ASPECTOS IMUNOLÓGICOS DA CO-INFECÇÃO PELO
Mycobacterium leprae
E O VÍRUS DA
IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA.
São Paulo 2008
ASPECTOS IMUNOLÓGICOS DA CO-INFECÇÃO PELO
Mycobacterium leprae
E O VÍRUS DA
IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA.
Orientador: Prof. Dr. Esper Georges Kállas
São Paulo 2008
Ficha Catalográfica
Carvalho, KI
Aspectos Imunológicos da co-infecção do Mycobacterium leprae e o vírus da
imunodeficiência humana. / Karina Incaio Ladislau de Carvalho Salmazi. São
Paulo, 2008.123p.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Immune aspects in coinfection of Mycobacteirum lepare and
human immunodeficiency virus.
Aos meus pais pelo amor incondicional, incentivo e apoio, indispensável para a realização deste projeto e de muitos outros de minha vida.
Ao meu querido Cristiano, que com muito amor, compreensão esteve sempre presente. À minha filha Julia, que é a luz de minha vida.
Ao meu orientador Prof. Dr. Esper George Kállas, que me ensina a cada minuto, pela sua amizade, compreensão e por sempre procurar meu limite para tornar os trabalhos sempre melhores e mais completos.
Ao Prof. Dr. Douglas Nixon, pelo apoio e confiança, pelas oportunidades de interação e colaboração junto a sua equipe e principalmente pelas sugestões.
Ao Prof. Dr. Patrick Hasllett, pelo incentivo de trabalhar com hanseníase,
e por suas sugestões.
À querida amiga Daniela Santoro Rosa pelo seu apoio, por muitas discussões científicas e pela amizade maravilhosa.
À querida amiga Ana Lucia Girello sua fidelidade, incentivo e apoio durantes todos estes anos.
À minha querida amiga Maria Regina, que me iniciou neste processo de pesquisa, meu eterno agradecimento.
À minha querida amiga Jennifer Snyder-Cappione, pelo seu incentivo e ajuda.
À todos que fizeram e fazem parte do grupo Kallas Lab, pelo apoio e incentivo. Em especial a Helena Tomiyama, por sua paciência e ensinamento em todos estes anos.
À minha borbes Fernanda Romano Bruno pela cumplicidade e carinho
desses últimos tempos.
À minha querida amiga Mariana Melillo Sauer pelo carinho, apoio e incentivo.
À minha querida amiga Candida, que sua experiência é um brilho constante.
Ao grupo do Prof. Dr. Mauricio Rodrigues e Prof.Dr. Edécio Cunha-Neto, pelo apoio e incentivo, em especial a Susan Ribeiro pelo carinho e apoio.
Ao Issler Silva pelas informações importantes e por tantos favores que me prestou.
alegria, que foram importantes para a realização deste doutorado.
À todos os voluntários, pela compreensão, paciência e dedicação. Aos amigos que me apoiam e me alegram sempre.
LISTA DE ABREVIATURAS…..……….……. v
RESUMO………. vi
ABSTRACT………. viii
INTRODUÇÃO……… 1
OBJETIVOS……… 20
ARTIGOS PUBLICADOS OU EM PREPARAÇÃO: RESUMO 1………. 21
ARTIGO 22 “Immune cellular parameters of leprosy and human immunodeficiency virus-1 co-infected subjects.” RESUMO 2……….. 31
ARTIGO……… 32
“Lower Th1 cytokine secretion ex vivo by CD1d-restricted NKT cells in HIV-1-infected individuals is associated with high CD161 expression.” RESUMO 3……….. 46
ARTIGO……… 47
“NKT cells profile in HIV and leprosy coinfected patients.” CONCLUSÕES……….. 67
AIDS - Sindrome da imunodeficiência adiquirida
APC - Células Apresentadoras de antígeno
CCR - Co-receptores de quimiocinas
DNA - Ácido desoxiboribonucléico
Gp - Glicoproteína
HIV - Vírus da imunodeficiência humana
HLA - Antígeno leucocitário humano
IFN - Interferon
IL - Interleucina
MB - Multibacilar
MHC - Complexo major de histocompatibilidade
NK - Células natural killer
NKT - Células natural killer T
NRAMP1 - natural resistance-associated macrophage protein one
OMS - Organização Mundial da Saúde
PB - Paucibacilar
PACRG - Parkin co-regulated gen
PQT - Polioquimioterapia
TLR - Receptores do tipo toll
TCR - Receptor de células T
TNF - Fator de necrose tumoral
TR - Transcriptase reversa
RESUMO
As características da resposta imunológica em pacientes infectados pelo
Mycobacterium leprae e pelo virus da imunodeficiência humana (HIV) não estão
bem elucidadas. O objetivo geral desta tese foi avaliar diferentes parâmetros imunológicos na interação destas doenças.
Inicialmente avaliamos a imunidade celular em quatro grupos de pacientes dividos em: indivíduos saudáveis, monoinfectados pelo
Mycobacterium leprae, monoinfectados pelo virus da imunodeficiência humana e
coinfectados pelo M. leprae e HIV. Observamos que o grupo coinfectado
apresentou diminuição da razão de células CD4:CD8, aumento de níveis de ativação em células T CD8+, aumento da razão de células T V 1:V 2 e diminuição da porcentagem de células dendríticas plasmocitóides, comparadas com o grupo de indivíduos monoinfectados pelo HIV-1. A produção de IL-4 por linfócitos T CD4+ foi correlacionado positivamente com a porcentagem de subpopulações de memória efetora de células T CD4+, sugerindo diferenciação antigênica da população de células T em ambas as infecções de HIV-1 e M. leprae. A coinfecção por M. leprae pode exacerbar a imunopatologia da doença
induzida pelo HIV-1. Houve uma tendência na expressão de citocinas Th2 na resposta de células T CD4+ em ambas infecções de M. leprae e HIV-1, mas não
obtivemos efeitos aparentes nos pacientes coinfectados.
diminuição na magnitude da resposta com produção de citocinas Th1 pelas células NKT quando correlacionado com a expressão de CD161, sugerindo um mecanismo inibitório deste receptor na regulação da resposta de células NKT.
Por último, nós demonstramos que pacientes coinfectados tem redução da frequência de células NKT no sangue periférico, quando comparados com indivíduos saudáveis e pacientes monoinfectados pelo M. lepare. Por outro lado,
as células NKT de pacientes coinfectados secretam mais IFN- quando comparadas com pacientes monoinfectados pelo M. lepare. Estes resultados
ABSTRACT
The immune response characteristics in patients infected with
Mycobacterium leprae and human immunodeficiency virus (HIV) is not
elucidated. The aim of this study was to evaluate different immune parameters in the overlapping of both diseases.
In the first paper we observaded The co-infected group exhibited lower CD4:CD8 ratio, higher levels of CD8T-cell activation, increased V 1 : V 2 T cell ratio and lower percentage of plasmacytoid dendritic cells, compared to HIV-1 infected subjects. Across infected groups, IL-4 production by CD4T lymphocytes was positively correlated with the percentage of effector memory CD4 T cells, suggesting antigenically-driven differentiation of such T cell population in both HIV-1 and M. leprae infections. Co-infection with M. leprae may exacerbate the
immunopathology of HIV-1 induced disease. A T helper 2 (Th2) bias in the CD4 T-cell response was evident in both HIV-1-infection and leprosy, but no additive effect was apparent in co-infected patients.
Subsequently, we evaluated quantitatively and qualitatively the NKT cells from innate immune response in HIV-infected subjects and healthy controls. The frequencies of NKT cells secreting IFN- and TNF- were significantly lower in HIV-1-infected subjects and the magnitude of the IFN- production was negatively correlated with the number of years of infection, suggesting that NKT cell function is progressively lost over time. NKT cell responses in HIV-1 infected subjects were essentially normal after treatment with Phorbol12-Myristate13-Acetato (PMA) and ionomycin, suggesting that defective TCR-signaling was the underlying defect in the cytokine production. The lower levels of the NKT Th1 response correlated with higher CD161 expression, suggesting a role for this inhibitory receptor in regulating NKT cell responsiveness.
Finally, we have investigated the NKT cells in the context of HIV and M. leprae coinfection. The volunteers were enrolled into four groups: twenty-seven
1. HANSEN
Há muitos séculos a hanseníase tem passado uma imagem de horror e fascinação. Até os dias de hoje vários aspectos da doença permanecem obscuros e abertos à investigação científica.
A primeira descrição do bacilo da hanseníase foi realizada pelo médico norueguês Gerhard Henrik Hansen. Ele descobriu o bacilo em 1873 em nódulos lepromatosos e foi sua primeira idéia da etiologia da doença. Tentou demonstrar que a hanseníase era transmissível e acabou com uma ação criminosa. Em 3 de novembro de 1879, Hansen inoculou material proveniente de um nódulo hansênico em uma mulher. O experimento não alcançou o objetivo proposto, que era comprovar que a hanseníase era uma doença infecto-contagiosa. No entanto, Hansen estava convencido que era uma doença transmissível e colocou a primeira lei (1877 “Norweigian Leprosy Act”) de isolamento dos pacientes baseados em teorias não comprovadas de transmissão (Alter, Alcais et al. 2008)
A hanseníase é causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae) e
continua sendo um dos maiores problemas de saúde pública mundial (Cole, Eiglmeier et al. 2001). É um bacilo álcool-ácido-resistente, parasita intracelular obrigatório, possui tropismo por macrófagos e células de Schwann e cresce de preferência em regiões frias do organismo (Britton and Lockwood 2004). Além disso, é relativamente resistente e pode viver fora do corpo humano por cerca de 45 dias. O M. leprae é encontrado em abundância na mucosa do septo-nasal de
pacientes sem tratamento e provavelmente sobrevive no ambiente antes de infectar um novo indivíduo (Lockwood and Suneetha 2005). O único animal conhecido por hospedar o M. leprae é o Dasypus novemcinctus, conhecido
A hanseníase consiste em uma infecção crônica que afeta nervos periféricos e pele. As lesões nos nervos resultam em deformidades e/ou desabilidades sensoriais e motoras. Os bacilos da hanseníase parecem depender de produtos metabolizados pelo hospedeiro, fato este que poderia explicar a cronicidade da doença e a incapacidade de seu crescimento em culturas (Cole, Eiglmeier et al. 2001). O fato de ser um microorganismo que não é cultivado em cultura e ser uma doença de curso lento faz com que os estudos
in vitro e ensaios clínicos se tornem complexos (Britton and Lockwood 2004).
Nas últimas décadas, vários avanços foram obtidos no estudo da patogênese da hanseníase, enquanto mais de 11 milhões de pacientes foram tratados com o esquema de polioquimioterapia (PQT).
Nos dias atuais, é díficil obter-se classificação das formas clínicas universalmente aceitas, devido a discordância na valorização dos critérios habitualmente utilizados. Entre as classificações existentes, é importante fazer referência a Ridley e Jopling, que utilizam as características imunológicas dos indivíduos afetados e os classifica em um espectro que varia entre o pólo tuberculóide, onde há grande resposta imunológica celular ao bacilo, e o pólo lepromatoso, onde há uma anergia relativa ao M. leprae (Ridley and Jopling
planas, únicas ou múltiplas, e com alteração na sensibilidade (Organization 2007).
O exame baciloscópico auxilia na classificação do paciente. A baciloscopia deve ser realizada em todos com a suspeita clínica de hanseníase, embora nem sempre seja possível evidenciar o M. leprae nas lesões hansênicas
ou em outros sítios de coleta. O M. leprae apresenta-se sob a forma de
bastonete pela microscopia, na maioria das vezes reto ou ligeiramente encurvado ou, mais raramente, formando ângulos. Mede 1,5 a 8 micra de comprimento por 0,2 a 0,5 micron de largura. A hanseníase apresenta um amplo aspecto nas manifestações clínicas e histopatológicas. Biópsias realizadas em lesões de pacientes hansênicos do pólo PB, apresentam infiltração granulomatosa e raros bacilos. Aparentemente estes pacientes apresentam resistência ao M. leprae. Contudo, no pólo MB as lesões são nodulares, com
presença de muitos bacilos, com infiltrado de macrófagos espumosos (células de virchow) (Scollard, Adams et al. 2006).
Esta doença é tratada com o uso combinado de dapsona, rifampicina e clofazimina, que tem efeito direto na bactéria e minimiza o desenvolvimento de cepas resistentes a drogas (Alter, Alcais et al. 2008). A OMS recomenda tratar por 6 a 12 meses os pacientes com a forma paucibacilar e multibacilar, respectivamente (Tabela 1) (Organizaton 1982).
Tabela 1. Esquema de poliquimioterapia (PQT) recomendado pela Organização Mundial da Sáude.
Classificação da Hanseníase
Esquema de PQT Duração do
tratamento (meses)
Mensal Diário
Paucibacilar Rifampicina 600 mg Dapsona 100 mg 6
Multibacilar Rifampicina 600 mg Clofazimina 300 mg
Clofazimina 50 mg Dapsona 100 mg
Em alguns paises endêmicos, tais como Indonésia e Etiópia, mais de 5% da população apresenta o ácido desoxicoribonucleíco (DNA) do M. leprae nos
septos-nasais, mas essas pessoas não apresentam os sintomas clínicos da doença (Klatser, van Beers et al. 1993). Nas últimas décadas foi descrito que até 90% dos indivíduos expostos ao M. leprae permanecem assintomáticos (Convit,
Sampson et al. 1992; Chaudhury, Hazra et al. 1994; Gupte, Vallishayee et al. 1998), sugerindo que a progressão para a doença necessita de fatores adicionais.
A hanseníase, assim como outras doenças infecciosas, apresenta um fator causal (ex.: agente infeccioso) que é necessário, mas às vezes insuficiente para a manifestação clínica. Esta doença aparentemente necessita de fatores de risco adicionais, como meio ambiente e/ou genéticos (Alter, Alcais et al. 2008). Em 1973, pela primeira vez foram descritas alterações genéticas, marco para uma série de estudos que correlacionaram o desenvolvimento da hanseníase e a suceptibilidade genética (Shields, Russell et al. 1987; Abel and Demenais 1988; Abel, Vu et al. 1995).
O fator genético de susceptibilidade ao bacilo pode estar presente em dois níveis: imunidade inata ou adquirida. Um dos maiores avanços de associação da suceptibilidade genética à doenças infecciosas foi realizado em 2003 (Scollard, Adams et al. 2006). Com relação a imunidade inata, foi identificado que o locus específico PARK2, co-regulatório de PACRG (Mira,
Alcais et al. 2004) ou alterações na proteína NRAMP1 estão associados a susceptibilidade na doença de Hansen. A proteína NRAMP1 possivelmente interfere na expressão de complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHCII) e na regulação da expressão de fator de necrose tumoral alfa (TNF- ) (Abel and Demenais 1988). Já em relação à imunidade adquirida, vários fatores podem conferir maior susceptibilidade à doença. Diversos estudos sugerem que o antígeno leucocitário humano (HLA) é determinante para a resposta ao M. leprae e alguns estudos associam os alelos HLA-D2 e DR3 com a forma PB
associada à suceptibilidade o TNF- , relacionado à resistência ao M. leprae. Os
níveis séricos desta citocina em pacientes com a forma PB estão elevados, como também a expressão da mesma nas células retiradas de lesões hansências (Roy, McGuire et al. 1997; Moraes, Sarno et al. 1999; Ferreira, Goulart et al. 2004). Os receptores semelhantes ao toll (toll-like receptors ou
TLRs), são moléculas de superfície que têm um papel importante no reconhecimento de patógenos. Estudos recentes em pacientes hansênicos indicaram que o TLR2 controla a produção de citocinas, sinais celulares e outros aspectos da resistência ao M. leprae (Kang, Lee et al. 2002; Bochud, Hawn et al.
Gráfico 1. Incidência de casos de hanseníase no Brasil. Fonte: Ministério da Saúde
0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000
Casos 14,515 17,133 16,994 18,798 18,854 19,303 18,497 19,728 26,615 27,844 28,765 30,874 33,396 34,251 33,190 36,263 40,505 45,125 42,444 42,389 41,305 44,609 47,506 49,026 49,366 38,410 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
A hanseníase era descrita como uma doença com características bem definidas que dependia da resposta imunológica do hospedeiro (mediada por células) contra o M. leprae (Ridley and Jopling 1966; Bloom 1986).
Aparentemente a resposta imunológica ocorre em resposta a estimulação antigênica de linfócitos T (timo-dependente), podendo ser desencadeada diretamente pelo patógeno ou após o mecanismo de fagocitose por macrófagos. Isso leva a uma proliferação linfocitária e secreção de citocinas, que aumenta a capacidade antimicrobiana dos macrófagos. Pacientes que apresentam a forma PB têm a capacidade de restringir o crescimento do patógeno e produzem uma resposta de células T contra o M. leprae com especificidade de citocinas, como
o interferon gama (IFN- ). Entretanto, pacientes que apresentam a forma MB têm manifestação disseminada do M. leprae, sendo que a resposta de células T
é diminuída e as células T presentes nas lesões expressam interleucina 4 (IL-4) e IL-10, associadas à resposta imunológica humoral, e suprimem a resposta imunológica mediada por células (Quiroga, Martinez et al. 2004).
Estudos imunológicos nos extremos do espectro da hanseníase são raros e geralmente realizados nas lesões de pele. Há evidências, no entanto, que o M. leprae não induz supressão de maturação/ativação das células dendríticas in vitro; por outro lado o Mycobacterium tuberculosis e o Mycobacterium bovis,
Um trabalho recente demonstrou que em pacientes com ambas formas de apresentação clínica nos pólos da doença e com a forma indeterminada apresentam contagem de células T CD4+ aumentadas, sendo que estas células produzem uma quantidade maior de IFN- enquanto as células T CD8+ apresentam-se diminuídas na forma multibacilar (Sridevi, Neena et al. 2004). Embora a imunidade adaptativa tenha um papel essencial na resistência à infecção pelo M. leprae, alguns indivíduos que apresentam a forma multibacilar
da doença têm danos permanentes em nervos periféricos (Scollard, Adams et al. 2006). A combinação de uma resposta imunológica efetiva e a baixa virulência do bacilo pode levar o indivíduo a não desenvolver manifestações clínicas da doença.
2. HIV
O primeiro caso da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) foi relatado no início da década de 80 (Prevention 1983). É causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e é conhecida por uma infecção persistente que pode ter um período latência clínica entre a infecção primária e os sintomas associados a imunodeficiência grave (Barre-Sinoussi 1996). Uma das primeiras características da infecção pelo HIV é a diminuição da resposta imunológica celular, com alterações quantitativas nas subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ (Barre-Sinoussi 1996). Esta diminuição pode resultar em infecções oportunistas recorrentes, que podem ser causadas por fungos, bactérias, vírus e micobactérias. Uma das infecções oportunistas mais frequentes em pacientes infectados pelo HIV é a causada pelo M. tuberculosis. Não existem
esclarecimentos suficientes do comprometimento imunológico que as co-infecções exercem em indivíduos infectados pelo HIV.
pandemia causada pelo HIV. Estima-se que ocorreram mais de 25 milhões de mortes e 33 milhões de pessoas vivem com o vírus, ao final de 2007, com consequências socio-econômicas, culturais, e políticas bastante significativas. O alvo principal dessa epidemia são pessoas em idade economicamente produtiva, os adultos jovens. A rota de transmissão pode ser sexual, vertical e parenteral, essa última principalmente envolvendo o uso drogas ilícitas por via intravenosa e, raramente hoje, transfusão de sangue e hemoderivados. A pandemia está fora de controle, mesmo com tratamento anti-retroviral existente. No último boletim epidemiológico do Ministério da Saúde do Brasil, aproximadamente 480.000 casos de AIDS foram notificados até junho de 2007, sendo 60% localizados na região sudoeste do país (Saúde 2007).
Desde a descoberta do HIV do tipo 1 (HIV-1) em 1983, tem sido a doença infecciosa mais estudada na história (Barre-Sinoussi, Chermann et al. 1983). O HIV-1 é um retrovírus e o seu conteúdo genético está disposto em duas fitas duplas de RNA. A extrema variabilidade dos retrovírus decorre do fato da transcriptase reversa (TR) não possuir a propriedade de correção durante o processo de replicação viral, característica comum à DNA-polimerase de outros organismos. O genoma do HIV é pequeno e contém poucos genes, mas tem a capacidade de neutralizar e escapar de diferentes componentes da defesa (Barre-Sinoussi 1996; Emerman and Malim 1998). Atualmente, a classificação adotada se baseia na análise do genoma completo de amostras de HIV-1 colhidas em diferentes regiões geográficas: grupo M (major), composto por nove
subtipos nomeados A – D, F – H, J e K (as variantes A e F são ainda segregadas como sub subtipos A1 ou A2 e F1 e F2, respectivamente), e o grupo O (out-group) e o N (new) (Simon, Ho et al. 2006). Em termos de diversidade
viral, o subtipo C continua dominante e é responsável por 55 a 60% de todas as novas infecções pelo HIV-1 no mundo (Simon, Ho et al. 2006). Além destes, várias formas recombinantes circulantes (circulating recombinant forms ou
O ciclo de vida do HIV é complexo e a duração e seu desenvolvimento dependem do tipo e estado de ativação celulares. No início da infecção, o HIV não causa danos letais às células do sistema imunológico, mas o processo pode estimular sinais intracelulares que facilitam a replicação viral (Cicala, Arthos et al. 2002; Balabanian, Harriague et al. 2004). Duas moléculas do envelope viral, a glicoproteína externa (gp120) e a proteína transmembrana (gp41), formam a ligação inicial do vírus com a célula alvo (Ray and Doms 2006). Durante este processo, a gp120 se liga ao receptor de membrana das células T CD4+. Logo, ocorre a interação entre o vírus e os co-receptores de quimiocinas (principalmente CCR5 e CXCR4), formando uma ligação irreversível (Eckert and Kim 2001; Ray and Doms 2006). Esta fusão leva minutos para formar um poro na membrana celular (Eckert and Kim 2001; Platt, Shea et al. 2005) e liberar o vírus para o interior citoplasmático. A distribuição destes receptores permitem que a infecção não seja apenas direcionada às células T CD4+, mas também às células apresentadoras de antígeno (APCs), incluindo macrófagos e células dendríticas. O vírus HIV-1 parece ter características biológicas únicas para a predileção destas células (Stevenson 2003). A destruição gradual de linfócitos T CD4+ naïve e de memória é a marca da infecção pelo HIV-1, que leva ao
desenvolvimento da AIDS (Douek, Picker et al. 2003). Apesar da ausência de sintomas durante a fase aguda e crônica na maioria dos casos, a replicação do HIV é dinâmica. A meia vida do vírus é tão pequena, que metade da população viral plasmática pode se replicar em menos de 30 minutos (Ramratnam, Bonhoeffer et al. 1999), sendo que o total de partículas virais produzidas na infecção crônica de um indivíduo infectado pode chegar à 1010 particulas por dia (Ramratnam, Bonhoeffer et al. 1999; Simon and Ho 2003). A ativação celular é um marcador de progressão (Giorgi, Hultin et al. 1999), e parece ser o foco central da patogenia do HIV.
necessário realizar a contagem de células T CD4+ e a quantificação de cópias de RNA do HIV no plasma (carga viral). A carga viral é utilizada principalmente para monitoramento do tratamento anti-retroviral. Vários testes para quantificação carga viral também estão disponíveis nos dias atuais. A carga viral, contudo, não determina o estágio destrutivo do sistema imunológico. Por outro lado, o número de células T CD4+ revela o grau de imunodeficiência e é utilizado como medidor do avanço para doença. O critério para classificação da infecção do HIV é medido através da contagem de células T CD4+ e manifestções clínicas (infecções oportunistas). A citometria de fluxo é o método padrão para a quantificação de células T CD4+ no sangue periférico.
O tratamento anti-retroviral é a melhor opção para a supressão viral e, subsequente, para a redução da morbidade e mortalidade. Nos dias de hoje, há aproximadamente 20 drogas anti-retrovirais disponíveis para tratamento. Definir o melhor momento para iniciar o tratamento anti-retroviral é uma das decisões mais importantes no acompanhamento do indivíduo infectado pelo HIV. O Ministério da Saúde do Brasil determina que pacientes com doença sintomática e os que, apesar de assintomáticos, apresentam imunodeficiência avançada (contagem de linfócitos T CD4+ abaixo de 200/mm3) devem iniciar tratamento; já
aqueles com contagem entre 200 e 350 céls./mm3 devem iniciar o tratamento na presença de manifestações clínicas associadas a imunodeficiência ou a critério do médico que está assistindo ao indivíduo (Saúde 2006).
3. Coinfecção HIV e Hanseníase
A infecção pelo HIV tem um efeito profundo na incidência e na patologia clínica da tuberculose. No entanto, houve uma preocupação no início da epidemia quanto a possibilidade de existir uma interação similar entre a infecção pelo HIV e a hanseníase, que não foi confirmada até hoje.
foi estimado e acredita-se que a sobreposição geográfica dessas duas doenças poderá resultar no aumento do número de indivíduos com ambas infecções (Figura 1) (Ustianowski, Lawn et al. 2006). O tempo prolongado de incubação da infecção pelo M. leprae e sua baixa incidência tornam complicada a realização
de um estudo prospectivo de incidência da co-infecção ou um estudo caso-controle de pacientes infectados ou não pelo HIV.
Figura 1. Distribuição mundial do número de adultos e adolescente que vivem com HIV/AIDS até o final de 2002 e seis paises com o maior número de novos casos com hanseníase no mesmo ano (adaptado de Ustianowski, Lawn et al. 2006).
Alguns estudos demonstraram que a prevalência de casos de pacientes co-infectados pelo HIV/M. tuberculosis ou infecções pelo M. avium tende a ser
maior que os casos de HIV/M. leprae (Meeran 1989; Borgdorff, van den Broek et
Um estudo realizado na Tanzânia, em 1990, identificou que 83 (12,2%) estavam infectadas pelo HIV entre 679 pessoas infectadas pelo M. leprae. Este
resultado deve ser visto com cautela, já que o diagnóstico da infecção pelo HIV contava com apenas um tipo de ensaio imunoenzimático (van den Broek, Chum et al. 1997). De fato, já havia sido descrito que a hanseníase podia afetar a especificidade e sensibilidade de alguns testes para o diagnóstico da infecção pelo HIV (ShivRaj, Patil et al. 1988; Andrade, Avelleira et al. 1991), porque pacientes com hanseníase multibacilar podem apresentar hipergamaglobulemia que eventualmente resultava em testes falso-positivos em sorologias para sífilis e ensaios de fator reumatóide (Murray 1982; Harboe 1988). Também foi descrito que pacientes com forma multibacilar da hanseníase produzem anticorpos contra antígenos micobacterianos, que podem ocasionar reações cruzadas em ensaios sorológicos com proteínas Pol e Gag do HIV-1 (Kashala, Marlink et al. 1994; Milanga, Kashala et al. 1999), embora alguns trabalhos tenham falhado em detectar estes efeitos (Lucas, Fine et al. 1995; Sterne, Turner et al. 1995).
O espectro clínico da hanseníase depende do sistema imunológico do hospedeiro. O HIV afeta a resposta imunológica celular, sugerindo, portanto, que pacientes co-infectados apresentariam a forma multibacilar da hanseníase com maior freqüência (Turk and Rees 1988). Cinco grandes estudos descreveram que a razão entre as formas paucibacilar e multibacilar não muda significantemente com a co-infecção pelo HIV (Munyao, Bwayo et al. 1994; van den Broek, Chum et al. 1997; Gebre, Saunderson et al. 2000).
TNF- tendem a ter sua expressão aumentada, mesmo com as células T CD4+ diminuídas no organismo (Sampaio, Caneshi et al. 1995).
A grande modificação clínica observada na co-infecção entre hanseníase e o HIV ocorreu após o advento do tratamento anti-retroviral, que possibilitou a caracterização de reações reversas como fenômenos de reconstituição imune. Há atualmente poucos casos documentados desta associação, na qual há aparecimento de manifestações clínicas da hanseníase previamente latente, após a introdução do tratamento anti-retroviral (Couppie, Abel et al. 2004; Hirsch, Kaufmann et al. 2004; Goebel 2005; Batista, SM. et al. 2007; Kharkar, Bhor et al. 2007; Murdoch, Venter et al. 2007).
As diversas conclusões destes estudos refletem a dificuldade de estudar a interação de ambas doenças, sendo que a maioria dos estudos realizados possui amostragens pequenas de co-infectados.
4. Células T natural killer (NKT)
As células T natural killer (NKT) são linfócitos T especializados e com
características funcionais únicas. Originalmente descritos em camundongos, essas células expressam o receptor de célula T (TCR) e o receptor C-lectina de células natural killer (NK), o NK 1.1 (CD161 nos humanos) (Bendelac 1995;
Bendelac, Rivera et al. 1997; Godfrey, Hammond et al. 2000; Kronenberg and Gapin 2002). Aproximadamente, 5 a 10% das células T do sangue periférico expressam CD161 (Unutmaz 2003; Kronenberg 2005). A maioria das células NKT humanas expressam TCRs V 24-J 18/V 11(Bendelac, Savage et al. 2007). Estas células têm um papel importante em várias respostas imunológicas, incluindo ação anti-tumoral, em doenças auto-imunes e em infecções virais e bacterianas (Godfrey, Hammond et al. 2000).
CD8+ e CD4-CD8- (Prussin and Foster 1997; Kawano, Nakayama et al. 1999; Nicol, Nieda et al. 2000; Metelitsa, Naidenko et al. 2001). As subpopulações CD4+ tendem a produzir citocinas tanto Th1 (IFN- ) e Th2 (IL-4, IL-10), embora células NKT CD4- produzam apenas citocinas do tipo Th1 (Chen, Wang et al. 2007). Grumperz e cols., demonstraram que células NKT CD4+ e CD4- têm diferentes expressões de perforina e células CD4- expressam o receptor coestimulatório de células NK (NKG2D). Já a expressão de FASL é aparentemente limitada à subpopulação CD4+ (Gumperz, Miyake et al. 2002). Eger e cols., no entanto, descreveram que as células NKT dos neonatos são diferentes na função e no fenótipo quando comparadas às células de adultos. Apresentam alta expressão de marcadores de diferenciação, como CCR7 e CD62L, e baixa expressão de marcadores de células NK (CD94) além de serem mais efetoras (Eger, Sundrud et al. 2006).
células NKT são CD4- com baixa ou nenhuma expressão de CD8 (Sandberg, Stoddart et al. 2004).
Há muito interesse em descobrir os sinais necessários para o desenvolvimento e funções das células NKT. Células T convencionais e NKT, expressam receptores . Um número considerável de estudos recentes, por outro lado, sugerem que os sinais necessários para o desenvolveimento e função destas células são diferentes dos necessários para as células T convencionais (Au-Yeung and Fowell 2007). Alguns estudos têm sugerido que uma função importante das células NKT pode ser a de proteger tecidos (particularmente órgãos vitais) de danos inflamatórios ocasionados pela resposta imunológica (Godfrey, Hammond et al. 2000). Estas células têm efeitos múltiplos na resposta imunológica, incluindo ativação, regulação e atração de células do sistema imunológico inato e regulação do sistema imunológico adaptativo (Rolf, Berntman et al. 2008).
As células NKT têm capacidade especial de reconhecer antígenos associados a molécula de CD1. Existem evidências que membros da família CD1 nos humanos podem reconhecer algumas células T e que se ligam ou são expressos em células T CD4+ e CD8+ (Bendelac, Lantz et al. 1995). A familia CD1 consiste em dois grupos de lipídeos, incluindo CD1a, CD1b e CD1c no Grupo I e CD1d no Grupo II. Após estímulo, as células NKT restritas a CD1d rapidamente produzem várias citocinas do tipo Th1 e Th2 (Kronenberg and Gapin 2002; Taniguchi, Harada et al. 2003; Godfrey and Kronenberg 2004; Mercer, Ragin et al. 2005; Seino, Motohashi et al. 2006).
1999; Exley, He et al. 2002; Kenna, Golden-Mason et al. 2003) e tendem, nos humanos, a ser aproximandamente dez vezes menos freqüêntes em todas as outras localizações (Bendelac, Savage et al. 2007). A freqüência de células NKT V 24 no sangue periférico em indivíduos normais varia de 0.01 a 1%, fazendo com que seja difícil de avaliar as diferenças entre indivíduos normais e aqueles que apresentam algum tipo de patologia (Ohteki and MacDonald 1994; Nuti, Rosa et al. 1998; Emoto, Emoto et al. 1999).
Um dos componentes mais eficientes para ativar as células NKT é um glicolípedo sintético (originalmente derivado das esponjas marinhas) (Hong, Scherer et al. 1999; Hayakawa, Godfrey et al. 2004) conhecido como -galctosilceramida ( -GalCer), que se liga efetivamente à molécula CD1d. O complexo CD1d e o glicolípideo então se liga ao TCR das células NKT (Sidobre, Naidenko et al. 2002). As células NKT podem ser identificadas por um fluorocromo conjugado, a um complexo de tetrâmero CD1d com -GalCer (Benlagha, Weiss et al. 2000; Matsuda, Naidenko et al. 2000; Hammond, Pellicci et al. 2001). Vários estudos têm utilizado o -GalCer, um potente agonista das células NKT (Hayakawa, Godfrey et al. 2004). Várias outras moléculas de glicolipídeos foram testadas como estimuladores destas células e de suas subpopulações, incluindo glangliosideo GD3 (Wu, Segal et al. 2003), glicofosfatidilinositol (Schofield, McConville et al. 1999; Hansen, Siomos et al. 2003), fosfoetanolamina (Rauch, Gumperz et al. 2003), e algumas formas de -GalCer (Ortaldo, Young et al. 2004).
Quando ativadas, as células NKT respondem vigorosamente com produção de citocinas após uma a duas horas (Godfrey, Hammond et al. 2000; Kronenberg and Gapin 2002). Essas células têm capcidade de secretar IFN- , TNF- e também citocinas do tipo Th2, incluindo IL-4 e IL-13 (Smyth and Godfrey 2000; Wilson, Johansson et al. 2003). Além disso, são capazes de secretar simultaneamente citocinas tipo Th1 e Th2. Curiosamente, o estímulo de sangue total ex vivo faz com que não secretem muita quantidade de citocinas
produção de IL-12 (Tomura, Yu et al. 1999). O mecanismo exato através do qual as células NKT secretam as citocinas não está totalmente elucidado, o que é um desafio para especialistas que atuam nessa área (Figura 2A e B).
Figura 2 A e B: Esquema de como as células NKT influenciam a resposta imunológica. (A) O lado em verde demosntra fatores que podem gerar uma resposta Th1 pelas células NKT, enquanto o lado vermelho demonstra fatores que podem gerar uma resposta Th2 pelas células NKT. (B) Subpopulações de células NKT humanas CD4- e CD4+ são programadas para produzir diferentes razões de citocinas Th1/Th2 (adaptado de Godfrey & Kronenberg, 2004).
APC
NKT
CTL
NK
CD8+ Treg
CD8-DC
IFN-CD40L
IL-4 IL-10 IL-13
IL-7
Diminui‹ o do sinal de TCR? Tipo de APC?
Outros fatores?
CD1d + glicolip’deo
(ex. -GalCer, OCH, C-glicos’deo) TCR
IL-12
Aumento do sinal TCR? Tipo APC?
Outros fatores?
Supress‹ o imunol—gica e Th2
Prote‹ o imunol—gica e Th1
IL-12
DC Tempo? Gr-1+
TGF-As células NKT têm um papel importante no desenvolvimento de outras respostas, incluindo a prevenção e o desenvolvimento de certas doenças auto-imunes, inibição do desenvolvimento de tumores e crescimento e a eliminação de algumas infecções. A depleção destas células pode ter um papel importante durante a infecção pelo HIV (Sandberg, Fast et al. 2002; van der Vliet, von Blomberg et al. 2002). É possível que a diminuição de células NKT vista em pacientes infectados esteja relacionada à suceptibilidade destes indivíduos em desenvolverem doenças como o sarcoma de Kaposi (Crowe, Godfrey et al. 2003).
As células NKT CD4+ expressam o receptor de quimiocina 5 (CCR5), também co-receptor da ligação do HIV à célula alvo (impresso de unutmaz03). Alguns trabalhos observaram que as células NKT (V 24+V 11+) no sangue
IFN-CD40L
IL-4 IL-10 IL-13
CD1d + glicolip’deo
IL-12
TGF-Supress‹ o imunol—gica e Th2
Prote‹ o imunol—gica e Th1
CD1d + glicolip’deo
periférco de indivíduos infectados pelo HIV ocorrem em percentagens menores quando comparados com indivíduos saudáveis. Também foi descrito que existe uma correlação positiva entre a carga viral do HIV e o número de células NKT CD4+ . Estas células são mais suceptíveis ao tropismo R5 na infecção do HIV quando comparadas com o tropismo X4 (Motsinger, Haas et al. 2002; Sandberg, Fast et al. 2002; van der Vliet, von Blomberg et al. 2002). A suceptibilidade das células NKT para com o vírus HIV R5, é dependente do nível de moléculas CCR5 expressas nestas células. O número reduzido de células NKT, especialmente a subpopulação CD4+, em pacientes infectados pelo HIV deve ter consequências significativas devido às suas importantes funções, descritas anteriormente (Unutmaz 2003).
Alguns autores descreveram que as células NKT são protetoras durante infecções bacterianas (Gumperz and Brenner 2001) e virais (Nuti, Rosa et al. 1998; Asselin-Paturel, Boonstra et al. 2001). Com isso, podem ter papel importante durante as infecções oportunistas, freqüêntes nos pacientes imunodeficientes (Unutmaz 2003). Umas das co-infecções mais comuns em portadores do HIV são as causadas por micobactérias (Barnes, Bloch et al. 1991). As células NKT são conhecidas por reconhecer e responder às infecções micobacterianas (Apostolou, Takahama et al. 1999; Emoto, Emoto et al. 1999). Existem algumas evidências que antígenos glicolipídicos de micobactérias apresentados pela molécula CD1d podem ativar funções efetoras das células NKT, tais como secreção de citocinas e citotoxicidade contra células infectadas por micobacterias (Apostolou, Takahama et al. 1999). Todavia, estas células são capazes de agir diretamente com a secreção de granulosina na ação anti-micobacteriana (Gansert, Kiessler et al. 2003). Portanto, a diminuição das células NKT em indivíduos infectados pelo HIV podem contribuir para infecções micobacterianas.
No presente trabalho, é apresentada uma série de experimentos para investigar diferentes aspectos da resposta imunológica do tipo celular em pacientes co-infectados pelo M. leprae e pelo HIV-1. Entre os diversos aspectos analisados,
Objetivo Principal
Caracterizar parâmetros imunológicos em pacientes que apresentam a coinfecção pelo HIV-1 e Mycobacterium leprae.
Objetivo 1
Caracterizar ativação celular, contagem de células T e distribuição de células dendríticas.
Objetivo 2
Avaliar a distribuição do estado de maturação dos linfócitos T CD4+. Objetivo 3
Identificar a resposta produtiva de IL-4, INF- e TNF- após estímulo inespecífico.
Objetivo 4
Identificar a distribuição e a função de células NKT na infecção pelo HIV-1 comparadas com controles.
Objetivo 5
Hanseníase e o vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV) são exemplos de infecções humanas cuja interação entre o patógeno e a imunidade celular do hospedeiro determina a manifestação clínica da doença. No entanto, é esperada uma interação significantiva dos aspectos imunopatológicos entre o HIV-1 e a hanseníase. Neste estudo, avaliamos vários aspectos da imunidade celular em pacientes coinfectados com HIV-1 e a Mycobacterium leprae. Vinte oito indivíduos foram estudados, divididos em
quarto grupos: controles saudáveis, coinfectados pelo HIV-1 e M. leprae,
monoinfectados pelo HIV-1, e monoinfectados pelo M.lepare. Os indivíduos
dos grupos monoinfectados e coinfectados foram pareados tanto quanto possível pela carga bacilar e parâmetros imunológicos relacionados ao HIV. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram analisadas no citômetro de fluxo de seis e sete cores para avaliar subpopulações e níveis de ativação cellular, distribuição de fenótipos de células dendríticas (DC) e expressão de IL-4 por células T. O grupo coinfectado apresentou diminuição da razão de células CD4:CD8, aumento de níveis de ativação de células T CD8+, aumento da razão de células T V 1:V 2 e diminuição da porcentagem de células dendríticas plasmocitóides, comparadas com o grupo de indivíduos monoinfectados pelo HIV-1. A produção de IL-4 por linfócitos T CD4+ foi correlacionado positivamente com a porcentagem da subpopulação de memória efetora de células T CD4+, sugerindo diferenciação antigênica da população de células T em ambas as infecções de HIV-1 e M. leprae. A
coinfecção com o M. lepare pode exacerbar a imunopatologia da doença do
Immune cellular parameters of leprosy and human
immunodeficiency virus-
1
co-infected subjects
Introduction
Leprosy is a chronic infectious disease, affecting the skin and peripheral nerves, caused by the intracellular bacillus
Mycobacterium leprae.1The incidence of new cases of lep-rosy remains constant at 286 000 per year, and Brazil is one of the countries worst affected, accounting for the
majority of new cases reported in the Americas.2 As the
prevalence rates of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) infection are escalating in some countries where leprosy is endemic, one might expect that the geographic overlap of the two epidemics may lead to increased
concerning leprosy endemicity and HIV-1 prevalence in Brazil and other countries emphasizes the importance of
monitoring for co-infections.3 In addition to the public
health aspect of this co-infection, these pathogens may have a potentially interesting immunologic interaction in the human host.
It has been previously suggested that leprosy is a human infection model in which to study the T helper
1/T helper 2 (Th1/Th2) paradigm,4 permitting the
delin-eation of polarized human T helper responses in response
to a single pathogen. The spectrum of M. leprae-specific
immune responses between these poles correlates with the
Karina I. Carvalho,1 Solange
Maeda,1 Luciana Marti,2Jane
Yamashita,1 Patrick A. J. Haslett3
and Esper G. Kallas1
1Federal University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo,
Brazil,2Albert Einstein Research Institute, Sa˜o Paulo, Brazil, and3University of Miami, FL, USA
doi:10.1111/j.1365-2567.2007.02756.x Received 1 June 2007; revised 15 October 2007; accepted 16 October 2007. Correspondence: E. G. Kallas, MD, PhD, Laborato´rio de Imunologia, Disciplina de Doenc¸as Infecciosas e Parasita´rias, Escola Paulista de Medicina/UNIFESP, Rua Mirassol 207, 04044-010 - Sa˜o Paulo – SP, Brazil. Email: kallas.dmed@epm.br
Senior author: Esper Kallas
Abstract
Leprosy and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) are examples of human infections where interactions between the pathogen and the host cellular immunity determine the clinical manifestations of disease. Hence, a significant immunopathological interaction between HIV-1 and leprosy might be expected. In the present study we explored several aspects of cel-lular immunity in patients co-infected with HIV-1 and Mycobacterium leprae. Twenty-eight individuals were studied, comprising four groups: healthy controls, HIV-1 and M. leprae co-infection, HIV-1 mono-infec-tion, and M. leprae mono-infection. Subjects in the mono-infection and co-infection groups were matched as far as possible for bacillary load and HIV disease status, as appropriate. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were analysed using six- and seven-colour flow cytometry to evaluate T-cell subpopulations and their activation status, dendritic cell (DC) distribution phenotypes and expression of IL-4 by T cells. The co-infected group exhibited lower CD4 : CD8 ratios, higher levels of CD8+ T-cell activation, increased Vd1 : Vd2 T cell ratios and decreased percentages of plasmacytoid DC, compared with HIV-1 mono-infected subjects. Across infected groups, IL-4 production by CD4+T lymphocytes was positively correlated with the percentage of effector memory CD4+ T cells, suggesting antigenically driven differentiation of this population of T cells in both HIV-1 and M. leprae infections. Co-infection with M. le-prae may exacerbate the immunopathology of HIV-1 disease. A T helper 2 (Th2) bias in the CD4+ T-cell response was evident in both HIV-1 infection and leprosy, but no additive effect was apparent in co-infected patients.
characterized by high levels of specific cell-mediated immunity that effectively limits bacillary replication and is associated with limited disease, although often with concomitant immunological damage to the nerves. At the other pole, lepromatous, or multibacillary, leprosy is
characterized by a selective unresponsiveness to M. leprae
antigens, diffuse cutaneous disease and the uncontrolled multiplication of organisms in the skin, often to extra-ordinary numbers. Much of the morbidity of leprosy results from episodic inflammatory exacerbations of lep-rosy lesions in the skin and nerves, called ‘lepra’ reac-tions, thought to be caused by spontaneous shifts in host
immunity.6
Because HIV-1 infection has a profound effect on the incidence and clinico–pathological features of other myco-bacterial diseases, such as tuberculosis, one might expect a significant interaction also to exist between HIV-1 and
leprosy.7 In HIV-1/
M. tuberculosis co-infections, immune suppression secondary to HIV-1 infection accelerates the progress of tuberculosis, and, conversely, the cellular immune activation associated with tuberculosis is
associ-ated with more rapid progression of HIV-1 disease.8,9 In
the setting of HIV-1/M. leprae co-infections, there has
been a general expectation that immune deficiency caused by HIV-1 infection would shift the spectrum of leprosy towards the lepromatous (Th2) pole, although
epidemio-logical data are sparse and conflicting.10Paradoxically, the
most detailed description of leprosy immunopathology in HIV-1 co-infected patients revealed no change in immune cell infiltrates across the leprosy spectrum, despite
advanced HIV-1-associated immune deficiency.7,11On the
other hand, there has been little or no attempt to evaluate
the impact ofM. leprae infection on HIV-1 pathogenesis.
This interaction has been studied in the macaque/simian immunodeficiency virus (SIV) model, however, where
M. leprae infection was observed to exert an unexpected and unexplained ameliorating effect on SIV disease, pro-longing survival of the animals, despite equal or increased
viral burdens.12
In light of these various reported interactions of myco-bacterial infections with HIV and SIV pathogenesis, we
were interested in investigating whether human M. leprae
co-infection might exacerbate or attenuate HIV-1 patho-genesis. As an initial exploration of these questions, we performed a cross-sectional analysis of immune cellu-lar parameters in blood cells from relatively rare HIV-1 and M. leprae co-infected subjects, in comparison with
HIV-1 andM. lepraemono-infected subjects, and healthy
volunteers.
Our investigation focused on peripheral blood immune cells that are known to be altered in HIV-1 disease and that are implicated in the immunity and/or pathogenesis of mycobacterial infections, including leprosy. Thus, in addition to CD4 and CD8 T-cell subsets, we examined
Vd1 cells. Vd2 cells are stimulated by isoprenoid
phosphoantigens that are present in bacteria, including
mycobacteria.13 This population of cells plays a role in
antimycobacterial defense,14,15 but the cell population
shrinks dramatically during acute HIV-1 infection, with
variable recovery following antiviral chemotherapy.16,17 In
contrast, the Vd1 population, of unknown function,
expands during HIV-1 infection, so that the ratios of Vd1
to Vd2 T cells are increased with progressive HIV-1
infec-tion.16,17 We also examined the two main subsets of
peripheral blood dendritic cells (DC), called plasmacytoid and myeloid DC. DC are key components of the innate immune system, acting as antigen-presenting cells that are essential for the priming and regulation of T-cell immu-nity. Hence, the responses and interactions of these popu-lations of DC are thought to determine whether T cells
differentiate into Th1 or Th2 cells,18 spanning the range
of phenotypes observed in leprosy. Mycobacteria are known to stimulate DC via toll-like receptors (TLR) pres-ent on both myeloid (TLR2) and plasmacytoid (TLR9)
subsets.19–21Both subsets of DC can be infected by HIV-1,
but a differential and striking loss of peripheral blood plasmacytoid DC characterizes progressive HIV-1
dis-ease.22 In light of the complex and contrasting effects of
HIV-1 and mycobacterial infections on cdT-cell and DC
populations, we were interested in examining these
immune cells in patients with HIV-1 and M. leprae
co-infections.
Materials and methods
Subjects and sample collection
This study was reviewed and approved by the local institu-tional review board (IRB, Comiteˆ de E´tica em Pesquisa Humana da Universidade Federal de Sa˜o Paulo/UNIFESP), and IRB-approved informed consent was obtained from all participants. Leprosy patients were treated according to
World Health Organization guidelines.23Acquired
immu-nodeficiency syndrome (AIDS) was defined using modified criteria adopted by the Brazilian Ministry of Health that
includes patients with a CD4 cell count of < 200 cells/ll
or clinical conditions related to AIDS.24
Seven healthy controls and seven HIV-seropositive
patients, most of whom had CD4+T-cell counts of < 400
cells/ll, were identified at UNIFESP. Seven patients with
leprosy were enrolled at the Leprosy Clinic at the State Health Department (Sao Paulo, Brazil) and were classified
according to their bacillary load.25 Seven patients
multibacillary form.
The HIV mono-infected and co-infected patients were receiving highly active antiretroviral therapy (HAART) and multidrug therapy (MDT). Patients with immune reconstitution inflammatory syndrome were not included in the present study to avoid potential interference in the immune parameters, as described in different
mycobacte-rial diseases.26–28
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were iso-lated from the study subjects by density-gradient
sedi-mentation over Ficoll–Paque (Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden). The isolated PBMC were then washed twice in Hank’s balanced salt solution (Gibco, Grand Island, NY). Cells were cryopreserved in RPMI 1640 (Gibco), supplemented with 20% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT),
50 U/ml of penicillin (Gibco), 50lg/ml of streptomycin
(Gibco), 10 mM glutamine (Gibco) and 75% dimethyl
sulphoxide (DMSO; Sigma, St Louis, MO). Cryopre-served cells were stored in liquid nitrogen until used in the assays. At the time of the assay, PBMC were rapidly
thawed in a 37° water bath and washed in RPMI 1640
supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U/ml of
penicillin, 100lg/ml of streptomycin and 20 mM
glutamine (R10). Cells were counted, checked for
viabil-ity and resuspended in R10 at a concentration of 106
cells/ml.
Plasma HIV-1 RNA detection
The plasma HIV RNA detection load was assessed using the ultrasensitive AMPLICOR HIV-1 MONITOR test ver-sion 1.5 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), according to the manufacturer’s instructions.
Flow cytometry
The following monoclonal antibodies were used for surface staining: CD3–allophycocyanin (APC) (clone UCHT1), CD8–allophycocyanin carbocyanin 7
(APC-Cy7) (clone SK1), Vd2–phycoerythrin (PE) (cloneB6),
CD45RA–peridin chlorophyll protein (PerCP) (clone HI 100), CCR7–phycoerithrin carbocyanin 7 (PeCY7) (clone
3D12) and CD69–fluorescein isothiocyanate (FITC)
(clone FN50), from BD PharMingen (San Jose, CA); CD4–Alexa 610 (clone S3.5) from Caltag Laboratories
(Burlingame, CA); Vd1–FITC (clone T58.2) from
Endo-gen (Rockford, IL); Lineage Cocktail 1 (Lin 1: CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 and CD56) FITC, human
leucocyte antigen (HLA)-DR–PerCP (clone L243),
CD11c–APC (clone S-HCL3), CD123–PE [anti-interleukin (IL)-3 receptor], CD38–PE (clone HB7), CD4–FITC (clone L120), from BD Biosciences (San Jose, CA); and CD25–
using mouse anti-human IL-4–PE (clone 3010.211), mouse
anti-human interferon (IFN)-c–PE–CY7 (clone B27) and
mouse anti-human tumour necrosis factor (TNF)-a–APC
(clone Mab11), all from BD PharMingen. Fluoresce minus
one (FMO) was used for gate strategy.29
In some experiments, thawed PBMC were incubated in 24-well plates (1 ml/well) (Becton Dickinson, San Jose,
CA) in the presence of 1lM ionomycin (Sigma) and
20 ng/ml of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma), for 16 hr. After stimulation, cells were centrifuged
at 1500g for 5 min and transferred into V-bottom
96-well plates (Nunc, Roskilde, Denmark) in 100ll of
staining buffer [phosphate-buffered saline (PBS)
supple-mented with 01% sodium azide (Sigma) and 1% FBS,
pH 74–76] with the panel of surface monoclonal
anti-bodies. Cells were incubated at 4°in darkness for 30 min,
washed twice and then resuspended in 100ll of fixation
buffer [1% paraformaldehyde (Polysciences, Warrington,
PA) in PBS, pH 74–76].
Intracellular staining was performed after surface stain-ing with CD4–FITC, CD3–PerCP and CD8–APC–CY7.
Cells were incubated with 100ll of 4% fixation buffer
and washed with permeabilization buffer (PBS
supple-mented with 01% sodium azide, 1% FBS and 01%
sapo-nin; Sigma). Each sample was resuspended in 100ll of
permeabilization buffer, incubated for 15 min at room
temperature in the dark, washed with 100ll of staining
buffer and incubated for 30 min at 4° in the dark with
either no antibody (unstained tube) or IL-4–PE,
anti-IFN-c–PE–CY7 and anti-TNF-a–APC in 50ll of staining
buffer.30 Cells were washed with 200ll of staining buffer
and resuspended in 100ll of 1% paraformaldehyde (PFA)
for flow cytometry analysis. Samples were acquired on a
FACSCanto or FACSAria, using FACSDIVA software (BD
Biosciences), and the analysed with FLOWJOsoftware (Tree
Star, San Carlo, CA). Fluorescence voltages were deter-mined using matched unstained cells. Compensation was carried out using CompBeads (BD Biosciences) single-stained with CD3–PerCP, CD4–FITC, CD8–APC–CY7, CD4–PE–CY7, CD3–PE or CD3–APC. Samples were acquired until at least 200 000 events in a live lymphocyte gate or at least 500 000 events in a live DC gate were obtained.
Statistical analyses
Groups were compared using non-parametric models; data are reported as median and interquartile range. Comparisons among groups were carried out using the Kruskall–Wallis non-parametric test, followed by inter-group comparisons by the Dunnet test. Correlations were performed using the Spearman non-parametric test.
Results
Characteristics of the HIV-1-M. lepraeco-infected patients
Demographic, clinical, microbiological and laboratory characteristics are detailed in Table 1. The median ages of all participants was 38 years (IQR: 35–48) and most
were male (839%). No difference in gender distribution
was observed between groups. For the leprosy and co-infected groups, 80% of the patients had a paucibacil-lary presentation at the time of diagnosis. Co-infected patients were treated with the appropriate MDT for
paucibacillary and multibacillary leprosy. Median CD4+
T-cell counts in both HIV-infected groups were
matched (949 cells/ll, IQR 7275–1465 for controls; 297
cells/ll, IQR 265–410 for HIV-infected patients; and
236 cells/ll, IQR 161–390 for co-infected patients
Table 1).
Leprosy and HIV-1 infections lead to marked disturbances of T-lymphocyte distribution
The CD4 : CD8 T-cell ratio was decreased in both
HIV-1-infected groups, but more in co-infected patients
compared with controls (016, IQR 009–020; and
130, IQR 095–19, respectively, P< 0001, Fig. 1a).
Although not statistically significant, co-infected patients exhibited lower CD4 : CD8 ratios than HIV-1 mono-infected subjects, suggesting more severe
immunopathol-ogy in the former group, despite similar CD4+ T-cell
counts (Fig. 1a). Case
numbers1 Groups Gender
Age (years) Leprosy clinical presentation Bacillary index Leprosy therapy (months of MDT) Viral load (HIV-RNA copies/ml) CD4+ T cells/ mm3 HIV therapy
102 Control Male 29 – – – – 1358 –
103 Control Female 47 – – – – 1695 –
104 Control Male 40 – – – – 742 –
105 Control Male 34 – – – – 774 –
106 Control Male 49 – – – – 1084 –
110 Control Male 54 – – – – 661 –
113 Control Female 51 – – – – 949 –
128 Control Male 37 – – – – 1571 –
131 Control Male 38 – – – – 713 –
142 Control Male 49 – – – – 980 –
1001 HIV Male 37 – – – <399 405 HAART
1004 HIV Male 34 – – – 925 503 HAART
1020 HIV Male 33 – – – <399 410 HAART
1039 HIV Male 35 – – – 200 170 HAART
1050 HIV Male 51 – – – <399 265 HAART
2008 HIV Male 38 – – – <399 275 HAART
2011 HIV Male 38 – – – 762 297 HAART
1 HIV-Leprosy Male 38 BL 2+ 10 <399 161 HAART
2 HIV-Leprosy Male 38 BT Negative 12 <399 269 HAART
3 HIV-Leprosy Male 31 BT 1+ 8 <399 235 HAART
4 HIV-Leprosy Female 51 BL 1+ 12 <399 390 HAART
5 HIV-Leprosy Male 35 BT Negative 12 7220 127 HAART
6 HIV-Leprosy Male 53 BT Negative 2 <399 236 HAART
7 HIV-Leprosy Male 47 BT 1+ 5 <399 481 HAART
10 Leprosy Male 38 LL 3+ 20 – ND
11 Leprosy Male 43 TT Negative 4 – ND
12 Leprosy Male 37 BT Negative 7 – ND
13 Leprosy Male 33 BT Negative 5 – ND
14 Leprosy Male 48 LL 3+ 23 – ND
15 Leprosy Female 31 BL 1+ 14 – ND
16 Leprosy Male 39 LL 3+ 22 – ND
BL, borderline-lepromatous; BT, borderline-tuberculoid; HAART, highly active antiretroviral therapy; HIV, human immunodeficiency virus; LL, lepromatous-lepromatous; MDT, multidrug therapy; ND, not done; TT, tuberculoid.
Surface activation markers were evaluated in all four
groups. Marked HLA-DR up-regulation on CD8+T cells
was observed in both HIV/M. lepraeco-infected and HIV
mono-infected groups compared with controls [mean flu-orescence intensities of 165 (IQR 94–271), 134 (IQR 114–
249) and 46 (IQR 21–68), respectively,P< 005, Fig. 1b],
but this was not seen in CD4+T cells. There was a
non-significant trend towards increased HLA-DR expression in the co-infected compared with the HIV-1 mono-infected group (Fig. 1b). No differences were observed in the
expression of CD69, CD25 and CD38 on CD4+ and
CD8+T lymphocytes (data not shown).
Dendritic cells and Vd2 T lymphocytes are proportionately diminished in co-infected patients
The Vd2 T-cell subset was decreased in the co-infection
group when compared with the control group (median
153%, IQR 073–24, P< 005), whereas the percentage
of Vd1 T cells was similar in all groups. There was a
sta-tistically significant overall difference in the Vd1 : Vd2 cell
ratio, exaggeratedly inverted in the co-infected group compared with subjects infected with HIV-1 only
(co-infection, 303%, IQR 99–357; HIV, 59%, IQR 38–
137; controls, 063%, IQR 025–31; and leprosy, 286%,
IQR 044–1084,P< 005, Fig. 1c).
The percentages of plasmacytoid DC in total PBMC were diminished in co-infected patients when compared
with controls (co-infected, 001%, IQR 0005–002; HIV,
002%, IQR 0005–018; control, 013%, IQR 009–018;
and leprosy, 003%, IQR 00–015, P< 005, Fig. 1d).
On the other hand, no significant differences in the percentages of myeloid DC were observed (data not
HIV-1 and leprosy drives the maturation of T lymphocytes
CD4+ T cells were stained for surface expression of
CD45RA and CCR7. Phenotypic nomenclature was based
on that proposed by Sallusto et al., where CCR7+
CD45RA+ are described as naı¨ve cells, CCR7+CD45RA)
as central memory cells and CCR7)CD45RA)as effector
memory cells 31. Control subjects had higher percentages
of naı¨ve and central memory cells compared with the other groups, with a corresponding decrease in the portion of effector memory cells (Fig. 2). The most pro-nounced difference in these maturation subsets was seen when control subjects were compared with leprosy
patients (CCR7+CD45RA+ naı¨ve: 547%, IQR 166–182
for controls and 056%, IQR 022–184 for leprosy;
CCR7+CD45RA) central memory: 33
8%, IQR 281–357
for controls and 1505%, IQR 86–22 for leprosy;
CCR7)CD45RA) effector: 49
9%, IQR 476–64 for
con-trols and 826%, IQR 7515–873 for leprosy). For CD8+
T-cell subsets, the only statistically significant difference
was observed when comparing central memory CCR7+
CD45RA)cells from control subjects (17
7%, IQR 1315–
30) with co-infected (428%, IQR 263–132) and leprosy
(567%, IQR 479–1045) patients.
Both pathogens tend to direct the immune response towards IL-4 production
Next, we assessed cytokine production after PMA and ionomycin stimulation. No differences were observed in
the production of TNF-a and IFN-c between CD4+ and
CD8+ T lymphocytes. On the other hand, IL-4
produc-Control HIV HIV–leprosy Leprosy 0·0 0·5 1·0 1·5 2·0 2·5 (a) (b) (c) (d)
CD4 : CD8 ratio
V
δ
1 : V
δ
2 ratio
Plasmocytoid DC (%)
HLA-DR MFI
P < 0·01
Control HIV HIV–leprosy Leprosy 0 100 200 300 400 500
Control HIV HIV–leprosy Leprosy 0 10 20 30 40 50 60 70
P < 0·01
Control HIV HIV–leprosyLeprosy 0·0 0·1 0·2 0·3 0·4 0·5 0·6
0·7 P < 0·01
Figure 1. Several cellular immunological mark-ers obtained using flow cytometry were evalu-ated and compared among the four groups of volunteers. These markers comprised (a) the CD4 : CD8 ratio, (b) cellular activation of
CD8+ T cells, measured by human
leuco-cyte antigen (HLA)-DR expression, (c) the
Vd1 : Vd2 ratio and (d) the percentage of
CD4+ T cells, was statistically lower in controls (057%,
IQR 033–093) when compared with the other three
groups (109%, IQR 062–285;P= 003). No statistically
Central memory
Effector memory
Control HIV HIV–leprosy Leprosy 0
10 20 30 40
P < 0·01
Control HIV HIV–leprosy Leprosy 0
10 20
(b)
(c)
P < 0·01
Control HIV HIV–leprosy Leprosy 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
P < 0·01
CCR7
+ CD45RA – % in CD4 + T cells
CCR7
– CD45RA – % in CD4 + T cells
CCR7
+ CD45RA + % in CD4 + T cells
Figure 2.Distribution of cellular maturation markers of CD4+ T
cells. Cellular subpopulations were determined by the expression of
CCR7 and CD45RA after gating on CD3+CD4+cells. The
percent-age of (a) naı¨ve (CCR7+CD45RA+), (b) central memory (CCR7+
CD45RA)) and (c) effector memory (CCR7)CD45RA)) cells are
depicted for all groups of subjects. HIV, human immunodeficiency virus.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 6 7 (c) (b) CD4
+ T cells producing IL-4 (%)
r = –0·5861; P = 0·0003
30 40 50 60 70 80 90 100 CCR7–CD45RA– among CD4+ T cells (%)
CCR7–CD45RA– among CD4+ T cells (%)
0 1 2 3 4 5 6 7 CD4
+ T cells producing IL-4 (%)
r = 0·4791; P = 0·0041
SSC
IL-4
0 102 103 104 105
0 1000 2000 3000 4000 0·42%
0 102 103 104 105
4·25%
Figure 3. Interleukin-4 (IL-4) production was determined by intra-cellular staining and flow cytometry after stimulation with
iono-mycin and phorbol 12-myristate 13-acetate for 16 hr. (a) The IL-4+
gate was set for cells producing high levels of cytokine. The level of IL-4 production was negatively correlated with the percentage of
central memory (CCR7+CD45RA)) CD4+T cells (b) and positively
correlated with effector memory (CCR7)CD45RA)) CD4+ T cells
