (320pb) SIG AAA GAC AAA CTT TCA GGT AA 3 Bannoehr et al. 2009
GCA TAA ACA AGC ATT GTA CCG
hla (210pb) Staphylococcus spp. CTG ATT ACT ATC CAA GAA ATT CGA TTG 4 Nilsson et al. 1999
CTT TCC AGC CTA CTT TTT TAT CAG T
hlb (300pb) Staphylococcus spp. GTG CAC TTA CTG ACA ATA GTG C 4 Nilsson et al. 1999
GTT GAT GAG TAG CTA CCT TCA GT
icaA (1315pb) Staphylococcus spp. CCT AAC TAA CGA AAG GTA G 5 Vasudevan et al. 2003
AAG ATA TAG CGA TAA GTG C
icaD (381pb) Staphylococcus spp. AAA CGT AAG AGA GGT GG 5 Vasudevan et al. 2003
GGC AAT ATG ATC AAG ATA C
fnbA (1279pb) Staphylococcus spp. GCG GAG ATC AAA GAC AA 6 El-Sayed et al., 2006
CCA TCT ATA GCT GTG TGG
fnbB (812pb) Staphylococcus spp. GGA GAA GGA ATT AAG GCG 7 El-Sayed et al. 2006
GCC GTC GCC TTG AGC GT
cap5 (880pb) Staphylococcus spp. ATG ACG ATG AGG ATA GCG 8 El-Sayed et al. 2006
CTC GGA TAA CAC CTG TTG C
cap8 (1147pb) Staphylococcus spp. ATG ACG ATG AGG ATA GCG 9 El-Sayed et al. 2006
CAC CTA ACA TAA GGC AAG
agr (200pb) S. aureus CAT AGC ACT GAG TCC AAG GA 10 Reinoso, 2004
CAA TCG GTG ACT TAG TAA AAT G
spaA (v**) S. aureus CAA GCA CCA AAA GAG GAA 11 Reinoso, 2004
CAC CAG GTT TAA CGA CAT
coa (v**) Staphylococcus spp. ATA GAG ATG CTG GTA CAG G 12 Karahan & Cetinkaya, 2007
GCT TCC GAT TGT TCG ATG C
tkala et al. 2004). No Brasil, foram isolados 36% (172/477)
de Staphylococcus spp. coagulase-negativos e apenas 13% (65/477) de S. aureus em leite bovino no estado de Per-nambuco (Freitas et al. 2005).
Dentre os estafilococos coagulase-positivos identifica -dos, a espécie S. aureus foi prevalente, assim como obser -vado em trabalho desenvolvido por Santos(2006) onde a
frequência de S. aureus foi de 43,24% entre os 74 isolados de estafilococos coagulase-positivos analisados a partir de amostras de oito propriedades leiteiras do município de Uberlândia, estado de Minas Gerais. S. aureus é reconhecido como sendo o patógeno frequentemente isolado em casos de mastite subclínica, relacionado entre os microrganis
-mos mais contagiosos, sendo responsável por grandes pre
-juízos à pecuária leiteira (Ferreira et al. 2006). Bannerman
(2003) destacaram a presença de outras espécies de Sta-phylococcus spp. coagulase-positivos, como por exemplo, S. intermedius como patógenos oportunistas em animais.
No presente estudo a ocorrência de S. intermedius em qua-dros de mastite pode estar relacionada a presença dos cães
observados próximos às instalações de produção leiteira. Coelho (2008) apontou para a existência de genes de re -sistência em S. aureus e S. intermedius isolados de mastite
bovina sugerindo uma possível transmissão interespecífica devido a aproximação entre o bovino leiteiro e outros ani
-mais domésticos no ambiente de fazenda. Staphylococcus spp. coagulase positivos do grupo SIG tem emergido como patógeno comum de diversas infecções em humanos e ani
-mais. Este grupo caracterizado por técnicas genotípicas in -clui as espécies de Staphylococcus intermedius, S. pseudin-termedius e S. delphini, que antes eram identificados como S. intermedius através das técnicas fenotípicas convencio
-nais (Bannoehr et al. 2009).
Após a detecção dos fatores de virulência (Quadro 2) foi possível observar que, S. aureus foi a espécie que apresen
-tou maior diversidade na expressão fenotípica de fatores de virulência e na detecção dos genes relacionados à codifica
-ção desses fatores. Os S. aureus têm capacidade de produzir um grande número de fatores de virulência e acredita-se que estas características possam ser responsáveis pela ex
-traordinária capacidade de adaptação da bactéria aos dife
-rentes nichos do organismo (Cruz 2008).
A produção de caseinase foi significativa nos isolados avaliados, com exceção do grupo SIG, sendo 66,9% em ECN (97/145), 68,4% em S. aureus (26/38), 66,7% em ECP
(34/51), e em S. intermedius (8/12). A caseína é a principal fonte protéica do leite e estes dados refletem a capacidade desses microrganismos assimilarem essa proteína como fonte de aminoácidos em sua nutrição. Possuir proteases, neste caso, pode ser fundamental para a sobrevivência do microrganismo no hospedeiro e não está associada à agres -sividade da bactéria. A produção de caseinase está
direta-mente relacionada à qualidade do leite, uma vez que em estudos cuja redução da proporção relativa de caseína no leite mastítico foi detectada.
A produção de DNase foi de 36,8% em S. aureus (14/38),
27,5% em ECP (14/51), 26,2% em ECN (38/145), e em 16,7% S. intermedius (2/12), não sendo detectada em SIG. Portanto, foi observada uma maior produção de DNase en -tre S. aureus em concordância com a literatura (Kateete et
al. 2010). Do ponto de vista da virulência, a DNase é tão
importante quanto a coagulase para o estabelecimento da infecção e sua detecção distingue estafilococos patogênicos de não patogênicos da microbiota (Citak et al. 2003).
O gene fnbA (1279pb) foi amplificado de 73,7% dos S. aureus (28/38), seguido de 31,4% dos ECPs (16/51), 25%
dos S. intermedius (3/12) e dos SIG (1/4) e 23,4% dos ECNs (34/145). O gene fnbB (812pb) foi amplificado de 18,4%
dos S. aureus (7/38), seguido de 8,3% dos S. intermedius (1/12), 2,0% dos ECPs (1/51) e 1,4% dos ECNs (2/145), não tendo sido detectado em SIG. Estudos apontam para o fato de que a aderência a fibronectina não difere entre amostras com um ou dois genes de fnb (Peacock et al.
2000). Greene et al. (1995) em experimento in vitro
de-monstraram que cepas de S. aureus mutantes para fnbA ou fnbB não mostraram redução significativa de adesão. No
entanto, o duplo mutante (fnbA e fnbB) foi completamente defeituoso em se aderir à superfície.
É consenso entre os autores que a maioria das cepas
isoladas de leite bovino podem ser classificadas nos tipos capsulares 5 e 8 (O’Riordam & Lee 2004, Zhao et al. 2010). Contudo, a frequência destes tipos capsulares de bactérias isoladas de amostras de leite mastítico pode ser variável. No presente trabalho, o gene cap5 (880 pb) foi amplifi
-cado em 25% dos SIG (1/4), 15,8% de S. aureus (6/38),
8,3% de S. intermedius (1/12), 2% dos ECPs (1/51) e 0,7% dos ECNs(1/145). O gene cap8 (1147 pb) foi amplificado de 21,1% de S. aureus (8/38), seguido de 1,4% dos ECNs
(2/145), não tendo sido detectado em S. intermedius, SIG e ECP. Nos Estados Unidos e Europa foi amplificado 14,9%
(54/362) de cap5 e 27,1% (98/362) de cap8 de Staphylo-coccus spp. oriundos de mastite bovina (Tollersrud et al. 2000). A presença de cap5 e cap8 pode variar de acordo
com a região geográfica e possui importância diferenciada no desenvolvimento da infecção nestas regiões, não consti
-tuindo um ponto único possível de intervenção no controle Quadro 2. Distribuição dos fatores de virulência nas
Staphylococcus spp. isoladas de leite mastítico de
propriedades leiteiras da região Sul fluminense entre outubro/2009 e março/2011
Percentual dos fato- Staphylococcus spp.*
res de Virulência** ECN ECP S. aureus S. intermedius ECP (SIG)
Fatores Fenotí- Sli 74,5 84,3 81,6 58,3 75,0 picos SHA 44,0 31,4 18,4 16,7 75,0
Hem 9,0 9,8 31,6 16,6 25,0
DNa 26,2 27,5 36,8 16,7 0
Cas 66,9 66,7 68,4 66,7 25,0
Fatores Genotí- icaA 4,1 7,8 63,2 25,0 25,0 picos icaD 8,3 23,5 63,2 33,3 25,0
hla 4,8 11,8 78,9 33,3 25,0
hlb 4,1 11,8 73,7 33,3 25,0
cap5 0,7 2,0 15,8 8,3 25,0
cap8 1,4 0 21,1 0 0
fnbA 23,4 31,4 73,7 25,0 25,0
fnbB 1,4 2,0 18,4 8,3 0
*ECP = estafilococos coagulase-positivo, ECN = estafilococos coagulase --negativo, (SIG) = estafilococos coagulase-positivo pertencentes ao gru -po de Staphylococcus intermedius. **Sli = “slime”, Hem = hemolisina, SHA
das mastites, uma vez que tem sido proposta a imunização
através destes antígenos capsulares (El-Sayed et al. 2006, Daum & Spellberg 2011).
Após a execução da técnica de microplaca para produ -ção de “slime” foi observada diferença significativa, utili
-zando o teste de Friedman (p<0,05), nas leituras realizadas
em diferentes tempos (0DPC, 1DPC e 7DPC). Considerando isolados positivos ou negativos para a produção de “slime” e desconsiderando a intensidade da produção, foi possível
observar um número elevado de Staphylococcus spp.
pro-dutores de “slime”. Um total de 84,3% dos ECPs (43/51) foi produtor, seguido de 81,6% dos S. aureus (31/38), 75% dos SIG (3/4), 74,5% dos ECNs (108/145) e 58,3% de S. inter-medius (7/12), sugerindo um alto potencial destes isolados em utilizar o mucopolissacarídeo na adesão ao tecido glan
-dular mamário. O “slime” facilita a adesão de Staphylococ-cus spp. ao tecido do hospedeiro e agregação célula-célula, favorecendo a formação do biofilme. No biofilme, as bacté
-rias são menos suscetíveis ao tratamento por antibióticos e a ação do sistema imune inato do hospedeiro. A capacidade de formação de biofilmes é fonte de estudo tanto na medi
-cina humana quanto veterinária e a melhor compreensão desta característica fornece subsídios para a aplicação de medidas de tratamento mais eficaz na mastite bovina (Mel
-chior et al. 2005). A camada de “slime” dificulta a fagoci
-tose por células do sistema imunológico do hospedeiro e está associada à infecções por ordenhadeiras mecânicas, pois este muco polissacarídeo facilita a adesão bacteriana à biomateriais, o qual não é removível mesmo após lavagens sucessivas (Dego et al. 2002).
A variação na expressão gênica produz intensidades di
-ferentes de coloração e formação de três grupos produtores de “slime”: fraco-produtor, produtor moderado e forte pro
-dutor, observáveis ao teste fenotípico de detecção de “sli -me” em microplaca. Em nosso estudo esta variação ocorreu
em todos os grupos de Staphylococcus spp. estudados, não mostrando associação com a espécie. Dois mecanismos são
propostos para a variação fenotípica: a mutação (no gene icaD e na região terminal do gene icaA) e regulação da
transcrição do operon ica (Handke et al. 2007). Quanto à presença dos genes icaA (1315pb) e icaD (381pb), apenas 2,8% (7/250) foram positivos para ambos os genes e nega -tivos para a produção de “slime” em microplaca. E um total
de 56% (140/250) dos isolados foram negativos para am
-bos os genes e positivos para a produção de “slime” em mi
-croplaca. Após calcular o coeficiente KAPPA foi possível ob
-servar uma leve concordância (K= 0,0187) entre a detecção do gene icaD e a expressão da característica de produção de “slime” e nenhuma concordância (K= - 0,0021) quando ana
-lisados a detecção do gene icaA e a expressão desta carac
-terística. Quando estes valores foram submetidos ao Teste de McNemar foi possível verificar que existe uma diferença significativa entre os dados obtidos na detecção fenotípica de “slime” frente a detecção dos genes icaA (p≤0,05)e icaD (p≤0,05) , respectivamente. A baixa amplificação dos genes icaA e icaD em contraposição a alta expressão de “slime” pode ser explicada pela existência de outros mecanismos genéticos envolvidos na adesão e que, em análise posterior deverão ser testados como a detecção do gene bap, que é
o codificador da proteína de superfície Bap cuja função é auxiliar na adesão intercelular e formação do biofilme e foi primariamente estudada em isolados provenientes de
mastite bovina (Cucarella et al. 2001). Outra justificativa
pode ser a presença de um fator independente do operon icaADBC que pode ser necessário para a síntese de polis
-sacarídeo e acumulação do biofilme (Dobinski et al. 2003).
A produção de “slime”, detectada pela técnica de
micro-placa, foi avaliada quanto a sua sensibilidade e especificida
-de consi-derando a presença -de ambos os genes icaA e icaD como teste padrão, através da análise estatística realizada pelo teste do qui-quadrado. Devido à elevada positividade
de produção “in vitro” a sensibilidade também se mostrou
elevada (80%). Já a especificidade foi inferior a 30% de
-monstrando que esta técnica apresenta dificuldade em de
-tectar isolados negativos. Uma das explicações plausíveis pode ser a possível deposição de corante agregado ao po
-liestireno causando efeito de positividade visual e detectá
-vel em leitura por espectofotometria. Porém a redução do tempo de incubação para evitar o excesso de corante de -positado não é recomendada uma vez que o polissacarídeo
relacionado à aderência ao substrato de poliestireno é ex
-presso em quantidade significativa somente após incuba
-ções de 24h (Krepsky et al. 2003).
Dos isolados avaliados quanto à produção de hemo
-lisinas, apenas 13,2% (33/250) foram hemolíticos. Des
-tes, 48,5% (16/33) apresentaram hemólise total, 36,4% (12/33) hemólise parcial e 15,1% (5/33) hemólise total e parcial. A produção de hemolisinas está relacionada a pato
-genicidade das amostras de Staphylococcus spp. Larsen et
al. (2002) sugerem que cepas de Staphylococcus spp.
pro-dutoras de hemólise parcial são mais virulentas ao gado que cepas não hemolíticas. A hemólise parcial, em Sta-phylococcus spp., é representada pela beta-hemolisina, uma enzima que apresenta atividade de esfingomielinase, des
-truindo membranas celulares ricas em esfingomielina, sen
-do tóxica para vários tipos celulares apresentan-do grande importância nos casos de mastite uma vez que o úbere é rico em esfingomielina (Linehan et al. 2003, Coelho et al. 2011). ECNs foram os menos produtores apresentando 91,0% (132/145) dos isolados não-hemolíticos. Chapman et al. (1934) reportaram estafilococos que não produziam nenhum tipo de hemolisina, concluindo-se que este não se
-ria um critério absoluto para sua patogenicidade. Silva & Cardoso (2000) apontaram que amostras não hemolíticas
também podem ser isoladas de casos de mastite bovina. Em estudo realizado com cepas de Staphylococcus spp. foi demonstrado que todas as amostras analisadas eram fra
-cas produtoras de alfa-hemolisina. A alfa-toxina é letal e sua expressão reduzida pode estar associada a vantagens
adquiridas em termos de colonização e transmissibilidade
(Sabersheikh & Saunders 2004).
O fenômeno de sinergismo hemolítico foi positivo em 36,8% (92/250) dos isolados. Dentre as espécies avaliadas
observou-se que S. aureus apresentaram baixo percentual de sinergismo hemolítico 18,4% (7/38), enquanto ECNs apresentaram percentual de 44,1% (64/145) de positivi
-dade. ECNs foram também o grupo de Staphylococcus spp.
(13/145) apenas. Isolados não hemolíticos com produção de sinergismo podem ser portadores da delta hemolisina, a qual é expressa somente na presença da beta-hemolisina (Reinoso 2004). Acredita-se que o fenômeno de sinergis
-mo he-molítico é independente da produção de he-molisi -nas, porém sua ação é considerada potencializadora para
isolados que são hemolíticos, especialmente em S. aureus,
pois permite uma melhor colonização do úbere por estes microrganismos (Watts 1988).
Através da técnica de PCR multiplex, os genes hla e hlb (210pb e 300 pb, respectivamente) foram amplificados, sendo que apenas 3,6% (9/250) foram produtores de he
-mólise total e apresentaram o gene hla, 2,8% (7/250) fo -ram produtores de hemólise parcial e apresenta-ram o gene hlb e 0,8% (2/250) dos isolados apresentaram os genes hla e hlb e foram produtores de alfa e beta hemolisinas. Em 7,2% (18/250) dos isolados foi detectada a produção de algum tipo de hemolisina, mas não amplificou para ne
-nhum dos genes, o que sugere o envolvimento de outros marcadores genéticos, possivelmente relacionados à ex
-pressão destas toxinas, que não foram amplificados no presente trabalho. Dos isolados avaliados, 14,4% (36/250) não expressaram hemolisina, porém foram positivos para pelo menos um gene. Este fato pode ser explicado pela não expressão dos genes nas condições “in vitro” fornecidas. E 72,4% (181/250) não expressaram nenhum tipo de hemo
-lisina e não amplificaram para os genes estudados.
Todos os isolados de S. aureus foram positivos para o gene spaA (n=38). O gene amplificado foi referente à região X, que consiste em um número variável de repetidos 24 pa
-res de bases. Nenhum isolado ap-resentou bandas múltiplas e foi possível estabelecer 9 perfis segundo o tamanho da banda. O perfil predominante foi o 7 (50%) que apresenta 12 repetições. Em trabalho desenvolvido por Coelho et al. (2011), o perfil predominante da amplificação da região x do gene spaA foi o amplicom com tamanho de 315pb com frequência de 64% (32/50) de cepas S. aureus oriundas de mastite bovina da região sul do estado do Rio de Janeiro. Frenay et al. (1996) determinaram que cepas com mais de 260 pb ou 11 unidades repetidas na região X tendem a ser mais epidêmicas, enquanto que a presença de 7 ou menos unidades indica circulação de cepas esporádicas. Isso se justifica pelo fato de que quanto maior o número de repeti
-ções, maior a longitude da região de união à porção Fc das imunoglobulinas, favorecendo a colonização e conseqüente infecção.
Os isolados de S. aureus apresentaram 9 perfis distin
-tos para o gene coa, estabelecidos pelas repetições dos 81 pares de base, sem bandas duplas e em 68,5% (26/38) dos amplicons foi encontrado um tamanho que variou de 600 a 800pb. O gene coa amplificado de isolados de S. aureus
provenientes de animais apresenta banda única,
enquan-to que em isolados de origem humana apresenta banda
dupla. Estudos têm indicado que S. aureus isolados de
re-servatórios humanos e animais representam duas subpo
-pulações que raramente sofrem infecção cruzada (Karahan & Cetinkaya 2007). Alguns genótipos de coa são predomi-nantes em determinados países, e estes são resistentes à fagocitose e morte por neutrófilos em detrimento daqueles
com genótipos menos frequentes (Aarestrup et al. 1995). Em trabalho desenvolvido por Reinoso et al (2008) foram detectados cinco perfis com amplicons de 400pb (2/15),
500pb (3/15), 600pb (3/15), 900pb (6/15) e de 1000pb (1/15) de isolados de S. aureus oriundos de mastite bovina na Argentina. Aslanta et al. (2007) amplificaram o gene coa
de 80 isolados de S. aureus oriundos de mastite bovina na
Turquia com tamanhos de 730-1050 pb, sendo os produ
-tos de 730 e 970 bp os mais freqüentes (38,8% e 41,3%,
respectivamente). Portanto, acredita-se que a prevalência
de amplicons com tamanhos entre 600 e 900pb envolvidos em casos de mastite bovina sugere que estes sejam os per
-fis mais virulentos e mais competitivos relacionados a este tipo de infecção.
Todos os isolados de S. aureus foram positivos para o gene rnaIII (n=38)., e apresentaram bandas de 200pb. Esse
gene, localizado no locus agr, codifica a molécula RNAIII e regula pelo menos 15 genes que codificam fatores de viru
-lência. Os mutantes Agr não patogênicas, são relacionados com a diminuição da síntese de toxinas extracelulares e en -zimas, e são, ao mesmo tempo, relacionado a um aumento
da síntese de moléculas de adesão, tais como coagulase e proteína A (Coelho et al. 2011).
Após a avaliação da frequência dos fatores de virulên
-cia analisados de forma separada e considerando as espé
-cies identificadas, as regiões foram caracterizadas quanto à presença de isolados potencialmente virulentos (Quadro 3). Nas quatro regiões de estudo (Rio Claro, Piraí, Paracam
-bi e Seropédica), os fatores de virulência com elevada fre
-quência foram a produção de “slime” e de caseinase. Estes podem ser, portanto, os fatores que caracterizam as cepas circulantes nestas regiões. A região de Paracambi foi a que apresentou elevada frequência de todos os fatores de viru
-lência quando comparado às outras regiões e uma maior detecção dos genes de fibronectina e cápsula, reflexo da
alta incidência de S. aureus. Esta espécie, quando associada
à mastite bovina, é caracterizada por apresentar uma alta variação de genes de virulência, bem como uma conside
-rável diversidade populacional. Sendo que, alguns genes codificadores de fatores de virulência são frequentemente
Quadro 3. Comparação dos fatores de virulência de
Staphylococcus spp. isoladas de leite mastítico de
propriedades leiteiras localizadas no Sul-fluminense entre outubro/2009 e março/2011 por região de estudo
Fatores de Regiões
virulência Rio Claro Piraí Paracambi Seropédica
(n=135) (n=36) (n=43) (n=36)
“Slime” 72,6 86,1 65,1 97,2
icaA 12,6 5,5 37,2 8,3 icaD 16,3 22,2 39,5 19,4
SHA 50,4 22,2 11,6 30,5
Hemolisina 8,9 2,8 27,9 22,2
hla 12,6 11,1 51,2 13,9 hlb 12,6 8,3 46,5 13,9
Dnase 25,2 36,1 27,9 25,0
Caseinase 60,7 88,9 62,8 69,4
cap5 3,7 5,5 7,0 0,0
cap8 0 0 14,0 11,1
fnbA 25,2 27,8 69,8 22,2
detectados, enquanto outros são ausentes ou raramente
es-tão presentes (Ote et al. 2011).
A partir dos resultados obtidos dos testes fenotípicos e genotípicos dos fatores de virulência foi possível estabe
-lecer 105 perfis distintos, dificultando o estabelecimento de clones específicos circulantes em cada região. Apenas os ECNs com perfil cuja característica é a positividade para caseinase e produção de “slime” (Perfil 1) se apresentaram prevalentes em todas as regiões. Este perfil também foi de
-tectado com elevada frequência em isolados de S.aureus da região de Rio Claro e ECPs das regiões de Rio Claro e Piraí, apontando para a importância destes fatores de virulência
no desenvolvimento da mastite.
A tipagem molecular através da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) foi realizada utilizando 50%
(19/38) dos isolados de S. aureus deste estudo. Depois da
digestão do DNA dos isolados com a enzima de restrição SmaI, foi possível a detecção de 6 perfis genéticos distintos (A-F). Os perfis A e B foram formados por 2 isolados cada um, os perfis C, D e E por 3 isolados cada um e o perfil F formado por um único isolado. Cinco (5) isolados não fo
-ram possíveis de tipar por esta técnica, destes, 4 isolados não foram cortados pela enzima Sma1 e 1 isolado quando
submetido ao campo pulsante originou um perfil do tipo rastro. Esta técnica de genotipificação apresenta alto poder
de discriminação e reprodutibilidade. Contudo, é uma téc-nica de custo elevado, onde são necessários, além de
pesso-al qupesso-alificado e materiais específicos, vários dias de análise
(Dendani et al. 2010).
Foi possível observar uma acentuada diversidade de
clones de S. aureus nas propriedades leiteiras avaliadas
na região Sul-Fluminense do Estado do Rio de Janeiro, não tendo sido detectado um perfil predominante nos isolados estudados. Rabello (2007) detectaram 16 perfis ao anali -sar 106 cepas de S. aureus isolados de 9 fazendas distintas do Estado do Rio de Janeiro, sendo um dos perfis com seus subtipos predominante em 54,2% dos isolados e presente em 66,7% (6/9) propriedades avaliadas.
Ao correlacionar os perfis eletroforéticos do DNA cro
-mossomal encontrados através do PFGE com os genes de virulência detectados por PCR, foi feito um agrupamento considerando os genes presentes em todos os isolados que apresentaram o mesmo perfil. Foi observado que os genes hla, hlb, cap5 e fnbA estavam presentes nos dois isolados
que apresentaram o perfil A; os genes icaA, icaD, hla, hlb e fnbA estavam presentes nos dois isolados que apresenta-ram o perfil B; os genes icaD, hla, hlb, fnbA e fnbB estavam
presentes nos três isolados que apresentaram o perfil C; os
genes icaD, hla, hlb, e fnbA estavam presentes nos três
iso-lados que apresentaram o perfil D; os genes hla, hlb e fnbA
estavam presentes nos três isolados que apresentaram o
perfil E. O perfil F foi verificado em apenas um isolado e apresentou prevalência dos mesmos de genes de virulência
observado no perfil D (Quadro 4). De modo geral, foi obser
-vado que a presença ou ausência dos genes de virulência
estudados não estavam relacionadas com os distintos
per-fis eletroforéticos. A grande diversidade genética observa
-da nos isolados demonstra a existência de diversos clones circulantes. Foi observado ainda que os genes de virulência
avaliados dentro do presente estudo não parecem
contri-buir para gerar discriminação entre os perfis obtidos. Estudos epidemiológicos baseados no polimorfismo dos genes coa e spaA tem demonstrado que isolados de S. aureus podem ser divididos em subtipos (El-Sayed et al.
2006). No presente estudo, ao correlacionar a análise do
polimorfismo dos genes spaA e coa com os perfis eletro
-foréticos obtidos por PFGE pode-se observar que apenas os perfis A e C, considerando o polimorfismo do gene spaA e os perfis A, B e D, considerando o polimorfismo do gene coa, tiveram similitude, indicando um alto grau de hetero
-geneidade do gene coa e spaA em S. aureus (El-Sayed et al. 2006, Karahan & Cetinkaya 2007). Já o gene agr não pode
ser usado na discriminação das cepas de S. aureus neste es-tudo, pois amplificou fragmentos de mesmo tamanho (200
pb).
O uso de técnicas moleculares adicionais e o estudo das demais cepas de estafilocócicas seriam necessários para um maior aprofundamento do estudo epidemiológico des
-Quadro 4. Perfis encontrados através de PFGE e detecção dos genes de virulência por PCR em Staphylococcus spp. isoladas de leite mastítico de propriedades leiteiras da
região Sul-fluminense de outubro/2009 a março/2011 Perfil Isolados Genes de Virulência detectados por PCR***
PFGE** icaA icaD hla hlb cap5 cap8 fnbA fnbB spa A (pb*) coa (pb*) agr (pb*)
A 5C (-) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (-) 300 600 200 21B (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (-) 300 600 200 B 225A (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) 100 500 200 243A (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) 300 500 200 C 186C (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) 100 500 200 241C (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) 100 600 200 251A (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) 100 450 200 D 147A (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-) 200 500 200 272B (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) 200 500 200 273C (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) 300 500 200 E 253E (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) 300 550 200 254B (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (-) 320 600 200 252A (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) 250 450 200 F 245B (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) 320 600 200 * pb = pares de base. ** PFGE = Eletroforese em Gel de Campo Pulsado. *** (+) presença do gene, (-) ausência
tes clones, pois o conhecimento dos fatores de virulência
de estafilococos isolados de rebanho leiteiro, pode ajudar a formular estratégias que reduzam a disseminação da infec
-ção (Linehan et al. 2003).
CONCLUSÕES
Os fatores de virulência prevalentes em Staphylococcus spp. foram produção de “slime” e caseinase, sendo S. aureus a espécie que apresentou maior expressão fenotípica de fa
-tores de virulência, bem como maior amplificação de genes relacionados à codificação desses fatores, o que ressalta o potencial patogênico deste microrganismo.
A região de Paracambi apresentou elevada frequência de todos os fatores de virulência quando comparado às ou
-tras regiões de estudo. O grande número de perfis gerados a partir dos testes fenotípicos e genotípicos de detecção dos fatores de virulência dificultou o estabelecimento de clones específicos circulantes em cada região.
A tipagem molecular através da PFGE de S. aureus não detectou um perfil eletroforético predominante e a pre
-sença ou ausência dos genes de virulência estudados não contribuiu como critério discriminatório entre os perfis obtidos, confirmando a acentuada diversidade de clones
circulantes desta espécie nas propriedades leiteiras avalia-das.
Agradecimentos.- À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ní -vel Supeior (CAPES) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo apoio financeiro.
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