Estudo da interação de amino derivados de quitosana com o plasmídeo VR1412

BRUNO CORTE ALVES DE SOUZA

Estudo da Interação de Amino Derivados de Quitosana com o Plasmídeo VR1412

BRUNO CORTE ALVES DE SOUZA

Estudo da Interação de Amino Derivados de Quitosana com o Plasmídeo VR1412

Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, junto ao Programa de Pós-Graduação em Química, Área de Concentração – Química Ambiental, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.

Orientador: Prof. Dr. Marcio José Tiera

BRUNO CORTE ALVES DE SOUZA

Estudo da Interação de Amino Derivados de Quitosana com o Plasmídeo VR1412

Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, junto ao Programa de Pós-Graduação em Química, Área de Concentração – Química Ambiental, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.

Banca Examinadora

Prof. Dr. Marcio José Tiera UNESP _– São José do Rio Preto Prof. Dr. Mário Sergio Galhiane UNESP _– Bauru

Prof. Dr. Elói da Silva Feitosa UNESP _– São José do Rio Preto

AGRADECIMENTOS

Agradeço,

A Deus pela saúde, força e esperança a mim concedidos de maneira essencial

para concretização dos meus sonhos. Por todas as oportunidades que surgiram, pelas que ainda surgirão e por todas as dificuldades que passei e que fizeram de mim um homem de fé.

Aos meus queridos e amados pais, Agnaldo e Cirene, pelo amor, carinho,

paciência, educação e por todo esforço realizado em prol da minha formação acadêmica. Eles são os grandes responsáveis pela minha felicidade e por todas as minhas conquistas.

Ao meu insubstituível irmão Lucas, por sempre me proporcionar inesquecíveis

momentos de descontração. Por me dar exemplo de perseverança, sabedoria, coragem e me mostrar que nunca devemos desistir dos nossos sonhos.

A minha linda namorada Naiara, pelo amor, companheirismo, carinho e confiança.

Por me apoiar todo o período em que estive morando em Montreal, compartilhar comigo os melhores momentos da minha vida e por me fazer o homem mais feliz do mundo desde pequenininho. O meu futuro não faz o menor sentido se não for com você.

Aos meus inesquecíveis amigos do IBILCE, especialmente Egon, Pedro, Juliana,

Ana Letícia, Paulo, e principalmente ao meu grande amigo e irmão Heitor, cuja amizade quero levar para toda vida. Além de colaborarem com grande empenho neste projeto de pesquisa, também fazem do riso um elemento constante em minha vida.

Aos meus amigos do Laboratório de Biomateriais e Nanotecnologia, Luiz,

Amanda, Mirelle, Wander, Ricchard, Rafael, Hellen e principalmente Isadora, por não medirem esforços ao me auxiliar durante todo o projeto e por me mostrarem que um ambiente de trabalho pode ser maravilhoso.

Aos amigos do Centro de Pesquisa do Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal,

Mohamed Benderdour, Qin Shi, e ao professor Julio C. Fernandes, minha imensa gratidão por todos os auxílios prestados, pela paciência, e por tudo que me ensinou. A sua dedicação ao trabalho, conquistou todo meu respeito e admiração.

Ao Governo Canadense e ao Programme des Futurs Leaders dans les Amériques, pela bolsa de estudos concedida e pela oportunidade única de realizar parte do meu mestrado em outro país.

Aos meus professores Márcia e Maurício por sempre me incentivar, aconselhar e

me mostrar que o conhecimento é irresistível.

E finalmente, ao meu professor Marcio José Tiera, que acreditou nesse projeto de

pesquisa. Agradeço por ser um verdadeiro “Pai” no meu mestrado, e por todos os

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo principal a síntese e caracterização de derivados hemocompatíveis de quitosana e sua utilização na preparação de nanopartículas para terapia gênica não-viral. O trabalho foi realizado em duas etapas, sendo a primeira a obtenção dos derivados, seguido de estudos da interação com o plasmídeo VR 1412 (pDNA) que expressa a β-galactosidase. A primeira etapa de síntese envolve a modificação de quitosana pela introdução de grupos amino, seguido pela ligação de cadeias de polietilenoglicol (PEG). Os derivados foram caracterizados por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, potenciometria e viscosidade. Os estudos da interação foram realizados utilizando as técnicas de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmica e citotoxicidade. O trabalho foi conduzido de forma comparativa, avaliando as mudanças estruturais e seus efeitos na força de interação e estabilidade das nanopartículas.

ABSTRACT

The current study aimed at the synthesis and characterization of

hemocompatible chitosan derivatives and their use in the preparation of

nanoparticles for non-viral gene therapy. The project was carried out in two

steps, first the synthesis and characterization of the derivatives, followed by

studies of the interaction between the chitosan derivatives and the VR1412

plasmid (pDNA), that expresses the β-galactosidase protein. The first step of

synthesis was the modification of chitosan by introducing tertiary amino groups,

followed by attaching the polyethyleneglycol (PEG) to the chitosan backbone.

The study of the interaction between the chitosan derivatives and the pDNA

was carried out using the fluorescence, electrophoresis in agarose gel, and light

scattering techniques. The study was performed in order to evaluate the effect

of structural changes of the chitosan backbone on the strength of interaction

and stability of the nanoparticles.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Reação de desacetilação de quitina em meio básico ... 16

Figura 2. Reação da síntese da quitosana com 2-cloro-N,N-dietiletilamina (DEAE-Cl)... 17

Figura 3. Viscosímetro do tipo Cannon-Ubbelohde ... 20

Figura 4. Placas com agar/canamicina e colônias de Escherichia coli ... 23

Figura 5. Estrutura do brometo de etídio ... 24

Figura 6. Estrutura do MTT (3-[4,5-dimethiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) ... 26

Figura 7. Redução do MTT para formazana ... 27

Figura 8. Titulação potenciométrica e 1ª. derivada de quitosana desacetilada ... 29

Figura 9. Espectro de RMN 1_{H da quitosana desacetilada em D2O/DCl a 70 °C} ... 29

Figura 10. _{ηsp/concentração} versus concentração da quitosana, em que com a extrapolação da reta para concentração próxima a zero obtém-se a viscosidade intrínseca ... 30

Figura 11. Síntese de derivados anfifílicos de quitosana ... 31

Figura 12. Espectro de RMN 1_{H do PEG-aldeído (Mw = 2000 g/mol) em} D2O/DCl a 70 °C ... 32

Figura 13. Espectro de RMN 1_{H do derivado de quitosana modificada com} PEG na proporção 5% em D2O/DCl a 70 °C ... 33

Figura 14. Estrutura do monômero dos derivados de quitosana contendo os hidrogênios que produzem os sinais utilizados dos espectros de RMN 1_{H ... 34}

Figura 15. Espectro de RMN 1_{H do derivado de quitosana modificado com} PEG e DEAE na proporção 5% e 25% em D2O/DCl a 70 °C ... 34

Figura 16. Titulação do complexo Plasmídeo-EtBr por CHdes e CH-PEG5%-DEAE25% em pH 5,0,força iônica 150mM e concentração de 50mM a 25ºC .. 36

Figura 17. Eletroforese de nanopartículas de quitosana em pH 5,0 e 7,4 ... 38

Figura 18. Eletroforese de nanopartículas do polímero CH-PEG5%DEAE25% em pH 5,0 e 7,4 ... 38

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS [η] Viscosidade intrínseca

β-gal β-galactosidade

a Constante de Mark-Houwink relacionada à flexibilidade do polímero

CHdes Quitosana desacetilada

CH-PEG5% CHdes modificada com polietilenoglicol na proporção 5%

CH-PEG5%-DEAE25%

CHdes modificada com polietilenoglicol e 2- cloro-N,N-dietiletilamina, nas proporções 5% e

25%, respectivamente DEAE 2-cloro-N,N-dietiletilamina

DLS Espalhamento de Luz Dinâmico

DMEM Meio Dubelco´s Modified Eagle Medium DNA Ácido Desoxirribonucleico

EtBr Brometo de Etídeo FBS Soro fetal bovino

FI Força iônica

GD Grau de desacetilação GS Grau de substituição

Km Constante de Mark-Houwink LB Meio Lysogeny broth

Mv Massa molar viscosimétrica média MTT Tetrazolio

N Grupos amina de quitosana

N/P Razão de grupos amina de quitosana e grupos fosfato de DNA

pDNA DNA plasmidial

PO4-3 Grupos fosfato de DNA

PS Penicilina/Estreptomicina PEG Polietilenoglicol

PEG-OH Polietilenoglicol aldeído

RMN 1_{H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio}

t Tempo de escoamento da solução polimérica TAE Tampão Tris-Acetato-EDTA

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 13

1.1. Terapia Gênica ... 13

1.2. Quitosana ... 16

2. OBJETIVOS ... 18

3. METODOLOGIA ... 18

3.1. Desacetilação da Quitosana ... 18

3.2. Determinação do Grau de Desacetilação (GD) ... 19

3.2.1. Titulação Potenciométrica ... 19

3.2.2. Ressonância Magnética Nuclear de Próton (RMN 1_{H) ... 19}

3.3. Determinação da Massa Molar por Viscosidade ... 20

3.4. Síntese dos derivados contendo poli(etileno)glicol (PEG) e 2-cloro-N,N-dietiletilamina (DEAE) ... 21

3.5. Caracterização da Quitosana e seus Derivados ... 22

3.6. Transformação de E.coli, Extração, Purificaçao do Plasmídeo VR1412.22 3.7. Estudo da Interação pDNA-Quitosana e Derivado utilizando o Ensaio com Brometo de Etídio (EtBr) ... 24

3.8. Eletroforese das Nanopartículas de Quitosana e Derivado com pDNA . 25 3.9 Espalhamento de Luz Dinâmico e Determinação do Potencial Zeta ... 25

3.10 Cultura de Células e Protocolo de Transfecção in vitro de Células HeLa ... 26

3.11 Estudo de Citotoxicidade das Nanopartículas Preparadas com Quitosana e Derivado ... 26

4. RESULTADOS E DISCUSSAO. ... 28

4.1 Síntese e caracterização de quitosana desacetilada e seus derivados .. 28

4.1.1 Desacetilação da quitosana ... 28

4.1.2 Determinação da Massa Molecular ... 30

4.1.3 Preparação e Caracterização de Quitosanas Modificadas ... 31

4.1.4 Determinação do Grau de Substituição de grupos DEAE por RMN 1_H ... 33

4.2 Ensaio de Fluorescência com Brometo de Etídio (EtBr) ... 35

1. INTRODUÇÃO 1.1 Terapia Gênica

A terapia gênica pode ser definida como o tratamento de doenças hereditárias pela transferência de material genético para dentro de células específicas de um paciente, com o objetivo de substituir, corrigir ou suplementar genes ausentes ou defeituosos, responsáveis pelo desenvolvimento de doenças (ROBBINS & GHIVIZZANI, 1998). Uma grande variedade de desordens genéticas herdadas e adquiridas, incluindo o diabetes, fibrose cística, câncer e hemofilia podem ser tratadas com a terapia gênica (GRIGSBY et al., 2009; LINDEN, 2010). Entretanto o maior desafio na terapia gênica é a transferência do material genético para dentro das células, e a maioria dos esforços se concentra na busca de vetores eficientes que possam transportar e transferir o DNA de modo seguro e eficiente (SOMIA et al., 2000). Pode-se dizer que o sucesso da terapia gênica é largamente dependente do desenvolvimento dos vetores de entrega de genes (NIIDOME & HUANG, 2002).

O vetor perfeito para ser usado em terapia gênica deve atender a vários requisitos, como ser administrado por uma via não invasiva, atingindo, portanto apenas as células desejadas no tecido alvo, expressar apenas uma quantidade terapêutica de produtos transgênicos com regulação desejada por um período definido e gerar apenas resíduos biodegradáveis de baixa toxicidade. Porém, nenhum sistema que utiliza vetor será ótimo para todas as aplicações (VORBURGER & HUNT, 2002) e apesar de alguns estudos mostrarem sucesso na captação de DNA livre em algumas tentativas de terapia gênica, a expressão e entrega eficiente foram limitadas a apenas alguns tecidos, como o músculo, pois o DNA é uma molécula muito flexível, e sob condições fisiológicas normais, é negativamente carregada devido aos seus grupos fosfato, e é muito grande para atravessar as membranas sem ajuda.

Para o transporte eficaz do gene in vitro e in vivo, outro problema

Para melhorar a eficiência e estabilidade de entrega do gene, várias pesquisas estão avaliando ambos os vetores virais e não-virais para a transferência de genes. Também é importante ressaltar que cada tipo de vetor tem as suas vantagens, bem como desvantagens, que requerem modificações adicionais para tornar um vetor adequado para aplicações gerais de terapia gênica (LI & MA, 2001).

Entre os vetores utilizados, os virais ainda são os mais investigados e aplicados clinicamente devido à sua alta eficiência de transfecção gênica, que é caracterizada pelo processo de entrega e expressão de material genético com sucesso no interior no núcleo celular. Os mais utilizados na terapia genica são os retrovírus, seguidos pelos adenovírus. No entanto, a morte de voluntários em estudos clínicos tem causado limitações nas aplicações desses vetores (FRIEDMANN, 2007). Por conta disso vários estudos são realizados para entender e reduzir a toxicidade desses vetores (GEORGE, J. A. St, 2003).

As vantagens que os vetores não virais oferecem sobre o sistema viral, incluem principalmente a preparação e segurança. Durante a última década, muitos esforços têm sido realizados para produzir sistemas não-virais que alcancem o nível de expressão de genes atingido por vetores virais. Os vetores não virais envolvem principalmente vetores de lipídeos e vetores de polímeros catiônicos, que são capazes de interagir com o DNA para formar complexos que protegem o DNA da degradação e neutralizam as cargas negativas do DNA plasmidial (ELOUAHABI & RUYSSCHAERT, 2005). Devido à importância dos complexos DNA- policátions para a terapia gênica, o processo de formação de complexos tem atraído considerável interesse e tem sido estudado por grande variedade de técnicas, tais como espectroscopia de fluorescência (TRUBETSKOY et al., 1999), microscopia eletrônica, (PERALES, et al., 1997) e espalhamento de luz (PICOLA et al., 2011).

grau de ionização do complexo. Isso favorece o deslocamento de íons para o interior do endossomo aumentando a força iônica do meio e, consequentemente, facilitando a liberação do DNA (PATIL et al., 2011). Portanto, a análise de novos poliplexos em diferentes condições experimentais se torna essencial para avanços nessa área.

Nanopartículas preparadas a partir de polímeros sensíveis a estímulos internos ou externos tem sido utilizadas como possíveis carreadores para a terapia gênica, bem como para liberação de fármacos anticancerígenos (GANTA et al., 2008). A construção desses sistemas explora mudanças nas propriedades físicas das nanopartículas que ocorrem, ou em resposta às mudanças nas condições do meio circundante, ou são induzidas externamente. Esses estímulos podem alterar as interações com células e disparar a liberação do fármaco no sítio de interesse. Entre os vários estímulos que podem ser utilizados para induzir essa liberação, a mudança do pH tem sido um dos mais explorados (GANTA et al., 2008). Entretanto o tamanho e forma das nanopartículas desempenham papel importante no processo de entrega e pode depender da massa molecular do policátion, da concentração e tipo do DNA/plasmídeo, bem como da razão de cargas policátion:DNA (+ : -) (TIERA, et al., 2011).

O tamanho da partícula é considerado um parâmetro importante, pois pode afetar o tempo de circulação na corrente sanguínea e o processo de captação celular. Em geral, tem sido relatado que poliplexos entram na célula principalmente por endocitose ou pinocitose, e que o tamanho deve ser inferior a 100 nm (MAO, et al., 2001; WOLFERT & SEYMOUR, 1996). Entretanto, os resultados experimentais disponíveis são contraditórios e alguns trabalhos afirmam que a transfecção pode ocorrer com partículas de tamanhos variando de 100 nm (ERBACHER et al., 1998) a 2,0 μm (AKBUGA et al., 2004). Estudos utilizando microscopia de força atômica indicaram que poliplexos quitosana-DNA com tamanhos de algumas centenas de nanômetros podem ser transferidos para dentro das células por meio da endocitose (LIU et al., 2003).

célula alvo. Dependendo das características da superfície, as nanopartículas podem ser removidas por macrófagos do sistema retículo endotelial do fígado, baço e outros órgãos (PEPPAS & BLANCHETTE, 2004). A obtenção de novos polímeros com camadas protetoras na superfície das nanopartículas pode evitar interações com proteínas plasmáticas e fagócitos, prolongando, portanto, o tempo de circulação na corrente sanguínea (OBA et al., 2010; SATO et al., 2001).

1.2 Quitosana

Um polímero com grande potencial para terapia gênica é o polissacarídeo quitosana, por ser natural, não tóxico, biocompatível e biodegradável (MACLAUGHLIN et al., 1998; TIERA et al., 2006). A quitosana pode ser obtida quimicamente pela desacetilação da quitina, um abundante polímero presente no exoesqueleto de crustáceos (caranguejos, camarões e lagostas) (CAMPANA & SIGNINI, 2001; MOURA et al., 2006). Esse polímero é

constituído por monômeros de acetamido-desoxi-D-glicopiranose e 2-amino-2- desoxi-D-glicopiranose, sendo que o primeiro é mais predominante que o segundo. O processo de desacetilação da quitina consiste em aumentar a predominância de monômeros 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose com relação a 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose, formando a quitosana.

Esse polímero é catiônico devido à presença de grupos amino em sua cadeia polimérica que, em meio ácido, são passíveis de protonação aumentando sua solubilidade. Além de interagir muito facilmente com o DNA formando nanopartículas, proporciona uma boa proteção contra a degradação por endonuclease, o que tem motivado sua utilização como vetor não viral para a terapia gênica (MAO et al., 2001; SATO et al., 2001; ROY et al., 1999; CHAE et al., 2005; BOWMAN & LEONG 2006; CORSI et al., 2003).

A possibilidade de produção de diversos derivados de quitosana por meio de reações químicas, em que são inseridos diferentes grupos funcionais à cadeia polimérica, confere à quitosana diferentes propriedades, sendo possível fazer modificações de interesses específicos na terapia gênica (OLIVEIRA et al., 2013).

No presente trabalho, baseado em estudos anteriores do grupo, foi proposto um estudo com sistemas que vem sendo sintetizados e caracterizados no Laboratório de Biomateriais e Nanotecnologia. Os polímeros estudados são derivados de quitosana, que foram sintetizados procurando introduzir aminas secundárias e terciárias na cadeia de quitosana (Figura 2).

Estudos recentes do nosso grupo de pesquisa mostraram que os polímeros que apresentam graus de substituição de 15 a 25% apresentaram eficiência de transfecção 10 vezes superior à de nanopartículas preparadas com quitosana desacetilada (CH95%) e aproximadamente 40 vezes superior ao DNA livre. Os grupos 2-cloro-N,N-dietiletilamina (DEAE-Cl) permitiram

aumentar a estabilidade coloidal das nanopartículas em pH fisiológico bem como o escape endossomal do DNA plasmidial com um aumento na eficiência de transfecção (OLIVEIRA, et al. 2011).

Figura 2. Esquema da síntese de amino derivados de quitosana com

Também foi proposto ampliar as propriedades desses polímeros pela inserção de polietilenoglicol (PEG) nas cadeias dos derivados, procurando-se avaliar o efeito de PEG na força de interação com o DNA e na estabilidade das nanopartículas. A ligação com polietilenoglicol permite a administração intravenosa, aumenta o tempo de circulação e sua utilização com poli-L-lisina mostrou resultados promissores em terapia antiangiogênica no tratamento de tumores (OBA et al., 2010). A primeira etapa foi a síntese dos derivados contendo grupos hidrofílicos, seguido do estudo da interação dos derivados com o DNA, buscando-se avaliar o efeito das modificações nas propriedades das nanopartículas.

2. OBJETIVOS

O objetivo geral do projeto foi a síntese e caracterização de derivados de quitosana e o estudo da interação com DNA plasmidial, visando a obtenção de nanopartículas mais estáveis com baixa toxicidade. Nesse sentido duas modificações foram propostas: a primeira envolve a modificação com grupos amino terciários seguida da modificação com polietilenoglicol. A proposta de introdução de grupos amino terciários tem como objetivo aumentar a solubilidade em meio neutro e a introdução de cadeias de PEG tem por finalidade aumentar a estabilidade coloidal.

O estudo da interação com pDNA teve como objetivo específico avaliar o efeito das modificações estruturais na força de interação com o DNA plasmidial, visando avaliar o efeito da composição na força de interação e estabilidade das nanopartículas em diferentes condições de preparação.

3. METODOLOGIA

3.1 Desacetilação da Quitosana

(0,3 mol.L-1_{). Uma alíquota de 200 mL de NaOH (12,5 mol.L}-1_{) foi adicionada à}

solução do polímero sob agitação em atmosfera de nitrogênio. Na sequência, a temperatura foi elevada a 100 °C e mantida por hora e 30 minutos. A reação foi interrompida e a suspensão foi transferida para um béquer contendo 4 litros de água deionizada a 70 °C, sob agitação. O precipitado obtido foi decantado, lavado por mais 10 vezes com água deionizada e desumidificado por filtração a vácuo. Após a filtragem a quitosana foi lavada com acetona e seca em estufa a 40 °C por 72 horas. Triturou o polímero utilizando um pistilo e almofariz.

3.2 Determinação do Grau de Desacetilação (GD) 3.2.1 Titulação Potenciométrica

A determinação do grau de desacetilação da quitosana por potenciometria foi realizada segundo o método de Tolaimate (2000). Uma amostra de 40 mg, previamente seca na estufa a 50 °C até atingir massa constante, foi dissolvida em 10 mL de HCl 0,093 mol.L-1_{. Em seguida, a}

solução resultante foi titulada com solução de NaOH 0,099 mol.L-1_{. O pH foi}

monitorado durante a titulação utilizando-se um pHmetro Analion modelo PM 608. Os resultados foram apresentados na forma de um gráfico de pH em função do volume adicionado de NaOH. O gráfico da derivada primeira (dpH/dV) em função do volume da base foi utilizada para calcular o GD (TOLAIMATE, et al., 2000).

3.2.2 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN de 1_H)

As amostras para análise por RMN 1_{H foram preparadas pela dissolução}

de 20 mg dos derivados de quitosana em 1 mL de D2O contendo 10 μL de DCl.

As amostras foram mantidas sob agitação magnética até a completa solubilização. Os espectros de RMN de 1_{H foram obtidos na Faculdade de}

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP em um espectrômetro Bruker de 500 MHz a 70 °C.

As medidas de viscosidade foram realizadas utilizando-se um viscosímetro calibrado Cannon-Ubelohde de diluição em série, em banho a 25 °C. Inicialmente mediu-se o tempo de escoamento da solução tamponante ácido acético/ acetato de sódio (0,3 mol.L-1_{/ 0,2 mol.L}-1_{) e posteriormente}

mediu-se o tempo de escoamento das soluções de quitosana no mesmo tampão, em concentrações decrescentes. O tempo de escoamento de cada solução foi medido em quintuplicata.

A massa molecular viscosimétrica foi determinada a partir da equação de Mark-Houwink (2), onde [ƞ] representa a viscosidade intrínseca da solução, Mv representa a massa molar viscosimétrica, Km é uma constante

característica do polímero dependente da temperatura e do solvente e “a” é uma constante característica da flexibilidade e geometria da molécula do polímero (SANTOS et al., 2003).

.

(2)

3.4 Síntese dos derivados contendo polietilenoglicol (PEG) e 2-cloro-N,N-dietiletilamina (DEAE)

A síntese dos derivados de quitosanas contendo PEG foi realizada utilizando-se o método descrito por Harris e colaboradores com pequenas modificações (TIERA, et al., 2010).

A quitosana foi dissolvida em uma solução a 2% de ácido acético. Em seguida, adicionou-se gota a gota uma solução aquosa com 250 mg de PEG aldeído, _“O-[2-(6-oxocaproilamino)etil]-_O′-metilpolietilenoglicol 20_00” (MM 2000 g.mol-1_{), Sigma Aldrich ®.}

Essa mistura reacional foi mantida sob agitação magnética por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o pH da mistura foi ajustado para 6,0 com solução de NaOH 0,05 mol.L-_{1 e a solução foi resfriada a 0 °C.}

Após o resfriamento adicionou-se lentamente, 10 mL de uma solução aquosa previamente preparada com 0,476 g de NaCNBH3. A mistura foi mantida por 18

horas sob agitação magnética constante e temperatura ambiente. O derivado foi purificado por diálise em membrana Spectrapore (MWCO 12 kDa) contra NaOH 0,05 mol.L-1 _{por um dia e depois contra água deionizada por três dias,}

trocando-se a água três vezes por dia, e o polímero recuperado por meio de liofilização. Para purificação, ou seja, para a remoção do PEG não ligado, realizou-se extração em sistema Soxhlet durante dois dias, utilizando clorofórmio como solvente.

A síntese dos derivados de quitosanas contendo DEAE foi realizada utilizando 0,45 g do derivado da reação anterior, solubilizada em 18,8 mL de ácido clorídrico 0,1 mol.L-1_{. Em seguida, 145 mg de DEAE foram adicionados à}

solução de quitosana e o pH foi ajustado para 8 com adição de NaOH 2 mol.L -1_{. A reação foi realizada sob agitação a 65 °C e o pH foi ajustado a cada 30}

minutos. O produto foi purificado pela diálise contra NaOH 0,05 mol.L-1_{, por 24}

3.5 Caracterização da Quitosana e seus Derivados

Os derivados foram caracterizados quanto a composição (grau de substituição) utilizando-se a Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (TIERA et al, 2006) a 70 ºC em D2O/DCl (100:1). A presença de PEG e o

cálculo do grau de substituição pode ser feito com base nas bandas características desse substituinte identificadas no espectro, sendo utilizadas em trabalhos recentes do grupo (TIERA et al., 2010).

3.6 Transformação de Escherichia coli, Extração e Purificação do

Plasmídeo VR1412

O DNA plasmidial (pDNA) VR1424, que codifica a proteína beta-galactosidase (β-gal) e possui um tamanho de 8100 kb, foi obtido da VICAL Inc. (San Diego, CA, USA). A determinação da concentração do pDNA foi realizada utilizando um nanofotômetro. Estes procedimentos foram realizados no laboratório do Prof. Júlio Fernandes da Université de Montreal – Canadá.

O tubo com bactérias Escherichia coli foi removido do freezer a -80 °C, e

foi descongelando em gelo. Dentro de outro tubo a 0º C foram colocados 50 mL da suspensão de bactérias e 5 mL do plasmídeo VR1412 e agitados com o auxílio de uma pipeta.

Figura 4. Placas com agar/canamicina e colônias de Escherichia coli

Para extração e purificação, 6 frascos com 300 mL de água deionizada e 6,0 g de meio LB foram autoclavadas e homogeneizadas; em seguida foi adicionado 1 mL (30 mg.mL-1_{) de canamicina e 1 mL do estoque de meio com}

bactéria/plasmídeo VR1412 em cada garrafa, ficando por 12 horas a 36 ºC sob agitação de 130 rpm. As soluções foram transferidas para tubos de ensaio e, em seguida, centrifugadas a 6000 rpm por 15 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi dispensado e os “pellets” de bactérias foram resuspendidos em Tampão P1

(QIAGEN Maxi kit), e transferidos para tubos menores em gelo. As bactérias foram tratadas com 10 mL do Tampão P2, e incubadas por 5 minutos. Em seguida, foi adicionado 10 mL do Tampão P3 e incubado em gelo por 20 minutos.

3.7. Estudo da Interação de pDNA-Quitosana e Derivado utilizando o ensaio com brometo de etídio

A interação da quitosana desacetilada, e seus derivados com pDNA VR1412 foi estudada utilizando técnicas de fluorescência, e eletroforese, em diferentes pHs e força iônica de 150 mmol.L-1 _{com brometo de etídio. O EtBr,}

brometo de etídio (Figura 5) é uma sonda catiônica que emite fluorescência quando intercalada entre as bases da cadeia de DNA(CASÉ et al., 2009).

A interação de quitosana com DNA desloca as moléculas de EtBr e a fluorescência decresce devido a sua transferência para o meio aquoso. Os comprimentos de onda utilizados na realização desse experimento foram de 560 nm de excitação e 605 nm de emissão. Para esse estudo, foram preparadas soluções de pDNA 16 µmol.L-1 _{de grupos fosfato com brometo de}

etídio em 4 µmol.L-1 _{e tampão de pH 5,0 ou 7,4 e força iônica 150 mmol.L}-1_,

ajustada com NaCl. Essas soluções foram mantidas em repouso por 24 horas e logo após foram tituladas com alíquotas de quitosana e derivado, preparadas no mesmo tampão. Os resultados desse estudo são apresentados como porcentagem de fluorescência relativa em função da razão de grupos amina de quitosana (N) e grupos fosfato de DNA (P) (N/P).

Os experimentos foram realizados em um fluorímetro Hitashi F4500 a 25 ºC, e a temperatura foi mantida com um banho termostatizado. As medidas foram realizadas em triplicata. A concentração de pDNA foi determinada pela absorção no UV em 260 nm em espectrofotômetro UV-visível Cary modelo 100Bio, utilizando-se a relação 1A (unidade de absorbância) = 50 µg/mL = 0,146 mmol.L-1 _{de grupos fostato (FELGNER et al., 1997).}

3.8. Eletroforese das nanopartículas preparadas pela interação de quitosana e seus derivados com pDNA

O ensaio utilizando eletroforese em gel das nanopartículas foi realizado com o objetivo de avaliar a estabilidade dos complexos formados em função do grau de substituição, pH e razão N/P, estes estudos foram realizados no laboratório do Prof. Júlio Fernandes da Université de Montreal _– Canadá. Os complexos formados para diferentes razões quitosana/DNA (+/-), para uma concentração fixa de plasmídeo, foram incubados nos tampões apropriados por 30 minutos. A eletroforese foi realizada em tampão TAE (10X). A solução de corante azul de bromofenol utilizada para corar o gel de eletroforese foi feita utilizando as seguintes porcentagens: 0,25 % de azul de bromofenol, 0,25 % de xileno cianol e 25 % de ficoll 400. As amostras para eletroforese foram preparadas pela mistura de 3,5 µL de azul de bromofenol e 8,5 µL de amostra da solução das nanopartículas preparadas em diferentes razões N/P. Os poços do gel foram carregados com 7,5 µL desta solução final e o tempo de corrida utilizado foi de 1 hora em 80 Volts. O gel foi previamente corado com brometo de etídio 1 µg/mL por 30 minutos.

3.9. Espalhamento de luz dinâmico (DLS) e determinação do Potencial Zeta

Para análise do tamanho das partículas, foi utilizada a técnica de espalhamento de luz dinâmico com o aparelho Zetasizer nano-ZS90, laser de 633 nm e ângulo de espalhamento de 90º, estes estudos foram realizados no laboratório do Prof. Júlio Fernandes da Université de Montreal - Canadá. As nanopartículas de quitosana/pDNA foram preparadas em diferentes razões N/P (1, 2, 3, 5 e 10) em tampão acetato de sódio 10 mmol.L-1 _{a pH 5,0 e força}

iônica 10 mmol.L-1_{, por meio da titulação da solução de pDNA (70 μmol.L}-1₎

3.10. Cultura das Células HeLa

As células HeLa utilizadas nos experimentos de toxicidade e transfecção foram obtidas da coleção da “American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)”. As células HeLa foram cultivadas em meio de cultura celular Dulbecco Mem (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, FBS (fetal bovine serum), e 1% de PS (penicilina/estreptomicina). As células foram incubadas em atmosfera de CO2-O2 (5-95%) a 37°C, suplementadas 24

horas antes dos experimentos.

3.11. Citotoxicidade das Nanopartículas Preparadas com Quitosana e Derivados

Nos estudos de toxicidade, 200 µL do meio de cultura contendo as células foram transferidas para placas de 96 poços, seguido da adição de 50 μL das nanopartículas e um período de incubação de 24 horas. Após esse período a viabilidade celular foi avaliada pela adição de 50 µL da solução do corante MTT = brometo de (3-[4,5-dimethiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) (Figura 6) na concentração de 0,5 mg.mL-1_{. As células foram incubadas por}

mais 4 horas.

O método baseia na redução do corante MTT, inicialmente amarelo na sua forma oxidada, mas adquire coloração azul na sua forma reduzida chamado de formazana (Figura 7), e esta redução é feita pelas desidrogenases mitocondriais, ou seja, ocorrerá somente em células viáveis. Em seguida o sobrenadante foi removido e adicionou-se 100 μL da solução ácida de isopropanol (0,1 mol.L-1 _{HCl no isopropanol absoluto) e a placa foi incubada por}

mais 10 minutos a 37 o_{C. A absorvância foi medida em 570 nm com um}

espectrofotômetro para leitura de placas EL800 (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA, USA). Estes estudos foram realizados no laboratório do Prof. Júlio Fernandes da Université de Montreal – Canadá.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Síntese e caracterização de quitosana desacetilada e seus derivados 4.1.1. Desacetilação da quitosana

A reação de desacetilação é uma reação de substituição nucleofílica que possibilita a obtenção de quitosanas com maiores graus de desacetilação para modificações posteriores. O gráfico da titulação potenciométrica e da primeira derivada são apresentados na Figura 8 e o espectro de RMN de 1_{H da}

quitosana desacetilada é apresentado na Figura 9. O alto grau de desacetilação caracteriza-se pelo pico de baixa intensidade em 2,57 ppm (Figura 9) que corresponde aos hidrogênios dos grupos acetamido. A área correspondente aos hidrogênios desse grupo, comparada a área do hidrogênio ligado ao carbono 2 do anel glucosamino (3,66 ppm), foi utilizada para calcular o grau de desacetilação segundo a relação:

GD = (ACH3/3) (2)

AH2

O valor obtido foi de 97,7%. Os demais picos que aparecem em 5,35 ppm e na faixa de 4,49 – 4,25 ppm correspondem, respectivamente, ao hidrogênio anomérico ligado ao carbono 1 do anel, e aos picos dos hidrogênios ligados aos carbonos 3, 4,5 e 6 do anel glucosamino.

Na titulação potenciométrica o volume de NaOH necessário para desprotonação dos grupos amino foi determinado a partir da Figura 8 e o grau de desacetilação foi calculado utilizando a equação 3. O grau de desacetilação (GD) obtidos pelos dois métodos são apresentados na Tabela 1, página 33.

Figura 8. Titulação potenciométrica e 1ª. derivada de quitosana desacetilada

Figura 9. Espectro de RMN 1_{H da quitosana desacetilada em D2O/DCl}

(1%) a 70 °C

-2 0 2 4 6 8 10 12 14

0 2 4 6 8 10

pH

V (mL) NaOH 0,099 mol/L pH

Primeira Derivada

0 2 4 6 8

D

e

ri

va

d

a

Pri

me

4.1.2 Determinação da Massa Molecular Viscosimétrica

A massa molar da quitosana desacetilada foi estimada por viscosimetria (Figura 10). O valor de massa molar viscosimétrica (Mv) da quitosana foi obtido

pela equação de Mark-Houwink. A viscosidade intrínseca [ƞ] foi determinada como 396 mL.g-1 _{e utilizando-se os valores de Km= 0,078 e a = 0,797 (SANTOS}

et al., 2003), Mv foi calculada como 44,49 kDa.

0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

300 600 900



/C

C (g/l)

Figura 10. ηsp/concentração versus concentração de quitosana. A

extrapolação da reta para concentração zero permite a obtenção da viscosidade intrínseca

4.1.3 Preparação e Caracterização da Quitosana Modificada

O esquema de síntese para a preparação das quitosanas modificadas com o polietilenoglicol (PEG) e cloreto de 2-cloro-N,N-dietiletilamina (DEAE) é

Figura 11. Esquema de síntese para os derivados de quitosana

A primeira etapa de síntese foi a inserção de cadeias de PEG, a qual ocorre via uma reação de aminação redutiva com PEG-aldeído utilizando o procedimento descrito por (DESBRIÈRES; MARTINEZ; RINAUDO, 1996). A quitosana apresenta aminas primárias, que são capazes de reagir com aldeídos

e cetonas formando iminas R2C=N, seguido da redução com borociano hidreto

de sódio. Na sequência foi realizada a substituição nucleofílica por DEAE e esta ordem foi escolhida para evitar uma possível reação de PEG-aldeído com os grupos amino terciários de DEAE, caso a ordem de inserção fosse invertida (Figura 11).

O espectro de RMN 1_{H do PEG aldeído é mostrado na Figura 12, e os}

sinais característicos de PEG podem ser observados em 3,25 e 3,6 ppm, que correspondem respectivamente ao CH3 terminal da cadeia de PEG e aos

observado em 5,1 ppm é o sinal característico do grupo acetal (CH(OH)2) que

confirma a presença do grupo aldeído na extremidade oposta.

Figura 12. Espectro de RMN 1_{H do PEG-aldeído (Mw = 2000 g/mol) em}

D2O/DCl a 70 °C

Utilizando a equação 4, que compara a integração do sinal do grupo metoxila (~ 3,86 ppm) com a integração correspondente ao hidrogênio ligado ao carbono C1 da cadeia de quitosana foi estimada a porcentagem de PEG

ligado. O espectro de RMN 1_{H do CH-PEG5% é mostrado na Figura 13. A}

Tabela 1 contém o valor da razão molar PEG/NH2 de GS para os derivados.

GS = (ACH3/3) (4)

Figura 13. Espectro de RMN 1_{H do derivado de quitosana modificada}

com 5% PEG em D2O/DCl a 70 °C

4.1.4 Determinação do grau de substituição (GS) de grupos DEAE por RMN 1_H.

A Figura 15 mostra o espectro de RMN 1_{H do derivado de quitosana}

substituído com PEG e DEAE. O espectro do derivado mostra dois sinais adicionais, o primeiro em 1,81 ppm que corresponde aos hidrogênios do grupos metil de DEAE, e outro em torno 3,71-3,79 que correspondem aos hidrogênios dos grupos metilênicos de DEAE. Além desses sinais, fica claro o desdobrando do pico referente ao hidrogênio que aparece como um dublete em 5,4 ppm. Este desdobramento ocorre devido à presença de DEAE como grupo substituinte, o qual provoca uma desblindagem gerando um deslocamento dos hidrogênios anoméricos para campos mais baixos. Na Figura 14 são indicados os hidrogênios H1 e os hidrogênios do grupos metil de DEAE utilizados para o

A Tabela 1 apresenta o valor da razão molar DEAE/NH2 e o grau de

substituição (GS) para todos os derivados.

Os dados da Tabela 1 mostram uma grande discrepância entre o grau de desacetilação determinado por RMN 1_{He aquele obtido por potenciometria,}

o que pode ser devido a umidade da amostra.

GS DEAE = (ACH3/6) / AH1 (5)

Figura 14. Estrutura do monômero dos derivados de quitosana contendo os hidrogênios que produzem os sinais utilizados dos espectros de RMN 1_H

Figura 15. Espectro de RMN 1_{H do derivado de quitosana modificado}

Tabela 1. Propriedades da quitosana e seus derivados Polímero Razão

molar PEG/NH2

Razão molar DEAE/NH2

GD%* GD%** GS% PEG

GS% DEAE

Mv

kDa

CHdes _{— —} 90,2 95,8 _{— —} 44,49

CH-PEG5% 0,05 — — — 5,0 — —

CH-PEG5%-DEAE25%

0,05 0,5 — — 4,3 25,5 —

* determinado por potenciometria. ** determinado por RMN 1_H

4.2 Ensaio de Fluorescência com brometo de etídio

O ensaio com brometo de etídio foi realizado com o objetivo de avaliar qualitativamente a força de interação da CHdes e CH-PEG5%-DEAE25% com pDNA. O experimento foi realizado em pH 5,0 e força iônica 150 mmol.L-1_{. Na}

figura 16 são apresentados os resultados desses experimentos. Para as duas amostras o comportamento foi similar, ou seja, com a adição do polímero a intensidade de fluorescência diminui, devido ao deslocamento do brometo de etídio para o meio aquoso, o que é uma medida indireta da interação da quitosana com DNA.

eletrostáticas entre as cargas positivas do polímero estudados e as cargas negativas do pDNA, mostrando dependente do grau de substituição do polímero (PICOLA, 2011).

0 5 10 15 20

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 In te n si d a d e d e F lu o re scê n ci a (% ) Razao N/P CHdes CHPEGDEAE

Figura 16. Titulação do complexo pDNA-EtBr por CHdes e CH-PEG5%-DEAE25% em pH 5,0, força iônica 150 mmol.L-1 _{e concentração de 50 mmol.L}-1

a 25 ºC.

4.3 Eletroforese das Nanopartículas Preparadas com de CHdes e CH-PEG5%-DEAE25%

O emprego da eletroforese em gel teve por objetivo principal avaliar comparativamente a estabilidade das nanopartículas preparadas com os dois polímeros em função do pH e da razão N/P. As partículas formadas em diferentes razões polímero/pDNA (+/-), para uma concentração fixa de pDNA, foram incubados nos tampões apropriados por 30 minutos. As figuras 17 e 18 apresentam os experimentos realizados em pH 5,0 e 7,4, em diferentes razões N/P, e FI 150 mmol.L-1_{. O primeiro poço à esquerda (L) de cada figura}

corresponde ao marcador de massa molecular - Ladder 1 kb plus.

migração do pDNA ocorre parcialmente, e somente na razão N/P 1, ou seja, acima da razão 1 toda a carga negativa do plasmídeo é neutralizada e a força de interação é suficiente para impedir a migração do pDNA associado às partículas. Em pH 7,4 o deslocamento do DNA ocorre parcialmente até a razão N/P 2,0, o que se deve à desprotonação parcial das cadeias de quitosana, enfraquecendo a ligação CH-DNA.

Figura 17. Eletroforese de nanopartículas de CHdes-pDNA em pH 5,0 e 7,4

Figura 18. Eletroforese de nanopartículas do polímero CH-PEG5%-DEAE25% em pH 5,0 e 7,4

4.4 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) e Medidas de Potencial Zeta das Nanopartículas

O tamanho bem como o potencial zeta das nanopartículas são parâmetros importantes para a captação celular e influenciam na citotoxicidade. Esses parâmetros podem ser determinados por medidas de espalhamento de luz dinâmico . Na Figura 19 são apresentados os diâmetros hidrodinâmicos (Dh) das partículas em diferentes valores de pH e razões N/P. A interação

a b

c d

Figura 19. Diâmetros (a e b) e potenciais zeta (c e d) das nanopartículas preparadas com quitosana desacetilada, CH-PEG5%-DEAE25% e o plasmídeo VR1412 em pH 5,0 () e 7,4 () e força iônica 150 mmol.L-1_.

De forma geral, em pH 5,0 o tamanho das partículas diminui com o aumento da razão N/P (a e b), tanto para as partículas preparadas com CH-des, quanto para CH-PEG5%-DEAE25%, uma vez que a densidade de carga positiva no complexo foi aumentada. Em pH 5,0 a diferença marcante entre os dois polímeros foi visível principalmente para baixas razões N/P (1-3). Nessa faixa a CHdes forma partículas com tamanhos da ordem de 600 nm, enquanto CH-PEG5%-DEAE25% levou à formação de partículas da ordem de 150- 200 nm. Essa diferença se deve provavelmente ao efeito estabilizador do PEG no tamanho das partículas, impedindo sua agregação. Para razões N/P maiores que 3 o potencial zeta se torna positivo (+12-25 mV) o que confere uma estabilidade adicional às partículas devido a repulsão eletrostática entre elas.

Em pH 7,4 o efeito estabilizador de PEG tornou-se mais importante e evidente pois, para as partículas preparadas com CH-des, o tamanho das

0 2 4 6 8 10

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 D h (n m) N/P

CH_Desacetilada pH 5,0 CH_Desacetilada pH 7,4

0 2 4 6 8 10

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 D h (n m) N/P

CH_PEG5_DEAE24,5 pH 5,0 CH_PEG5_DEAE24,5 pH 7,4

0 2 4 6 8 10

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 Poten ci a l Z e ta (mV) N/P

CH_Desacetilada pH 5,0 CH_Desacetilada pH 7,4

0 2 4 6 8 10

-25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 Poten ci a l Z e ta (mV) N/P

partículas aumenta com o aumento da razão N/P e há formação de agregados com Dh da ordem de 750 nm para toda a faixa N/P estudada. Entretanto, para as partículas preparadas com CH-PEG5%-DEAE25% os diâmetros para N/P > 4 permaneceram em torno de 200 nm o que mostrou que o PEG tem um efeito estabilizador, diminuindo a agregação e formando partículas estáveis em pH 7,4.

Analisando as medidas de potencial zeta, nota-se uma boa correlação com a estabilidade e o tamanho das partículas. Inicialmente, observa-se que as nanopartículas exibem carga superficial negativa, já que a proporção pDNA é maior que a do policátion. Em pH 5,0 o aumento da razão N/P causa um aumento no potencial zeta, sendo que inicialmente os potenciais são negativos em torno de -12 mV para CH-des e -10 mV para CH-PEG5%-DEAE25%, atingem valores neutros próximo a razão N/P 1 e, por fim, assumem potenciais positivos + 20 mV e +15 mV, respectivamente (Figura 19 c e d).

Em pH 7,4 os grupos amina são quase que completamente desprotonados e o aumento da razão N/P causa um aumento gradual no potencial zeta. Ocorre uma diminuição do potencial zeta das partículas preparadas com CH-PEG5%-DEAE25%, e embora os potenciais permaneçam próximos da neutralidade, as partículas exibiram estabilidade adicional devido a presença de PEG.

4.5 Citotoxicidade das Nanopartículas Preparadas Com CHdes e CH-PEG5%-DEAE25%

A quitosana é considerada um polímero atóxico e experimentos in vitro

visando avaliar o efeito das modificações na viabilidade de células HeLa. Os resultados mostram que na presença das nanopartículas preparadas em pH 7,4 a viabilidade celular é próxima daquela exibida por CH-des, ou seja, maior do que 90%, sofrendo pequena alteração com a variação da razão N/P. Em pH 5,0, a citotoxicidade é maior, levando a uma diminuição da viabilidade em torno de 10% em relação ao pH fisiológico (7,4).

0 20 40 60 80 100 120

1 2 3 5 10

N/P

V

iabilidade Celular

(%

)

pH 5,0 pH 7,4

Figura 21. Viabilidade celular de HeLa em presença das nanopartículas preparadas com CH-PEG5%-DEAE25% em pH 5,0 e 7,4 para razões N/P crescentes. As nanopartículas foram administradas na concentração de 5 µg de pDNA por poço.

5. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitem concluir que a reação de desacetilação da quitosana apresentou rendimentos elevados, visto que o GD obtido por RMN 1_{H foi de 97,7%. O procedimento de síntese utilizado é viável para}

obtenção de derivados de quitosana, tanto para o derivado com PEG quanto com o DEAE nas razões desejadas, com rendimentos satisfatórios. O pH é um parâmetro importante que deve ser controlado para maximizar o rendimento da reação. Além disso, o grau de substituição pode ser determinado com boa precisão utilizando RMN 1_{H. Os ensaios de fluorescência com brometo de}

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AKBUGA, J.; OZBAS-TURAN, E. & ERDOGAN, N. Plasmid-DNA loaded chitosan microspheres for in vitro IL-2 expression. Eur J Pharm and Biopharm 2004; 58(3): 501-507.

BOWMAN, K. & LEONG, K. W., 2006. Chitosan nanoparticles for oral drug and gene delivery. Int J Nanomedicine 2006; 117-128.

BRUGNEROTTO, J.; DESBRIERES, J.; ROBERTS, G.; RINAUDO, M. Characterization of chitosan by steric exclusion chromatography. Polymer 2001; 42: 09921-09927.

CAMPANA-FILHO, S. P.; SIGNINI, R. Efeito de aditivos da desacetilação da Quitosana. Polimeros 2001; 11(4): 169-173.

CASÉ, A. H., PICOLA, I.P.D. ; ZANIQUELLI, M.E.D.; FERNANDES, J. C.; TABOGA, S. R.; WINNIK, F. M.; TIERA, M.J. Physicochemical characterisation of nanoparticles formed between DNA and phosphorylcholine substituted chitosans. J Colloid Interf Sci 2009; 336: 125-133.

CHAE, S. Y., et al. Deoxycholic acid-conjugated chitosan oligosaccharide nanoparticles for efficient gene carrier. J Control Release 2005; 109: 330-344. CORSIA, K. et al. Mesenchymal stem cells, MG63 and HEK293 transfection using chitosan-DNA nanoparticles. Biomaterials 2003; 1255-1264.

ELOUAHABI, A. & RUYSSCHAERT, J-M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexesand polyplexes. Mol Ther 2005; 11: 336-347.

ERBACHER, P.; ZOU, S.; BETTINGER, T.; STEFFAN, A.-M. & REMY, J.-S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability. Pharmaceut Res 1998; 15(9): 1332-1339.

FELGNER, P.L. et al. Nomenclature for Synthetic Gene Delivery Systems. Hum Gene Ther 1997: 511-512.

FRIEDMANN, T. A. New serious adverse event in a gene therapy study. Mol Ther 2007; 15(11): 1899-1900.

GANTA, S., DEVALAPALLY, H., SHAHIWALA A., AMIJI, M. A review of stimuli responsive nanocarriers for drug and gene delivery. J Control Rel 2008; 126: 187-204.

GEORGE, J. A. St. Gene therapy progress and prospects: adenoviral vectors. Gene Ther 2003; 10: 1135-1141.

GRIGSBY, C. L. & Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. J R Soc Interface 2009; 7: 67-82.

LI, S. & MA, ZHENG. Nonviral gene therapy. Curr Gene Ther, 2001; 1: 201-226.

LINDEN, R. Terapia gênica: o que é, o que não é e o que será, Estud. av. 2010; 24 (70).

LIU, W. G.; ZHANG, X.; SUN, S. J.; SUN, G. J. & YAO, K. D. N. Alkylated chitosan as a potential nonviral vector for gene transfection. Bioconjugate Chem 2003; 14: 782-789.

MACLAUGHLIN, F. C., et al. Chitosan and depolymerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery. J Control Release 1998; 56: 259-272.

MAO, H.; ROY, K.; TROUNG-LE, V. L.; JANES, K. A.; LIN, K. Y., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency. J Control Release 2001; 70: 399-421.

NIIDOME T. & HUANG L. Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors. Gene Ther 2002; 9: 1647-1652.

OBA, M.; VACHUTINSKY, Y.; MIYATA, K.; KANO, M. R.; IKEDA, S.; NISHIYAMA, N.; ITAKA, K.; MIYAZONO, K.; KOYAMA, H.; KATAOKA, K. Antiangiogenic gene therapy of solid tumor by systemic injection of polyplex micelles loading plasmid DNA encoding soluble Flt-1, Mol Pharm 2010; 7: 501-509.

OLIVEIRA, F.P.P.; PICOLA, I.P.D.; SHI, Q.; BARBOSA, H.F.; TIERA, V.A.O.; FERNANDES, J.C.; TIERA, M. J. Synthesis and evaluation of diethylethylamine-chitosan for gene delivery: composition effects on the in vitro transfection. Nano 2013, doi: 10.1088/0957-4484/24/5/055101.

OLIVEIRA, F.P.P.; PICOLA, I.P.D.; TIERA, V.A.O.; SHI, Q.; FERNANDES, J.C.; TIERA, M. J. Synthesis, Characterization and the Charge Density Effects of Amino Derivatives of Chitosan on the “in vitro” Transfection Efficiency.

PATIL, M. L.; ZHANG, M.; MINKO, T. Multifunctional triblock nanocarrier (PAMAM-PEG-PLL) for the efficient intracellular siRNA delivery and gene silencing. ACS Nano 2011; 5(3): 1877-1887.

PEPPAS, L. B. & BLANCHETT, J. O. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy. Adv Drug Deliver Rev, 2004; 56: 1649-1659.

PERALES, J. C.; GROSSMANN, G. A.; MOLAS, M.; LIU, G.; FERKOL, T.; HARPST, J., et al. Biochemical and functional characterization of DNA complexes capable of targeting genes to hepatocytes via the asialoglycoprotein receptor. J Biol Chem 1997; 272(11): 7398-7407.

PICOLA, I. P. D.; BUSSON, K. A. N.; CASÉ, A. H.; NASÁRIO, F. D.; TIERA, V. A. O.; TABOGA, S. R.; RUGGIERO, J. N.; TIERA, M. J. Effect of ionic strength solution on the stability of chitosan-DNA nanoparticles. J Exp Nanosci 2011; doi: 10.1080/17458080.2011.602120

ROY, K., et al. Oral gene delivery with chitosan–DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nat Med 1999; 5: 387-381.

SANTOS, J. E. D.; SOARES, J. D. P.; DOCKAL, E. R.; FILHO, S. P. C.; CAVALHEIRO, E.T. G. Caracterização de quitosanas comerciais de diferentes origens. Polímeros 2003; 13: 242-249.

SATO, T., ISHII, T. and OKAHATA, Y. In vitro gene delivery mediated by chitosan. Effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection effciency. Biomaterials 2001; 2075-2080.

SELLENET, P. H.; ALLISON, B.; APPLEGATE, B. M.; YOUNGBLOOD, J. P. Synergistic activity of hydrophilic modification in antibiotic polymers. Biomacromolecules 2007; 8: 19-23.

SOMIA, N.; VERMA, I. M. Gene therapy: trials and tribulations. Nat Rev Genet 2000; 1: 91-99.

TIERA, M. J.; QIU, X.; BECHAOUCH, S.; SHI, Q.; FERNANDES, J. C. & WINNIK, F. M. Synthesis and characterization of phosphorylcholine substituted chitosans soluble in physiological pH conditions. Biomacromolecules 2006; 7: 3151-3156.

TIERA, M. J.; SHI, Qin.; WINNIK, F.; FERNANDES, J. C. Polycation-based gene therapy: current knowledge and new perspectives. Curr Gene Ther 2011; 11(4): 288- 306.

TIERA, V. A. O.; WINNIK, F. M.; TIERA, M. J. Interaction of amphiphilic derivatives of chitosan with DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). J Therm Anal Calorim 2010; 100: 309-313.

TRUBETSKOY, V. S.; SLATTUM, P. M.; HAGSTROM, J. E.; WOLFF, J. A. & BUDKER, V. G. Quantitative assessment of DNA condensation. Anal Biochem 1999; 267: 309-313.

VORBURGER, S. A. & HUNT, K. K. Adenoviral Gene Therapy. The Oncologist 2002. doi: 10.1634/theoncologist.

WOLFERT, M. A. & SEYMOUR, L. W. Atomic force microscopic analysis of the influence of the molecular weight of poly(L)lysine on the size of polyelectrolyte complexes formed with DNA. Gene Ther 1996; 3: 269-273.