RODRIGO RODENBUSCH
ANÁLISE DE SNPs EM GENES DE PIGMENTAÇÃO HUMANA EM INDIVÍDUOS COM ALTO OU BAIXO CONTEÚDO DE MELANINA
Tese apresentada como requisito para a obtenção do grau de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Biociências da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Orientador
Profa. Dra. Clarice Sampaio Alho
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer à minha orientadora Profª. Drª. Clarice Sampaio Alho, que tive a oportunidade e alegria em ser seu primeiro aluno de Iniciação Científica na PUCRS, onde durante estes mais de 15 anos levei não só ensinamentos profissionais mas também ensinamentos para a minha vida pessoal.
Aos queridos colegas e amigos do Laboratório de Investigação de Paternidade, agradeço por toda a compreensão e apoio durante os momentos de ausência, momentos estes essenciais para a execução deste trabalho. Agradeço, principalmente ao colega André Gastaldo, pela ajuda nas correções da língua portuguesa.
Às bolsistas, e hoje mestrandas, Thayane Rispoli e Mayara Jorgens Prado, pela ajuda nas coletas e parceria nas viagens pelo Estado, a fim de conseguirmos todas as amostras necessárias para esta pesquisa. Aos colegas, do LabGen da PUCRS, Diego Gubert, Fernanda Sawitzki, Eduardo Capelesso e Bruna Schroeder Oliveira, por abraçarem esta causa da predição fenotípica e ajudarem em todas as etapas da coleta e validação da mesma. Agradeço também por toda ajuda com o levantamento populacional dos bancos de dados de frequência e conferência dos mesmos; ao Eduardo por passar horas organizando, normalizando e formatando as fotos dos olhos dos indivíduos, tarefafa esta que foi muito ardúa.
À minha família, pela base e apoio durante as horas de inquietude em busca de amostras, de resultados contundentes e na preparação dos seminários de acompanhamento. Pela vibração deles pelas minhas conquistas.
Agradeço do fundo do meu coração, à minha mãe Sirlei (in memoriam), pelo carinho incondicional, pelas incontáveis noites que passamos no hospital, onde eu, nervoso, preparando os seminários, tinha o seu apoio sempre dizendo que daria tudo certo. Embora ela não esteja mais neste plano conosco, sei que está muito orgulhosa do caçula dela.
Ao meu filho Vinícius Rodenbusch, agradeço pelo carinho e ao mesmo tempo me desculpo pela ausência em alguns momentos durante a execução deste trabalho. Filho, tu és uma das pedras
fundamentais que sustentam a minha saúde afetiva.
Por fim, e não menos importante, à minha esposa, Jéssica Pegoraro Rodenbusch, agradeço pelo amor e compreensão ao longo desta caminhada, pelo incentivo e por nunca me deixar desistir nos momentos de maior aflição. Agradeço também a ela e a Deus pela chegada nos próximos meses da nossa filha Valentina, que será muito amada pelos seus pais e iluminará nossa família.
RESUMO
A compreensão da função e expressão dos genes envolvidos nos traços externamente visíveis (EVC; do inglês externally visible characteristics) têm sido amplamente utilizada em vários estudos de evolução humana e investigações forenses. Para este último propósito, vários esforços têm sido feitos para descobrir um modelo eficiente e fácil para a predição da cor da pele e dos olhos em seres humanos. A vantagem óbvia da predição de tais EVCs, através da utilização do DNA, é sua incorporação na rotina em laboratórios forenses, sendo assim aplicada em investigações policiais. Em nosso estudo, relacionamos o genótipo de oito SNPs em genes relacionados com a pigmentação (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) com diferentes abordagens analíticas. Este painel de SNPs considerou as frequências alélicas obtidas de dados do HapMap e Alfred a partir de indivíduos com Alto Conteúdo de Melanina (HMC; do inglês High Melanin Content; a partir de populações africanas), e Baixo Conteúdo de Melanina (LMC; do inglês Low Melanin Content; a partir de populações europeias) e definiu os alelos H (para predizer os HMC) e alelos L (para predizer os LMC). A distribuição cumulativa dos alelos H e L nos dois grupos com
características de pigmentação fenotipicamente distintas, dos 134 indivíduos da nossa população, mostrou que 82% dos indivíduos HMC (N = 61) tinham oito ou mais alelos H e 100% dos indivíduos de LMC (N = 73) tinham menos de oito alelo H, com o valor de precisão de 96,3%. Outras abordagens como AUC (do inglês; Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), cálculo de PGL (do inglês; Pathway Genetic Load) e GP (do inglês; Genetic Probability) foram realizadas. A análise AUC foi de 0,99 tanto para a predição fenotípica dos HMC quanto LMC; as análises PGL, para o painel com 8 SNPs, teve 93% de concordância genótipo-fenótipo nos HMC ou LMC; e a abordagem GP mostrou 91% de concordância para predição dos fenótipos HMC e LMC. Nossa tecnologia de genotipagem de alto rendimento, combinada com diferentes abordagens analíticas, chegou a uma precisão muito alta para predizer os fenótipos extremos de
pigmentação humana. Acreditamos que esta técnica de fenotipagem forense pelo DNA (FDP; do inglês forensic DNA phenotyping), seria particularmente útil nos casos em que os perfis genéticos de locais de crime não fossem encontrados no bancos de dados de DNA ou para ajudar a classificar cadáveres degradados, esqueletos, ou vestígios biológicos de pessoas desaparecidas.
ABSTRACT
The understanding of gene function in the externally visible characteristcs (EVC) expression has several uses in human population evolution studies or in forensic investigations. To this last, some effort has been done to discover an efficient and easy model for prediction of skin and eye color in humans. The obvious advantage of the prediction of such EVCs through the use of DNA is to be incorporated as routine in forensic labs and to be applied to police investigations. In our study we combined the genotyping of eight SNPs in pigment-related genes (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) with different analytical approaches. Considering this SNP panel we evaluated allele frequencies from HAPMAP and ALFRED data obtained from subjects with High Melanin Content (HMC; from African populations), and Low Melanin Content (LMC; from European populations) and defined the alleles H (to predict HMC subjects) and alleles L (to predict LMC subjects). The cumulative distribution of alleles H and alleles L in two
phenotypically different color groups of 134 South Brazilian subjects showed that 82% of HMC subjects (N = 61) had eight or more allele H and 100% of LMC subjects (N = 73) had less than eight allele H, with accuracy value of 96.3%. We performed other analyses using AUC (Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), PGL (Calculation of Pathway Genetic Load), and GP (Genetic Probability) approaches. The AUC was 0.99 in predicting both HMC and LMC phenotypes; PGL showed the eight SNPs panel had 93% of
concordance between genotype and HMC or LMC phenotypes; and GP approach showed 91% of concordance between prediction and HMC or LMC phenotypes. Our high-throughput genotyping technology combined with different analytical approaches reached very high accuracy to predict the extreme phenotypes of human pigmentation. We believe this forensic DNA phenotyping (FDP) technique would be particularly useful in cases in which the genetic profiles of crime scenes were not found in the DNA data banks or to help classify degraded cadavers skeletons, or biological clues of dismissed people.
LISTA DE ABREVIATURAS
EVC Características externamente visíveis; do inglês externally visible characteristcs SNP do inglês, Single Nucleotide Polymorphism
HMC Alto conteúdo de melanina; do inglês High Melanin Content LMC Baixo conteúdo de melanina; do inglês Low Melanin Content AUC do inglês Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve
PGL do inglês Pathway Genetic Load
GP do inglês Genetic Probability
FDP fenotipagem forense pelo DNA; do inglês Forensic DNA Phenotyping MC1R do inglês, melanocortin 1 receptor
ASIP do inglês, Agouti signaling protein
MATP do inglês, Membrane associated transporter protein SLC45A2 do inglês, Solute Carrier Family 45, member 2 SLC24A5 do inglês, Solute Carrier Family 24, member 5
TYR do inglês, Tyrosinase
TYRP1 do inglês, Tyrosinase-related protein 1 OCA2 do inglês, Oculocutaneous albinism type II
HERC2 do inglês, HECT domain and RCC1-like domain-containing protein 2 VNTR do inglês, Variable Number of Tandem Repeat
STR do inglês, Short of Tandem Repeat
AIM do inglês, Ancestry Informative Marker PCR do inglês, Polymerase Chain Reaction
CREB do inglês, cyclicAMP response-element binding protein MITF do ingles, Microphthalmia-associated Transcription Factor
DQ dopaquinona
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 - APRESENTAÇÃO DO TEMA E OBJETIVOS 01
1- REFERENCIAL TEÓRICO 01
1.1 Importância da Predição de Fenótipo 02
1.2 Biologia da Pigmentação 02
1.2.1 Melanogênese ____ 02
1.2.2 Pigmentação da Pele 04
1.2.3 Pigmentação do Olho 05
1.3 Pigmentação e Ancestralidade 06
1.4 Genes e SNPs Envolvidos na Determinação de Pigmentação de Pele e Olhos 08
1.4.1 Gene HERC2: rs916977 e rs12913832 09
1.4.2 Gene OCA2: rs4778138 10
1.4.3 Gene SLC24A5: rs1426654 11
1.4.4 Gene SLC45A2: rs16891982 12
1.4.5 Gene TYR: rs1042602 12
1.4.6 Gene TYRP1: rs2733832 13
1.4.7 Gene MC1R: rs8045560 13
1.5 Frequências alélicas dos SNPs em populações Africanas e Européias 13
2- OBJETIVOS 15
CAPÍTULO 2 - ARTIGO CIENTÍFICO 16
CAPÍTULO 3 - CONSIDERAÇÕES FINAIS 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44
CAPÍTULO 1 - APRESENTAÇÃO DO TEMA E OBJETIVOS
1- REFERENCIAL TEÓRICO
Ao longo dos anos foram implantadas diferentes técnicas a fim de caracterizar e individualizar pessoas, como por exemplo os exames antropométricos, impressões digitais e estudos envolvendo marcadores genéticos e bioquímicos (STRs, VNTRs, polimorfismos dos sistemas HLA, ABO e de outras proteínas séricas) (Kobachuk, 2012). Os marcadores moleculares conhecidos como STRs (Short tandem repeat) são altamente polimórficos e amplamente utilizados na identificação humana em casos forenses há quase trinta anos (Jobling et al., 2004). Na atualidade, o uso dos marcadores STR é muito vasto no sistema forense, sendo aplicado nos casos de identificação forense criminal e em testes de paternidade ou parentesco (Yoshida et al., 2011). A confiabilidade elevada do resultado de uma análise de STR permite que ele seja usado como prova respeitável nos processos penal ou cível. Além disto, análises conjuntas de marcadores moleculares do tipo SNPs (single nucleotide polymorphisms) podem também auxiliar na identificação humana, pois permitem a obtenção de perfis genômicos únicos para cada indivíduo (Kobachuk, 2012). SNPs, que representam a classe mais abundante de polimorfismos humanos, podem servir tanto para a discriminação individual como para a predição de Características Externas Visíveis (EVCs). Sua abundância é a principal razão do grande interesse atual no campo forense; e o mapeamento do genoma humano tornou possível o desenvolvimento de mapas de genótipos e de haplótipos que podem caracterizar fenotipicamente um ser humano (Stacey et al., 2002).
Entre as EVCs, a variação de pigmentação em humanos tem sido um bom alvo. Mutações polimórficas do tipo SNPs, podem determinar substituições de aminoáciodos na proteína, alterando as propriedades funcionais da proteína traduzida e sendo expressa em fenótipos distintos (O’rahilly, 2009). Os traços fenotípicos mais promissores para a identificação forense são aqueles relacionados à pigmentação da pele, olhos e cabelos, por serem características muito marcantes, de fácil visualização e constituírem um dos fenótipos mais variáveis na população humana (Jablonski e Chaplin, 2000; Sturm et al., 2001; Parra, 2007; Kayser e Schneider, 2009). O desenvolvimento de técnicas quantitativas para mensurar a
pigmentação proporcionou uma maior objetividade na classificação da ampla variação de pigmentação existente, permitindo identificar de forma mais precisa os genes que de alguma forma exercem influência sobre essa característica (Jablonski, 2004).
Apesar de ser promissora a utilização de marcadores genéticos de traços fenotípicos na
identificação humana para fins forenses, a descrição de genes e do mecanismo pelo qual eles influenciam a definição das características fenotípicas é de difícil elucidação, uma vez que essas características
apresentam um padrão de herança complexo, por serem determinadas por múltiplos genes (poligenia) e por sofrerem forte influência do meio ambiente (Sturm e Larsson, 2009). Não obstante, estudos
2008) se forem avaliadas as variantes genéticas adequadas (Liu et al., 2009). Nós estamos, neste momento, tentando identificar quais são, portanto, elas.
1.1 – Importância da Predição de Fenótipo
Estudos de associação genótipo-fenótipo sobre a cor do cabelo, a cor da íris e a pigmentação da pele têm identificado SNPs em genes diretamente envolvidos na síntese de pigmentos (Sturm, 2009; Walsh et al., 2011a; Walsh et al., 2011b; Walsh et al., 2013). Todos eles sustentam que há uma necessidade grande por parte dos órgãos policiais de possuir uma base de dados com perfis genéticos que possam auxiliar na solução de crimes, excluindo ou inserindo indivíduos em processos criminais que buscam
identificar suspeitos ou vitimas (Pulker et al., 2007). Especialmente no caso de não se ter informações sobre o perfil genético de referência (para confronto de alelos de STRs), a amostra questionada pode ser
estudada para fins da predição do fenótipo do individuo (Kayser et al., 2011).
1.2 - Biologia da Pigmentação
Acredita-se que existam mais de 120 genes de alguma forma envolvidos nas vias de pigmentação, os quais agem em diferentes estágios do processo de produção da melanina (Sturm, 2006; Branicki et al., 2009). Tais genes agem em caráter quantitativo, influenciando cumulativamente nas diferentes tonalidades de coloração (Tully, 2007).
A compreensão da biologia da pigmentação depende do entendimento dos eventos intramelanos-somais. Os melanossomas (compartimentos sub-celulares, produzidos pelos melanócitos, que sintetizam e estocam polímeros de melanina) são os principais responsáveis pela coloração dos tecidos humanos (Sulem et al., 2007) por causa do seu conteúdo de melanina. Melaninas são produzidas em dois tipos distintos quimicamente: eumelanina (coloração castanho-preto) e feomelanina (coloração amarelo-avermelhada) (Ito et al., 2006). Eumelaninas são escuras, opacas e altamente polimerizadas (formato oval), enquanto que as feomelaninas, por possuírem sulfidrila e cisteína em seus passos de conjugação, são mais leves e menos polimerizadas (formato esférico), o que ocasiona uma deposição rândomica no lúmen. O acúmulo, a transferência, o conteúdo e a forma destes componentes estão diretamente ligados à intensidade da coloração de pele e de olho (Sturm, 2006; Kondo e Hearing, 2011).
1.2.1- Melanogênese
O regulador da síntese de melanina mais importante é o receptor de melanocortina 1 (MC1R). Na sua via, o MC1R ativa a CREB (cyclicAMP response-element binding protein) que aumenta a expressão de MITF (Microphthalmia-associated Transcription Factor) e sua ativação, por fosforilação, estimula a
Eumelanogênese: Após a produção de DQ a sua espontânea ciclização acontece, dando origem a ciclodopa, que então faz uma reação de redução com uma molécula de DQ, resultando em uma molécula de DOPAcromo e uma de DOPA (Land et al., 2003). O DOPAcromo, por sua vez, é decomposto
espontaneamente por descarboxilação em pH neutro para formar dihidroxindole (DHI) e ácido 5,6-dihidroxindole-2-carboxílico (DHICA) numa razão de 70:1 (Palumbo et al., 1987). A enzima DOPAcromo tautomerase (DCT) tautomeriza o DOPAcroma produzindo somente DHICA (Palumbo et al., 1991). DHI e DHICA são oxidadas e polimerizadas para dar origem a eumelanina (Figura 1B).
Feomelanogênese: A feomelanogênese se dá pela adição de cisteína na oxidação da DQ para produzir dois isômeros principais de DOPAcisteinila (CD): a 5SCD (do inglês 5-S-cysteinyldopa) e a 2SCD ((do inglês 2-S-cysteinyldopa). Ocorre uma troca redox entre a CD e a DQ para produzir CD-quinonas e DOPA. A desidratação da CD-quinona faz com que ocorra a ciclização dando origem a orto-quinona que é
rearranjada e forma o intermediário 1,4-benzotiazina, que se polimeriza dando origem a feomelaninas (Napolitano et al., 1994; Napolitano et al., 1999; Napolitano et al., 2000; Greco et al., 2009; Wakamatsu et al., 2009) (Figura 1C).
Figura 1 – Via biossintética da produção de eumelanina/feomelanina a partir de tirosina. As atividades da TRY, TYRP1 e DCT estão envolvidas na produção da eumelanina, mas apenas TYR e cisteína são necessários
para a produção de feomelanina a partir de DQ (Ito e Wakamatsu, 2010).
1.2.2- Pigmentação na Pele
2006). O número de melanócitos entre os diferentes tons de pele é constante, mas peles mais escuras apresentam melanossomas mais densos e individualmente dispersos, enquanto peles mais claras apresentam melanossomas menos densos e menores (Sturm et al., 2012).
Os melanossomas desenvolvem gradualmente o pigmento enquanto amadurecem (Slominski et al., 2004; Lin e Fisher, 2007; Ho et al., 2011). Após sintetizado, o pigmento é passado aos queratinócitos circundantes da pele e do folículo piloso (Sturm, 2006) e, por fim, para as células do epitélio pigmentar da retina (Kondo e Hearing, 2011). O acúmulo de melanina e a distribuição do melanossomas variam
quantitativamente entre indivíduos de diferentes grupos étnicos (Alaluf et al., 2002; Sturm, 2006). Os melanossomas são divididos em quatro estágios de maturação (I a IV), determinados pela sua estrutura, quantidade, qualidade e arranjo da melanina produzida (Kushimoto et al., 2001; Costin e Hearing, 2007) (Figura 2). O melanossoma no estágio I é uma organela esférica, com ausência da enzima tirosinase (enzima que promove a quebra da tirosina, formando os elementos precursores da eumelanina e feimelanina) e, ausência também, de componentes internos estruturais. No estágio II a organela apresenta uma estrutura ovoide, atividade de TYR e a expressão de uma proteína da matriz estrutural, conhecida como PMEL17, necessária para a produção da matriz fibrilar interna, e pela deposição mínima de melanina (Berson et al., 2001; Sturm, 2006; Costin e Hearing, 2007; Kondo e Hearing, 2011). No estágio III, a síntese de melanina é iniciada e o pigmento é depositado sobre fibras internas. No estágio IV de desenvolvimento, o
melanossoma apresenta formato elíptico ou elipsoide. Estes estádios de desenvolvimento referem à eumelanossomos (que sintetizam a eumelanina), e nos feomelanossomos (que sintetizam a feomelanina) o processo é similar com a diferença que durante o processo de maturação, há ausência de fibrilas (Costin e Hearing, 2007; Brenner e Berking, 2010).
Figura 2 - Esquema de um melanócito: O mecanismo para a produção da melanina. Os quatro estágios (I, II, III e IV) de desenvolvimento dos melanossomos são mostrados deslocando-se em direção à periferia da célula. À esquerda (ampliado) está um melanossomo maduro (estágio IV) onde se vê a via de síntese de
eumelanina e feomelanina de forma simplificada (Figura do autor). 1.2.3- Pigmentação no Olho
Os melanócitos dos olhos têm duas origens distintas, os que se encontram no epitélio pigmentoso da íris (IPE, do inglê iris pigment epithelium) que têm origem neuroectodérmica, e os melanócitos
migram através do trato uveal durante o desenvolvimento. Nas íris de coloração castanha existe uma abundância de melanina na camada basal anterior e no estroma, enquanto que nas íris de coloração azul essas camadas contêm muito pouco de melanina (Sturm e Larsson, 2009).
A íris, região ocular composta por tecido conectivo e muscular, é responsável pelo controle da entrada da luz incidente através de sua abertura central denominada pupila, regulando a formação das imagens na retina. Essa região é subdividida em cinco camadas, sendo a mais externa denominada borda anterior, seguida do estroma, esfíncter e músculos dilatadores e, mais internamente, o epitélio posterior pigmentado (Sturm e Frudakis, 2004). Dessas, a borda anterior e o estroma são as principais camadas contribuintes para a variação da coloração da íris (Wilkerson et al., 1996), uma vez que o epitélio posterior pigmentado apresenta a mesma pigmentação em todos as cores observadas, não contribuindo de forma relevante para a variação fenotípica final (Sturm e Frudakis, 2004). Íris de coloração marrom apresentam melanócitos com alto conteúdo de melanina na borda anterior e no estroma, enquanto em íris azuis, essas camadas possuem baixo teor de melanina, permitindo maior passagem da luz e consequente refletância de ondas curtas azuis pelas fibras de colágeno presentes. No estroma, os dendritos dos melanócitos são geralmente paralelos à superfície da íris, os quais tendem a se agrupar na borda anterior, e correspondem a aproximadamente 66% das células componentes dessas camadas, independentemente da coloração da íris (Wilkerson et al., 1996).
Ao contrário do que ocorre na pele, onde a melanina é continuamente produzida e secretada, os melanossomos da íris não são secretados dos melanócitos, mas sim retidos e acumulados no citoplasma destes. As variações na coloração observadas são resultado das diferentes quantidades e tipos de melanossomos presentes nos melanócitos, sendo a proporção de eumelanina/feomelanina geralmente maior em colorações mais escuras, e colorações mais claras apresentando maior concentração do pigmento feomelanina (Sturm e Larsson, 2009).
Sabe-se que, apesar de todas as colorações de olhos possuírem um número similar de
Figura 3 - Pigmentação dos olhos. Diferenças entre os tipos e quantidades de melanossomos nos melanócitos dos olhos mais claros aos mais escuros (retirado de Sturm e Frudakis, 2004).
1.3 - Pigmentação e Ancestralidade
Sabe-se que a pigmentação de pele e de olhos está ligada à evolução. Os seres humanos, diferente de outros primatas e mamíferos, não possuem pelos em todo o corpo. Uma explicação bem aceita à ausência de pelos é de que seria difícil a transpiração em lugares quentes e, assim, a regulação da temperatura seria mais eficiente na carência de pelos. Porém, a sobrevivência do indivíduo diante da quantidade reduzida de pelos na superfície do corpo implicaria na necessidade de uma proteção contra a radiação ultravioleta (UV). A principal via de proteção contra a luz UV é a presença de melanina na superfície da pele, a qual é capaz de absorver a radiação eletromagnética no comprimento das ondas ultravioleta resguardando assim, a integridade da moléculas de DNA, de proteínas e de outras macromoléculas (Rees, 2004; Liu et al., 2013).
Observando a diferença da pigmentação e a localização geográfica das populações humanas, pode-se estabelecer uma relação entre radiação ultravioleta, perda dos pelos e manutenção da pigmentação da pele pela evolução: a pele negra oferece uma proteção maior em ambientes com alta incidência de
radiação UV, como em locais de baixa latitude, enquanto a pele clara facilita a biossíntese de vitamina D em regiões de latitudes elevadas, onde a incidência de radiação UV é mediana ou baixa (Soejima et al., 2007). Sendo assim, acredita-se que a historia da transformação do fenótipo africano de pigmentação negra até o leque de variação melânica presente nos seres humanos de hoje se deu, pelo menos em parte, pela pressão seletiva da radiação solar, fixando-se o clareamento da pele mais em europeus e asiáticos, do que nos africanos (Liu et al., 2013).
pigmentos de pele e de olhos, independentemente da origem étnica da população em estudo (Kenny et al., 2012). Por exemplo, como será citado a seguir, o SNP rs12913832 do gene HERC2, o qual se encontra a 21kb upstream do promotor de OCA2, regula a expressão de OCA2 pelo dobramento da cromatina que permite o ancoramento dos fatores de transcrição de OCA2. O produto da expressão de OCA2, a proteína P, é essencial para a síntese de melanina. O alelo T (ou alelo A, considerando a fita complementar) do SNP rs12913832 ao permitir a abertura de cromatina, e o recrutamento dos fatores de transcrição de OCA2, induz à coloração mais escura, enquanto o alelo C (ou alelo G, considerando a fita complementar) mantém a cromatina mais fechada, tendo menos eficácia no recrutamento destes fatores, ocasionando uma coloração mais clara (Figura 4).
Figura 4- Modelo de determinação da cor de Iris castanho (A) e azul (B) influenciado pelo SNP rs12913832 do gene HERC2, segundo Sturm e Larsson, 2009.
Mesmo se localizando no interior de segmentos gênicos chave para a produção de melanina, poucos os alelos foram, contudo, já reconhecidos como sendo os próprios responsáveis pelo efeito variante de síntese de pigmento. Por não ter sido ainda completamente elucidada a implicação efetiva no fenótipo de cada variante alélica, algumas delas podem estar associadas à pele/olho escuro ou à pele/olho claro apenas por estarem em desequilíbrio de ligação com uma variante, de fato, fenótipo-efetiva. De todas as formas, em geral, têm sido usados para explicar a coloração escura aqueles alelos cuja frequência está mais elevada nas populações africanas negras (alelos originais/ancestrais) e os alelos derivados, cuja frequência está mais elevada nas populações europeias, para explicar a coloração clara. O desafio na análise da maioria dos SNPs ainda é saber se o marcador é de fenótipo ou de ancestralidade. No intuito de focar nos marcadores de fenótipo, têm sido retirados dos estudos associativos e/ou de predição de fenótipo aqueles alelos derivados (isto é, mutações polimórficas mais recentes) cujas frequências estão mais aumentadas nas populações africanas, como é o caso do alelo derivado (mais recente) do SNP rs26722 do gene SLC45A2 (regulador do pH que controla a via da síntese de melanina, no interior do melanócito). Algumas
al., 2005). Devido ao fato de o alelo original (G; Glu272) estar presente em grupos populacionais com diferentes fenótipos de pigmentação (caucasianos claros e aborígenes escuros), e ao fato de populações africanas de cor escura conterem ambas variantes (Lys272 e Glu272), Graf et al. (2005) concluíram que este polimorfismo não estaria associado com a determinação de pigmentação, mas sim que se trataria de uma variação associada à distribuição/isolamento geográfico. Assim, o alelo raro A surgiu como uma mutação recente apenas em africanos, e não interferiu na expressão da cor.
1.4 - Genes e SNPs envolvidos na determinação de pigmentação de pele e olhos
Mais de uma centena de genes com efeitos conhecidos já foram descritos em modelos animais e seus homólogos identificados em humanos (IFPCS, 2009). Esses genes podem ser divididos em grupos funcionais de acordo com a influência que seus produtos proteicos exercem na produção e regulação da pigmentação como segue: 1- genes que codificam fatores de crescimento e transcrição para o controle do crescimento e diferenciação dos melanoblastos em melanócitos; 2- genes que codificam proteínas
componentes dos melanossomos; 3- genes que controlam a biossíntese de organelas relacionadas; 4- genes que determinam a produção de eumelanina versus feomelanina e 5- genes envolvidos no transporte dos melanossomos.
Com base na literatura disponível, um estudo de revisão do nosso grupo selecionou oito SNPs em genes candidatos ao estudo de previsão de pigmentação em diversas populações, por estarem
significantemente relacionados com a manifestação da pigmentação em seres humanos. A base do nosso estudo foi: Tully, 2007; Sulem et al., 2007; Sturm et al., 2008; Branicki et al., 2009; Giardina et al., 2011; Walsh et al., 2011a; Walsh et al., 2011b, Donnelly et al., 2012; Allwood et al., 2013; Liu et al., 2013; Walsh et al., 2013. No Quadro 1, estão apresentadas informações acerca dos genes e SNPs por nós selecionados e, na Figura 5, se pode visualizar a localização de cada produto gênico ou estrutura em questão.
Adicionalmente, no ADENDO há informações detalhadas sobre cada SNP.
Quadro 1. Alguns Genes e SNPs para predição de pigmentação em Humanos
Gene Lócus Proteína rs Variação SNP
HERC2 15q13.1 HERC2 (350 aa) rs916977 Íntron 12 A>G rs12913832 Íntron 86 A>G OCA2 15q11.2 Proteína P (814 aa) rs4778138 Intron 1 G>A SLC24A
5
15q21.1 NCKX5 (500 aa) rs1426654 Ala111Thr 331G>A
SLC45A 2
5p13.2 MATP (530 aa) rs16891982 Leu 374 Phe 1122C>G
TYR 11q14 TYR rs1042602 Ser192Tyr C>A
Figura 5- Indicação na estrutura celular dos genes (citados no quadro1) e/ou seus produtos proteicos para predição de pigmentação em Humanos (Figura do autor)
1.4.1- Gene HERC2: rs916977 e rs12913832
O gene HERC2 (lócus 15q13.1) codifica a proteína HECT domain - RCC1-like domain-containing protein 2 (ou E3 ubiquitin-protein ligase HERC2) envolvida no tráfego de proteínas. Ainda que a função do gene HERC2 seja desconhecida, a sequencia de DNA no interior de HERC2 desempenha um papel estrutural no genoma e na regulação de pigmentação (Donnelly et al., 2012). De acordo com Sturm et al. (2008), a proteína HERC2 não está diretamente envolvida na síntese de pigmento, mas a sequência de DNA dentro da região do gene HERC2 controla a expressão do gene OCA2 o que, por sua vez, controla a produção de melanina (Sturm et al, 2008). Tais sequências no interior de HERC2 são enhancers do promotor do gene OCA2 (Visser et al., 2012).
cor de olho do que três SNPs já descritos no interior do íntron 1 do próprio gene OCA2 (rs7495174, rs6497268 e rs11855019) (Branicki et al, 2009). Estudos em outras populações também indicam o SNP rs12913832 como sendo o SNP com maior efeito na predição da cor de olhos (Allwood et al., 2013).
Adicionalmente, se observou que o alelo A do SNP rs1667394, localizado no íntron 4 do gene HERC2, tem um padrão de associação com cor de cabelo e de olhos em um gradiente de redução da pigmentação: menor frequência alélica em indivíduos com cabelos e olhos castanhos e com a maior frequência em indivíduos com cabelo loiro e olhos azuis. O alelo A é encontrado em uma frequência de 80-90% na população Norte da Europa (Sulem et al., 2007).
1.4.2- Gene OCA2: rs4778138
O gene que, ao conter mutações deletérias, ocasiona o albinismo oculocutaneo tipo 2 (gene OCA2), codifica uma proteína com 12 domínios transmembrana denominada proteína P (Sturm et al., 2008). Acredita-se que a proteína P esteja envolvida no transporte de ânions, na regulação do pH melanossomal (Visser et al., 2012), e que esteja envolvida no tráfego de proteínas internas como a tirosinase (TYR) e as proteínas associadas a tirosinase 1 (TYRP1) (Valenzuela et al., 2011). OCA2 por si só, independente de HERC2, também desempenha um papel na variação de coloração comum em olhos, cabelo e pele. Três SNPs que se encontram no intron 1 de OCA2 mostraram ter uma forte associação com a coloração dos olhos (Liu et al., 2013). Além disto, o SNP rs1800407 encontrado no exón 13 do gene OCA2 ocasiona uma troca do tipo Arg419Gln na sequência polipeptídica da proteína P (Donelly et al., 2012), esta troca aumenta a penetrância do fenótipo de olhos azuis associados ao SNP rs12913832 (Sturm et al., 2008; Walsh, et al., 2011a).
A proteína P, relacionada ao transporte de sódio/sulfeto (família SLC13), pode estar diretamente implicada na regulação do pH melanossomal (Kondo e Hearing, 2011). Foi observado que a proteína P atuava na permuta de cátions Na+/H+, e/ou como um transportador de glutamato. Ambas as funções indicam que este produto do gene OCA2 esteja envolvido no fornecimento de substrato para a TYR. A proteína P pode ainda estar envolvida no tráfego intracelular da enzima TYR, durante a maturação dos melanossomos (Eiberg et al., 2008). O pH do melanossomo regula a atividade da TYR afetando, portanto, uma série de fatores na síntese da melanina, como a taxa de produção de melanina, a proporção de eumelanina/feomelanina e a maturação de melanossomos nos melanócitos e células de melanoma. Resultados experimentais indicaram que a produção de melanina é ideal em ambiente celular com pH próximo a pH-neutro (cerca de pH= 6.8). Paralelamente, a síntese da melanina é quase ausente em pH menor que 5.5. Em um pH menos ácido, por outro lado, a melanogênese pode prosseguir sem qualquer alteração na abundância de proteínas melanogênicas (Ancans et al., 2001; Fuller et al., 2001).
1.4.3- Gene SLC24A5: rs1426654
Baseado no que se conhece do NCKX5 (Na+/Ca2+/K+ exchanger 5), a regulação do pH
melanossomal pode ser o papel da proteína codificada pelo gene SLC24A5 (Tully, 2007). O gene codifica uma proteína de 500 aminoácidos, que faz parte da família das proteínas envolvidas nas trocas de
sódio/cálcio dependente de potássio, localiza-se próxima à membrana melanossomal e atua no transporte de membrana do melanossomo (Sturm, 2006; Norton et al, 2007; Liu et al., 2013). Lamason et al. (2005) descobriram que NCKX5 está localizado em melanossomos ou seus precursores, e assumiram que ele poderia atuar acumulando Ca2+ no melanossomo. O gene SLC24A5 foi descoberto primeiramente em zebra-fish, no qual está relacionado ao fenótipo de uma listra clara significante. O homólogo foi identificado e caracterizado em humanos. O gene humano mostrou que uma substituição de Ala111Thr, resultante do SNP rs1426654 (de Ala111-alelo G para Thr111-alelo A) tinha um efeito similar na pigmentação humana, isto é, conferia redução de melanina (fenótipo claro). De acordo com Ginger et al. (2008) o SLC24A5 está associado com a rede trans-Golgi. Neste mesmo estudo, eles descobriram que o alelo G (Ala111) do SNP rs1426654, associado com pele mais escura, teve maior atividade de troca de íons em relação ao alelo A (Thr111), o qual está associado com pele mais clara. O alelo ancestral evolutivamente conservado (Ala111) do gene SLC24A5 também foi encontrado em alta frequência em populações africanas e asiáticas, e que o alelo derivado (Thr111) atingiu a fixação em europeus. Especificamente, a frequência para a variante Thr111 varia entre 98,7 e 100% entre as amostras da população de origem europeia, enquanto Ala111 tem uma frequência de 93-100% em amostras de africanos, nativos americanos e população do Leste Asiático (Dimisianos et al., 2008)
1.4.4- Gene SLC45A2: rs16891982
variante Phe374 (alelo C) pode alterar o transporte, o pH e a síntese do pigmento (Graf et al, 2005; Tully, 2007; Vierkötter et al., 2012). Nakayama et al. (2006) referiram o alelo C (Phe374) como alelo “tipo-Caucasiano”, já que ele resultou na redução da função da MATP, por alterar o tráfego intracelular de elementos melanossomais, criando um ambiente de decréscimo na produção de melanina. Estudando o mesmo gene, Graf et al. (2005) observaram que o alelo Lys272 do gene SLC45A2 mostrou um significante aumento nas populações asiáticas e afro-americanas quando comparadas a caucasianos. Contudo, as populações aborígenes australianas mostraram frequências alélicas similares às das populações de
caucasianos. Devido ao fato do fenótipo de pigmentação dos dois últimos grupos populacionais serem bem diferentes, os autores sugeriram que o polimorfismo rs26722 não estaria associado com a determinação de pigmentação, mas apenas seria uma variação associada à distribuição ou isolamento geográfico.
1.4.5- Gene TYR: rs1042602
O gene TYR transcreve a tirosinase, uma importante enzima para a fase inicial da melanogênese (Liu et al., 2013). O gene TYR foi indicado como um loci para a susceptibilidade ao vitiligo generalizado (Jin et al., 2012). Variações polimórficas em TYR estão diretamente associadas com alterações na coloração de olhos, cabelos e pele (Sulem et al., 2007). Em especial, dois polimorfismos de TYR, rs1042602 (Ser192Tyr) e rs1126809 (Ala402Gly), têm mostrado frequências alélicas associadas a fenótipos de diferentes colorações: alelos que aparecem em alta frequência em populações europeias e estão ausentes em populações
africanas (Stokowski et al., 2007). As análises enzimáticas in vitro revelaram que existe uma redução de aproximadamente 40% na atividade catalítica de tirosinase devido à variação Ser192Tyr (Chaki et al., 2011).
1.4.6- Gene TYRP1: rs2733832
Localizado no cromossomo 9p23, o gene TYRP1 codifica a proteína relacionada à tirosinase 1, que faz parte do complexo da enzima tirosinase durante a produção de melanina (Parra, 2007; Liu et al., 2013). O impacto da proteína TYRP1, assim como a da DCT, na estabilidade da proteína TYR e na produção de outras enzimas envolvidas na formação catalítica de melanina mostra que alterações no gene TYRP1 têm um papel importante na variação normal da pigmentação humana (Sturm, 2006). Há mais de dez anos, viu-se evidências que polimorfismos no TYRP1 estão associados à coloração de olhos em europeus (Frudakis et al., 2003). Estudos proteicos mostraram que a proteína codificada por TYRP1 foi encontrada estando elevada 2,6 vezes na pele de africanos e de indianos (com pigmentação escura) se comparada à pele de Mexicanos, Chineses e Europeus (com pigmentação clara) (Alaluf et al, 2003). Foi ainda observado que mutações raras (não polimórficas) em TYRP1 são responsáveis pelo albinismo oculocutaneo tipo 3 (OCA3) (Sulem et al., 2007).
1.4.7- Gene MC1R: rs8045560
peculiar de distribuição dos seus alelos entre as populações humanas: populações africanas e outras caracterizadas pela pele escura apresentam as menores variações alélicas desse gene, enquanto em populações asiáticas e europeias, esse gene é altamente polimórfico (Makova e Norton, 2005). Estudos em diferentes populações têm demonstrado que a região codificadora do gene MC1R apresenta mais de 70 variantes já identificadas (Gerstenblith et al., 2007), com impacto significativo no fenótipo de pigmentação (Harding et al., 2000; Strum, 2006).
O gene MC1R transcreve para o receptor de melanocortina 1 (MC1R), uma proteína-G localizada na membrana de melanócitos (Valenzuela et al., 2011) e diretamente responsável pela regulação da síntese de eumelanina/feomelanina (Makova et al., 2005). A ligação do hormônio paracrino alfa-estimulante dos melanócitos (α-MSH) ao gene MC1R causa uma cascata de sinalização de cAMP aumentando a produção de eumelanina (Makova et al., 2005; Valenzuela et al., 2011), enquanto que a ligação de seu antagonista, a proteína de sinalização agouti (ASIP), resulta em menos produção de eumelanina e no aumento da produção de feomelanina (Voisey et al., 2006; Liu et al., 2012).
1.5 - Frequências alélicas dos SNPs envolvidos na determinação de pigmentação de pele e olhos em populações Africanas e Europeias
O Quadro 2 apresenta uma levantamento realizado com dados de indivíduos oriundos de populações Africanas e Europeias descritas nos bancos de dados ALFRED (The ALlele FREquency Database) e HAPMAP. O ALFRED (da U.S. National Science Foundation) foi projetado para tornar os dados de frequência de alelos em amostras de populações humanas prontamente disponíveis para utilização pelas comunidades; e o projeto internacional HAPMAP é resultado de uma parceria de cientistas e agências de financiamento do Canadá, China, Japão, Nigéria, Reino Unido e Estados Unidos, que tem por finalidade desenvolver e manter um recurso público para ajudar pesquisadores a encontrar genes e estes SNPs resultantes de estudos populacionais. Consultando estas duas bases de dados, compilamos resultados de todas as populações já estudadas até maio de 2013.
Neste levantamento não foram consideramos dados de indivíduos oriundos de populações asiáticas devido a sua baixa representatividade na população do Rio Grande do Sul. Todos os dados foram plotados em uma planilha prévia para, finalmente, se obter o número total de indivíduos já genotipados e a
frequência de cada alelo. Estes dados estão apresentados no Quadro 2.
Quadro 2. Genes, SNPs (rs) e Alelos associados de pigmentação em Humanos, segundo sua frequência nos conjuntos de populações Africanas e Europeias estudados nos projetos HAPMAP e ALFRED.
Gene (SNP) Alelo PROJETO FREQ AFRICANOS FREQ EUROPEUS HERC2 (rs12913832): Alelo A HapMap 1.000 (120/120) 0.208 (47/226)
ALFRED 0.956 (4365/4568) 0.285 (7973/27945) HERC2 (rs916977): Alelo A HapMap 0.950 (114/120) 0.133 (16/120)
ALFRED 0.746 (1047/1404) 0.166 (945/5706) SLC24A5 (rs1426654): Alelo G HapMap 0.987 (223/226) 0.000 (0/116)
ALFRED 0.707 (2630/3720) 0.011 (49/4271) SLC452A (rs16891982): Alelo C* HapMap 1.000 (114/114) 0.017 (2/116)
ALFRED 0.919 (3478/3786) 0.071 (1840/25961) TYR (rs1042602): Alelo C HapMap 1.000 (120/120) 0.571 (129/226)
ALFRED 0.940 (1757/1870) 0.705 (3544/5026) TYRP1 (rs2733832): Alelo C HapMap 0.951 (215/226) 0.398 (90/226)
ALFRED 0.879 (181/206) 0.419 (447/1066) MC1R (rs8045560): Alelo C HapMap 0.951 (215/226) 0.465 (105/226)
ALFRED 0.909 (1225/1348) 0.438 (1624/3706) * Ou alelo G, considerando a fita complementar
2- OBJETIVOS
Objetivo Geral
Identificar e analisar os SNPs mais significativos para a previsão de pigmentação em humanos e medir suas frequências alélicas e genotípicas em indivíduos com fenótipo de alto ou baixo conteúdo de melanina em pelo e olhos.
Objetivos Específicos
I. Selecionar, na literatura científica, SNPs significativos para a previsão de pigmentação em humanos.
II. Identificar dois grupos de indivíduos fenotipicamente distintos: Grupo 1: indivíduos com muita pigmentação (olhos negros e pele escura); Grupo 2: indivíduos com pouca pigmentação (olhos azuis claro e pele muito clara).
III. Genotipar os SNPs selecionados em genes de pigmentação.
CAPÍTULO 2 - ARTIGO CIENTÍFICO
Analysis of eight SNPs in pigmentation-related genes in Southern Brazilian subjects with simultaneous high or low skin and eye melanin content.
ABSTRACT
The understanding of gene function in the determination of externally visible characteristics (EVCs) has several uses in human population evolutionary studies and in forensic investigations. With regards to the latter, a fair amount of effort has been made to discover an easy and efficient model for the prediction of eye and skin color in humans. The obvious advantage of the prediction of such EVCs through the use of DNA is that it can be incorporated as routine procedure in forensic labs and be applied to police
BACKGROUND
Different techniques, such as anthropometric examinations, fingerprinting and genetic
studies, have been largely implemented in order to characterize and individualize people. For nearly
twenty years, autosomal sets of short tandem repeat markers (STRs) and, more recently, single
nucleotide polymorphisms (SNPs) have been used for human identification in forensic cases [1].
SNPs, which represent the most abundant class of human polymorphisms, may determine amino acid
substitutions altering the functional properties of proteins and expressing distinct phenotypes [2].
SNP abundance has sparked the interest in forensics and the mapping of the human genome has
made possible the development of sets of genotypes and haplotypes that can phenotypically
characterize a human being [3]. Thus, SNP studies may serve for individual discrimination as well as
for the prediction of externally visible characteristics (EVCs). Among the EVCs, the pigmentation of
skin, eyes, and hair has become a good target for the prediction of phenotypes. Genotype-phenotype
association studies regarding iris and skin color have been focusing on detecting SNPs within genes
directly involved in the synthesis of pigments [4-16]. There are more than one hundred genes involved in the pigmentation process [17, 18] and they have a cumulative effect. However, for forensic purposes, despite the small number of known genes determining human pigmentary traits, it is possible to predict with high confidence the color of a person’s eye, hair, and/or skin based on this small number of DNA polymorphisms [19]. Thus, it is fair to say that some genes have alleles which can definitely determine the extremes of melanin pigmentation patterns, i.e. , light and dark
patterns.
In this work, we selected eight SNPs in seven genes that are linked to the melanin synthesis in
order to investigate their significance in skin and eye color phenotypes for forensic purposes. SNPs
were selected in the following human pigmentation associated genes: HERC2, OCA2, SLC24A5,
SLC45A2, TYR, TYRP1, and MC1R; SNPs in the first three were shown to significantly alter the melanin content in human melanocytes, supporting their functional role in pigmentation [20].
OCA2, rs4778138: The OCA2 gene encodes the P protein involved in anion transport and in
the melanosomal pH regulation, operating in the tyrosinase (TYR) and the tyrosinase related protein
1 (TYRP1) functions [21-25]; changes on OCA2 may interfere with melanin synthesis due to pH changes. The rs4778138 is a G>A SNP in the intron region of OCA2 and it is strongly associated with eye color [19].
HERC2, rs12913832: The Hect Domain and RCC1-like Domain 2 gene is located 10 Kb
recruitment of the OCA2 transcription factors, which leads to a darker iris, while the allele G (or allele C, if in the complementary DNA strand) maintains the chromatin closed, being less effective in recruiting the aforementioned factors, which results in a lighter iris [20, 23].
SLC45A2, rs16891982: The solute carrier family 45 member 2 gene encodes the MATP
protein [26], which plays a crucial role in the processing and intracellular trafficking of tyrosinase
(TYR) and of other enzymes necessary for the synthesis of melanin [18, 28]. The rs16891982 is the 1122C>G SNP in exon 5 of the SLC45A2 gene. This SNP results in the non-synonymous substitution of Leucine (allele C; codon TTG on the coding/reverse DNA strand) by Phenylalanine (allele G; codon TTC on the coding/reverse DNA strand) at amino acid 374 (Leu374Phe). The rs16891982 is associated with the normal variation of human skin pigmentation , since it regulates the MATP function; the
Leu374 variant (allele C – complementary to G on codon TTG on the coding/reverse DNA strand) plays an important role in the transport of protons, resulting in an optimum intramelanosomal pH,
which allows the activity of tyrosinase (TYR) and, consequently, the adequate production of
eumelanin (brow-black spectrum), while the derived Phe374 variant (allele G – complementary to C on codon TTC on the coding/reverse DNA strand) may change the transport, the pH and the synthesis of the pigment [28-30]. A strong association between rs16891982 and eye color has been reported [19, 27].
MC1R, rs8045560: MC1R gene transcribes the melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte stimulating hormone receptor), a G-protein located in the melanocyte membrane [24] which is directly responsible for the regulation of eumelanin / pheomelanin synthesis [19, 31, 32]. The MC1R
gene is the best characterized among the genes that influence the normal variation of human skin
pigmentation, and the ancestral allele C of rs8045560 (C>T SNP) is associated with darker skin populations [17, 31, 33].
SLC24A5, rs1426654: The solute carrier family 24, member 5, is responsable for the
accumulating Ca+2 in the melanosome [34, 35]. The rs1426654 (G>A SNP in the coding region of
SLC24A5 gene) results in non-synonymous substitution of Alanine (GCA) by Threonine (ACA) at amino acid 111 Ala111Thr. This SNP has shown evidence of natural selection; the derived allele A (Thr111) is associated with light skin pigmentation and is common in Europe, southwest Asia, and central Asia [25]. The ancestral allele (G allele; Ala111) is associated with darker skin [20, 36].
TYRP1, rs2733832: Located at 9p23, this gene encoding to tyrosinase-related protein 1, which is part of the enzyme tyrosinase in melanin production [4, 17, 19]. TYRP1 polymorphisms are associated with
coloring eyes in Europeans [37], and the presence of TYRP1 protein has been found to be 2.6 times higher
in the skin of Africans and Indians (darker pigmentation) than in the skin of Mexicans, Chinese, and
Europeans [38]. The ancestral allele C of rs2733832 (C>T SNP) is associated with darker skin populations.
TYR, rs1042602: TYR gene transcribes the tyrosinase, an important enzyme for the initial process of
melanogenesis [19]. Mutations in the TYR gene are associated with vitiligo susceptibility [39] and
changes in the color of eye, hair, and skin [4, 41]. The rs1042602 (C>A SNP) results in the non-synonymous substitution of Serine (TCT) by Tyrosine (TAT) at amino acid 192 (Ser192Tyr) and in a reduction of about 40% in the catalytic activity of tyrosinase [42]. The ancestral allele C is associated with darker skin populations.
HERC2, rs916977: The derived allele G of rs916977 (A>G SNP) has been associated with blue eyes [4, 43].
In this paper, we have processed different analyses with these SNP variants and genotyped subjects
from two southern Brazilian populations with either high or low melanin content using a multiplex system.
We used this panel to predict color phenotype for forensic uses.
MATERIAL AND METHODS
Design, subjects, and approval. This observational cohort study was conducted with data and DNA collected from adult subjects (over 18 years old) enrolled between March 1st, 2012 and October 31st, 2013. Subjects were selected based on their skin/eye phenotype characteristics. All subjects were from southern Brazil, an area that presents a distinctive genetic background: the majority of subjects were of European origin (Portuguese, Italian, Spanish, and German ancestry) and a smaller amount of individuals were of African origin [44]. A form containing information about gender, age, origin, place of birth and residence was filled out by all individuals. This COLOR-genotyping project was approved by the Research Ethics Committee of the Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul (protocol #11-05722, Of.CEP-0295/12 and Of.CEP-1041/12), and the informed written consent for the study was obtained from all subjects.
Skin Phenotyping. The skin color of each participant was identified using the Fitzpatrick score, ranging from Type 1 to Type 6, where: 1- Highly sensitive skin, always burns, never tans; 2- Very sun-sensitive skin, burns easily, tans minimally; 3- Sun-sun-sensitive skin, sometimes burns, slowly tans to light brown; 4- Minimally sun-sensitive skin, burns minimally, always tans to moderate brown; 5- Sun-insensitive skin, rarely burns, tans well; 6- Sun-insensitive skin, never burns, deeply pigmented. We also measured the skin amount of red (R), green (G), and blue (B) pigments in an inner and hairless portion (below elbow) of the right arm using the ACR-1023 (Instrutherm, São Paulo, Brazil), a battery-portable color analyzer equipment which employs a spectral analysis method to determine the color of the sample. Each R, G, and B values range from zero to 1023, where the minimum value (zero) represents the complete absence of color, and the maximum (1023), its complete presence. In this system, total white has a value of R=1023, G=1023, and B=1023, and total black has a value of R=0, G=0, and B=0. The RGB skin values of each person were measured three times and the average was recorded. The equipment was calibrated before each use by measuring a white plate. Potential subjects that reported having a recent or intense tan were excluded.
placed at a distance of 6cm ± 0.5cm from the subject’s eye, having its focus locked onto the central area of the iris. The images were taken in a room with standardized artificial light conditions. The participants wearing contact lenses were required to remove them. We measured both eye amounts of R, G, and B pigments by analyzing each photo with the software COLOURS [45]. A triangular-shaped representative area of the iris covering approximately 2.500 pixels was selected in each picture and the R, G, and B values of each pixel were measured on a scale of zero to 255, where the minimum value (zero) represents the complete absence of a given color and the maximum (255) represents its complete presence. To calculate the R value, the software divides the total amount of red pigment present in each pixel of the selected area by the product of 255 times the total amount of pixels in the same area. For example (Figure 1, picture on the right): 264002 / (255 x 2542) = 0.41 – as the total amount of red in the selected area is 264002 and the total amount of pixels in the same area is 2542. The same mathematical formula is used to G and B
calculations. In this system, total black has a value of R=0, G=0, and B=0, and total white has a value of R=1, G=1, and B=1. The RGB eye values were measured on both eyes and the average was recorded. The primary RGB values were then converted into HSV (hue, saturation, value of brightness) system values using standard formulas. HSV is a cylindrical-coordinate representation of points in an RGB color model. This representation maps the values into a cylinder (color wheel), where: the angle around the central vertical axis corresponds to hue (H) and the distance from the axis corresponds to saturation (S). The height corresponds to a third value (V), the system's representation of the perceived luminance (brightness) in relation to the saturation. Potential subjects with Heterochromia iridum (excessively different colored irises) were excluded from the experiment.
1.2 Kv, injection time of 23s, run voltage of 15Kv and run time of 1200s, in a capillary of 36cm. The analysis was performed using the GeneMapper ID software version 3.2.1 (Applied Biosystems). In order to confirm the genotyping system, we performed a sequence analysis in the ABIPRISM® 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) using the same designed primers in 10% of our sample.
Candidate SNP parameters: At each locus, we dubbed ‘allele H’ each of the alleles strongly
associated with subjects from African populations (individuals with High Melanin Content; HMC), and ‘allele
L’ the alleles strongly associated with subjects from European populations (individuals with Low Melanin
Content; LMC). Based on the SNP frequencies per locus available on the HAPMAP and ALFRED databases,
we constructed a 2 x 2 table with number of alleles, where: the True Positive (TP; correctly identified) was allele H in HMC subjects, True Negative (TN; correctly rejected) was allele L in LMC subjects, False Positive (FP; incorrectly identified or Type I error) was allele H in LMC subjects; False Negative (FN; incorrectly rejected or Type II error) was allele L in HMC subjects. We then calculated the following parameters: Sensitivity (ability to identify positive results) = TP / (TP + FN); Specificity (ability to identify negative results) = TN / (FP + TN); Predictive value to allele H in HCM subjects = TP / (TP + FP); Predictive value for the presence of allele L in LMC subjects = TN / (FN + TN); Relative risk (ratio of the probability of allele H in HMC group to the probability of allele H in LMC group) = [TP / (TP + FP)] / [FN / (FN + TN)]; and Odds ratio (to identify the probability of exposure and non-exposure) = (TP x TN) / (FP x FN). We calculated the sensitivity, specificity and accuracy values joying the set of all 16 alleles. The Accuracy value, or the detection of how the test correctly identifies or excludes the predicted phenotype, was calculated as = (TP + TN) / (TP + FP + TN + FN).
Area under the Receiver Operating Characteristic curve: A Receiver Operating Characteristic (ROC) curve was constructed by computing the sensitivity and specificity of the set of all 16 SNPs. The accuracy in this test was measured by the area under the ROC curve (AUC) with a parametric method using a maximum likelihood estimator. The AUC measures the ability of the set of SNPs to correctly classify those with and without the phenotype, as an overall measure for prediction accuracy. An area of 1 represents a perfect test; an area of 0.5 represents a worthless test. A recommended guide for classifying the accuracy would be 0.90-1 = excellent; 0.80-0.90 = good; 0.70-0.80 = fair; 0.60-0.70 = poor; 0.50-0.60 = fail.
Cluster analysis using STRUCTURE Software: We used the eight SNPs and the STRUCTURE software to estimate clusters among subjects. The STRUCTURE Software v2.3.4
(http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html; 47) analyses the data plotting probabilistically the individuals in K populations by characterization of the allele frequencies set in each locus. The individuals may be assigned in one, two or more populations if their genotype shows an admixed pattern. Our data file was composed by: row of makers (SNP and gene data), column of labels of each individual, column of population data (1 for HMC; 2 for LMC), and the genotype data. The ADMIXTURE MODEL and CORRELATED ALLELE FREQUENCIES MODEL were chosen because the admixture between populations is a common characteristic of real genetic data, since subjects may have recent ancestors in more than one population [48]. To estimate the K value, the data was analyzed with twenty replicates for K=1 to K=10, all runs were performed with 10,000 in period and 100,000 Markov Chain Monte Carlo (MCMC) repeats after burn-in, ADMIXTURE MODEL, CORRELATED ALLELE. The K values were estimated using the lnPr(X|K) values for each simulation. With these values, it is possible to calculate the probability for each K and estimate the best K [47]. The method used to estimate the value of K calculates the delta K and then selects the appropriate K value [49, 50]. Graphics were constructed using Clumpp [51] and Distruct [52] software.
RESULTS
Table 2 presents the allele frequencies of the selected SNPs – based on population data available
on the HAPMAP and ALFRED websites – obtained from African and European subjects (the database used
to construct Table 2 is shown in a Supplementary Excel file). An association Chi-square test was performed
to examine the relationship between allele frequencies in the aforementioned populations (Africans and
Europeans). There was a highly significant association between one of the alleles with Africans and the
other with Europeans for all the SNPs tested. We dubbed ‘allele H’ each allele strongly associated with
subjects with High Melanin Content (HMC; from African populations), and ‘allele L’ each allele strongly
associated with subjects with Low Melanin Content (LMC; from European populations). Considering the
relationship between alleles and populations, we calculated (as explained in Material and Methods) the
sensibility, specificity, predictive values, relative ratio, and odds ratio for each SNP present in table 1. The
eight SNPs in pigmentation-related genes presented remarkable results in all of the parameters and they
were considered robust markers for color prediction (Table 2).
We analyzed 134 southern Brazilian subjects belonging to two color categories: HMC – individuals
with high melanin content (N = 61) – and LMC – individuals with low melanin content (N = 73). The
phenotype data of these subjects is presented in Table 3. As expected by the previous selective sampling,
the clustering toward the color was evident between these two groups: the HMC group presented only
people with Types 5 and 6 of skin and eye classification, and with RGB values closer to zero (black); and the
LMC group presented only people with Types 1 and 2 of skin and eye classification, and with RGB values
closer to the highest values (white) (Table 3). However, the ancestral origin reported by the subjects was
they had European origin. We genotyped these 134 southern Brazilian subjects using the SNaPshot® Multiplex System with a set of eight primer pairs to analyze the eight target SNPs. Table 4 shows a highly significant association between ‘alleles H’ and HMC people, and ‘alleles L’ and LMC people. The other
parameters (sensibility, specificity, predictive values, relative ratio, odds ratio) were equally remarkable.
Although not dealing with such a clear ethnic background in our sample, the allele frequencies evaluated confirmed the eight SNPs as robust markers for color prediction.
To observe the cumulative distribution of alleles H and alleles L in our two phenotypically different color groups, we plotted the frequency data from southern Brazilian subjects considering the total number of each allele H per person in the two groups, comprised of 61 HMC subjects and 73 LMC subjects,
respectively. Figure 2 shows that LMC subjects had between zero and seven alleles H, while HMC subjects had between four and 14 alleles H. In our sample, no subject had 15 or 16 alleles H. The average of alleles H among the HMC subjects was 12.0 (SD=3.78) , and 82% (56/61) of the HMC individuals had eight or more alleles H. The average of alleles H among the LMC subjects was 3.3 (SD=1.49), and 96% (70/73) of the LMC individuals had up to five alleles H, and 100% had seven or less alleles H. Some results are especially interesting because they present a divergence between the quantity of alleles H and the phenotype
category: one HMC person had only four alleles H, one HMC person had five alleles H, two HMC people had
six alleles H and one HMC person had seven alleles H. The individual allele analyses of these five subjects
show that all loci were in some way involved in homo or heterozygosis, i.e. , there was no evidence of any
locus to explain the high skin/eye melanin content even with such few alleles H. We also analyzed one LMC
person (HC120) with seven alleles H: this person was homozygote HH to rs8045560 (MC1R) and heterozygote to rs4778138 (OCA2), rs12913832 (HERC2), rs2733832 (TYRP1), rs1042602 (TYR), and rs916977 (HERC2). The analysis of these people could be important to identify which loci are more critical to color prediction – however, a conclusion about the matter was not possible with the present data because of the size and heterogeneity of the sample.
different color groups we obtained the very high value of AUC at 0.9908 in the prediction of both HMC and LMC phenotypes (SE= 0.0088; IC 95% = 0.99736-1.0).
For another cumulative analysis, we used the Pathway Genetic Load (PGL) , which allows for a simultaneous evaluation of multiple loci with cumulative effect on the phenotype [46]. Individual unweighted PGL scores ranged from zero (homozygous for allele L at all eight loci) to 14, as previously shown in Figure 2. PGL weighted scores (PGL-WSs) for color were obtained by multiplying the allele H count (HH=2.0, HL=1.0, LL=0.0) per locus by its adjusted odds ratio (OR) – previously determined by HAPMAP and ALFRED data (presented in Table 2). For example: to the following loci rs4778138 (OCA), rs12913832 (HERC2), rs16891982 (SLC452A), rs8045560 (MC1R), rs1426654 (SLC24A5), rs2733832 (TYRP1), rs1042602 (TYR), and rs916977 (HERC2), the complete genotype of subject HC123 was, respectively: LL – LL – LL – HL – LL – HL – HH – LL. Using respective OR values by locus, we obtained to HC123 subject this values: PGL-WS= (0.0 x 14.81) + (0.0 x 54.26) + (0.0 x 103.28) + (1.0 x 13.38) + (0.0 x 226.12) + (1.0 x 15.47) + (2.0 x 7.37) + (0.0 x 29.73) = 43.59. The PGL analysis in all of the 134 southern Brazilian subjects showed that the individual PGL-WSs in HMC population ranged from 65.29 to 870.92, with the median in 567.37 (mean= 584.63; SD=262.46); and the individual PGL-WSs in LMC population ranged from zero to 148.40, with the median in 38.31 (mean= 44.80; SD=30.93). The PGL-WS for the eight SNPs tested were significantly
different between HMC and LMC groups (P<0.0001; Mann-Whitney Test), 95% (58/61) of the HCM subjects had the PGL-WSs higher than the maximum value among LMC subjects (148.40), and 88% (67/73) of the LCM subjects had the PGL-WSs lower than the minimum value among HMC subjects ( 65.29). Considering these two cut points (more than 148.40 to HMC, and less than 65.29 to LMC), the PGL analysis showed that the current eight SNPs genotyping system had 93% (125/134) concordance between genotype and HMC or LMC phenotype.
Based on the HAPMAP and ALFRED allele frequencies, we calculated each expected genotype
frequency to HH, HL, and LL genotypes, by locus, in HMC and LMC groups (Table 5). Then, we examined the
complete genotype of each South Brazilian subject and calculated the probability of the complete genotype
belonging to expected HMC and LMC groups. For example: to the following loci rs4778138 (OCA),
agreement with the actual HC123 phenotype data obtained: a male with light skin color (Type 2), dark blue eyes (Type 2), high R-G-B values to skin (317-239-200) and eyes (0.385-0.365-0.530), and of European origin.
We applied this model to predict color in the HMC or LMC phenotype categories based on the genotype probability (GP) in all 134 South Brazilian subjects; we observed that 80% (49/61) of the
genotypes of our HMC subjects had a higher chance of belonging to the HMC group than to the LMC group, with rates from 1.95 to 8.27 x 107 (mean= 7.92 x 106). Analyzing the genotypes of our LMC subjects, we noticed that 100% (73/73) had a higher chance of belonging to the LMC group, with rates from 1.46 x 104 (in subject HC120, with seven alleles H) to 7.77 x 1012 (mean= 2.02 x 1011). This GP analysis using the current eight SNPs genotyping system showed 91% (122/134) concordance between predicted and observed HMC or LMC phenotype.
As a complementary approach, we used the eight SNPs and the STRUCTURE software to estimate clusters among subjects. The program assigned to each subject a value, which represented the probability of belonging to each of two phenotypic clusters. This value clustered the subjects into HMC or LMC groups. Figure 3 shows the dot plot of probability values in each phenotypic cluster; the set of SNPs separated the individuals into the two extreme HMC or LMC groups indicating a substructure across the total population.
DISCUSSION
Forensic DNA phenotyping (FDP, a relatively young field within forensic genetics, aims to predict appearance traits of a sample donor from DNA left behind at a crime scene; an efficient FDP technology would be especially useful in cases where the Police have no clues (including conventional DNA profiling) as to who the crime scene sample donor might be [5]. As with other applications of DNA data in the forensic arena, FDP has to be backed up by the legislation as, for instance, is currently the case of forensic DNA-based eye color prediction in the Netherlands [19]. Skin and eye color are important externally visible traits (EVTs) in forensics, since they are highly heritable genetic traits and are the most obvious and distinguishing externally visible characteristics to be used in human identification.
Melanin is gradually produced in melanosomes inside melanocytes. Although the number of
melanocytes in different skin colors is essentially constant, the distribution of melanosomes is not so, as
darker skins have denser and individually dispersed melanosomes, while lighter skins have less dense
melanosomes [54]. In the eyes, pigments are distributed in the epithelium and in the stromal cells of the
iris; brown iris has an abundance of melanin while blue iris contains low levels of melanin allowing light
transmittance and reflectance which results in a blue shortwave due to the presence of collagen fibers.
Variations in both skin and eye color also result from the ratio of eumelanin/pheomelanin [55] and are
strictly connected to human evolution as well. The presence of melanin is an important protection against
ultraviolet radiation (UV): darker skin provides greater protection in environments with high UV radiation
(high latitudes) [56]. Since pigmentation and ethnicity are correlated, it is important to understand if the
presence of a particular allele in populations with high or low melanin content could be directly used in
determining phenotypic pigmentation or if it is only a marker of ancestry.
It is still unclear whether a gene is expressed only in the skin or only in the iris, and for this reason we have selected subjects with HMC or LMC in both skin and eye phenotypes. Our results for the
association study, sensibility, specificity or accuracy parameters, or the final analysis using different interpretation models would still have been the same even if only the eye color data had been considered. We have, nonetheless, preferred to work, in a first moment, with subjects with whole (skin and eye) HMC or LMC phenotypes, even though there are many Brazilian subjects with intermediary or ambiguous phenotypes, such as dark eye / light skin or light eye / dark skin. Further studies with the last subjects could select genes with preferential expression to skin or eye. In the same way, further studies with subjects with intermediate pigmentation phenotype should be mandatorily conducted. Although genetic markers have been informative to predict phenotypes in human pigmentation, this field of study still requires many efforts to be really applicable. Thus, we chose to design a panel that could at least detect the extreme phenotypes (subjects with high or low melanin content).
We have not analyzed the hair color because the melanin content in the hair is more strongly changed by intrinsic or extrinsic factors; hair color is also age-dependent , changing during late childhood, adolescence, adulthood, and old age, becoming darker, gray or white at any given stage [57]. These changes, added to the occurrence of baldness, make hair a not very useful trait to be useful for practical forensic DNA phenotyping applications.
Human skin and eye pigmentations are continuous traits and there is not a worldwide model to determine the limits of each mate category. However, in FDP studies, the use of categorized information about these continuous traits is inevitable. Thus, more accurate and more detailed pigmentation
determinations may guarantee better conclusions in these FDP studies [16, 19]. To avoid any mistakes in the true color categorizations and to concentrate on high accuracy and high level of detail in color
phenotype description, we have only worked with representatives of the two extremes of the continuous skin and eye color distribution. Considering only two extremely stratified groups of high (dark) and low (light) melanin content phenotypes and using reproducible methods to quantify the skin-eye pigmentation, we have obtained well-characterized information on both skin (using a surface color analyzer ) and eye color (using digital photographs and a specially designed color quantifier software).
