Isoflurano fornece neuroproteção em lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal por inibição da apoptose.

(1)

REVISTA

BRASILEIRA

DE

ANESTESIOLOGIA

PublicaçãoOficialdaSociedadeBrasileiradeAnestesiologia

www.sba.com.br

ARTIGO

CIENTÍFICO

Isoflurano

fornece

neuroprotec

¸ão

em

lesão

cerebral

hipóxico-isquêmica

neonatal

por

inibic

¸ão

da

apoptose

De-An

Zhao

∗

_,

_Ling-Yun

_Bi,

_Qian

_Huang,

_Fang-Min

_Zhang

_e

_Zi-Ming

_Han

TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,DepartmentofPediatrics,Weihui,China

Recebidoem16defevereirode2015;aceitoem22deabrilde2015

PALAVRAS-CHAVE

Isoflurano; Hipocampo; Lesãocerebral; Neuroprotec¸ão; Apoptose

Resumo

Justificativaeobjetivos: Isoflurano é um éter volátil halogenado usado para anestesia por via inalatória. É amplamente usado na clínica como um anestésico para inalac¸ão.A lesão hipóxico-isquêmicaneonatalocorrenocérebroimaturoeresultaemmortecelulartardiavia excitotoxicidadeeestresseoxidativo.Isofluranomostrouterpropriedadesneuroprotetorasque formam umabasebenéfica para oseuusotanto em culturadecélulas quanto emmodelos animais, incluindováriosmodelos delesão cerebral.Nossoobjetivo foideterminaroefeito neuroprotetordeisofluranoemhipóxiacerebraleelucidaromecanismosubjacente.

Métodos: Fatiasdehipocampo,emfluidocerebrospinalartificial(CSFA)comglicoseeprivação deoxigênio,foramusadascomoummodeloinvitrodehipóxiacerebral.Opicodepopulação ortodrômica(PPO)eopotencialdelesãohipóxica(PLH)foramregistradosnasregiõesCA1e CA3.Aconcentraçãodeneurotransmissoresdeaminoácidosnasoluçãodeperfusãodasfatias dehipocampofoimedida.

Resultados: O tratamento com isoflurano retardou a eliminação do PPO e melhorou a recuperação do PPO; diminuiu a frequência do PLH, retardou o início do PLH e aumentouaduraçãodoPLH.Otratamentocomisofluranotambémdiminuiu aliberaçãode neurotransmissoresde aminoácidosinduzida pelahipóxia, comoaspartato,glutamato e gli-cina,masosníveisdeácido ␥-aminobutírico(GABA)estavamelevados.Estudosmorfológicos mostramqueotratamentodeedemacomisofluranoatenuouoedemadeneurônios pirami-daisnaregiãoCA1.Tambémreduziuaapoptose,comomostradopelaexpressãoreduzidada caspase-3egenesPARP.

Conclusões: Isofluranomostrouumefeitoneuroprotetornalesãoneuronalnohipocampo indu-zidaporhipóxiaatravésdasupressãodeapoptose.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:zhaodean17@gmail.com(D-A.Zhao).

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjan.2016.08.003

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KEYWORDS

Isoflurane; Hippocampus; Braininjury; Neuroprotection; Apoptosis

Isofluraneprovidesneuroprotectioninneonatalhypoxicischemicbraininjury bysuppressingapoptosis

Abstract

Backgroundandobjectives: Isoflurane is halogenated volatile ether used for inhalational anesthesia.Itiswidelyusedinclinicsasaninhalationalanesthetic.Neonatalhypoxicischemia injuryensuesintheimmaturebrainthatresultsindelayedcelldeathviaexcitotoxicityand oxidativestress.Isofluranehasshownneuroprotectivepropertiesthatmakeabeneficialbasis ofusingisofluraneinbothcellcultureandanimalmodels,includingvariousmodelsofbrain injury.Weaimedtodeterminetheneuroprotectiveeffectofisofluraneonhypoxicbraininjury andelucidatedtheunderlyingmechanism.

Methods:Ahippocampalslice,inartificialcerebrospinalfluidwithglucoseandoxygen depri-vation,wasusedasaninvitromodelforbrainhypoxia.Theorthodromicpopulationspikeand hypoxicinjurypotentialwererecordedintheCA1andCA3regions.Aminoacid neurotransmit-tersconcentrationinperfusionsolutionofhippocampalsliceswasmeasured.

Results:Isofluranetreatmentcauseddelayedeliminationofpopulationspikeandimprovedthe recovery of population spike; decreased frequency of hypoxic injury potential, postponed theonsetofhypoxicinjurypotentialandincreasedthedurationofhypoxicinjurypotential. Iso-fluranetreatmentalsodecreasedthehypoxia-inducedreleaseofaminoacidneurotransmitters suchasaspartate,glutamateandglycineinducedbyhypoxia,butthelevelsof␥-aminobutyric acidwereelevated.Morphologicalstudiesshowedthatisofluranetreatmentattenuatededema ofpyramidneuronsintheCA1region.Italsoreducedapoptosisasevidentbyloweredexpression ofcaspase-3andPARPgenes.

Conclusions:Isofluraneshowedaneuro-protectiveeffectonhippocampalneuroninjuryinduced byhypoxiathroughsuppressionofapoptosis.

Introduc

¸ão

Aslesõescerebraishipóxicascausamváriascondic¸ões pato-lógicas, o que também pode ocorrer durante cirurgias cardíacas e neurológicas. O mecanismo subjacente desse tipo de lesão cerebral ainda não foi esclarecido. Como protegero cérebro de umalesão hipoxêmicae como tra-tar tal lesão cerebral continua a ser um desafio clínico. Ostratamentoscomhipotermiaepré-isquemia apresenta-ramefeitoprotetor sobreocérebro,1,2 _mas_são_difíceis_de fazerclinicamente,enquantoostratamentos farmacológi-cossãoclinicamentemaispráticos.Duranteasúltimastrês décadas,oefeitoneuroprotetordosanestésicostematraído grandeatenc¸ãodosclínicos.

Isoflurano [2-cloro-2-[difluorometoxi)-1; 1,1-trifluoro--etano,CHF2-O-CHCl-CF3]éuméterhalogenadousadopara anestesiaporinalac¸ão.Juntamentecomenfluranoe halo-tano,substituiuoséteresinflamáveisusadosnosprimórdios da cirurgia. Por ser um isômero estrutural do enflurano, recebeu o nome de isoflurano e, portanto, ambos têm a mesmafórmulaempírica.Éumamisturaracêmicados isô-merosóticosRe S.Atualmente,seu usomédicoemseres humanoscomec¸aadiminuir.Ésubstituídoporsevoflurano, desfluranoepeloanestésicointravenosopropofol.Ousode isofluranoaindaéfrequenteemanestesiaveterinária. Pro-pofolpode reduzir o fluxo sanguíneoarterial no cérebro, apressãointracranianaeometabolismoemantero supri-mentodesangue eataxa deoxigênio.Propofolmelhorou

o suprimentodeoxigêniodurante ahipóxia, oquesugere efeitos protetores contra a hipóxia cerebral.3---5 _Estudos sugeremque propofol desempenha umpapel na proteção dosistemanervosocentral(SNC)atravésdamodulaçãode Ca2+_,_radicais_livres_de_oxigênio,_receptores_de_ácido gama--aminobutírico (GABA) e receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA).6---9_Contudo,_alguns_dados_sugerem_que_propofol_não apresentouefeitoprotetor cerebralapós cirurgiacardíaca eatépiorouahipóxiacerebral10 _e_que_a_hipotermia,_e_não propofol, éum neuroprotetor.1 _Todos_os_anestésicos volá-teisdiferem em potência, efeitos adversose custose são amplamenteusadosduranteacirurgiaemhumanos recém--nascidos e durante a pesquisa neonatal em animais.Em estudosdelesãocerebralhipóxico-isquêmicaneonatal, iso-flurano mostrou ter funções neuroprotetoras.11 _Isoflurano foiestudadoem modelosanimaisdeváriasdoenças, como inflamaçãopulmonaragudainduzidaporlipopolissacarídios (LPS),12 _lesão _pulmonar _aguda,13 _estresse _oxidativo indu-zido por glicose,14 _lesão _renal _por _{isquemia/reperfusão}15 e lesão cardíaca.16 _Isoflurano _mostrou _fornecer _protec_¸ão contralesãoemelhorarváriosresultadosfuncionais negati-vosnessesmodelos.

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comoanestésicoemcirurgiaparaamodelagemde hipóxia--isquemianeonatallevou aespeculaçõesdequeisoflurano podeterefeitos protetores emrecém-nascidos. Em parti-cular, isofluranomostra neuroproteção em vários modelos deAVC,incluindohemorragiasubaracnoidea(HSA),19 oclu-são da artéria cerebral média (OACM),20,21 _hemorragia intracerebral,22 _lesão _cerebral _traumática23 _e _lesão cere-bralhipóxico-isquêmicaneonatal.24_Um_estudo_mostrou_que duashoras deexposiçãoaisofluranonãocausaram neuro-apoptoseem cérebros de adultose sugere que a demora em reduzir os processos gliais após a exposição a iso-flurano pode explicar por que alguns anestésicos voláteis podemconferirneuroproteçãoapósacidentevascular cere-bralexperimental.25

Alega-se que isoflurano é tanto neuroprotetor quanto neurotóxico;entretanto,aalegaçãodequeisofluranocausa apoptose neural permanece controversa. Neste estudo, investigamososefeitosdaexposiçãodeisofluranoafatiasde hipocampocerebralderatoseavaliamosafunção apoptó-tica.Parainvestigarosefeitosemecanismosdeisoflurano, avaliamos asalteraçõesneurológicas e osgrausde neuro-gênesee apoptoseem ratos após seremexpostos avárias concentraçõesdeisoflurano.Oobjetivogeraldesteestudo foi encontrar evidências que demonstrassem que o tra-tamento com isoflurano tem efeitos neuroprotetores no cérebro durante a hipóxia. Semelhantemente aos resulta-dosdeváriosestudos,nãoencontramosevidênciademorte celular cerebral ou neurogênese em tecidos cerebrais de hipóxia-isquemianeonatalapósanestesiacomisoflurano.

Métodos

Animaisexperimentais

Todososprotocolos depesquisa com animaisforam apro-vados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da instituic¸ão. Os animais foram alojados e mantidos sob o protocolodefinido em ciclos de claro-escuro (12 horas) e em temperatura ambiente mantida a 25±1◦C. Sessenta

ratosSpragueDawley (SD),nosétimo diapós-natal(peso: 16-18g),foramalocadosrandomicamenteemcincogrupos (n=12): Grupo (i) recebeu tratamento de normóxia para controle.QuarentaeoitoratosSDforamsubmetidosà hipó-xiae,emseguida,redistribuídosemquatrogrupospara:(ii) hipóxia(Hx);(iii)HX-isofluranoa0,5%;(iv)HX-isofluranoa 1,5%;(v)HX-isofluranoa2,5%.

Hipóxia-isquemianeonatal

Osratosdosgrupos(ii-v)foramanestesiadoscomhalotano a3%eposteriormentesubmetidosaumaincisãocervicalde 3mmnalinhamédia,deacordocomoprocedimentopadrão. Aartériacarótidaesquerdafoiexpostaecoaguladacomo usodeumaunidadedeeletrocautériobipolar;emseguida, aincisãocirúrgicafoifechadapormeiodeadesivotópico. Apósumperíododerecuperac¸ãode3horas,osratosforam colocadosemumacâmaracomoO2a8%eN2a92%por45 minutos.Atemperaturadacâmarafoimantidaa37◦_C._Os

ratos dogrupocontrole (tempo zero) foramsubmetidos à explorac¸ãodaartériacarótidaesquerdasemcauterizac¸ão.

Exposic¸ãoaisoflurano

Os ratos foram preparados para a exposic¸ão a isoflurano após18hde hipóxia. Foramcolocadosem contêineres de plásticoeexpostosaisofluranopor6hininterruptas. Usou--se ar como transportador com um fluxo total de gás de 2L.min-1_. _Durante _a _exposic_¸ão _a _isoflurano, _os contêine-res foram mantidos a 37◦_C _mediante _um _dispositivo _de

aquecimento. Os níveis de isoflurano, oxigênio e dióxido decarbono foram monitoradosna câmara via monitor de gás.Após 6h, aadministração deisoflurano foi interrom-pidaeosratosforamexpostossomenteaar.Apósobservar asualivremovimentação,osratos foramrecolocadosnas gaiolasmaternas.Afrequênciarespiratóriaeacordapele dosratosforammonitoradas duranteaexposiçãoa isoflu-rano.Osratosobservadoscomqualquercasodeapneiaou hipóxiaforamimediatamenteexpostosaareexcluídosda experiência.Osratosdogrupocontroleforamcolocadosem contêinersemelhanteaodosratosdogrupoisoflurano,mas foramexpostossomenteaarpor6h.

Preparac¸ãotecidual

Apóso períododerecuperac¸ão,osratos foram anestesia-doscomisoflurano.Aperfusãotranscardíacafoifeitacom fosfato de formalina tamponada a 10%, de acordo com o protocoloanterior.Oscérebrosforamextraídosdoscrânios mediante procedimento cirúrgico e armazenados em for-mol tamponado a 10% por 48h. Em seguida, o tecido foi congelado-seccionadoem fatiasde30mm,comum micró-tomoLeicaSM2000R(Leica,Alemanha).Secc¸õesdaregião dohipocampoforamselecionadasdeformarandômicapara aanálisehistológicaeoutrosestudos.

Examehistopatológico

Os ratos expostos a isoflurano, bem como os do grupo controle, foram sacrificados após 6h (n=3). As fatias de hipocampodosratosdecadagrupoforamfixadasem meta-nola0,1%eembebidasemceraapósadesidratac¸ão.Blocos detecidoforamcortadosemfatiasde5mmdeespessurae coradoscomhematoxilinaeeosina (HE),deacordocomo protocolopadrão.Osresultadosforamexaminadosem deta-lhesobummicroscópiodeluzparadeterminarasalterac¸ões morfológicasempartesdasregiõesCA1eCA3.

Registrodopotencialextracelular

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desaparecer.Cadagrupocontinhaoitoamostras. O decai-mentodePPOfoidefinidocomooperíododetemponoqual umaPPOtornou-seindetectávelapósaprivaçãode oxigê-nio.A amplitudedarecuperação deumaPPOfoi definida comoaproporçãodaamplitudedePPOapósumahorade perfusãocomLCRanormalduranteaamplitudedePPOantes daprivaçãodeoxigênio.AtaxaderecuperaçãodaPPOfoi definidacomo a percentagemdefatiasdohipocampo nas quais a recuperação da amplitude dePPO atingiu 60% da amplitudedePPOantesdaprivaçãodeoxigênio.Oiníciodo PLHfoidefinidocomooperíododetemponoqualoPLHfoi registradoapós aprivaçãode oxigênio.A duraçãodoPLH foidefinidacomootempodeduraçãodoPLH.Aincidência dePLHfoidefinidacomoaporcentagemdefatiasdo hipo-camponasquaisosPLHforamregistradosapósaprivação deoxigênio.

Análiseemlíquidocromatográficodealto desempenho(LCAD)

Asfatiasdehipocampodosratosdecadagrupo(n=3)foram incubadas em LCRa (NaCl 124Mm; KCl 3,3mM; NaH2PO4 1,24mM; MgSO4 2,4mM; NaHCO3 25,7mM; CaCl2 2,4mM) comesemglicose(10,0mM)a37,5◦_C_por_2-2,30_h._O_volume

de fluxo foi de 200mLmin.L-1_. _Após ₁₅_min, _o _LCRa _de perfusão de cada grupo foi coletado e centrifugadopara sobrenadante límpido. O sobrenadante foi processado paraanáliseem LCADde acordocomo protocolopadrão, comasmodificac¸õesnecessárias.AfasemóvelAfoi consti-tuídaporacetatodesódio(0,5M,pH6)com0,05%deTHF. A fasemóvel Bfoi constituída por metanol. Osseguintes gradientesdelavagem(minutos,FaseB%)foramusados:0, 30%;7,60%;9,30%;comvelocidadede0,9mL.min−1_, tem-peraturaa35◦_C,_␭_em_a₃₃₀_nm_e_␭_ex_a₄₅₆_nm._O_agentes

dederivaçãousadosforamOPA,2-MCE,hidróxidode sódio--ácidobóricoemetanol(pH9,6).Osagentesdederivação (25mL)e asamostras(25mL)foramincubadaspor2minà temperaturaambiente.Ovolumedeinjeçãofoide20mL. Ascurvaspadrãoforampreparadascom10;5;2,5;1,25e 0,625mMdeAsp,Glu,Gln,GlyouGABA(graudoLCAD).As concentrações(mM)deAsp,Glu,Gln,GlyeGABAna perfu-sãodoLCRaforamcalculadascombasenascurvaspadrão.

PCRemtemporeal(PCR-TR)

Asfatiasdehipocampodecadagrupo(n=3)foram conge-ladasrapidamente a 80◦_C _em _tubos _para_{microcentrífuga}

livresdeRNase nomomentodadissecc¸ãoparaPCR-TR.O RNAtotalfoiisoladodostecidoscomoreagenteTrizol (Invi-trogen,EUA), deacordocom asinstruc¸ões dofabricante. RNAtotal(1␮g)foiincubadocom200ngdehexâmeros ale-atórios, 0,5mM dNTPs e água livre de RNase a 65◦_C _por

10min(Invitrogen).Emseguida,tampãodeprimeiracadeia (5×), 5mM DTT,40 Ude ARNase A e 200 Ude transcrip-tasereversa (SuperScriptIII)foramadicionados.A mistura

dereac¸ãofoi incubadaàtemperaturaambientepor 5min e, em seguida,a 50◦_C_por ₆₀_min, _a ₇₀◦_C_por ₁₅_min _e _a

4◦_C _por₁₀_min. _PCR_quantitativa _em _tempo_real_foi _feita

comoSistemaABI7500paraPCRemTempoReal(Applied Biosystems).Osensaiosparaosníveis-alvodeDNAc foram feitoscomsondasTaqManMGBmarcadascomcoranteFAM

(AppliedBiosystems)emumareac¸ãode20␮Lcom2␮Lde DNAc,corantesdereferênciapassivaROXemisturaTaqMan UniversalPCR(AppliedBiosystems).Osconjuntosdeprimers

específicos usados e seusnúmeros de sequência são:poli (ADP-ribose)polimerase-1(PARP-1)25591Rn00565018mLe caspase-3 (Casp-3), cisteína protease relacionada à apop-tose 25402Rn00563902mL. As quantidades relativas de ambos os RNAm foram determinadas pela normalizac¸ão deseusníveisa18SnomesmoDNAc.

Análiseestatística

Todos os valores foram expressos em média com desvio padrão(DP).Osdadosforamanalisadoscomosprogramas estatísticosSPSSv.17eSystatSigmaPlot10.0.Asignificância estatísticafoicalculadacomotestetdeStudenteanálise devariânciasimples (Anova)paracomparac¸õesmúltiplas. Valoresdep<0,05foramconsideradosestatisticamente sig-nificativos.

Resultados

EfeitodotratamentocomisofluranosobrePPO ePLHapóshipóxia-isquemianeonatal

PPO e PLH foram registrados na região CA1. No grupo hipóxia, o tempo médio de decomposição da PPO foi de 144±21s; a taxa derecuperação da PPO foi de 22% e a amplitudederecuperaçãofoide24±9%.Em1,5%e2,5%dos gruposexpostosaisoflurano,otempodedecomposiçãoda PPOfoisignificativamenteprolongadoeataxaeaamplitude derecuperaçãodaPPOaumentaram,emcomparaçãocom osvaloresdogrupohipóxia.Nãohouvealteração significa-tivadotempodedecomposição,amplitudeeporcentagem derecuperaçãodaPPOnogrupoexpostoaisofluranoa0,5% (fig. 1A). No grupo hipóxia, o tempo médio para o início do PLH foi de 403±56s; a duração média do PLH foi de 104±14s e a incidência doPLH foi de aproximadamente 100%.AincidênciadoPLHfoireduzida,oiníciodoPLHfoi retardadoeaduraçãodoPLHfoiprolongadaem1,5%e2,5% dos grupos expostos a isoflurano,em comparação com os valoresdogrupo hipóxia.Osparâmetrosacimanãoforam estatisticamentesignificativosnogrupoexpostoaisoflurano a0,5%(fig.1B).

Efeitodaexposic¸ãoaisofluranosobrealiberac¸ão deaminoácidosneurotransmissores

(5)

300

A

B

∗

∗ ∗

∗

∗ ∗

∗

∗ ∗ ∗

∗

250

200

Tempo de

decomposição (s)

Início (s)

Taxa de recuperação (%)

Duração (s)

Taxa da amplitude de

recuperação (%) Incidência (%) 150

100

50

100

80

60

40

20

0

250

200

150

100

50

0

100

80

60

40

20

0

120

100

80

60

40

20

0

+

0 +

0,5 +

1,5 +

2,5

Isoflurano (%)

0

800

600

400

200

0

Hipóxia +

0 +

0,5 +

1,5 +

2,5

Isoflurano (%) Hipóxia

Figura1 OefeitodeisofluranosobrePPOePLH.Tempodedecomposição(s),taxaderecuperação(%)eamplitudederecuperação

(%)daPPO(A); oinício(s),adurac¸ão(s)eaincidência(%)doPLH(B)foramestimadoscomo descritonasec¸ãoMétodos(n=3; *p<0,05vs.grupohipóxia).

umneurotransmissor.Nesteestudo,medimosdiretamentea concentraçãodeaminoácidosneurotransmissoresnasolução deperfusãodasfatiasdohipocampoduranteahipóxiacom LCAD. As concentrações dos neurotransmissores Asp,Glu, GlieGABAforamsignificativamenteelevadas(p<0,05)no grupo hipóxia em comparação com as dogrupo controle--normóxia(tabela1). AsconcentraçõesdeAsp, Glu,Glie GABAaumentaram em1,32; 1,27;1,78 e 1,17vezes, res-pectivamente.Aexposiçãoaisofluranoreduziuosníveisde Asp, Glu e Gli deforma dose-dependente, especialmente em1,5%e2,5%.Porém,aexposiçãoaisofluranoaumentou

continuamenteosníveisdeliberaçãodeGABA,com signifi-cânciaestatística.OníveldeliberaçãoGlnnãofoialterado pelahipóxiaoupelaexposiçãoaisoflurano(tabela1).

Isofluranomelhoraasalterac¸õesmorfológicas emfatiasdehipocampohipoxêmico

Os estudos histológicos com a colorac¸ão com HE (fig. 2) mostraram que os neurônios piramidais na região CA1 do hipocampo ficaram intumescidos. As bordas celulares

Tabela1 Oefeitodeisofluranonaliberac¸ãodeaminoácidosneurotransmissoresdasfatiasdehipocampo(pmoL.L-1₎

Grupo Asp Glu Gln Gli GABA

Controle 2,03±0,12 1,85±0,12 0,77±0,05 1,05±0,07 1,79±0,08 Hipóxia(Hx) 2,68±0,14a _2,35_±_0,09a _0,76_±_0,05 _1,87_±_0,04a _2,09_±_0,06a Hx-ISF0,5% 2,61±0,15a _2,42_±_0,11a _0,75_±_0,04 _1,78_±_0,07a _2,21_±_0,09a,b Hx-ISF1,5% 2,44±0,13a,b _2,01

±0,14a,b _0,71

±0,05 1,65±0,09a _2,43

±0,12a,b Hx-ISF2,5% 2,41±0,14a,b _1,92_±_0,12b _0,72_±_0,04 _1,57_±_0,07a,b _2,55_±_0,14a,b

ISF,isoflurano.

(6)

Figura 2 Coloração com HE das fatias de hipocampo. (A) controle normóxia; (B) hipóxia (Hx); (C) Hx-isoflurano a 0,5%; (D)Hx-isofluranoa1,5%;(E)Hx-isofluranoa2,5%.AcoloraçãocomHEfoifeitacomodescritonaseçãoMétodos(n=3).

ficaram indistintas e os núcleos diminuíram e escurece-ram. Osdados dacolorac¸ão sugerem que danoscelulares ocorreram no grupo hipóxia. Além disso, o tratamento com isoflurano melhorou essas alterac¸ões morfológicas induzidas por hipóxia nos neurônios piramidais de modo dose-dependente.

Isofluranosuprimiuaapoptoseinduzida porhipóxia-isquemianeonatal

Quantificamos osníveis de RNAmdoPARP e da caspase-3 no hipocampo com a PCR-TR. As quantidades relativas a ambososRNAmforamdeterminadaspelanormalizaçãode seusníveis a18Snomesmo DNAc. Osníveis daexpressão logdosgenesforamexpressosemtermosdealteraçãoem dobro,em comparação comosníveis dos animaisde con-trole.Afigura3mostraqueoRNAmdacaspase-3aumentou cerca de duas vezes após hipóxia-isquemia neonatal, em comparaçãocomogrupocontrole-normóxia.Aumentosde

RNAmnacaspase-3sãoumaevidênciadiretadainduçãode apoptoseem fatiasdohipocampo. Ainduçãodeapoptose requeraativaçãodacaspase-3,queclivaosubstratonuclear PARP.AanálisedoRNAmdoPARPmostrouqueo seunível aumentou1,86 vezapósahipóxia, em comparaçãocom o grupo controle-normóxia. Os aumentos doRNAm do PARP confirmaramainduçãodeapoptoseemfatiasdohipocampo. Alémdisso,aexposiçãodeisofluranoaessestecidosmostrou reduçãodose-dependentedosníveisdeexpressãodeambos os genes. Isoflurano diminuiu os níveis de RNAm do PARP edacaspase-3comsignificânciaestatística.Esses resulta-dosmostramqueaapoptoseinduzidaporhipóxia-isquemia neonatalésuprimidapelaexposiçãoaisoflurano.

Discussão

(7)

2,5

A

B

Caspase-3

PARP

∗

∗ ∗#

∗# ∗#

∗# 1,5

Alteração em dobro

1

0,5

0 2

2,5

1,5

1

0,5

Hipóxia Isoflurano (%)

0

–

0 0 0,5 1,5 2,5

+ + + +

2

Figura3 PCRquantitativaem temporeal(PCRq-TR)paraa

caspase-3(A)ePARP(B).RNAtotalfoiisoladodefatiasde hipo-campo(n=3).DNAcfoisintetizadoeaPCRq-TRfoifeitacomo descritonasec¸ãoMétodos.

cerebral de ratos sob hipóxia-isquemia. Observamos prin-cipalmente que isoflurano não altera a neurogênese e não causa a morte celular neuronal em várias formac¸ões do hipocampo. Nossas descobertas demonstram que iso-fluranoproporciona neuroprotec¸ão aosuprimiraapoptose induzidaporhipóxia.

Fatiasdehipocamposãocomumenteusadasem pesqui-sasdelesãocerebralinduzidaporhipóxiaedesuaproteção farmacológica.Osneurônios piramidais do hipocampo são ascélulasmaissensíveisàhipóxia, dosquaisosneurônios piramidaisemCA1sãomaisvulneráveisàhipóxia.Comoas sinapsessãoformadasentreCA1eCA3,apopulaçãodepico ortodrômico(PPO) podeser registradaem CA1 quandoas colaterais de Schafferestão em CA3. Consequentemente, a PPOdemonstraalterações aparentesdurante ahipóxia. Estudosanterioresdemonstraramumareduçãonaamplitude daPPOduranteahipóxia,umindicadordedisfunção sináp-ticaeperdadacapacidadeexcitatória.Essasalteraçõesda PPOsãoreversíveisseosuprimentodeoxigêniofor restau-radoatempoeoatrasonodesaparecimentodaPPOsugere que os neurônios sãomenos vulneráveis à hipóxia.26 Por-tanto,otempodedecomposiçãodaPPOpós-hipóxiapode serusadocomoumparâmetroparaavaliaratolerânciados neurônios.Opotencialdelesãohipoxêmica(PLH)éum indi-cadorde dano hipoxêmico irreversível induzido em fatias

dehipocampo.27,28 _O_início_e _a_durac_¸ão_do_PLH _estão cor-relacionadoscomodanohipoxêmico.Oaparecimentomais prolongadodePLHcorrelacionacomrecuperac¸ãomaisfácil paraafatiadehipocampoapósarestaurac¸ãodosuprimento deoxigênio.Seo aparecimentodoPLH for postergadoou prolongado,odanoneuronalseráadiado.

Investigamoscomoisofluranoafetaospotenciais evoca-dosemfatiasdehipocampohipoxêmico.Nosgruposhipóxia, otempomédiodedecomposiçãodaPPOfoide aproximada-mente144segundos,ataxaderecuperaçãoeaamplitude daPPOdiminuíramapósarestauraçãodeoxigênioe supri-mentodeglicose(fig.1A).Esseresultadoindicouquehouve danohipoxêmicona transmissãosinápticaentreos neurô-niosdohipocampo.Aexposiçãoaisofluranocausouaumento dose-dependentedataxaderecuperaçãodaPPOeda ampli-tudedaPPO.Issosugere queotratamentocomisoflurano aumentou a tolerância da fatia de hipocampo à hipóxia. Oatraso noiníciodo PLH,a extensãodaduração doPLH eareduçãodaincidênciadoPLHcomdosesdiferentesde isofluranotambémdemonstraramqueaexposiçãoa isoflu-ranoadia aocorrência dedanoshipoxêmicos irreversíveis eaumentaa duraçãodos danosreversíveis.Em conjunto, essesdadossugeremqueotratamentocomisofluranoreduz odanohipoxêmicodeneurônioseprotegeasfunções sináp-ticasdedanoshipoxêmicos.

O efeito protetor de isoflurano pode advir da inibição deumaminoácidoneurotransmissorcomo Glu, um neuro-transmissorimportantedaregiãoCA1dohipocampo.Relatos sugeremque osaminoácidos excitatórios (AAE), incluindo GlueAsp,desempenhamumpapelfundamental no meca-nismo de lesão cerebral hipoxêmica.29-31 _O _receptor _de NMDA é um importante receptor de AAE e sua ativação resultana sobrecarga deCa2+ _intracelular _na _hipóxia.32,33 Nogrupohipóxia,asconcentraçõesdeAspeGlunasolução deperfusãoaumentaram1,32e1,27vez,respectivamente (tabela1).Otratamentocomisofluranoreduziualiberação de Asp e Glu induzida por hipóxia e reduziu assim a toxicidade excitatória. GABA é um neurotransmissor ini-bitório no sistema nervoso central que pode proteger os neurônioscontradanoshipoxêmicos.34,35 _Este_estudo mos-trou que o tratamento com isoflurano pode aumentar a concentraçãodeGABAnolíquidodeperfusão,oquepode ser ummecanismo neuroprotetor de isoflurano durante a hipóxia.Relatou-sequeoutroanestésico(propofol)aumenta aafinidade entreGABAe seureceptor;dessaforma,ativa diretamenteoreceptordeGABApararesultaremmelhoria dofluxo decorrente pelamembrana e a inibição hipopo-larizadainduzidaporGABA.3_Glicina_(Gli)_é_um_modulador deAAEque aumentaasensibilidadedoreceptordeNMDA aosAAE e amplifica a toxicidade excitatória induzidapor EAA.36-38_Observamos_que_a_Gli_estava_aumentada_no_grupo hipóxia,oquepodefacilitaratoxicidadeexcitatória(tabela 1). O tratamento com isoflurano reverteu o aumento da concentração de Gli induzida por hipóxia de um modo dose-dependente, o que sugere os efeitos protetores de isofluranonoSNC.Osdadosnão mostraramefeitode iso-flurano sobre a liberação de Gln, o que pode não estar diretamenteassociadoaomecanismoneuroprotetorde iso-flurano.AhipóxiacerebralpodeprovocarexaustãodeATP, influxode Na+ _e _Cl− _e _efluxo _de _K+ _e _H

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aumentodos receptoresde NMDAdependentes do influxo deCa2+_._Isso_resulta_em_sobrecarga_de_Ca2+_intracelular_que iniciaa ativação enzimática, hidróliseproteica, formação deradicaislivres deoxigênio,danosaoDNAemorte celu-larneuronal.Nossosdadosmostramqueisofluranodiminui oedemacelularinduzidoporhipóxiaeodanomitocondrial. Combasenosdados,conjecturamosqueoutrospotenciais mecanismospelosquaisisofluranoexerceproteçãocontraos danoshipoxêmicosaoSNCincluemamodulaçãodeCa2+_,_a depuraçãoderadicaislivresdeoxigênio,asobrerregulação do receptor de GABA e a inibição do receptor de NMDA. Alémdisso, descobrimosque otratamento comisoflurano causou a inibição dos níveis de RNAm da caspase-3 e do PARPinduzidosporhipóxia.Aapoptosepodeserexecutada principalmenteporduasvias:aviaintrínseca(mitocondrial) dependentedacaspase-9eaviaextrínsecadependenteda caspase-8.Ambaslevamàativaçãodoexecutorda caspase-3que,eventualmente,provocaamortecelularporclivagem deumasériedesubstratosnuclearesecitoplasmáticoscomo o PARP. Este estudo descobriu que isoflurano suprimiu os níveis deexpressão dos genes apoptóticos dacaspase-3 e doPARP,deformadose-dependente(fig.3).

Em conclusão, a exposição a isoflurano fornece neuroproteçãocontralesõeshipóxico-isquêmicascerebrais emratos.Aexposiçãoaisofluranoreduzodanohipoxêmico aosneurônioseprotegeasfunçõessinápticasdedanos hipo-xêmicos. Isofluranoreduz osníveis de liberação deAsp e GluinduzidosporhipóxiaeaumentaaliberaçãodeGABA. Esses aminoácidos neurotransmissores ajudam a proteger contradanoshipoxêmicosaoSNC.Omecanismobásicopor trásdessaneuroproteçãopareceserainibiçãodaapoptose induzidaporhipóxia.Esteestudoincideluzsobreousode isofluranocomoumanestésicoseguroempráticasclínicas, bemcomoempráticasveterinárias.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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