UNIVERSIDADE ESTATUAL PAULISTA – UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – CÂMPUS DE RIO CLARO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MESTRADO EM ZOOLOGIA
DIVERSIDADE GENÉTICA E CONSIDERAÇÕES SOBRE
Elachistocleis cesarii (MIRANDA-RIBEIRO, 1920)
Aluno: Vinicius Simões de Almeida Loredam
Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad
Co-Orientador: Victor Goyannes Dill Orrico
VINICIUS SIMÕES DE ALMEIDA LOREDAM
DIVERSIDADE GENÉTICA E CONSIDERAÇÕES SOBRE
Elachistocleis cesarii (MIRANDA-RIBEIRO, 1920)
Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Zoologia).
Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad Co-Orientador: Victor Goyannes Dill Orrico
Claro, 2015
86 f. : il., figs., gráfs., tabs., fots., mapas
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad Coorientador: Victor Goyannes Dill Orrico
1. Anfíbio. 2. Anura. 3. Microhylidae. 4. 16S. 5. CO1. I. Título.
Victor Dill pela confiança em mim depositada e toda a assistência prestada durante o desenvolvimento deste projeto.
Agradeço a Mariana Lyra, Délio Baeta, Bianca Berneck, Ariadne Sabbag, Francisco Brusquetti, Thais Condez, Nadya Pupin, Leo Malagolli e todas as pessoas que me ajudaram direta ou indiretamente nesse aprendizado e pelo convívio agradável do dia a dia.
Agradeço aos pesquisadores, curadores e as coleções herpetológicas que contribuíram de maneira tão significativa para a realização deste estudo:
Dra. Cynthia Prado — UNESP Jaboticabal Dr. Daniel Loebmann — FURG
Francisco Brusquetti — IIPBH Dra. Glaucia Pontes — PUC-RS Dr. Hussam Zaher — MZUSP Dr. Julian Faivovich — MACN Dr. Marcelo Napoli — UFBA Dr. Miguel Trefaul — USP Dr. Natan Maciel — UFG Dra. Paula Valdujo — WWF Dr. Paulo Garcia — UFMG
Dr. Pedro Peloso — AMNH / MPEG Dr. Robson Ávilla — URCA
Agradeço também ao Idea Wild pelo belo trabalho desenvolvido, em especial
Ann Marie Gage por todo o apoio e pela doação de equipamentos, que sem dúvida foi e será de grande valia.
Ao Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP, Rio Claro (CEIS), em especial ao Prof. Dr. Maurício Bacci Jr., pela permissão no uso de suas instalações para as análises moleculares.
“A noble spirit embiggens the smallest man”
Para instituições:
CFBH Coleção de anfíbios “Célio F. B. Haddad” - UNESP Rio Claro UNESP Universidade Estadual Paulista
USP Universidade de São Paulo
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais UFG Universidade Federal de Goiás
URCA Universidade Regional do Cariri UFBA Universidade Federal da Bahia
FURG Fundação Universidade Federal do Rio Grande MNRJ Museu Nacional, Rio de Janeiro
MPEG Museu Paraense “Emílio Goeldi”
MCP Museu de Ciências e Tecnologia da PUC-RS
MACN Museo Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino Rivadavia” IIBP Instituto de Investigaciones Biológicas del Paraguay
AMNH American Museum of Natural History – Estados Unidos da América
Para as espécies e amostras:
BB Elachistocleis bumbameuboi BC Elachistocleis bicolor
CS Elachistocleis cesarii CV Elachistocleis carvalhoi HE Elachistocleis helianneae MN Elachistocleis magnus MO Elachistocleis matogrosso
OV Elachistocleis ovalis PE Elachistocleis pearsei PN Elachistocleis panamensis PS Elachistocleis piauiensis SU Elachistocleis surumu sp. espécie não identificada
Para o grupo externo:
DM Dermatonotus muelleri MH Microhyla heymonsi
Para os países:
AR Argentina BO Bolívia BR Brasil CO Colômbia GU Guiana
PN Panamá PY Paraguai UR Uruguai VE Venezuela
necessidade de uma revisão taxonômica do gênero em seus trabalhos, alegando a presença de complexos de espécies ainda a serem descritos e, apesar do avanço da genética como ferramenta taxonômica nas últimas duas décadas, nenhum trabalho desse tipo foi realizado para as espécies do gênero. Nesse estudo foi
avaliada a diversidade genética de Elachistocleis cesarii com considerações
taxonômicas, além de buscar entender suas relações com as demais espécies do gênero. Uma abordagem integrativa, usando dados moleculares e morfológicos, foi utilizada. Foram encontrados baixos valores de divergência genética dentro da espécie e em comparação com as demais de ventre manchado, assim como uma sobreposição geográfica e de caracteres morfológicos, nos levando a crer que o
gênero Elachistocleis contém espécies que devem ser sinonimizadas.
Palavras-chave: Anura. Microhylidae. 16S. CO1.
ABSTRACT
The genre Elachistocleis is currently composed of 16 species aside from
Elachistocleis ovalis, considered species inquirenda. Several authors indicate the
necessity of an taxonomic revision in their work, citing the presence of complex of species to be described and, despite the advance of genetic and taxonomic tools in the last two decades, no such work was carried out from this genre. In this study we
evaluated the genetic diversity of Elachistocleis cesarii with taxonomic
considerations, and seek to understand it relationship with the other species of the genus. An integrative approach, using molecular and morphological data was used. Low genetic diversity values were found within species and compared with other spotted belly, as well as geographical and morphological characters overlap, leading
us to believe that the Elachistocleis genus contains species that should be
synonymized.
1. INTRODUÇÃO ... 10
OBJETIVOS ... 14
2. MATERIAIS E MÉTODOS ... 15
2.1. MATERIAL DE ESTUDO ... 15
2.2. TRABALHO DE CAMPO ... 15
2.3. DADOS MOLECULARES ... 15
2.3.1. Análise dos dados moleculares ... 17
2.3.2. Grupo Externo ... 19
2.3.3. Teste de mantel ... 19
2.4. DADOS MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS ... 20
2.4.1. Caracteres Morfométricos ... 20
2.4.2. Caracteres morfológicos e seus estados ... 22
2.4.3. Análise dos dados morfométricos e morfológicos ... 26
3. RESULTADOS ... 28
3.1. DISTÂNCIAS GENÉTICAS... 28
3.1.1. Clados ... 32
3.2. TESTE DE MANTEL ... 39
3.3. DADOS MORFOMÉTRICOS E MORFOLÓGICOS ... 40
4. DISCUSSÃO ... 46
4.1. ELACHISTOCLEIS CESARII ... 46
4.1.1. Diagnose de Elachistocleis cesarii ... 46
4.1.2. Vocalização de Elachistocleis cesarii ... 47
4.3. TESTE DE MANTEL ... 50
4.4. MORFOLOGIA ... 51
4.4.1. Estágios larvais em Elachistocleis ... 51
4.5. OUTROS AGRUPAMENTOS ... 53
5. CONCLUSÕES ... 55
APÊNDICE B – PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA ... 75
APÊNDICE C – LISTA DE TECIDOS USADOS NESTE ESTUDO. ... 76
APÊNDICE D – ÁRVORES 16S E CO1 DAS AMOSTRAS USADAS ... 81
APÊNDICE E – DISTÂNCIAS GENÉTICAS ENTRE AS UMTOs DESTE ESTUDO. ... 85
1. INTRODUÇÃO
A Família Microhylidae Günther, 1858 é representada atualmente por 564 espécies distribuídas em 11 subfamílias e totalizando 68 gêneros. As subfamílias mais numerosas são Asterophryinae (298 spp.), Cophylinae (66 spp.), Gastrophryninae (70 spp.) e Microhylinae (82 spp.), totalizando 572 espécies, aproximadamente 90% do total de espécies desta família (FROST, 2015). O gênero
Elachistocleis Parker, 1927 faz parte da família Gastrophryninae e é composto atualmente por 16 espécies válidas, além de E. ovalis, considerado nomen dubium
associado a species inquirenda por Caramaschi (2010) — lista das espécies na Tabela 1. Este gênero apresenta uma ampla distribuição pela América do Sul cis-andina e América Central, possuindo registros desde a Argentina até o Panamá (FROST, 2015).
O histórico taxonômico do grupo é extenso, incluindo as designações genéricas Rana L., 1758 (SCHNEIDER, 1799), Bufo GARSAULT, 1764 (DAUNDIN, 1802), Engystoma FITZINGER, 1826, Microps WAGLER, 1830, Dactylethra
CUVIER, 1829, Stenocephalus TSCHUDI, 1838, Gastrophryne STEJNEGER, 1910 e finalmente Elachistocleis com a descrição do gênero por Parker em 1927, separando-o de Gastrophryne (Engystoma) e Chiasmocleis – detalhes e comentários em FROST, 2015.
A espécie designada por Parker (1927) para representar o gênero foi
Elachistocleis ovale (SCHNEIDER, 1799) e as características diagnósticas propostas por ele para o gênero foram: pupila redonda; língua elíptica, inteira e livre posteriormente; palato posteriormente com dois sulcos transversais, lisos ou ligeiramente crenulados, o anterior ligeiramente curvado; clavícula presente, minúscula, curvada, não passando lateralmente do meio do coracóide; omosterno ausente; o esterno é uma placa cartilaginosa; pontas dos dedos não dilatadas; falanges terminais simples (PARKER, 1927). Na época o gênero apresentava duas variedades, E. ovale ovale (SCHNEIDER, 1799) e E. ovale bicolor (GUÉRIN-MÉNEVILLE, 1838). Uma informação importante vem na sequência da descrição de Parker (1927):
portanto, que as duas sejam realmente espécies distintas, intimamente próximas e morfologicamente quase indistinguíveis. Existem, no entanto, as diferenças constantes na cor, embora a cor das superfícies dorsal, o que anteriormente vinha sendo utilizado para distingui-los, não forneça nenhuma distinção definitiva”.
Parker (1927) concluiu que a característica que distinguia as duas espécies era a coloração ventral sendo E. o. ovale com ventre vermiculado e E. o. bicolor com ventre imaculado (PARKER, 1927). No entanto, em sua monografia, Parker (1934) muda sua definição, passando a considerar E. bicolor como a variedade de ventre manchado, além de fazer uma breve menção à presença de espinhos dérmicos no dorso, mãos, pés, queixo e gula de alguns machos.
Dunn et al. (1948) descrevem Chiasmocleis panamensis, que em 2012 passaria a fazer parte do gênero Elachistocleis (ver de Sá et al. 2012). Em 1949, Dunn resgata a ideia original de Parker (1927) sobre a questão da coloração ventral e adiciona uma observação sobre E. pearsei, ressaltando ter visto E. pearsei e E. ovalis em campo e, portanto, não considerando-as raças vicariantes, corroborando a anotação de Ruthven (1914) de que elas ocorriam juntas em Fundación, Colômbia.
Durante os anos seguintes poucos trabalhos envolveram espécies do gênero, com destaque para Cochran (1955), Nelson (1973), Caramaschi & Jim (1983) e Kwet & Di-Bernardo (1998). Até que em 2003, Lavilla e colaboradores descreveram uma espécie nova para o gênero e fizeram uma revisão histórica das espécies descritas até então. Inclusive, apresentando a transcrição da descrição original de Rana ovalis
A proposta operacional de Lavilla et al. (2003) ganhou força como pode ser observado em diversas coleções e trabalhos publicados (e.g. Rossa-Feres & Nomura, 2006; Rossa-Feres et al. 2011) onde as designações E. ovalis e E. bicolor
ainda são usadas frequentemente, mesmo após a revalidação de E. cesarii por Toledo et al. (2010) e a descrição de oito espécies novas desde então.
Além dos problemas taxonômicos intraespecíficos, há também problemas de identificação, sendo comum que exemplares depositados em coleções zoológicas sejam encontrados sem uma identificação ao nível específico (“aff.”, “cf.” ou “sp.” são registros usuais). Essa falta de precisão pode se perpetuar em listas de espécies e levantamentos de anurofauna, impactando negativamente em programas que visam à proteção da biodiversidade, além de dificultar o entendimento da evolução e da distribuição geográfica do grupo (e.g. Rossa-Feres et al., 2011; Magalhães et al., 2013).
Miranda-Ribeiro (1920) determinou três variedades de Engystoma ovale
encontradas no Museu Paulista (atual MZUSP), são elas Engystoma ovale cesarii
(18 spp.), E. ovale lineatum (2spp.) e E. ovale concolor (5 spp.), além de reportar a presença de um indivíduo num frasco com a seguinte informação manuscrita “Engystoma cesarii mottæ, Iher. S. Paulo”. Miranda-Ribeiro apresenta apenas o município de origem dos indivíduos e não determinando um tipo ou localidade tipo dessas variedades, sendo todas do estado de São Paulo (Os Perus, Ypiranga, Alto da Serra, Rio Grande da Serra, Cubatão e Piquete). Com o fim do segundo império, o estado e a cidade de São Paulo tiveram um crescimento econômico e populacional que transformou um centro regional em uma metrópole nacional (PMSP, 2005). Essa expansão demográfica e econômica trouxe consigo transformações ambientais significativas resultando em poucas áreas ainda não antropizadas.
Nos anos seguintes, Parker (1927, 1934) e Dunn (1949) publicaram trabalhos importantes para o gênero e E. cesarii passou a ser visto como sinônimo de E. ovalis
coloração ventral branca ou amarelada com reticulado cinza; presença de uma glândula comissural e tímpano indistinto (TOLEDO et al., 2010).
Tabela 1: Espécies de Elachistocleis, localidades tipo e autores.
Espécie Município Departamento Estado / País Autor
E. bicolor Buenos Aires Capital Federal Argentina Guérin-Méneville (1838)
E. bumbameuboi São Luis Maranhão Brasil Caramaschi (2010)
E. carvalhoi Aragominas Tocantins Brasil Caramaschi (2010)
E. cesarii Piquete São Paulo Brasil Miranda-Ribeiro (1920)
E. erythrogaster São Francisco de Paula Rio Grande do Sul Brasil Kwet & Di Bernardo (1998)
E. haroi El Algorrobal Jujuy Argentina Pereyra et al (2013)
E. helianneae Humaitá Amazonas Brasil Caramaschi (2010)
E. magnus Espigão D'oeste Rondônia Brasil Toledo (2010)
E. matogrosso Cuiabá Mato Grosso Brasil Caramaschi (2010)
E. muiraquitan Xapuri Acre Brasil Nunes de Almeida & Toledo (2012)
E. surumu Pacaraima Roraima Brasil Caramaschi (2010)
E. panamensis El Cope Old Panamá Panamá Dunn et al. (1948)
E. pearsei - Fundacíon Colômbia Ruthven (1914)
E. piauiensis Picos Piauí Brasil Caramaschi & Jim (1983)
E. skotogaster El Toldos Salta Argentina Lavilla et al (2003)
E. surinamensis - - Suriname Daudin (1802)
E. ovalis - - - Schneider (1799)
Apesar dos estudos recentes, ainda existem várias questões taxonômicas associadas às espécies de Elachistocleis,com indícios que reforçam a necessidade de uma exaustiva revisão taxonômica que permita reavaliar a riqueza de espécies do gênero (e.g. Lavilla et al., 2003; Caramaschi, 2010). Essas questões estão relacionadas, em parte, ao grande aumento de material disponível em coleções nas últimas décadas, o que culminou no aumento exponencial de dados disponíveis, nos permitindo avaliar melhor as variações intra e interespecíficas das espécies a partir de diferentes fontes de dados. A continuidade no uso do binômio Elachistocleis ovalis pela comunidade cientifica (e.g. Schalk et al., 2013, exceto no Brasil e Argentina, é mais um ponto que reforça a necessidade de novos estudos.
um complexo de espécies ainda indistintas sob o nome Elachistocleis cesarii. Uma abordagem integrativa é proposta para solucionar essas questões taxonômicas, com enfoque principal em dados genéticos, que permitem o reconhecimento de eventuais novas linhagens ou linhagens parafiléticas ou polifiléticas, e em dados morfológicos, para que pudéssemos confrontar as diagnoses propostas. O uso da genética como ferramenta taxonômica vem crescendo ao longo dos últimos 20 anos, no entanto nenhum trabalho foi publicado tendo como enfoque espécies do gênero, fazendo desse o primeiro trabalho filogenético do grupo. Há, no entanto, trabalhos envolvendo microhilídeos que incluíram dados de Elachistocleis (e.g. de SÁ et al., 2012).
O status de conservação das espécies do gênero é, de maneira geral, pouco preocupante. A exceção é E. erythrogaster, conhecido apenas para a localidade tipo e áreas próximas, além de longo período sem coleta (T. G. Santos, com. pess.). Para Elachistocleis cesarii, o status é “menos preocupante” (Least Concern - LC), segundo a Lista Nacional de Espécies Ameaçadas de Extinção (SUBIRÁ et al., 2012); porém a espécie não consta na lista vermelha da IUCN. É importante ressaltar que o status está sujeito a mudanças de acordo com novos estudos de revisão taxonômica e distribuição geográfica das espécies.
OBJETIVOS
Os objetivos desse estudo foram avaliar a diversidade genética de
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo foi baseado prioritariamente no uso de dados moleculares e morfológicos de Elachistocleis cesarii e de outras espécies do gênero, obtidos a partir de coleções zoológicas e de tecido.
2.1. MATERIAL DE ESTUDO
Foram utilizadas amostras de tecidos e exemplares das seguintes coleções: CFBH, FURG, URCA, UFBA, UNESP — Jaboticabal, PUC-RS, UFMG, MTUR, UFG, MACN e IIBP.
Foi realizada uma visita ao MZUSP para a observação dos exemplares de E. cesarii descritos por Miranda-Ribeiro e também para o levantamento de dados morfológicos. Para material examinado, ver Apêndice A.
2.2. TRABALHO DE CAMPO
Os esforços de coleta foram pontuais, restringindo-se a duas localidades da série tipo de E. cesarii, de forma a complementar os dados obtidos em coleções.
A primeira delas foi à cidade de São Paulo (SP), mais especificamente no Projeto Pomar Urbano, localizado na margem do rio Pinheiros; neste local foi coletado um exemplar de Elachistocleis ovalis em 2006, durante um levantamento de herpetofauna (VIZIOLI, 2007). Entretanto, nossa visita não foi bem sucedida e outras tentativas foram descartadas devido às características do ambiente, como constantes remodelagens do local com obras e paisagismo.
A segunda localidade foi a cidade de Piquete, localizada no interior do estado de São Paulo, entre a Serra do Mar e a Serra da Mantiqueira. Durante as buscas o canto da espécie foi ouvido em diversos trechos e três exemplares foram coletados.
2.3. DADOS MOLECULARES
Para as análises moleculares utilizamos algumas sequências de DNA recuperadas da base de dado online Genbank e outras de populações de
utilizando o Protocolo de Extração de DNA por Acetato de Amônio (MANIATIS et al., 1982), com algumas adaptações (Mariana Lyra, Lab. Herpeto UNESP-RC) ver apêndice B.
Foram escolhidos dois fragmentos de genes mitocondriais frequentemente usados na literatura (e.g. Vences et al., 2005a; 2005b; de Sá et al., 2012; Peloso et al., 2014) e de fácil comparação. São eles: CO1 (Cythocrome oxidase Subunit 1) e 16S. Os primers usados foram: Anf1 e AnR1 (JUNGFER et al., 2013) para CO1 e 16S AR e 16S BR (PALUMBI et al., 2002) para 16S (ver tabela 2), ambos os primers
com caudas, M13_F (CTGGCCGTCGTTTAC) e M13_R (CAGGAAACAGCTATA). As sequências foram amplificadas usando o método de PCR (Polymerase Chain Reaction) em termociclador com as seguintes configurações: 3 minutos para desnaturação inicial a 95ºC, seguido por 36 ciclos de 20 segundos para desnaturação a 95ºC; 20 segundos para anelamento a 51ºC e 60 segundos para extensão a 60ºC. Ao final é realizada uma etapa para extensão por 7 minutos a 60ºC.
Após esse processo uma alíquota das amostras é aplicada em gel de agarose a 1% em cuba de eletroforese, onde ficavam de 25 a 40 minutos dependendo das proporções geométricas do gel e da corrente aplicada. Por fim, as amostras funcionais foram enviadas para sequenciamento na empresa MACROGEN (Seul, Coréia do Sul).
Tabela 2: Sequências dos primers usados. Primers
Sequências
16S AR 5'-CGCCTCTTGCTTAAAAACAT-3' 16S BR 3'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-5' CO1 AnF1 5'-ACHAAYCAYAAAGAYATYGG-3' CO1 AnR1 3'-CCRAARAATCARAADARRTGTTG-5'
do estado/país de origem da amostra (e.g. VL025_OV_SP), informações detalhadas das amostras no Apêndice C. Para os estados brasileiros foi utilizado o padrão usual de abreviação. Para as espécies: OV = Elachistocleis ovalis; BC = E. bicolor; CS =
E. cesarii; CV = E. carvalhoi; PS = E. piauiensis; BB = E. bumbameuboi; HE = E. helianneae; MO = E. matogrosso; MN = E. magnus; PN = E. panamensis; PE = E. pearsei; SU = E. surumu.
2.3.1. Análise dos dados moleculares
As sequências obtidas de cada gene foram editadas para remoção dos
primers e trechos de baixa qualidade no software SEQUENCER 4.5 (Gene Codes Corporation, Michigan, USA) e as sequências forward e reverse foram unidas em uma única sequência consenso. Estas foram exportadas como arquivos de texto no formato FASTA. Posteriormente as sequências foram alinhadas, juntamente com as sequências do grupo externo, no software MEGA 6.0 (TAMURA et al., 2013) utilizando o algoritmo MUSCLE com configurações em default, além de eventuais correções manuais. Nesse mesmo software, foram realizadas análises preliminares em busca por sequências contaminadas e outros eventuais problemas.
Essas matrizes foram então convertidas em formato TNT com auxilio do
software MESQUITE 2.75 (MADDISON & MADDISON, 2011), no qual as matrizes dos genes foram concatenadas.
As análises filogenéticas e a geração das árvores foram realizadas no
software TNT 1.1 (GOLOBOFF et al., 2000), a partir das matrizes dos genes 16S, CO1 e concatenadas, uma de cada vez, como dados de entrada. As árvores dos genes separados apresentam alguns terminais e clados que não estão presentes na árvore concatenada devido à falta de complementaridade, o que fazia com que os valores de suporte caíssem bruscamente. Essas árvores estão disponíveis no apêndice D. As configurações das análises foram as mesmas para todas as matrizes, sendo primeiramente definido o grupo externo (amostra GB44_MH_XX —
As configurações sugeridas foram aceitas sem alterações nos parâmetros e buscando 250 vezes por árvores com menor quantidade de passos.
O algoritmo sectorial search trabalha com partes pequenas do conjunto de dados de forma a rearranjá-los e realocá-los diversas vezes, enquanto o algoritmo
treedrift aceita árvores com valores subótimos nos rearranjos e, por fim, o algoritmo
tree-fusing combina e compara clados compatíveis em diferentes árvores, sempre com a finalidade de encontrar a árvore mais parcimoniosa (GOLOBOFF, 1999).
Após análise a árvore consenso (conjugado das árvores mais parcimoniosas) foi salva para então ser reamostrada (resampling) usando jackknife (FARRIS et al., 1996) (algoritmo de remoção independente de caracteres) no valor padrão (36), replicando a busca 1000 vezes usando os mesmos parâmetros da busca inicial, apenas limitando a quantidade de encontros da melhor árvore para 5.
Os clados [ou tecnicamente mais apropriado nesse caso, Molecular Operational Taxonomic Unit – MOTU (BLAXTER et al., 2005), em português Unidade Molecular Taxonômica Operacionais – UMTO], foram agrupados com base na estrutura da árvore mais parcimoniosa, sempre mantendo o monofiletismo e valores de suporte ≥70 de Jackknife. Essas UMTOs foram nomeadas tentativamente a partir de dados geográficos. Desses clados definidos inicialmente, foram calculadas as divergências genéticas dentro dos clados e entre eles, buscando evidências que corroborassem a delimitação dos agrupamentos; algumas mudanças foram feitas nos grupos que apresentavam valores discrepantes comparados aos demais.
2007) ou casos de linhagens genéticas muito divergentes que não representam espécies distintas (falsos positivos) (MEYERS & PAULAY, 2005).
Vences et al. (2005a, 2005b) sugerem valores de divergência genética de 5% e 10%, para os genes 16S e CO1 em anfíbios, respectivamente. Em teoria, esses valores representariam um ponto de clara distinção entre as divergências intraespecíficas e interespecíficas em anfíbios; porém, eles podem variar e não devem ser encarados como pontos de corte absolutos, necessitando de uma análise caso a caso.
Com base nos agrupamentos recuperados na árvore filogenética e corroborados pelo distanciamento genético dos espécimes, os clados foram organizados e a distância genética média entre e dentro dos grupos foi calculada no
software MEGA 6.0.
Os gaps (ou indels) foram interpretados como quinto estado, estando presentes apenas nas sequências 16S e, em geral, devido ao alinhamento com as sequências do grupo externo.
2.3.2. Grupo Externo
O grupo externo foi escolhido com base em grupos previamente utilizados na literatura (e.g. de SÁ et al., 2012; PELOSO et al., 2014). Foram utilizadas sequências de DNA, obtidas principalmente no Genbank e as espécies escolhidas foram Dermatonotus muelleri (Gastrophryninae), grupo irmão de Elachistocleis e
Microhyla heymonsi (Microhylinae), uma espécie mais afastada, ambos da Família Microhylidae.
2.3.3. Teste de mantel
O teste de Mantel tem como objetivo testar a dissimilaridade entre duas matrizes de distância, no caso distância genética e geográfica, em busca de co-dependência entre as variáveis.
pelas coordenadas de latitude e longitude em grau decimal e outra matriz contendo o nome das amostras e as respectivas sequências do gene 16S. Resultado apresentado na figura 10.
2.4. DADOS MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS
Foram observados 14 caracteres da morfologia externa e quatro caracteres morfométricos, além das relações entre esses caracteres, de 458 indivíduos adultos e fixados de diversas populações do gênero Elachistocleis. Desses, 67 indivíduos foram identificados a priori como E. cesarii. A escolha dos caracteres que foram mensurados seguiu alguns caracteres já usados em outros trabalhos, como nas descrições das espécies do gênero. A tabela 3 apresenta uma lista de todos os caracteres morfológicos e morfométricos usados por nós juntamente com a informação de que outros pesquisadores também usaram.
Os espécimes foram sexados com base nos caracteres sexuais secundários, como presença de saco vocal nos machos e presença de ovócitos maduros nas fêmeas. Eventualmente, a presença de fendas vocais (exclusividade dos machos) também foi verificada. Para a observação de caracteres diminutos foram usadas lupa e estereomicroscópio (Zeiss) e para os dados morfométricos foi usado um paquímetro digital de precisão 0,01 mm (Mitutoyo).
2.4.1. Caracteres Morfométricos
- Comprimento Rostro-Cloacal (CRC) (sensu Duellman, 2001) Comprimento da ponta do focinho até a cloaca (Fig. 1).
- Comprimento da Cabeça (CC) (sensu Duellman, 2001)
Comprimento da comissura bucal até a ponta do focinho (Fig. 1).
- Largura da Cabeça (LC) (sensu Duellman, 2001)
Largura da cabeça obtida entre as comissuras bucais (Fig. 1).
Largura do corpo medida entre as axilas. A adoção desta medida foi uma tentativa de diminuir a interferência causada por fêmeas ovadas que, em geral, são muito mais largas, e assim obter medidas e proporções corpóreas mais realistas para comparações (Fig. 1).
Também foram calculadas as relações: CC/LC; CC/CRC; LC/LA e LA/CRC. Esses resultados são apresentados nas figuras 14a — 14d em valores percentuais. A utilização de proporções aparece em alguns trabalhos de descrição de espécies do gênero Elachistocleis (e.g. Caramaschi & Jim, 1983; Caramaschi, 2010; Toledo, 2010).
Tabela 3: Lista de caracteres morfométricos e morfológicos usados neste estudo e por alguns outros autores. Descrição dos caracteres abaixo.
Caracteres morfológicos e morfométricos CC/ CC/
CRC CC LC LC CRC CD LD CV CVM LDVC LF LT AXL VIR GPC Toledo et
al. (2010) X - - X - X X X - - X X X X X
Caramaschi
(2010) X X X X - X X X - - X X X X X
Toledo
(2010) X - X X X - - X X X X X
Nunes de Almeida & Toledo (2012)
X X X X - X X - - X - X X X
Caramaschi & Jim
(1983) X X X - X X X - - X - X X X
Pereyra et
al. (2013) X X X X X X X X - X X X - - -
Ruthven
(1914) X - - - - X X X X X - X X -
Dunn et al.
(1948) X - - - - X X X X X X X - - -
Figura 1: Diagrama esquemático das medidas usadas neste estudo (adaptado de DUELLMAN, 2001). Veja o texto para maiores detalhes.
2.4.2. Caracteres morfológicos e seus estados
Os caracteres morfológicos, baseados em cor e forma, geralmente carregam consigo um grande peso de subjetividade relativa ao ponto de vista do observador devido às condições de iluminação, conservação do espécime e o próprio observador. De forma a minimizar esses efeitos, tentamos eliminar as variáveis subjetivas e os dados morfológicos foram observados e analisados da maneira mais simples possível.
- Coloração Dorsal (CD): Coloração dorsal predominante.
1 – Cinza uniforme 2 – Marrom
- Linha Dorsal (LD):
Linha medial dorsal, comumente branca ou clara, que pode ou não estar presente. Quando presente, esta pode apresentar formas irregulares (não completamente retilíneas), com larguras e comprimento diversos.
0 – Ausente 1 – Branca 2 – Preta*
3 – Preta e branca
* Apesar da coloração dorsal dos exemplares ser geralmente escura, é possível observar uma linha bem definida e mais escura em alguns exemplares.
- CV (Coloração Ventral) e CVM (Coloração Ventral dos Membros):
A coloração ventral (CV) e a coloração ventral dos membros (CVM) foram baseadas no padrão predominante de cor e se tratam de caracteres relevantes principalmente considerando-se a viabilidade prática de observá-los em exemplares preservados, bem como durante atividades de campo. Os estados desses caracteres podem ser vistos na prancha da Figura 2 e uma descrição formal de cada estado segue abaixo:
0 - Imaculada: Matriz amarelada (creme) ou branca, por vezes com uma grande mancha de mesma coloração e tonalidade mais intensa, no tórax. Não apresenta outros tipos de mancha.
1 – Branco com manchas escuras: Matriz predominantemente clara com pontuações acinzentadas e agrupamentos esparsos de pontos pretos formando manchas discretas e disformes.
2 – Marrom com manchas claras: Matriz clara evidenciada por manchas de tamanho médio em meio ao predomínio de manchas escuras (geralmente marrons) dando uma impressão de “escuro com manchas claras”.
4 – Escuro com manchas claras: Matriz clara ou marrom claro evidenciada por manchas de tamanho pequeno e predomínio de manchas escuras pouco densamente pontuadas, dando uma impressão de “escuro com manchas claras”.
5 – Claro com manchas escuras (variando de marrom a preto): Predomínio da matriz clara que fica evidente através de manchas grandes e aglomerados disformes de pontos escuros com adensamento variado.
6 – Claro com manchas escuras: Predomínio da matriz clara, com pontos mais claros esparsos e pequenos aglomerados escuros densamente pontuados e disformes.
- Limite Dorso-Ventral de Coloração (LDVC):
0 – Bem definido: Quando ocorre uma clara distinção entre a coloração ventral e dorsal.
1 – Progressivo: Quando as colorações do flanco dorsal e ventral apresentam gradiente, sem que seja possível uma clara distinção dos limites.
- Linha Femoral - Retilínea (LFR):
Mancha femoral em formato de linha, comumente de coloração clara que cruza a parte posterior da coxa, podendo ou não passar sobre a região cloacal e apresentar diversidade na largura e na regularidade das bordas.
0 – Ausente 1 – Presente
- Linha Femoral - Não Retilínea (LFNR):
Mancha femoral em formato de pontuações na parte posterior da coxa, comumente de coloração clara, podendo ou não passar sobre a região cloacal e de intensidade variável (pouco manchada até muito manchada).
- Linha Tibial - Retilínea (LTR):
Mancha tibial em formato de linha na parte interior da tíbia. Geralmente de cor clara. Pode apresentar largura variada e irregularidades nas bordas.
0 – Ausente 1 – Presente
- Linha Tibial - Não Retilínea (LTNR):
Mancha tibial em formato de pontuação na parte interior da tíbia, sendo geralmente de cor clara. Pode apresentar largura e quantidade de pontuações variável além de formato irregular.
0 – Ausente 1 – Presente
- Manchas axilares (AXL):
Manchas claras presentes na região axilar (axila, parte posterior do braço e região lateral do tórax próximos às axilas), podendo variar de uma mancha única até várias manchas pequenas aglomeradas.
0 – Ausentes 1 – Presentes
- Manchas Inguinais (VIR):
Manchas claras presentes na região inguinal (virilha, parte anterior da coxa e região lateral do tórax próximos à virilha), podendo variar de uma mancha única ou várias manchas pequenas aglomeradas.
0 – Ausentes 1 – Presentes
- Glândula pós-comissural (GPC):
diretos e indiretos de hormônios que podem ou não estar ligados ao estado reprodutivo (WOODLEY, 2015), levando a observações, eventualmente, enviesadas. Preferimos, portanto, ser conservativos e manter apenas dois estados para esse caractere.
0 – Ausente 1 – Presente
- Espinhos Dérmicos Cloacais (EDC) e Gulares (EDG):
A presença de espinhos dérmicos é comum entre os microhilídeos (e.g. PARKER, 1934; NELSON, 1973; LEHR & TRUEB, 2007; PELOSO et al., 2014). Estes são projeções, aparentemente queratinizadas, levemente curvas e pequenas, geralmente visíveis apenas com auxílio de estereomicroscópio, na região posterior do corpo, próximas à cloaca, eventualmente encontrado na superfície dorsal da coxa e posterior do dorso (EDC). Os espinhos dérmicos gulares (EDG) são menores que os EDC e visíveis apenas com auxilio de estereomicroscópio em grandes aumentos, sendo encontrados na região do arco mandibular e, eventualmente, na superfície gular. Também são observados na parte interior dos membros anteriores de alguns indivíduos.
0 – Ausentes 1 – Presentes
2.4.3. Análise dos dados morfométricos e morfológicos
Para a análise dos dados morfométricos (quantitativos) foi realizada uma análise de PCA (Principal Component Analysis) no software PAST 3.07 (HAMMER et al., 2001), buscando identificar algum grau de variação entre as UMTOs analisadas. Também foram gerados gráficos “Box Plot”, que calculam a mediana e os quartis (inferior = 25% dos menores valores; superior = 75% de todas as medidas) — representados pela “caixa” e segmentos de reta que conectam os extremos da caixa aos valores extremos.
3. RESULTADOS
Foram analisadas 191 sequências do gene 16S (~545 pb) e 180 do gene CO1 (~645 pb), ambos mitocondriais, resultando nas árvores do Apêndice D. Uma matriz com os genes concatenados foi gerada e todas as sequências que não apresentavam os dois genes foram removidas, já que se agrupavam aleatoriamente, gerando uma matriz com 158 terminais e cerca de 1190 pares de bases. Foi realizada análise de parcimônia usando o método de busca New Technology Search, obtendo o melhor score de 837 com retenção de 213 árvores, um consenso seguido de reamostragem foi realizado resultando na árvore da Figura 3, que será detalhada ao longo do texto (Figuras 4 — 8).
Devido a grande quantidade de árvores retidas (213), foi realizado o processo de pruning pelo TNT que, grosso modo, busca por terminais que estejam instáveis na topologia da árvore, causando o acumulo de árvores similares. Foram testados valores entre 1 e 15, sem melhoria dos resultados.
Em todas as árvores geradas observou-se a presença de dois grandes clados muito bem suportados (jackknife = 100) que, após a análise morfológica dos exemplares testemunhos, percebemos que correspondiam às populações de ventre imaculado e às de ventre manchado. Cada um desses clados está subdividido em subclados que foram nomeados, em sua maioria, tentativamente com base em dados geográficos, como maior proximidade à localidade tipo, além de dados morfológicos. No entanto, as únicas populações com identidade confirmada são E. bumbameuboi (holótipo) e E. cesarii. Portanto, a utilização de UMTOs foi uma forma operacional de viabilizar as análises.
3.1. DISTÂNCIAS GENÉTICAS
Tabela 4: Distâncias genéticas médias e erro padrão dentro dos clados. Valores expressos em %. N refere-se ao total de amostras para cada gene.
Elachistocleis cesarii destacada em negrito.
CLADOS 16S N (191) CO1 N (180)
OG1 - 1 - 1
OG2 - 1 - 1
BICOLOR 0,334 ± 0,16 5 0,979 ± 0,27 4 HELIANNEAE 1,673 ± 0,54 2 2,492 ± 0,61 2 MATOGROSSO 1,087 ± 0,26 29 1,795 ± 0,32 11 CESARII 0,521 ± 0,13 67 0,980 ± 0,20 70 BUMBAMEUBOI 0,485 ± 0,16 18 1,163 ± 0,23 20 PANAMENSIS 0,186 ± 0,18 2 0,468 ± 0,25 2
PEARSEI 0,186 ± 0,18 2 - 0
SURUMU 0,310 ± 0,13 6 0,427 ± 0,19 4 SP3 0,173 ± 0,08 15 0,681 ± 0,17 18 SP4 0,037 ± 0,04 10 0,350 ± 0,14 9
SP5 0 3 0,305 ± 0,15 4
SP6 0,146 ± 0,07 26 0,634 ± 0,17 30
SP7 0,124 ± 0,12 4 1,211 ± 0,31 4
3.1.1. Clados Grupos Externos
Figura 4: Grupos externos (outgroup) usados para enraizar as análises.
Microhyla heymonsi – MH (Microhylinae) e Dermatonotus muelleri – DM (Gastrophryninae).
As distâncias genéticas médias entre Microhyla heymonsi e as espécies de
Elachistocleis variaram acima de 11,5% no gene 16S e 17,5% em CO1. No caso de
Dermatonotus muelleri, as distâncias foram menores por se tratar de uma espécie da mesma subfamília que Elachistocleis; apesar disso, os valores ficaram acima de 8,5% e 16,5% para 16S e CO1, respectivamente. Para todos os valores de distância genética ver Apêndice E.
Imaculados
Devido à baixa amostragem denominamos os clados de ventre imaculado baseados nas informações geográficas e distribuições conhecidas para as espécies.
Podemos observar a presença de três UMTOs, de espécimes com ventre imaculado, bem suportadas (Fig. 5). Sendo essas identificadas como HELIANNEAE (AM), BICOLOR (RS) e MATOGROSSO (MT, MS, RO e SP).
A UMTO MATOGROSSO apresenta uma topologia composta por três ramos principais e primariamente foi tratada como três UMTOs distintas; porém, as distâncias internas e entre os grupos eram mais baixas do que as encontradas nos outros grupos. Não foi possível analisar a morfologia de todos os exemplares. Analisamos somente os exemplares de São Paulo, que são compatíveis com E. matogrosso, nos levando a crer que se trata de apenas uma UMTO, cuja topologia é reflexo da estrutura populacional.
A amostra VL085 é de um exemplar coletado na área da Usina Hidrelétrica APM Manso (Aproveitamento Múltiplo de Manso), aproximadamente 100 km de Cuiabá, MT — localidade tipo da espécie.
As amostras de Rondônia estavam identificadas originalmente como
Elachistocleis magnus; no entanto, não foi possível a análise morfológica de nenhum desses testemunhos e devido aos resultados genéticos aqui apresentados, acreditamos que o mais provável seja erro de identificação dos espécimes ou das amostras, de forma que mais amostras e exemplares testemunhos devem ser analisados.
Por fim, a presença de E. matogrosso no estado de São Paulo já havia sido documentada na literatura como E. bicolor e variações “cf.” e “aff.” (e.g. Prado & Rossa-Feres, 2014; Ribeiro-Junior & Bertolucci, 2009; Rossa-Feres et al., 2011; Provete et al., 2011; Araujo et al., 2013) e de forma concordante com os nossos resultados por Nunes de Almeida & Toledo (2012).
Os ramos que contemplam as UMTOs de ventre manchado foram subdivididos em três partes:
- SURUMU, SP7, SP5 e SP6 (Figura 6);
- SP4, SP3 e BUMBAMEUBOI (Figura 7);
Manchados
Figura 6: Porção da árvore de consenso estrito contemplando as UMTOs SURUMU, SP5, SP6 e SP7. Valores sobre os nós correspondem a valores de
Figura 8: Parte final da árvore filogenética com destaque para o clado
Tecnicamente as UMTOs SP5 e SP6 (figura 6) poderiam ser consideradas uma só devido ao baixo suporte (jackknife = 59) no ramo que as une. No entanto, apesar da baixa amostragem, preferimos deixá-las separadas visto que SP5 é formado exclusivamente por espécimes da Bahia e SP6 apresenta espécimes de outros estados, majoritariamente do Tocantins. Apesar da distribuição geográfica próxima entre os espécimes das duas UMTOs, o suporte interno de cada uma é muito elevado (jackknife = 100), justificando mantê-las separadas nas análises.
Caso semelhante ocorre entre as UMTOs SP4, SP3 e BUMBAMEUBOI (figura 7), porém com a diferença que há um suporte elevado no ramo que as une (jackknife
= 99). Os espécimes da UMTO SP4 são exclusivamente do Ceará e identificados originalmente como E. piauiensis. Apesar disso, espécimes da UMTO SP6 estão praticamente equidistante da localidade tipo de E. piauiensis em relação aos espécimes de SP4. Além disso, existe um espécime da UMTO SP7, geograficamente muito próximo desses espécimes. Somando-se a esses fatos a sobreposição de caracteres morfológicos, não foi possível atribuir nomes.
Dentro da UMTO SP3 temos amostras identificadas como E. carvalhoi e que morfologicamente são coerentes. No entanto, as amostras identificadas como E. magnus certamente estão identificadas erroneamente, sendo morfologicamente compatíveis com E. bumbameuboi. Portanto, devido a sobreposições morfológicas preferimos deixar essa UMTO sem nome específico.
Por fim, a UMTO BUMBAMEUBOI foi nomeada com base nas sequências do holótipo da espécie, representado pelo terminal PT536_BB_MA. O suporte do ramo que une esses subclados é elevado (jackknife = 94) e sua topologia decorre da distribuição geográfica dos espécimes.
Figura 9: Mapa de distribuição geográfica d
estudo. Quadrados coloridos para espécimes de ventre imaculado e coloridos para espécimes de ventre manchado.
localidades-tipo: A = Elachi E. pearsei; E = E. panamensis
I = E. surinamensis; J =
E. magnus; N = E. carvalhoi
Podemos observar a proximidade geográfica de diversas dificultou nomear alguns clados com base em dados geográficos.
Mapa de distribuição geográfica dos espécimes
coloridos para espécimes de ventre imaculado e
es de ventre manchado. Quadrados pretos representam as
Elachistocleis cesarii; B = E. bumbameuboi; C =
E. panamensis; F = E. matogrosso; G = E. bicolor
; J = E. piauiensis; K = E. erythrogaster; L =
E. carvalhoi; O = E. muiraquitan; P = E. haroi.
Podemos observar a proximidade geográfica de diversas dificultou nomear alguns clados com base em dados geográficos.
es amostrados neste coloridos para espécimes de ventre imaculado e círculos Quadrados pretos representam as ; C = E. surumu; D =
E. bicolor; H = E. helianneae; ; L = E. skotogaster; M =
3.3. DADOS MORFOMÉTRICOS E MORFOLÓGICOS Foi realizada uma
morfométricos na tentativa de recuperar alguma informação representativa. O resultado para as UMTO
Figura 11: Gráfico d UMTOs de ventre manchado
dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão em função dos autovalores (
O CRC explica aproximadamente com aproximadamente
Componente 1 e alternadas no Componente 2, indicando respectivamente “tamanho” e “forma” de acordo com Humphries et al.
Situação semelhante ocorre na 12 e tabela 7).
DADOS MORFOMÉTRICOS E MORFOLÓGICOS
a uma análise de componentes principais (PCA) com os dados na tentativa de recuperar alguma informação representativa. O
UMTOs de ventre manchado pode ser observado na
Gráfico da Análise de Componentes Principais (PCA s de ventre manchado. CRC e LA são os maiores contribuidores para
dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão utovalores (eigenvalue).
explica aproximadamente 87,4% da variação total,
com aproximadamente 6,68%, sendo todas as correlações positivas para o Componente 1 e alternadas no Componente 2, indicando respectivamente
de acordo com Humphries et al. (1981).
Situação semelhante ocorre na PCA das UMTOs de ventre imaculado (figura (PCA) com os dados na tentativa de recuperar alguma informação representativa. O
pode ser observado na Figura 11.
e Componentes Principais (PCA) para as são os maiores contribuidores para os eixos dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão
total, seguido pela LA , sendo todas as correlações positivas para o Componente 1 e alternadas no Componente 2, indicando respectivamente
Dessa forma, os dados
separação entre as espécies, visto a sobreposição das no gráfico da figura 11.
Tabela 6: Valores encontrados
Comp. Principal
Figura 12: Gráfico da Análise de Componentes Principais (PCA) para as UMTOs de ventre imaculado. CRC e LA são o
dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão em função dos autovalores (
Tabela 7: Valores encontrados na PCA das
Comp. Principal
Dessa forma, os dados morfométricos não fornecem nenhum grau de as espécies, visto a sobreposição das UMTOs de
Valores encontrados na PCA das UMTOs de ventre
Comp. Principal Autovalor % Variância
1 3,498 87,442
2 0,267 6,677
3 0,138 3,454
4 0,097 2,427
Gráfico da Análise de Componentes Principais (PCA) para as s de ventre imaculado. CRC e LA são os maiores contribuidores para os eixos dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão em função dos autovalores (eigenvalue).
Valores encontrados na PCA das UMTOs de ventre
Comp. Principal Autovalor % Variância
1 32,935 96,551
2 1,035 3,035
3 0,108 0,317
4 0,033 0,097
não fornecem nenhum grau de s de ventre manchado
ventre manchado.
Gráfico da Análise de Componentes Principais (PCA) para as s maiores contribuidores para os eixos dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão
Os gráficos “Box Plot
no conjunto de Figuras 13 e 14
Figura 13a — d respectivamente.
Na medida do CRC BICOLOR (~21 mm — medida de CC (Fig. 13b)
— 7,7 mm) sendo a mediana apro maiores variações foram encontradas aproximadamente 4 mm
encontrada na UMTO aproximadamente 14 mm.
Box Plot” obtidos para cada medida e relações pode 13 e 14.
d: Box plot das medidas CRC, CC, LC e LA (
Na medida do CRC (Fig. 13a) a maior variação foi encontrada 45 mm) sendo a mediana aproximadamente 25 b) a maior variação foi encontrada na UMTO
mm) sendo a mediana aproximadamente 6,1 mm. Na medida LC
maiores variações foram encontradas nas UMTOs BICOLOR e SP6, sendo de 4 mm em cada. Na medida LA (Fig. 13d) a maior variação foi UMTO CESARII (~10 mm — 24 mm) sendo a mediana
mm.
” obtidos para cada medida e relações podem ser vistos
das medidas CRC, CC, LC e LA (em mm),
Figura 14a — d: (em %), respectivamente
Na relação CC/LC (Fig. 1 MATOGROSSO (~76%
variações foram encontradas n
(~16% — 21,5%). Na relação LA/CRC (Fig. 1 CESARII (~39% — 58%), assim como n
Outra informação morfo (já relatada por Parker, 1934 como Chiasmocleis (e.g. em geral, próximo à abertura alguns machos. Também f
: Box plot das relações CC/LC, CC/CRC, LA/CRC e LC/LA , respectivamente.
Na relação CC/LC (Fig. 14a) a maior variação foi encontrada % — 93%). Na relação CC/CRC (Fig. 1 es foram encontradas nas UMTOs BICOLOR (~17% —
21,5%). Na relação LA/CRC (Fig. 14c) a maior variação foi encontrada em 58%), assim como na relação LC/LA (Fig. 14d
Outra informação morfológica levantada foi a presença de espinhos
por Parker, 1934 — pg.121), relativamente comuns entre os Microhylidae (e.g., Peloso et al., 2014). Essas estruturas foram encontradas, próximo à abertura cloacal de algumas fêmeas, e na região gular de Também foram observados em alguns machos espinhos dérmicos das relações CC/LC, CC/CRC, LA/CRC e LC/LA
a maior variação foi encontrada na UMTO 93%). Na relação CC/CRC (Fig. 14b) as maiores — 22,5%) e CESARII ) a maior variação foi encontrada em
4d) (~36% — 60%).
na face superior dos membros anteriores, alcançando o antebraço e parte das mãos, principalmente dedos II e III. Ver figuras 15 a 17.
Figura 16: Espinhos dérmicos no membro anterior – antebraço, dorso da mão e superfície dorsal dos dedos III e IV — de um macho de E. ovalis – Aguiarnópolis, Tocantins (CFBH 19902).
4. DISCUSSÃO
4.1. ELACHISTOCLEIS CESARII
De acordo com as evidências resgatadas por esse estudo, Elachistocleis cesarii não se trata de um complexo de espécies, como predito por nossa hipótese inicial, sendo uma espécie com ampla distribuição geográfica nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Goiás e Mato Grosso, abrangendo mais de 1.400 km de distribuição Leste-Oeste e mais de 1.000 km Norte-Sul e muitas variações fenotípicas que a tornam de difícil identificação quando colocada lado a lado com outras espécies de ventre manchado.
Analisando a morfologia de diversas populações de E. cesarii do estado de São Paulo, observou-se grande variedade no padrão ventral dos espécimes como descrito anteriormente, indo desde colorações quase uniformemente claras (creme, amarelada, acinzentada) (CFBH 35043 — Campinas), passando por vários estágios de manchas com padrões que se sobrepõem às colorações ventrais de
Elachistocleis piauiensis (CFBH 21353 — Pirassununga; CFBH 31879 — Luis Antônio), E. bumbameuboi (CFBH 20004 e CFBH 20008 — Assis), E. carvalhoi
(CFBH 04133 — Rio Claro; CFBH 06635 — Itirapina) e E. surumu (CFBH 06576 — Rio Claro; CFBH 26075 — União de Minas, MG). Também se observa padrões ventrais escuros e quase sem manchas (CFBH 31875 [PT604_CS_SP] e CFBH 31876 — Luis Antônio), como pode ser visto na figura 18.
4.1.1. Diagnose de Elachistocleis cesarii
As características diagnósticas apontadas por Toledo et al. (2010) são apresentadas e discutidas a seguir:
- Coloração ventral branca ou amarelada com reticulado cinza — essa é uma descrição bastante vaga e subjetiva já que todas as espécies de Elachistocleis de ventre manchado apresentam alguma variação desse padrão.
- Tímpano indistinto — característica comum para o gênero e diversos outros, portanto não sendo uma diagnose no nível de espécie.
- Canto de anúncio com frequência média dominante de aproximadamente 3,5 kHz. — As características do canto são influenciadas por muitas variáveis, como a temperatura do ambiente (GERHARDT, 2005), tipo de gravação (analógica ou digital), entre outros, sendo difícil uma comparação direta usando apenas dados da literatura.
4.1.2. Vocalização de Elachistocleis cesarii
Segundo a análise da vocalização realizada por Giaretta et al. (2012), em diversas populações de Elachistocleis de várias localidades (Triângulo Mineiro - Uberlândia, Perdizes e Ituiutaba - MG; Pontal do Araguaia - MT; Campinas - SP; Alto Paraíso de Goiás - GO), todas essas populações apresentam vocalização similar à descrita por Toledo et al. (2010), assim como o descrito para “E. ovalis” de Poços de Caldas (MG) por Haddad et al. (1988). Há também a indicação de que existem diferenças mínimas entre a vocalização dessas populações brasileiras quando comparadas às vocalizações de populações bolivianas (DE LA RIVA et al., 1996; DE LA RIVA et al., 2000), sob o nome E. ovalis, sugerindo que possam ser a mesma espécie.
No trabalho de revalidação de E. cesarii, foram analisados o canto de oito indivíduosapresentando uma variação de 3,45 — 3,60 kHz na frequência dominante (temperatura do ar: 23,1ºC, Rio Claro, SP) sendo esses valores comparados a gravações de 18 indivíduos de E. piauiensis que apresentam variação na frequência dominante entre 4,48 — 4,65 kHz (temperatura do ar: 22 — 27ºC, Caucaia, CE) (TOLEDO et al., 2010).
(1973) apresenta cantos de populações de várias localidades, em geral gravados por outros pesquisadores ou disponíveis em coleções. Esse autor não distingue entre espécies e não associa o canto a características morfológicas que poderiam nos levar a alguma identificação, de modo que extrapolações dessas informações podem resultar em comparações errôneas.
Tabela 8: Transcrição da tabela de cantos de Elachistocleis sintetizada por Nelson (1973).
Estado / Temp. ºC Nº Duração (s) Freq. Intervalo
Município Depart. País Ar/ Água Cantos Média ± Desv. Pad. Dominante (Hz) Harmônico (Hz)
Santo
André São Paulo Brasil 14,0 4 3,2 — 41 2100 — 3600 180
- 3,7 ± 0,5 3097 ± 414 -
Villavicencio Meta Colômbia 20,7 6 3,0 — 4,6 3500 — 4200 160 — 200 24,0 4,3 ± 0,6 3820 ± 227 189 ± 18 Villa Lola Bolívar Venezuela 24,0 37 2,0 — 4,1 3650 — 4150 125 — 142
24,0 2,9 ± 0,5 3834 ± 157 140 ± 7 David Chiriqui Panamá - 5 2,2 — 4,2 3400 — 3600 200
24,0 2,9 ± 0,5 3500 ± 100 - Paramaribo Suriname 25,0 9 2,1 — 2,4 4000 — 4200 200 — 220 - 2,3 ± 0,1 4133 ± 71 211 ± 7 Tunacuna Trinidad 25,0 15 1,3 — 1,7 4100 — 4300 100 — 112 - 1,6 ± 0,2 4133 ± 59 102 ± 4 Cerro la Panamá Panamá - 4 2,0 —- 4,0 3000 — 4100 167 — 220 Compaña 25,2 2,9 ± 1,0 3450 ± 384 210 ± 42
Bejuco Panamá Panamá - 8 2,0 — 3,0 2400 — 4150 220 — 260 25,5 2,2 ± 0,4 3860 ± 173 240 ± 9 Lethem Rupununi Guiana 26,7 8 2,3 — 2,6 4000 — 4800 244 — 260
25,5 2,5 ± 0,1 4425 ± 242 255 ± 7 David Chiriquí Panamá - 13 1,4 — 4,6 3000 — 4000 200 — 230
26,0 2,7 ± 1,6 3455 ± 230 208 ± 11 Maturín Monogas Venezuela 26,0 2 2,1 — 2,4 4000, 4200 216, 220
26,0 - - -
San
Fernando Apure Venezuela 27,8 1 2,3 4700 113
de Apure 26,7 - - -
4.2. DADOS MOLECULARES
Com base nos dados de distância genética das Tabelas 4 e 5 vemos uma baixa variação genética dentro e entre as populações do gênero Elachistocleis. As implicações dessa baixa variação, no nosso caso, são: o baixo valor de suporte para alguns clados na árvore consenso já que os terminais podem ficar “pulando” entre os ramos e, consequentemente, baixos níveis de resolução quando usados valores de suporte mais confiáveis (ex. ≥70, jackknife), resultando numa grande politomia com todas as UMTOs de ventre manchado.
Durante a busca pelas árvores nos deparamos com uma grande quantidade de árvores ótimas retidas. Isso pode acontecer por diversas causas, como problemas no alinhamento das sequências, contaminação, baixa amostragem ou sequências altamente conservadas. Os alinhamentos foram revistos e problemas de contaminação foram descartados. Ocorre baixa amostragem em algumas UMTOs (PE, PN, SP4 e SP5), o que poderia explicar parcialmente o problema. No entanto, o principal fator são as sequências altamente conservadas ou mesmo idênticas, que resultam em terminais instáveis em diversos pontos na árvore, gerando várias topologias ótimas.
Em termos geográficos vemos diversas áreas de sobreposição das UMTOs, especialmente nas regiões Centro-Oeste e Nordeste do Brasil.
4.3. TESTE DE MANTEL
Os resultados obtidos a partir do teste de Mantel apresentam baixa correlação positiva (r = 0,254), ou seja, a distância geográfica explica pouco da variação genética, como pode ser visto em diversos casos com distâncias geográficas superiores a 3000 km e genéticas inferiores a 3% (Figura 10). Isso pode ser reflexo de sequências gênicas extremamente conservadas e, nesse caso, não sendo um bom fator de resolução taxonômica.
do clado SP3 terem comprimento menor devido a dados faltantes no início ou fim da sequência.
4.4. MORFOLOGIA
Os caracteres morfométricos amostrados apresentaram completa sobreposição das UMTOs como demonstrado nos gráficos box plot e PCA (figuras 11 — 14), sugerindo que não são diagnósticos.
Houve um problema na metodologia utilizada para a obtenção dos dados morfológicos, sendo que nem todos os exemplares amostrados molecularmente foram amostrados morfologicamente, em especial os testemunhos de outras coleções herpetológicas. Portanto, não foi possível a realização de análises conjuntas com os dados moleculares (evidência total), como estava previsto, e nem análises estatísticas.
No entanto, os dados morfológicos possibilitaram comparações diretas com as características diagnósticas de várias espécies de ventre manchado como, por exemplo, o padrão das manchas e coloração ventral, que assim como a linha dorsal e glândula pós-comissural, apresentaram variações correspondentes às encontradas em mais de uma espécie, mesmo quando observados exemplares dentro de uma mesma UMTO.
Possivelmente, esse resultado é reflexo da grande quantidade de exemplares de diversas populações amostrados neste estudo, mostrando uma distribuição mais heterogênea e sobreposta das características diagnósticas, em relação ao que foi originalmente proposto na literatura. Essas informações podem significar que novas características diagnósticas devem ser buscadas ou corroborar os dados genéticos obtidos nesse estudo, que sugerem a sinonímia de várias espécies de ventre manchado.
4.4.1. Estágios larvais em Elachistocleis
Existem poucos trabalhos que descrevem os estágios larvais de espécies de
Elachistocleis, entre eles Magalhães et al. (2012) para E. cesarii (coletados em Macaíba, Rio Grande do Norte); Rossa-Feres & Nomura (2006) para E. bicolor
E. ovalis e E. surinamensis (diversas localidades da ilha de Trinidad). No entanto, a identificação desses espécimes podem estar equivocadas.
De maneira geral, as características morfológicas descritas para as diferentes espécies são muito similares, sendo elas: comprimento total do corpo de 20 mm — 30 mm; corpo deprimido, arredondado em vista dorsal e triangular em vista lateral; olhos pequenos e lateralmente dirigidos; espiráculo ventral sinistro, longo e largo, com abertura direcionada dorsalmente; coloração marrom escura com listras e manchas claras pelo corpo; disco oral sem partes queratinizadas ou papilas.
Comportamentalmente as características também são similares, sendo girinos pouco ativos que se mantêm imóveis próximos à superfície onde se presume que se alimentam por filtração; também se alimentam de matéria orgânica no fundo das poças, adotando uma posição de cabeça abaixada (KENNY, 1969).
Uma característica que parece divergir é a presença de abas dérmicas pareadas na porção anterior da boca, geralmente com bordas regulares em E. bicolor e E. ovalis (Kenny, 1969 trata Elachistocleis ovalis como sendo uma espécie de ventre imaculado), e abas dérmicas pareadas com bordas irregulares (denticuladas) em E. sp. e E. surinamensis.
Figura 19: Abas dérmicas orais pareadas — adaptado de Kenny (1969).
espécies, o que poderia invalidar essa aparente correlação. Também não se pode descartar a possibilidade de ocorrência de polimorfismo larval, em decorrência de condições ecológicas e ambientais, como as descritas por Pfenning (1992) para
Spea multiplicata [Scaphiopus multiplicatus] (Cope, 1863), que poderiam gerar confusões, principalmente em áreas de simpatria.
4.5. OUTROS AGRUPAMENTOS
Incluímos aqui Elachistocleis surinamensis, E. surumu, E. pearsei e E. panamensis com o intuito de discutir e levantar hipóteses. Primeiramente, a relativa proximidade geográfica, cerca de 550 km, entre a localidade tipo de E. surinamensis
e E. surumu, além de características morfológicas semelhantes na descrição das espécies, podem indicar tratar-se de sinônimos. Não obtivemos sequências de topotipos e nem de espécimes com identidade confirmada dessas espécies. No entanto, temos sequências de algumas localidades de Roraima e outras da Venezuela e Guiana (GenBank) que estão dentro da distribuição geográfica conhecida para essas espécies – UMTO SURUMU (gene 16S apêndice D). Essas sequências (UMTO SURUMU) formam um agrupamento com baixo suporte (jackknife = 23), podendo esse valor ser reflexo da pequena quantidade de sequências amostradas, mas também pode indicar que E. surumu e E. surinamensis
sejam a mesma espécie. E nesse caso, Elachistocleis surumu CARAMASCHI, 2010 deve ser considerado sinônimo junior de Elachistocleis surinamensis (DAUDIN, 1802).
A UMTO SURUMU tem como grupo irmão as UMTOs PEARSEI e PANAMENSIS, que apresentam um valor de suporte elevado (jackknife = 91). No entanto, o ramo que suporta essas UMTOs apresenta valor de suporte jackknife = 65, de forma que necessitamos de mais evidências para compreender as relações filogenéticas dessas UMTOs.
do Panamá apresentam suporte jackknife (62)abaixo do valor de confiança (≥ 70), e como demonstrado nas tabelas 4 e 5, as distâncias genéticas são baixas o suficiente para que sejam consideradas a mesma espécie, sendo a estrutura encontrada na árvore apenas reflexo de estrutura populacional.
5. CONCLUSÕES
Dentro do clado das espécies de ventre manchado observamos uma politomia, composta por diversos subclados que apresentam topologia que parece derivar majoritariamente da estrutura populacional. Isso fica evidente nas baixas distâncias genéticas encontradas dentro e entre as UMTOs, apesar da ampla distribuição geográfica e da variação morfológica dos espécimes.
As variações morfológicas observadas, incluindo as características consideradas diagnósticas das espécies descritas, apresentam sobreposição, indicando que a morfologia, baseada nos caracteres usados até então, não explica a diversidade de espécies válidas atualmente.
Apesar de existir na literatura descrições do canto de algumas espécies de
Elachistocleis e essas apresentarem diferenças em um primeiro momento, não foi possível compará-las de forma adequada devido, em alguns casos, às variáveis intrínsecas das gravações como, condições climáticas e metodologia, e em outros à falta de informações a respeito das populações estudadas. Sem dúvida os cantos podem trazer uma nova luz sobre a taxonomia do gênero, mas, no momento, as informações são inconclusivas.
Portanto, com base nos dados aqui expostos, é possível que as espécies
Elachistocleis piauiensis Caramaschi & Jim, 1983; E. bumbameuboi, E. carvalhoi e
E. surumu Caramaschi, 2010 sejam sinonímias de Elachistocleis cesarii (Miranda-Ribeiro, 1920). Estas sinonímias tornariam E. cesarii em uma espécie de distribuição ainda mais ampla, abrangendo os seguintes estados brasileiros: São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Mato Grosso, Goiás, Tocantins, Bahia, Piauí, Ceará, Maranhão, Pará, Roraima (presente estudo), Rio de Janeiro (SILVEIRA et al., 2010) e Rio Grande do Norte (MAGALHÃES et al., 2013).
Ficam em aberto às questões levantadas a respeito de Elachistocleis surumu
e E. surinamensis no que diz respeito a possibilidade de E. surumu ser sinônimo junior de E. surinamensis. Caso se confirme essa suspeita, de que ambas são uma única espécie, a combinação E. cesarii proposta aqui passaria a ser E. surinamensis
Outras espécies de Elachistocleis com ventre manchado que não foram amostradas adequadamente no presente estudo (E. skotogaster, E. erythogaster, E. panamensis e E. pearsei) necessitam de maior investigação a fim de se comprovar a validade das mesmas e de se entender as relações com as demais espécies do gênero.
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