UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA
KANDIR GENÉSIO INNOCENTI DINHANE
EFEITOS DO CORTICOSTEROIDE INJETADO NO TENDÃO
CALCÂNEO DE COELHOS - ANÁLISE HISTOLÓGICA,
BIOMECÂNICA E DAS EXPRESSÕES DE METALOPROTEINASES
E INTERLEUCINAS.
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina, Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, para obtenção
do título de Mestre em Bases Gerais
da Cirurgia
Orientador : Prof. Dr. Winston Bonetti Yoshida
Coorientador : Prof. Dr. Alexandre Leme Godoy dos Santos
Botucatu
Kandir Genésio Innocenti Dinhane
EFEITOS DO CORTICOSTEROIDE INJETADO NO TENDÃO CALCÂNEO DE COELHOS - ANÁLISE HISTOLÓGICA, BIOMECÂNICA E DAS EXPRESSÕES DE METALOPROTEINASES E INTERLEUCINAS.
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina, Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, para obtenção
do título de Mestre em Bases Gerais
da Cirurgia
Orientador : Prof. Dr. Winston Bonetti Yoshida
Coorientador : Prof. Dr. Alexandre Leme Godoy dos Santos
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651
Dinhane, Kandir Genésio Innocenti.
Efeitos do corticosteroide injetado no tendão calcâneo de coelhos : análise histológica, biomecânica e das expressões de metaloproteinases e interleucinas / Kandir Genésio Innocenti Dinhane. - Botucatu, 2015
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de
Botucatu
Orientador: Winston Bonetti Yoshida
Coorientador: Alexandre Leme Godoy dos Santos Capes: 40000001
1. Corticosteroides. 2. Metaloproteinases. 3. Tendões. 4. Interleucinas. 5. Injeções.
Dedicatória
Ao Prof. Dr. Hamilton da Rosa Pereira, com gratidão por ter
me escolhido, entre outros, da sexta turma da FCMBB, no
direcionamento à melhor residência médica em Ortopedia e
Agradecimentos Especiais
À minha esposa,
Ema Amélia Dorico Dinhane
, extensivo a meus
pais Genésio Dinhane (in memoriam) e Rosa Apparecida Innocenti
Dinhane (in memoriam); à minha irmã Rosamara Innocenti Dinhane
Vicente; aos meus filhos Dra. Luciana Innocenti Dinhane e Dr.
Daniel Innocenti Dinhane; ao meu genro Dr. Silas Otero Reis Salum;
à minha nora Dra. Juliana Gonzalez Luvizutto Dinhane e aos meus
Agradecimentos Especiais
Ao Prof. Dr. Winston Bonetti Yoshida, Professor Titular da
Disciplina de Cirurgia Vascular do Departamento de Cirurgia e
Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP,
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Alexandre Leme Godoy dos Santos, Professor
do Departamento de Ortopedia da Faculdade de Medicina – USP,
coorientador;
A Profa. Adj. Regina Helena Garcia Martins, Coordenadora
do Programa de Pós-Graduação em Bases Gerais da Cirurgia da
Faculdade de Medicina de Botucatu –UNESP;
A Profa. Dra. Érika Veruska de Paiva Ortolan, Chefe do
Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de
Botucatu – UNESP;
Ao Prof. Dr. Trajano Sardenberg, Professor do
Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de
Botucatu -UNESP, pelo auxílio na elaboração da Dissertação;
Ao Prof. Dr. Paulo Roberto de Almeida Silvares,
representando professores e médicos do Departamento de Cirurgia e
Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP;
Ao Prof. Dr. Sérgio Swain Müller, Professor do
Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de
Botucatu -UNESP, pelo auxílio na elaboração da Dissertação;
Ao Prof. Dr. Alexandre Todorovic Fabro, Médico
Patologista e Diretor da Unidade de Pesquisa Experimental
Agradecimentos
A Profa. Dra. Adriana Lucia Mendes do Departamento de
Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu -UNESP, pelo
auxílio na elaboração da Dissertação;
A Profa. Dra. Beatriz Funayama Alvarenga Freire do
Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de
Botucatu -UNESP, pelo auxílio na elaboração da Dissertação;
À Márcia Fonseca Piagentini Cruz, representando os demais
funcionários da Secção Técnica de Pós Graduação da Faculdade de
Medicina de Botucatu- UNESP;
Ao Prof. Hélio Rubens de Carvalho Nunes, Estatístico do
Escritório de Apoio à Pesquisa –EAP;
À Diva Aparecida Luvizutto Gasperini Rodrigues e
Marlucci Betini, extensivo aos demais funcionários da Biblioteca do
Campus de Botucatu- UNESP;
Ao José Rafael Franco e ao Paulo Sérgio dos Santos
Teixeira, do Biotério Central do Campus da UNESP;
Ao Luis Carlos Edevalter Bardella, à Maria Cecília Salgado
Mercadante e ao Dr. Diego Generoso , do Laboratório de Técnica
Cirúrgica e Cirurgia Experimental “Prof. William Saad Hossne”, da
Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) da Faculdade de
Agradecimentos
Á Dra. Luciana Innocenti Dinhane, pelo auxílio na
elaboração da dissertação;
Ao Dr. Daniel Innocenti Dinhane, pelo auxílio na
elaboração da dissertação;
À Andressa Aparecida dos Santos e à Amanda Luisa dos
Santos, alunas do curso de aprimoramento de Fisioterapia;
À Ana Paula Dória, Márcia Tenório Del Neri, Renata
Campos Capela, Biólogas da Unidade de Pesquisa Experimental
(UNIPEX) da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP;
À Maria Regina Moretto, Bióloga da Unidade de Pesquisa
Experimental (UNIPEX) da Faculdade de Medicina de Botucatu –
UNESP;
Ao Igor Deprá, Biólogo da Unidade de Pesquisa
Experimental (UNIPEX) da Faculdade de Medicina de Botucatu –
UNESP;
À Marta Regina Russo Sarzi e ao Florian José Fontana, da
Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) da Faculdade de
Medicina de Botucatu – UNESP;
Ao Prof. Dr. Sérgio Luis Felisbino e ao Prof. Dr. Luis
Antônio Justulin Junior, Professores do Instituto de Biociências -
Agradecimentos
Ao Carlos Luís Miguel e ao Douglas de Jesus, Técnicos de
informática do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de
Medicina de Botucatu – UNESP;
Ao Marcos Eduardo Barreiros Aloise, Desenhista científico
do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina
de Botucatu – UNESP;
À Solange Aparecida de Albuquerque Clara e à Marinede
Ribeiro Jorge, Secretárias do Departamento e Cirurgia e Ortopedia da
Faculdade de Medicina DE Botucatu– UNESP;
Ao Alberto Santos Capelluppi, Secretário da Comissão de
Ética no Uso de Animais-CEUA;
À Profa. Heleina Torres, Professora de informática, do
Colégio Anglo de São Manuel;
À Profa. Cacilda Langoni Canneppele e à Prof. Maria
Epígrafe
Os tendões são estruturas surpreendentes!
Kandir Dinhane, 2015
Os tendões não gostam de inatividade e nem de mudanças bruscas.
Resumo
RESUMO
Introdução: A injeção de corticosteroide (CE) para tratamento de
tendinopatias é recurso terapêutico muito utilizado na prática ortopédica; contudo há controvérsias clínicas e experimentais a respeito dos benefícios e complicações desse procedimento. Objetivo: Avaliar os efeitos histológico, biomecânico, a expressão das metaloproteinases (MMP-1 e MMP-2) e das interleucinas (IL-1 e IL-6) nos tendões calcâneos de coelhos submetidos a injeção de CE. Métodos: Setenta e três coelhos New Zealand foram randomizados e divididos em dois Grupos: Grupo Teste composto por trinta e sete animais submetidos a injeção intratendinosa de CE (0,2 ml de solução com 1,4 mg de betametasona) no tendão calcâneo do membro pélvico direito, e Grupo Controle composto por trinta e seis animais, no qual o mesmo animal possibilitou dois espécimes de tendão calcâneo (direito e esquerdo); o tendão do membro pélvico direito foi submetido a injeção de soro fisiológico (0,2 ml de solução de cloreto de sódio a 0,9 %) e recebeu denominação de Controle Placebo (CP); o tendão calcâneo do membro pélvico esquerdo, sem nenhum procedimento, foi utilizado como Controle Normal (CN). Quarenta e oito horas após o procedimento foi realizada eutanásia e os tendões foram dissecados e retirados em uma extensão de quatro centímetros de suas inserções nos ossos calcâneos. As análises histológicas, de resistência mecânica e as expressões das metaloproteinases e interleucinas foram realizadas por avaliador sem conhecimento dos grupos. Resultados: O Grupo Teste apresentou menor expressão da MMP-2 em relação aos espécimes do Grupo Controle (p= 0,027). No grupo Controle, os espécimes de tendão calcâneo dos membros pélvicos direitos (CP) mostraram maior quantidade de fibras colágenas grossas em relação aos de tendão calcâneo dos membros pélvicos esquerdos (CN) (p= 0,041). Nas comparações entre os grupos nas demais variáveis não houve diferenças estatisticamente significantes.
Conclusões: Quarenta e oito horas após a injeção intratendinosa de 0,2
ml de solução com 1,4 mg de betametasona em tendões calcâneos normais de coelhos, ocorreu diminuição da expressão de metaloproteinase 2, sugerindo menor degradação do colágeno. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos nas alterações das características histológicas, biomecânicas, na expressão de metaloproteinase 1 e das interleucinas 1 e 6.
Palavras-chave: Tendão, Corticosteroide, Resistência, Metaloproteinases,
Abstract
ABSTRACT
Introduction: The injection of corticosteroids (CE) for the treatment of
tendinopathies is a therapeutic resource often used in orthopedic practice; however, there are clinical and experimental controversies regarding the benefits and complications of such practice. Objective: Is to evaluate the histological, biomechanical effects, and also the expression of metalloproteinases (MMP-1 and MMP-2) and interleukins (IL-1 and IL-6) on Achilles tendons of rabbits treated with CE injections. Methods: Seventy three New Zealand rabbits were randomly divided into two groups: The Test Group was comprised of thirty seven animals which underwent intratendineous injections of CE (0.2 ml of solution with 1.4 mg of betamethasone) in the Achilles tendon of the right pelvic limb, and the Control Group was comprised of thirty six animals, which provided two specimens of Achilles tendon (right and left); the Achilles tendon of the right pelvic limb underwent injections of saline solution (0.2 ml of 0.9% sodium chloride solution) and was called Placebo Control (CP); the Achilles tendon of the left pelvic limb received no medical procedure and was used as Normal Control (CN). Forty eight hours after the procedure, the animals were euthanized and the tendons were dissected and extracted at an extension of four centimeters (1.6 in) of its insertions in the calcaneus bones. The expressions of metalloproteinases and interleukins, mechanical resistance and histological analysis were all performed by an observer unaware of the groups Results: The Test Group has shown a smaller MMP-2 expression compared to those in Control Group (p= 0.027). In the Control Group, the Achilles tendon of the right pelvic limb (CP) has shown a greater amount of thick collagen fibers in comparison to those in left pelvic limb (CN) (p= 0.041). There were no other significant statistical difference between the groups when comparing other variables.
Conclusions: Forty eight hours after the intratendinous injection of 0.2 ml
of solution with 1.4 mg of betamethasone in the normal Aquilles Tendon of rabbits, there was a decrease of metalloproteinases 2 expression, suggesting a minor collagen degradation. Statistical differences in the change of histological characteristics, biomechanics, and in the expression of metalloproteinases 1 and in interleukins 1 and 6 were not observed between the groups.
Keywords: Tendons, Corticosteroids, Resistance, Metalloproteinases,
Lista de Ilustrações
Lista de Ilustrações
Figura 1 - Fluxograma dos procedimentos ... 39 Figura 2 - Medida padronizada com paquímetro do ponto onde foram
feitas as injeções, a 2 cm da inserção do tendão calcâneo do
coelho, mantendo o tornozelo em flexão dorsal ... 42
Figura 3 - Agulha com a ponta semidobrada ... 42 Figura 4 - Injeção no tendão calcâneo do coelho, em local previamente
marcado ... 42
Figura 5 - Tendão calcâneo de coelho dissecado (seta branca) e que foi
retirado íntegro, desde a junção miotendínea (seta escura
grande) até a inserção no osso calcâneo (seta escura
pequena) ... 44
Figura 6 - Máquina de ensaio biomecânico, EMIC ... 45 Figura 7 - Tendão roto após teste ... 45 Figura 8 - Exemplo do gráfico Força x Deformação com resultados de
um dos espécimes (A105) submetido ao ensaio de tração, que
mostra valores das variáveis de resistência mecânica ... 46
Figura 9 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho sem ruptura
do colágeno (HE; 400xx) ... 47
Figura 10 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com ruptura
do colágeno (seta escura) (HE; 400xx). ... 47
Figura 11 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com
celularidade aumentada (HE; 400xx) ... 47
Figura 12 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com
celularidade habitual (HE; 400xx) ... 47
Figura 13 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com
presença de células inflamatórias: macrófagos (setas escuras)
(HE; 400xx) ... 48
Figura 14 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com
presença de células inflamatórias: Linfócitos (seta vermelha e
Lista de Ilustrações
Figura15 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho mostrando
fibras colágenas finas (verdes) (Picrosirius red; 400 xx) ... 48
Figura16 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com Fibras
colágenas espessas (vermelhas) (Picrosirius red; 400xx) .... 48
Figura 17 - Imagem do retículo de Weibel extraído do monitor do
computador: setas brancas indicando células que cruzaram
traços do retículo (400xx) ... 49
Figura 18 - Equipamento Bio Rad para leitura colorimétrica usado no
estudo das MMPs ... 51
Figura 19 - Equipamento de eletroforese usado nos estudos das MMPs
... 51
Figura 20 - Bandas de degradação em gel cromassie blue eletroforese de
MMP, forma ativa (seta amarela) e forma inativa, (seta
vermelha) ... 51
Figura 21 - Montagem da placa do teste ELISA com as amostras. Uma
amostra por alvéolo ... 53
Figura 22 - Lavadora de placas do teste ELISA ... 53 Figura 23 - Placa do teste ELISA pronta para ser lida ... 53 Figura 24 - Equipamento e monitor para leitura de placas de teste ELISA
... 53
Figura 25 - Os gráficos A, B, C, D, E, F mostram as médias e os desvios
padrões dos valores das variáveis de resistência mecânica . 57
Figura 26 - Mostra os gráficos A, B, C, D, E, F, G, H, e I, referentes às
medianas dos valores das variáveis histológicas, comparadas
entre os grupos Teste e Controle ... 59
Figura 27 - Gráfico mostra mediana dos valores das formas ativas das
MMP2s do grupo Teste em relação a mediana dos valores das
formas ativas das MMP2s do grupo controle ... 60
Figura 28 - Os gráficos A e B mostram medianas dos grupos Teste e
Controle; não houve alteração da expressão de IL1 e IL6 na
Lista de Tabelas
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Diferenças mínimas detectáveis com o tamanho amostral
determinado ... 41
Tabela 2 - Comparação entre grupos em relação às variáveis de
resistência mecânica ... 56
Tabela 3 - Comparação entre os grupos em relação a variáveis
histológicas... 58
Tabela 4 - Comparação entre os grupos em relação às MMPs ... 60
Tabela 5 - Comparação entre os grupos em relação a ILs ... 61
Tabela 6 - Comparação dos resultados sobre resistência mecânica de
diversos autores ao longo do tempo, após injeções
intratendinosas de CE ... 65
Tabela 7 - Comparação dos resultados das variáveis histológicas de
diversos autores ao longo do tempo, após injeção
intratendinosa de CE ... 68
Tabela 8 - Comparação dos resultados das variáveis histológicas de
diversos autores ao longo do tempo, após injeção
peritendinosa de CE ... 71
Tabela 9 - Resultados comparativos de estudos envolvendo avaliação da
expressão de MMPs após uso de CE em tendões ... 72
Tabela 10 - Demonstrativo de estudos com Interleucinas ... 74
Tabela 11 - Demostrativo de estudos in vitro sobre efeitos de CE,
adicionados a placas de cultura em relação a alterações
celulares (proliferação, diferenciação, migração e apoptose) e
de expressão do colágeno e proteoglicanas ... 77
Tabela A - Tabela Piloto dos Procedimentos ... 90
Tabela B - Dados Brutos das Variáveis de Resistência mecânica ... 92
Tabela C - Dados Brutos das Variáveis Histológicas do Tendão ... 93
Tabela D - Dados Brutos das Variáveis Histológicas do Paratendão ... 94
Tabela E - Dados Brutos das Variáveis de Expressão das MMPs ... 95
Tabela F - Dados Brutos das Variáveis de Expressão das Interleucinas
Lista de Abreviaturas e Siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Beta: Betametasona
CE: Corticosteroide
Cm: centímetro
CEUA: Comitê de ética no uso de animais
CP: Controle Placebo
CN: Controle Normal
ºC: Grau Celsius
ELISA Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay
EV: Endovenoso
G: Gauge: Unidade de medida de diâmetro
HE: Tipo de coloração histológica: Hematoxilina-Eosina
HISTO: Histologia
IL: Interleucina
ILs: Interleucinas
Intra: Intratendinosa
Kg: Quilograma
kDa: KiloDaltons (unidade de massa atômica )
Peri: Peritendinosa
mg: Miligrama
ml: Mililitros
mm: Milímetros
MPa: MegaPascal
MPD: Membro pélvico direito
MPE: Membro pélvico esquerdo
MMP: Metaloproteinase da matriz
MMPs: Metaloproteinases da matriz μg: Micrograma
N: Newton
Lista de Abreviaturas e Siglas
nM: Nanomoles
ng: Nanograma
pg: Picograma
picro: Tipo de coloração histológica- picrosirius red
RES: Resistência mecânica
TIMPs: Inibidores Teciduais de Metaloproteinases
TNF: Fator de necrose tumoral
UNESP: Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
UNIPEX: Unidade de pesquisa experimental da Faculdade de Medicina
Sumário
SUMÁRIO
RESUMO ABSTRACT
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
1. INTRODUÇÃO ... 30
2. OBJETIVO... 36
3. MÉTODOS... 38
3.1 - Aspectos éticos ... 38
3.2 - Locais de realização do estudo ... 38
3.3 - Desenho do estudo ... 38
3.4 - Critérios de inclusão e não inclusão ... 40
3.5 - Randomização ... 40
3.6 - Cálculo do tamanho da amostra ... 40
3.7 - Procedimento anestésico e método de injeção do medicamento e
soro ... 41
3.8 - Manutenção ... 43
3.9 - Eutanásia e coleta dos espécimes ... 43
3.10 - Cegagem ... 44
3.11 - Estudo da resistência mecânica ... 44
3.12 - Estudo das variáveis histológicas ... 46
3.13 - Estudo das Metaloproteinases e Interleucinas ... 50
3.13.1 Metaloproteinases 1 e 2 ... 50
3.13.2 Interleucinas 1 e 6 ... 52
3.14 - Análise estatística dos resultados ... 54
4. RESULTADOS ... 56
4.1 - Resistência Mecânica ... 56 4.2 - Variáveis Histológicas ... 58
Sumário
4.4 - Expressões de interleucinas ... 61
5. DISCUSSÃO ... 63
5.1 - Metodologia ... 63
5.2 - Resistência Mecânica ... 65
5.2.1 Injeções intratendinosas ... 65
5.2.2 Injeções peritendinosas ... 67
5.2.3 Comentários ... 67
5.3 - Variáveis Histológicas ... 68
5.3.1 Injeções intratendinosas ... 68
5.3.2 Comentários ... 70
5.3.3 Injeções peritendinosas ... 70
5.3.4 Comentários ... 72
5.4 - Expressões de MMPs ... 72
5.5 - Interleucinas ... 74
5.6 - Estudos in vitro ... 76
5.7 - Revisões Sistemáticas ... 78
5.8 - Considerações Finais ... 79
Introdução
1. INTRODUÇÃO
Tendões são definidos como estruturas que conectam um
músculo ou grupamento muscular ao osso. Originam-se no ventre
muscular, mais precisamente na junção musculotendínea e se inserem no
osso formando a êntese ou junção osteotendínea.
A arquitetura do tendão é composta hierarquicamente por
moléculas de colágenos, que se unem em fibrilas, que formam as fibras,
que se reúnem e formam os feixes ou fascículos primários e secundários,
envoltos por tecido conjuntivo frouxo contendo células, vasos sanguíneos
e nervos. Todo esse conjunto é envolvido externamente por uma bainha
de tecido conjuntivo denso, dividida em duas camadas: uma presa ao
tendão e outra ligada às estruturas adjacentes; entre essas duas
camadas, forma-se uma cavidade revestida por células mesenquimais
banhadas por líquido viscoso semelhante ao líquido sinovial, com água,
proteínas, glicosaminoglicanas, glicoproteínas e íons1.
Os tendões têm a função de transmitir as forças geradas pelas
contrações musculares, produzir o movimento e auxiliar a estabilização
articular. Apresentam a capacidade de adaptar sua composição e
estrutura em resposta aos diversos estímulos mecânicos e bioquímicos.
As lesões dos tendões são uma parte significante das doenças do
aparelho locomotor. Alguns tendões são particularmente vulneráveis e
mostram alterações degenerativas primárias, como o manguito rotador,
patelar, calcâneo e o tendão tibial posterior.
Tendinopatia é um termo amplo usado para um grupo de
afecções, de etiologia multifatorial, que acometem essas estruturas e que
resultam em dor e vários graus de perda funcional. São fatores etiológicos
extrínsecos: carga, anatomia local, postura, atividades ocupacionais e
esportivas; sendo os intrínsecos: alterações metabólicas, autoimunes e
fatores genéticos, como associação com genes do sistema ABO, e
Introdução
polimorfismos que afetam expressões de componentes da matriz,
destacando-se dentre elas as metaloproteinases2-5.
O tecido tendíneo é composto por uma pequena quantidade de
células embebidas por uma matriz extracelular (MEC) abundante. O
principal componente celular é o tenoblasto, em associação a outros tipos
celulares, como os condrócitos, células sinoviais e epiteliais6.
Os tenoblastos representam linhagem celular imatura, de
morfologia celular mais arredondada, citoplasma rico em organelas e alta
atividade metabólica. Alinham-se em colunas ao longo do eixo longitudinal
do tendão e de suas fibras colágenas. Os tenócitos, a forma amadurecida
dos tenoblastos, possuem morfologia mais alongada. Esses dois tipos
celulares representam 90-95% dos elementos celulares tendíneos,
produzem colágeno, equilibram a composição da matriz extracelular, e
assim, preservam a integridade do tendão. Devido à baixa celularidade e
reduzida atividade mitótica destas células, a capacidade cicatricial do
tendão é limitada6.
A matriz extracelular é dividida em dois componentes principais,
denominados fibrilar e fundamental. O primeiro é composto principalmente
pelas fibras de colágeno e elastina. Já o fundamental, pelas
proteoglicanas e glicosaminoglicanas, água de solvatação, minerais, além
de proteínas especializadas, tais como as glicoproteínas adesivas
fibronectina e a tenascina-C, ácido hialurônico, metaloproteinases da
matriz (MMPs) e seus inibidores (TIMPs)7. Estas moléculas interagem entre si e com as células tendíneas, de maneira bidirecional. Portanto,
alterações celulares podem levar a consequências estruturais na MEC,
bem como modificações na última podem desencadear o recrutamento,
proliferação, apoptose e diferenciação celular8.
Até a década de 1990, as alterações dos tendões eram
referidas como “Tendinites”, nas quais o componente inflamatório seria o
principal responsável por essas afecções. Esse ponto de vista era
Introdução
amplamente aceito nas estratégias de tratamento, acarretando
terapêuticas baseadas em anti-inflamatórios esteroides e não esteroides.
Nas décadas de 1990 a 2000, houve uma série de mudanças
na conceituação dessas alterações, direcionadas para alterações não
inflamatórias e degenerativas, referidas como “Tendinopatias”, sendo o
tratamento direcionado para as áreas de fisioterapia, terapia por ondas de
choque, e para outros tipos de medicamentos como agentes
esclerosantes, dextrose, toxina botulínica, como também injeções locais
com células tronco, plasma rico em plaquetas.
Nos últimos anos, as considerações sobre tendinopatia como
totalmente não inflamatória parece ser uma simplificação, e não é
totalmente aceita por todos especialistas, surgindo assim estudos que
buscam mostrar componentes do processo inflamatório presentes nas
alterações dos tendões9.
Na fisiopatogenia, em estágio precoce, como resposta à
compressão e ou sobrecarga, ocorre aumento do volume do tendão, por
aumento das proteoglicanas e de suas ligações com água; no estágio
seguinte, predomina degradação da matriz tecidual, separação do
colágeno, proliferação de tenócitos anormais, e alguma neovascularização
no tendão. Nestes dois estágios, pode haver certo grau de reversibilidade,
mas no estágio avançado ocorre principalmente rompimento do colágeno,
morte celular generalizada e ingresso mais intenso de neovascularização
e inervação dentro da substância do tendão10. A dor na tendinopatia, tem várias explicações, sendo uma delas esse ingresso tanto de neo vasos
quanto da inervação na substância do tendão, visto que, na arquitetura
normal dos tendões, os vasos e nervos encontram-se entre os fascículos
de colágenos e não na substância do tendão24.
As tendinopatias são doenças comuns, que afetam
indistintamente tanto atletas quanto a população em geral. A prevalência,
de transtornos dos tecidos moles (maioria em tendões), no Reino Unido, é
Introdução
de 18 casos por 1000 pessoas11. Nos EUA, ocorrem, anualmente, 16,4 milhões de lesões em tendões e ligamentos, dos quais pelo menos
100.000 envolvem o tendão calcâneo12. A prevalência é maior em jovens entre 20 e 30 anos, e em pessoas de meia idade dos 40 aos 60 anos13.
Nas lesões do manguito rotador do ombro, a prevalência aumenta com a
idade, ultrapassando 50% aos 60 anos14. Outra alteração denominada de dedo em gatilho tem prevalência de 2 % na população geral, e de 20 %
em pacientes com diabetes15.
Não existe uma diretriz única para o tratamento das
tendinopatias. Embora sem evidências protocoladas, várias modalidades
de tratamento são recomendadas: repouso, fisioterapia e medicamentos
anti-inflamatórios não esteróides ou CE (via sistêmica, ou injeção local).
Associadamente, terapêuticas específicas para fatores predisponentes e
cirurgias, podem estar indicadas dependendo da região anatômica
acometida e da gravidade da lesão.
Embora as alterações inflamatórias histológicas nas
tendinopatias sejam discretas, o uso de injeções locais de CE persiste
como prática entre ortopedistas, principalmente nos membros superiores9. Na verdade, os CE, além das conhecidas ações anti-inflamatórias,
possuem outras atividades importantes que ampliam suas indicações.
Uma destas atividades, com ação genômica, envolve a ativação de
receptores citoplasmáticos, os quais migram para o núcleo das células,
que atuam na transcrição e codificação de vários genes, entre outros, os
que codificam as ILs. Outra propriedade reside no mecanismo de ação
(tipo proteína-proteína) sem interação com o DNA, que leva à transcrição
de vários genes codificantes de ILs, ciclooxigenases e colagenases16. Existe outra atividade, chamada ação não genômica, de ação muito
rápida, com mecanismos não totalmente esclarecidos, na qual os CE são
utilizados em atendimentos de emergências clínicas17.
Os CE, para uso em injeções locais são formulados em
Introdução
soluções com sais que formam ésteres solúveis de liberação rápida
(fosfatos mono e dissódico, succinatos, e outros) ou ésteres menos
solúveis de liberação lenta (acetato, diproprionato, entre outros)18
O desenho de estudos sobre efeitos dos CE em tendões não
são simples de se desenharem, pois dependem de muitas variáveis. O
tipo de droga, dose, local e modo de administração devem ser
considerados19. Estas e outras dificuldades metodológicas explicam as poucas evidências observadas na literatura a respeito dos benefícios ou
efeitos deletérios dos CE no tratamento das tendinopatias20. Estudos clínicos que avaliaram injeções de CE em tendões, em grande parte, eram
relatos de casos ou amostras reduzidas de pacientes, especialmente em
tendões calcâneos e patelares nos quais os resultados eram, em geral,
contraditórios e controversos20,21.
Entretanto, estudos recentes confirmaram a presença de
células inflamatórias22, como também que as sobrecargas mecânicas podem causar respostas inflamatórias23. Tais fatos estimularam pesquisas sobre a expressão das ILs no início da cicatrização dos tendões9. Há limitação de conhecimentos a respeito da participação das ILs e de outros
mediadores inflamatórios no reparo de tendões24, 25.
Há carência de estudos experimentais sobre os efeitos de
injeção intratendinosa de CE que possibilite a correlação, em um mesmo
momento experimental, de aspectos morfológicos, biomecânicos de
resistência, envolvimento de mediadores inflamatórios (ILs) e da
expressão das MMPs.
A hipótese do presente estudo foi que, no tempo de observação
de quarenta e oito horas após as injeções de CE em tendões normais de
coelhos não ocorram alterações na resistência mecânica, histologia e nas
expressões de metaloproteinases e interleucinas.
Objetivo
2. OBJETIVO
Comparar os desfechos histológicos, de resistência mecânica,
a expressão das metaloproteinases (MMP-1 e MMP-2) e das interleucinas
(IL-1 e IL-6) nos tendões calcâneos normais de coelhos 48 horas após
terem sido submetidos à injeção de corticosteroide, soro ou nenhum
procedimento.
Métodos
3. MÉTODOS
3.1 - Aspectos éticos
O protocolo experimental deste estudo (Certificado CEUA,
número 1047-2013) foi conduzido em conformidade com os princípios
éticos na experimentação animal, aprovado pelo Comitê de Ética no Uso
de Animais da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP.
3.2 - Locais de realização do estudo
O estudo foi realizado no Laboratório de Ensino, Pesquisa e
Cirurgia Experimental “Prof. William Saad Hossne” e nos laboratórios de
Ensaios Biomecânicos localizados na Unidade de Pesquisa Experimental
(UNIPEX) da Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP).
3.3 - Desenho do Estudo
Ensaio experimental randomizado controlado com avaliador
sem conhecimento dos grupos.
Foram selecionados setenta e três coelhos da raça New
Zealand clinicamente saudáveis examinados por Médico Veterinário da
UNIPEX, fornecidos pelo Biotério Central da UNESP - Campus de
Botucatu.
Os animais foram randomizados, submetidos ao fluxograma
ilustrado (Figura 1) e divididos por aleatorização em dois grupos:
Grupo Teste: trinta e sete coelhos da raça New Zealand foram
submetidos a injeção intratendinosa no tendão calcâneo do membro
pélvico direito de CE: 0,2 ml da suspensão de dipropionato de
betametasona e fosfato dissódico de betametasona (Diprospan®,
Mantecorp – Hipermarcarcas S.A.). O volume da suspensão de 0,2 ml,
Métodos
com 1,4 mg de Betametasona, para efeito anti-inflamatório, foi calculado
de acordo com valores e equivalências recomendados para coelhos, em
livro texto de Medicina Veterinária26.
Grupo Controle: trinta e seis coelhos da raça New Zealand, no qual o
mesmo animal permitiu dois espécimes: um do tendão calcâneo direito e
outro do tendão calcâneo esquerdo. O tendão calcâneo do membro
pélvico direito foi submetido a injeção intratendinosa de 0,2 ml de solução
de Cloreto de Sódio a 0.9% (Farmace®, Farmace Indústria Químico
Farmacêutica Cearense Ltda) e foi denominado de Controle Placebo; o
tendão calcâneo do membro pélvico esquerdo, sem nenhum
procedimento, foi utilizado como Controle Normal.
n, número de animais ; CP, Controle Placebo; CN, Controle Normal
HISTO, Histologia; RES, Resistência Mecânica; MMPs, Metaloproteinases; ILs, Interleucinas
Figura 01 – Fluxograma dos procedimentos n=73 Randomização Grupo (n=37) Teste Grupo (n=36) Controle Membro Pélvico
Direito Membro Pélvico Direito Controle Placebo (CP)
Controle Normal (CN) Membro Pélvico Esquerdo
n=12 n=12 n=12 n=12 n=12 n=12 n=12 n=12 n=12
HISTO RES MMPs ILs HISTO RES MMPs ILs HISTO RES MMPs ILs
Métodos
3.4 - Critérios de Inclusão e não Inclusão
Inclusão
Coelhos machos
Peso corporal entre dois e três quilogramas
Com membros pélvicos normais.
Não inclusão
Qualquer tipo de alteração no exame clínico, verificado pelo
médico veterinário da Unipex
3.5 - Randomização
A sequência aleatória foi gerada pela função “runif”, do software
R v 2.11.0. Essa função permitiu gerar uma sequência de “0” (zeros) e “1”
(uns), ambos equiprováveis. O código “0” representou o Grupo Controle e
o código “1” representou o Grupo Teste. O modo de chegada dos coelhos
definiu como a sequência aleatória gerada foi aplicada. Com todos os
coelhos disponíveis, eles foram enumerados de um a setenta e três.
Assim, o coelho número um representou a posição número um da
sequência aleatória, o coelho número dois representou a posição número
dois da sequência e assim por diante também definindo os códigos. Como
os coelhos chegaram sequencialmente, então a ordem de chegada foi
igual a posição na sequência aleatória. Ou seja, o primeiro coelho
disponível foi para o grupo Controle ou para o grupo Teste dependendo
do código associado à primeira posição da sequência aleatória e assim
por diante (Tabela A – Apêndice).
3.6 - Cálculo do tamanho da amostra
Para se determinar o tamanho dos grupos a serem estudados,
a fim de se obter poder estatístico de 80 %, com nível de significância de
Métodos
0,05 e supondo amostragem aleatória simples com distribuição normal
dos desfechos, elaborou-se uma tabela (Tabela 1), que permite detectar
diferenças mínimas iguais às apresentadas na tabela. O número das
amostras para o Grupo Teste foi de trinta e sete animais e para o Grupo
Controle, de trinte e seis animais.
Tabela 1 – Diferenças mínimas detectáveis com o tamanho amostral
determinado
Desfechos
Histologia TEN_TD RUP_TD C_INF_TD FG_TD FF_TD TEM_PD C_INF_PD FG_PD FF_PD
DMS 1.1 0.06 0.05 12 10 0.08 3 14 7
Interleucinas IL6 IL1
DMS 60 290
Metaloproteinase MMP2_INAT MMP2_AT MMP1_INAT MMP1_AT
DMS 0.3 1.5 0.3 0.4
Resistência DEFMAX FCMAX EFMAX EAFMAX TFMAX MODEL
DMS 2300 120 400 3200 14 60
TEN_TD, Tenócitos HE Tendão; RUP_TD, Ruptura do colágeno HE Tendão; C. INF_TD, Células Inflamatórias HE Tendão; FG_TD, Fibras grossas picro Tendão; FF_TD, Fibras finas picro tendão; TEN_PD, Tenócitos HE Peritendão; C_INF_PD, Células Inflamatórias HE Peritendão; FG_PD, Fibras grossas peritendão; FF_PD, Fibras finas peritendão; DEFMAX, Deformação máxima, FCMAX, Força ou carga máxima; EFMAX
DMS= Diferença mínima detectável
3.7 - Procedimento anestésico e método de injeção do medicamento e soro
Todos os coelhos foram submetidos a anestesia geral EV com
50 mg/kg de cloridrato de quetamina e 1 mg/kg de cloridrato de xilazina,
seguido de tricotomia e antissepsia. A injeção dos medicamentos foi feita
sempre a dois cm (medida com paquímetro) proximais da inserção do
tendão calcâneo, sem incisão cirúrgica (Figura 2) com volume de 0,2 ml,
por meio de punção com agulha BD-(Becton Dickinson Ind. Cirug. Ltda-
Curitiba-PR) de 0,45x 13mm (26 G x 1/2"), com a ponta da agulha semi
dobrada (Figura 3 e 4) e seringa de 1 ml, BD-Becton Dickinson Indústria
Cirúrgica. Ltda- Curitiba-PR.
Métodos
Figura 2 - Medida padronizada com paquímetro do ponto onde foram feitas as injeções, a 2 cm da inserção do tendão calcâneo do coelho, mantendo o tornozelo em flexão dorsal.
Figura 3 - Agulha com a ponta semidobrada.
Figura 4 - Injeção no tendão calcâneo do coelho, em local previamente marcado, com aplicação feita com a seringa na horizontal e não na perpendicular ao tendão.
Métodos
3.8 Manutenção
Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura,
iluminação e ventilação adequadas, em jaulas individuais e foram
alimentados com ração e água potável.
3.9. Eutanásia e coleta dos espécimes
Quarenta e oito horas após o procedimento, foi realizada
eutanásia com dose letal de anestésico. O tendão foi dissecado, exposto
e retirado integralmente a quatro cm proximais de sua inserção no osso
calcâneo (Figura 5). Os espécimes foram identificados em recipientes com
letras e números sem citação a quais grupos pertenciam e seguiram para
conservação conforme o tipo de exame:
Os trinta e sete espécimes dos testes de resistência mecânica
foram congelados em freezer a -20º C.
Os trinta e seis espécimes dos exames histológicos foram
conservados em formalina neutra a 10% antes do processamento.
Para a realização dos exames das MMPs e ILs, os trinta e seis
espécimes foram divididos em duas partes iguais, resultando em setenta e
dois espécimes: metade para MMPs e metade para ILs. Os setenta e dois
espécimes foram congelados imediatamente em nitrogênio líquido e
depois conservados em Freezer a -80ºC. O total de espécimes obtidos foi
de cento e quarenta e quatro. Por problemas técnicos nos equipamentos
de conservação, desprezamos nove espécimes, e portanto os estudos
foram realizados em cento e trinta e cinco espécimes.
Métodos
Figura 5 - Tendão calcâneo de coelho dissecado (seta branca) a ser retirado íntegro, desde a junção miotendínea (seta escura grande) até a inserção no osso calcâneo (seta escura pequena).
3.10. Cegagem
Os avaliadores de todos os desfechos, não tinham
conhecimento sobre qual grupo os espécimes pertenciam. Ao final das
avaliações, os dados foram organizados em planilhas Excel e
encaminhados para análise estatística (Tabelas B a F - Apêndice).
3.11 - Estudo da Resistência mecânica
Os espécimes foram submetidos a ensaio biomecânico de
tração.
No momento do ensaio, todos os espécimes foram
descongelados à temperatura ambiente e presos pelas extremidades em
presilhas especiais para tendões. Foi determinada a área de secção do
tendão a partir da medida da circunferência e pela aplicação das fórmulas R=C/2π, e A=π.R², na qual R, era o raio, C, a circunferência, e A, área de secção. Em seguida, as presilhas com o tendão fixado, foram montadas
axialmente em máquina universal de ensaio mecânico (EMIC–DL®10.000 Equipamentos e Sistemas de Ensaio Ltda, Curitiba), (Figura 6 e 7), com
Métodos
célula de carga de 1000 N e velocidade de aplicação de 30 mm/min. O
valor da área de secção foi incorporado ao software M-teste que forneceu
os gráficos força x deformação (Figura 8) e valores das seguintes
variáveis das propriedades mecânicas: Força Máxima (força em N=
Newtons, suportada até a ruptura); Deformação (alongamento, em
milímetros); Energia na Força Máxima (N.mm); Energia por área na Força
máxima (N.mm/mm²); Tensão na Força Máxima (MPa); Módulo de
Elasticidade (MPa)27-29.
Figura 6 - Máquina de ensaio biomecânico, EMIC.
Figura 7 - Tendão roto após teste.
Métodos
Figura 8 - Exemplo do gráfico Força x Deformação com resultados de um dos espécimes (A105) submetido ao ensaio de tração, que mostra valores das variáveis de resistência mecânica.
3.12 - Estudo das Variáveis Histológicas
Após fixação, o tecido foi incluído em blocos de parafina,
obtendo-se, a seguir, cortes coronais de quatro micras para análise
histológica. As lâminas foram coradas com solução Hematoxilina - Eosina
(HE) e Picrosirius red (Picro). Através de Histomorfometria foram obtidas
as seguintes variáveis: do tendão-tenócitos (celularidade habitual ou
aumentada), ruptura do colágeno, presença de células inflamatórias
(macrófagos, linfócitos) fibras grossas (colágeno I) e fibras finas (colágeno
III); e do peritendão- tenócitos (celularidade normal ou habitual), presença
de células inflamatórias (macrófagos, linfócitos), fibras grossas (colágeno
I) e Fibras finas (colágeno III).
Métodos
O método utilizado foi o histomorfométrico.
O sistema de imagens foi composto por uma Câmera Leica
(DFC 295), conectada a um microscópio Leica (DM 4000 B LED, USA). As
imagens foram transmitidas a um monitor (Analisador Leica DM 4000) e
carregadas em um computador (Pentium 1330 MHz, Intel, Santa Clara,
CA, USA). O software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville,
MD, USA) foi usado para identificar e quantificar as variáveis (Figuras 9 a
16).
Figura 9 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho sem ruptura do colágeno ( HE; 400xx).
Figura 10 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com ruptura do colágeno (seta escura) (HE; 400xx).
Figura 11 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com celularidade aumentada (HE; 400xx).
Figura 12 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com celularidade habitual (HE; 400xx).
Métodos
Cada lâmina corada, tanto com Hematoxilina Eosina quanto
com Picrosirius red, geraram vinte fotografias, sendo dez do tendão e dez
do peritendão.
As lâminas coradas com Picrosirius red foram usadas para
avaliar e quantificar as fibras grossas e as fibras finas no tendão e
peritendão. Por meio do Image pro plus, a fração de área das fibras
colágenas foi medida pela área delimitada pelas fibras dos tendões e
peritendões observadas em campos com grande aumento (400xx). O Figura13 - Imagem histológica do tendão
calcâneo do coelho com presença de células inflamatórias: macrófagos (setas escuras) (HE; 400xx).
Figura 14 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com presença de células inflamatórias: Linfócitos (seta vermelha e tracejado) (HE; 400 xx).
Figura15 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho mostrando fibras colágenas finas (verdes) (Picrosirius red; 400 xx).
Figura16 - Imagem histológica do tendão calcâneo do coelho com Fibras colágenas espessas (vermelhas) (Picrosirius red; 400xx).
Métodos
limiar para colágeno espesso (amarelo e vermelho) e fino (verde) foi
estabelecido em todas as lâminas histológicas coradas pelo aumento do
contraste e alteração da cor dos colágenos em questão, tornando-os
facilmente identificáveis. A fração de área do colágeno foi expressa pela
taxa da área de colágeno medido dividido pela área total do campo
histológico. Essa medida, expressa em porcentagem, foi realizada em dez
campos histológicos, selecionados randomicamente conforme
aleatorização de todos os campos. O resultado final foi expresso como
média dos campos quantificados.
As lâminas coradas com Hematoxilina e Eosina foram usadas
para quantificar ruptura do colágeno, presença de células inflamatórias e
celularidade (quantificação de tenócitos), usando 10 campos de grande
aumento, selecionados randomicamente, pelo método estereológico de
point-counting. O método utilizado de morfometria pelo retículo de Weibel
(Figura 17) foi por meio de um sistema de cinquenta traços em área
conhecida (62,500 mm2 em 400x), na qual cada célula, ou imagem de
ruptura do colágeno ao cruzarem traços do retículo eram contados; sendo
que esse número de células ou rupturas contados, foi dividido por
cinquenta (número total de traços) fornecendo resultados
quantitativos30,31.
Figura 17 - Imagem do retículo de Weibel extraído do monitor do computador: setas brancas indicando células que cruzaram traços do retículo (400xx).
Métodos
3.13 - Estudo das Metaloproteinases e Interleucinas
Os espécimes inteiros foram cortados ao meio
transversalmente a dois cm proximais da extremidade de inserção, sendo
uma metade para análises de expressão MMPs e outra metade para
estudos da expressão das ILs. Os estudos foram direcionados para
exames das formas ativas e inativas das MMPs 1 e 2, e das ILs 1 e 6.
3.13.1 Metaloproteinases 1 e 2
O método utilizado foi o da Zimografia.
As metades dos espécimes foram trituradas em
homogeneizador ultra-turrax (IKA), com tampão de extração (Tris-HCl
50mM, NaCl 0,2M, CaCl2 10mM, Triton X-100 2,5%, inibidores de
protease 1%). Após duas horas a 4oC, foram centrifugadas a 4000 Rpm, por vinte minutos, para eliminar resíduos sólidos. A quantificação da
concentração proteica nas amostras foi feita pelo ensaio de Bradford, por
leitura colorimétrica, usando o reagente Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad)
(Figura 18) e a albumina sérica bovina como padrão. Foram feitas
alíquotas das amostras com concentrações iguais para aplicação no gel
de eletroforese. Os géis de poliacrilamida foram preparados com 1 mg/mL
de gelatina, para detecção de gelatinases, e aproximadamente 0,5 mg/mL
de colágeno bovino tipo I (código: C9791, Sigma), para detecção de
colagenases. As amostras foram aplicadas em gel com tampão de
amostra (Tris-HCl 62,5mM, glicerol 30%, azul de bromofenol 1:1000 m/v),
na proporção 2:1, sendo 35µg para detecção de gelatinases e 20µg para
colagenases. Após a corrida de eletroforese (Figura 19) para separação
por peso molecular, os géis foram lavados em Triton X-100 para retirada
do decil sulfato de sódio e em Tris-HCl 50 mM, pH 8,4, para retirar o Triton
X-100 e assim possibilitar a verificação da atividade enzimática; após o
que, foram incubados por dezesseis horas em solução de incubação
Métodos
HCl 50mM, pH 8,4, CaCl2 50µM). As bandas de degradação (Figura 20)
foram observadas por marcação em Cromassie Blue e os géis foram
fotografados usando o sistema Image Quant LAS 4000.
Figura 18 - Equipamento Bio Rad para leitura colorimétrica usado no estudo das MMPs.
Figura 19 - Equipamento de eletroforese usado nos estudos das MMPs.
Figura 20 - Bandas de degradação em gel cromassie blue eletroforese de MMP, forma ativa (seta amarela) e forma inativa (seta vermelha).
Métodos
A quantificação da degradação foi feita por densitometria em
analisador de imagens White Darkhon, Software Image Quant TL,
normalizando os volumes das bandas com parâmetros de uma amostra
que foi incluída em todos os géis. As colagenases ou gelatinases foram
analisadas pelas bandas claras. A MMP-2 foi observada como duas
bandas com tamanhos de 72 e 62 kDa (formas inativa e ativa)32. A MMP-1 foi identificada nos géis com colágeno, como uma forma inativa de 60 kDa
e uma forma ativa de 54 kDa.
3.13.2 Interleucinas 1 e 6
O método utilizado foi o do imunoensaio enzimático.
Utilizou-se o método Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,
ELISA, no qual ocorre identificação de anticorpos e ou antígenos por
anticorpos marcados com uma determinada enzima.
Uma das metades dos espécimes (a outra metade foi usada
para exame das MMPs) foi homogeneizada no Turrax, passada no
Sonicador , depois no gelo (para que a membrana celular se rompa), e
centrifugada a 5000 g /4º C, 5´, (g = equivalente a rotações por minuto
indicando velocidade de centrifugação) e com separação do
sobrenadante em alíquotas e, por fim, armazenadas a - 80 º C.
Realização do preparo dos tampões PBS e DPBS, dos anticorpos de
captura, dos anticorpos de detecção, da Streptavidin e dos kits, com
padrões para Recombinant Rabbit IL-1alfa (RPO346U-005, marca
Kingfisher Biotech, Inc, U.S.A.) e para Recombinant Rabbit IL-6 (SEA a79
Rb, marca Cloud-Clone Corp., U.S.A.). Um dia anterior ao ensaio, foi feita
sensibilização da placa, diluição e pipetagem de 100 microlitros na placa;
no dia do ensaio, esvaziou-se a placa, adicionou-se PBS à temperatura
ambiente, pipetagens, lavagens da Streptavidin–HRP, do substrato TMB,
e da solução Stop, finalizando leitura, com parâmetros a 450 nm, unidade
ng/ml e curva log log, e quantificação em pg/ml33,34. (Figuras 21 a 24)
Métodos
Figura 21 - Montagem da placa do teste ELISA com as amostras. Uma amostra por alvéolo.
Figura 22 - Lavadora de placas do teste ELISA.
Figura 23 - Placa do teste ELISA pronta para ser lida.
Figura 24 - Equipamento com monitor para leitura de placas de teste ELISA.
Métodos
3.14 - Análise estatística dos resultados
A comparação entre os grupos em relação às variáveis
histológicas e de expressão de MMPs e de ILs foram feitas pelos testes
não-paramétricos de Kruskal-Wallis e pelos testes de Dunn para
comparações múltiplas.
A comparação entre os grupos em relação às variáveis de
resistência mecânica foram feitas pelo teste paramétrico ANOVA, após
verificação dos pressupostos de simetria das variáveis e igualdade de
variâncias.
As diferenças foram consideradas estatisticamente
significativas se p< 0,05 com análise estatística feita com o software
SPSS v 21.0.
Resultados
4. RESULTADOS
4.1 - Resistência Mecânica
Os resultados obtidos na avaliação da resistência mecânica
estão expressos na tabela 2. Não houve diferença significante entre os
grupos estudados.
Tabela 2 – Comparação entre grupos em relação às variáveis de
resistência mecânica.
Variável
CN (n=11) CP (n=12) Teste (n=11)
P*
Média dp Média dp Média dp
Peso (g) 2.5 0.3 2.5 0.3 2.4 0.2 0.571
Força máxima (N) 261.7 109.8 258.8 68 265.6 70.6 0.982
Deformação máxima (mm) 3.9 1.6 2.9 1.1 4.1 1.9 0.167
Energia na força máxima (N. mm) 569.1 309.2 440.4 207.1 555.7 286.9 0.457
Energia por área na força máxima (N. mm/mm2) 50.8 27 45.3 22.4 59.7 28 0.419
Módulo de elasticidade (Mpa) 73.9 42.3 115.6 56.6 79.7 42.8 0.092
Tensão na força máxima (Mpa) 23.6 10.8 26.8 10.7 25.5 6.3 0.715
ANOVA*
CN, Controle normal; CP, Controle placebo.
Os gráficos mostram as médias e os desvios padrões dos
valores das variáveis de resistência mecânica (Figura 25). Não houve
diferença significante entre os grupos estudados.
Resultados
B
E F
G
CN, Controle normal; CP, Controle placebo.
Figura 25 - Os gráficos A, B, C, D, E, F e G mostram as médias e os desvios padrões dos valores das variáveis de resistência mecânica.
E
n
e
rg
ia
p
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á
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a
x
im
a
(
N
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m
/m
m
2 )
A
C D
Resultados
4.2 - Variáveis Histológicas
Os resultados das variáveis histológicas, com as comparações
entre os grupos Teste e Controle estão dispostos na tabela 3.
Tabela 3 – Comparação entre os grupos em relação a variáveis
histológicas. Grupos p(1)
CN CP Teste
n Med Min Max n Med Min Max n Med Min Max
Peso (Kg) 11 2.39 2.15 2.73 12 2.43 2.15 2.81 12 2.23 2.00 2.99 0.478
Tenócitos HE
Tendão 10 2.80 0.44 3.50 12 2.16 0.98 5.40 12 2.49 1.50 3.50 0.610 Ruptura do
colágeno HE
Tendão 11 0.02 0.00 0.12 12 0.04 0.00 0.12 12 0.04 0.00 0.14 0.841
C. Infl. HE
Tendão 11 0.00 0.00 0.12 12 0.00 0.00 0.04 12 0.00 0.00 0.06 0.956
Fibras grossas
picro Tendão 11 50.60 33.10 63.70 12 63.00 40.70 82.00 11 59.80 41.00 68.90 0.041(2)
Fibras finas picro
tendão 11 6.40 0.00 12.50 12 3.80 0.00 11.70 11 4.50 0.30 24.00 0.799
Tenócitos HE
Peritendão 11 0.05 0.02 0.22 12 0.06 0.00 0.18 12 0.07 0.01 0.12 0.682
C. Infl. HE
Peritendão 11 2.00 0.00 9.00 12 1.00 0.00 4.00 11 2.00 0.00 3.00 0.083
Fibras grossas
Peritendão 11 38.50 19.10 54.00 12 33.15 23.10 49.10 12 39.60 17.60 52.00 0.265
Fibras finas
Peritendão 11 11.00 0.80 16.80 12 11.35 0.80 15.30 12 11.40 2.10 17.00 0.982
(1) Teste de Kruskal – Wallis
(2) Controle normal < Controle placebo pelo teste de Dunn para comparações múltiplas (p<0,05) Resumo descritivo em mediana (Mínimo-Máximo)
CN, Controle normal; CP, Controle placebo, C. Infl., Células inflamatórias.
As variáveis histológicas analisadas estão mostradas na tabela
3. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos Teste
e Controle. A análise comparativa entre o Controle Placebo e o Controle
Normal revela diferença estatística (destaque em negrito), para a variável
“Fibras grossas picro tendão”, através do teste de Dunn, para
comparações múltiplas (p=0,041).
Resultados
A figura 26 mostra os gráficos referentes às medianas dos
valores das variáveis histológicas, comparadas entre os grupos Teste e
Controle.
CP, Controle placebo; CN, Controle normal; C. Infl., Células inflamatórias.
Figura 26 – Mostra os gráficos A, B, C, D, E, F, G, H, e I, referentes às medianas dos valores das variáveis histológicas, comparadas entre os grupos Teste e Controle.
As variáveis histológicas analisadas estão mostradas na figura
26. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos
Teste e Controle. A análise comparativa entre o Controle Placebo e o
Controle Normal revela diferença estatística, (no gráfico D) para a variável
“Fibras grossas picro tendão”, através do teste de Dunn, para
comparações múltiplas (p=0,041).
C
. I
n
fl
. H
E
T
e
n
d
ã
o
I
C
. I
n
fl
. H
E
T
e
n
d
ã
o
Resultados
4.3 - Expressões de Metaloproteinases
Na tabela 4 estão as comparações entre os grupos Teste e
Controle em relação às MMPs.
Tabela 4 – Comparação entre os grupos em relação às MMPs.
Grupos
p(1)
CN CP Teste
n Med Min Max n Med Min Max n Med Min Max
Peso (Kg) 12 2.47 2.12 2.93 12 2.47 2.12 2.93 12 2.35 2.19 2.58 0.218
MMP2 inativa 12 1.07 0.89 1.71 12 1.07 0.75 1.51 8 1.19 0.58 1.48 0.593
MMP2 ativa 12 1.44 0.33 4.33 12 1.38 0.90 5.00 8 0.47 0.30 1.67 0.027 (2)
MMP1 inativa 12 1.15 0.62 1.59 12 1.13 0.70 1.47 8 1.19 0.94 1.34 0.958
MMP1 ativa 12 0.91 0.35 1.35 12 0.90 0.38 1.45 8 0.49 0.28 1.05 0.080
(1) Teste de Kruskal - Wallis
(2) Teste < Controle (p<0,05; teste de Dunns para comparações múltiplas entre os grupos) Resumo descritivo em mediana (Mínimo-Máximo)
CN, Controle normal; CP, Controle placebo.
Os grupos Teste e Controle revelam diferença significante
(valores expressos em negrito) em relação a MMP-2 ativa, valores
menores no grupo Teste.
A figura 27 mostra o gráfico com a comparação entre as
medianas dos grupos Teste e Controle.
Figura 27 - Gráfico mostra mediana dos valores das formas ativas das MMP2s do grupo Teste em relação a mediana dos valores das formas ativas das MMP2s do grupo controle.
Resultados
O grupo Teste revela no gráfico da figura 27, valores menores
que os do grupo Controle.
4.4 - Expressões de Interleucinas
A tabela 5 mostra a comparação entre os grupos Teste e
Controle, em relação à expressão das ILs e, indica que não houve
diferenças significantes entre os grupos.
Tabela 5 – Comparação entre os grupos em relação a ILs.
Grupo
p(1)
CN CP Teste
N Med Min Max n Med Min Max n Med Min Max
PESO (Kg) 12 2.467 2.122 2.925 11 2.454 2.122 2.925 11 2.348 2.189 2.583 0.356
IL6 12 92 37 182 11 83 36 194 11 106 26 157 0.938
IL1 12 275.5 145 463 11 321 109 629 11 311 91 1145 0.638
(1) Teste de Kruskal - Wallis
Resumo descritivo em mediana (Mínimo-Máximo) CN, Controle normal; CP, Controle placebo.
A figura 28 mostra os gráficos A e B, referentes às medianas
dos valores das ILs, dos grupos Teste e controle.
Figura 28 – Os gráficos A e B mostram medianas dos grupos Teste e Controle; não houve alteração da expressão de IL1 e IL6 na comparação entre os grupos.
Discussão
5. DISCUSSÃO
5.1 - Metodologia
A opção para o presente estudo usando modelo de
experimentação em animal, ao invés de em humanos, foi devido a
restrições éticas na obtenção de biópsias e dificuldade de obtenção de
uma amostra homogênea. Em estudos prévios, as biópsias, em geral, são
extraídas da população mais idosa com lesões crônicas e os controles,
em geral, de população jovem, portanto com viés importante22. Nos ensaios com animais, há possibilidade de melhor controle das variáveis e
homogeneidade dos resultados.
A escolha do coelho como animal de experimentação foi pelo
tamanho relativamente grande do tendão calcâneo, com características
anatômicas e fisiológicas semelhantes ao tendão calcâneo dos
humanos35.
Os CE e outras drogas podem ser injetados diretamente nos
tendões (intratendão ou no peritendão), pois são estruturas com anatomia
e localização superficiais, e as doses usadas podem ser menores que as
sistêmicas23.
A opção de realizar o estudo em tendões normais de coelhos,
com tempo de observação de 48 horas, utilizando uma única aplicação do
CE, e o modo de aplicação intratendinosa, foi baseado em artigos de
Balassubramanian e Prathap36 e Kennedy e Willis37, que mostraram “necrose” do colágeno e diminuição da resistência dos tendões. Os
achados destes autores causaram impacto entre os especialistas e
contribuíram para a controvérsia a respeito de injeções de CE em
tendões. No presente estudo usamos também injeção única,
intratendinosa e dose (usada por Kennedy e Willis), semelhantes aos
estudos de Balassubramanian e Prathap36 e Kennedy e Willis37, para comparações de resultados.
Discussão
No presente estudo, os membros contralaterais não foram
usados como controles nos animais submetidos à injeção de CE, uma vez
que estudos com injeções de CE em tendões bilaterais de coelhos
mostraram efeitos aditivos nos desfechos estudados.
A opção de estudo em tendões normais foi escolhida porque
modelos experimentais de lesão em tendões, por traumas ou por injeções
de outras substâncias38,39, já foram usados, mas ainda carecem de validação.
O método de histomorfometria foi escolhido pela possibilidade
de quantificação com maior objetividade nos resultados das variáveis
histológicas, além da pesquisa não só focal, e, sim ao redor da área de
injeção do CE ou do soro. As variáveis de fibras grossas e finas
representam a quantidade de colágenos I e III, respectivamente, e foram
incluídas no estudo para verificação de alteração da relação entre elas,
sendo o normal existir maiores quantidades de fibras grossas.
A escolha das MMPs1 e as MMPs2 foi feita, pois essas
enzimas clivam colágenos fibrilares I, II, e III, sendo que as MMPs2,
também degradam colágeno amorfo7. Após as injeções de CE, poderíamos ter a degradação de uma ou de várias formas de colágeno,
fato que motivou a opção, de verificar as expressões dessas duas MMPs.
Uma das atividades dos macrófagos, na fase inicial da
inflamação aguda, seria a produção de IL1, IL6, e TNF, as quais agem na
indução da adesão endotelial dos leucócitos que com o aumento da
permeabilidade vascular, chegariam em maior número ao local agredido7. No presente estudo, o tempo de observação de quarenta e oito horas
(considerado como fase inicial de eventual inflamação) nos levou a
pesquisar as expressões de IL1 e IL6, eventualmente relacionadas às
respostas ao CE.
