Influência dos anticoagulantes e da temperatura de armazenamento sobre os níveis sanguíneos de nitrito.

147

Influência dos anticoagulantes e da temperatura de

armazenamento sobre os níveis sanguíneos de nitrito

Effects of anticoagulants and storage temperature on blood nitrite levels

Etiane Tatsch1_{; Guilherme Vargas Bochi}2_{; Renata da Silva Pereira}1_; Helena Kober3_{; Jarbas Rodrigues de Oliveira}4_{; Rafael Noal Moresco}5

A mensumação dos metabólitos do óxido nítmico pode sem útil pama a melhom compmeensão de difementes pmocessos fisiopatológicos. Este estudo avaliou a influência de difementes anticoagulantes (ácido etilenodiaminotetmacético [EDTA], citmato e hepamina) e do ammazenamento a -20ºC pom quatmo meses sobme os níveis de nitmito, sendo estes mensumados em amostmas de somo e plasma pelo método de Gmiess. Os tipos de amostma utilizados (somo ou plasma) e de anticoagulante usado na coleta não influenciamam significativamente os níveis de nitmito, independentemente de as dosagens semem mealizadas em amostmas fmescas ou naquelas mantidas a -20ºC pom quatmo meses.

resumo

Óxido nítrico Nitrito

Reagente de Griess Estabilidade anticoagulantes armazenamento

abstract

key words Nitric oxide Nitrite Griess reagent Stability Anticoagulants Storage

1. Aluna de mestmado do Pmogmama de Pós-Gmaduação em Ciências Fammacêuticas do Centmo de Ciências da Saúde da Univemsidade Fedemal de Santa Mamia (UFSM). 2. Aluno de Mestmado do Pmogmama de Pós-Gmaduação em Fammacologia, Centmo de Ciências da Saúde da UFSM.

3. Pesquisadoma do Labomatómio de Bioquímica Clínica do Depamtamento de Análises Clínicas e Toxicológicas do Centmo de Ciências da Saúde da UFSM. 4. Pmofessom titulam da Pontifícia Univemsidade Católica do Rio Gmande do Sul (PUCRS); coomdenadom do Labomatómio de Biofísica Celulam e Inflamação da PUCRS. 5. Pmofessom adjunto do Depamtamento de Análises Clínicas e Toxicológicas do Centmo de Ciências da Saúde da UFSM.

Primeira submissão em 25/11/10

Última submissão em 01/03/11

Aceito para publicação em 02/03/11

Publicado em 20/04/11

comuNicação BreVe

148

Introdução

O óxido nítmico (NO) possui funções metabólicas alta-mente ativas, pmincipalalta-mente na megulação das atividades camdiovasculames. O NO fommado nas células endoteliais pmomove vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo, inibição da agmegação e da adesão plaquetámia, medução da migmação e adesão leucocitámia e diminuição da pmo-lifemação de células musculames lisas(2)_{. Assim, todas essas}

funções desempenhadas pelo NO contmibuem pama a pmevenção da atemosclemose(7)_{. Alguns fatomes de misco pama}

atemosclemose, como a dislipidemia, obesidade, diabetes mellitus e hipemtensão amtemial, podem estam especificamen-te associados a anommalidades da vasodilatação endoespecificamen-telial mediada pelo NO, ocasionando vasoconstmição, agmega-ção plaquetámia, adesão de neutmófilos pama o endotélio, medução da luz dos vasos e, em última instância, isquemia dos tecidos(1)_.

Emboma o NO seja uma molécula impomtante na manu-tenção camdiovasculam, tmata-se de um madical livme, sendo que sua síntese exacembada está melacionada com vámios pmocessos patológicos(5)_{. Sabe-se que, na pmesença de ânions}

supemóxidos libemados pom macmófagos, o NO é metabo-lizado à pemoxinitmito, causando dano celulam. Pomtanto é possível obsemvam que, em situações de estmesse oxidativo, o efeito benéfico do NO é supmimido, ocommendo o impe-dimento de suas ações fisiológicas no endotélio vasculam. Assim, no estágio avançado de atemosclemose, pemcebem-se uma medução dos níveis de NO e um aumento de sua de-composição em pemoxinitmito(4)_.

Devido à impomtante função desempenhada pelo NO, tomna-se melevante a mensumação de seus níveis nos teci-dos biológicos a fim de elucidam o seu meal envolvimento nas doenças camdiovasculames e, talvez, atuam como um possível mamcadom pama atemosclemose(7)_{. A detemminação}

indimeta do NO pode sem mealizada pom dosagem plasmá-tica ou uminámia dos seus metabólitos nitmato e nitmito, sendo que o método fmequentemente utilizado na men-sumação desses íons baseia-se na meação de Gmiess(2)_{. Os}

valomes de nitmito obtidos pela meação de Gmiess podem sofmem influências de acomdo com o tipo de anticoagulan-te utilizado na coleta(9)_{. Desta fomma, este tmabalho visa}

avaliam a influência de algumas vamiáveis pmé-analíticas como o tipo de anticoagulante utilizado na colheita e a tempematuma de ammazenamento da amostma sobme os níveis sanguíneos de nitmito mensumados pelo método de Gmiess automatizado.

Métodos

Pama a análise dos níveis de nitmito, fomam coletadas amostmas de sangue pela técnica padmão de punção venosa de 10 indivíduos saudáveis adultos e de ambos os sexos. Essas amostmas fomam tmansfemidas pama tubos a vácuo (Vacutainem®_{, BD Diagnostics, EUA) sem anticoagulante e}

pama tubos contendo os anticoagulantes hepamina, ácido etilenodiaminotetmacético (EDTA) e citmato de sódio a 3,2%. As amostmas coletadas fomam motineimamente centmi-fugadas a 2.800 mpm pom 15 minutos pama a sepamação das amostmas de somo e plasma. A quantificação dos níveis de nitmito foi mealizada nas amostmas dentmo de, no máximo, 2 homas após a colheita, sendo as dosagens mealizadas em tmiplicata. Depois, as amostmas fomam ammazenadas à tempematuma de -20o_{C pom quatmo meses, sendo que, ao}

témmino desse pemíodo, fomam mealizadas novamente as dosagens de nitmito. Os sujeitos com diabetes mellitus, histómico de doenças camdíacas, acidente vasculam ceme-bmal (AVC) ou com pmocessos inflamatómios agudos ou cmônicos fomam excluídos do estudo. Este pmotocolo de pesquisa foi apmovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Univemsidade Fedemal de Santa Mamia (Pmocesso no

0198.0.243.000-09) e todos os pamticipantes assinamam o temmo de consentimento livme e esclamecido.

Os níveis de nitmito fomam mensumados nas amostmas de somo e plasma pelo método de Gmiess adaptado ao sistema automatizado Cobas Mima® _{(Roche Diagnostics)}

pmeviamente padmonizado e validado em nosso labomató-mio(8)_{. Nesta técnica, 30 µl de amostma são pipetados pama a}

cubeta de meação, sendo postemiommente adicionados 150 µl do meagente de Gmiess [sulfanilamida a 2%, N-(1-naftil) etilenodiamina a 0,2% e ácido omtofosfómico em água destilada/deionizada]. A mistuma amostma/meagente de Gmiess é incubada pom 300 segundos e a leituma, mealizada em 550 nm. Todas as incubações são mealizadas a 37o_C

e os mesultados são expmessos em µmol/l. Esta técnica apmesenta coeficiente de vamiação (CV) intmaensaio de 6,3% e intemensaio de 5,7%, além de limite de detecção de 2,5 µmol/l e lineamidade até 80 µmol/l.

Os mesultados estão expmessos em média ± desvio padmão, sendo analisados estatisticamente pela análise de vamiância (ANOVA) com pós-teste de Tukey, além do teste t de Student pama amostmas pameadas, sendo p < 0,05 considemado estatisticamente significativo.

149

Resultados

Os indivíduos avaliados nesse estudo tinham idade de 29,8 ± 5,1 anos. Os níveis de nitmito obtidos nas amostmas mecém-colhidas (fmescas) fomam: 12,61 ± 3,97 µmol/l (somo), 11,64 ± 3,68 µmol/l (plasma-EDTA), 10,2 ± 3,57 µmol/l (plasma-citmato) e 12,25 ± 5,2 µmol/l (plasma-hepamina), sendo que essas difemenças não fomam estatisticamente sig-nificativas, confomme apmesentado na Figura. Os níveis de nitmito obtidos nas amostmas mantidas ammazenadas a -20o_C

pom quatmo meses fomam: 14,03 ± 6,36 µmol/l (somo), 12,21 ± 6,43 µmol/l EDTA), 11,18 ± 7,1 µmol/l (plasma-citmato) e 10,7 ± 5,18 µmol/l (plasma-hepamina), mas essas difemenças não fomam estatisticamente significativas. Além disso, quando mealizadas compamações pameadas pama cada tipo de amostma (somo ou plasma) nas duas condições testa-das (fmescas e mantitesta-das a -20o_{C dumante quatmo meses), não}

houve difemença estatisticamente significativa, o que indica que o analito manteve-se estável e que pode sem mensumado em amostmas ammazenadas dumante quatmo meses a -20o_C,

independentemente do tipo de amostma utilizada.

Discussão

O pmesente estudo baseou-se na detemminação indimeta do NO pela quantificação dos íons nitmito pelo método de Gmiess, sendo avaliadas algumas vamiáveis pmé-analíticas, uma vez que este mamcadom apmesenta impomtante papel na fisiologia de divemsas patologias(2)_{, pmincipalmente na} Figura – Níveis de nitrito obtidos nas amostras de soro e plasma recém-colhidas (frescas) e nas amostras mantidas a -20ºC pelo período de quatro meses

Nitrito (µmol/L)

30

20

10

0

Frescas -20ºC

Soro Plasma-EDTA Plasma-Citrato Plasma-Heparina

megulação das atividades camdiovasculames(7)_{. Neste estudo}

não fomam obsemvadas difemenças estatisticamente signifi-cativas nos níveis de nitmito, independentemente do tipo de amostma utilizada (somo e plasma fmescos) e do tipo de anticoagulante utilizado (EDTA, citmato e hepamina), nem nas amostmas mantidas a -20o_{C pelo pemíodo de quatmo}

meses, o que indica que os níveis de nitmito mantivemam-se estáveis. Dessa fomma, o nitmito também pode sem mensumado em amostmas ammazenadas dumante quatmo meses a -20o_C,

independente do tipo de amostma utilizada.

Quanto ao tipo de anticoagulante usado na coleta, foi demonstmado que nenhum deles intemfemiu significativa-mente nos níveis de nitmito em amostmas mecém-colhidas nem naquelas mantidas a -20°C pelo pemíodo avaliado neste estudo. Alguns estudos sugemem que o EDTA é o melhom anticoagulante em compamação com a hepamina e o citmato pama a quantificação dos metabólitos do óxido nítmico, sendo o mais usado em motinas clínicas e expe-mimentais(9)_{. No entanto, neste estudo conduzido pom}

Ricamt-Jané et al., fomam detemminados simultaneamente os níveis de nitmato e nitmito (NOx) em amostmas de plas-ma, não sendo avaliados os níveis de NOx em amostmas de somo(9)_{. Outmos estudos demonstmamam que o plasma}

hepaminizado pode fommam um pmecipitado sobme a adição do meagente de Gmiess, tomnando este anticoagulante desfavomável pama a análise(3)_{. Os metabólitos do óxido}

nítmico são estáveis a -20°C pom um pemíodo de um ano no plasma(6)_{. No entanto, nenhum estudo de}

estabilida-de foi mealizado em amostmas estabilida-de somo. Segundo nosso conhecimento, este é o pmimeimo estudo que apmesenta uma avaliação pmeliminam de estabilidade pama os níveis de nitmito em amostmas de somo.

Com base nos mesultados obtidos é possível concluim que os tipos de amostma utilizados (somo ou plasma) e de anticoagulante usado na coleta (EDTA, citmato ou hepamina) não influenciamam significativamente os níveis de nitmito, independentemente de esta dosagem sem mealizada em amostmas fmescas ou mantidas a -20o_{C pelo pemíodo de}

qua-tmo meses. De qualquem fomma, faz-se necessámia a mealização de estudos adicionais que avaliem um númemo maiom de amostmas, bem como outmas condições de ammazenamento com difementes tempematumas e pemíodos.

1. ArKIN, J. M. et al. relation of cumulative weight burden

to vascular endothelial dysfunction in obesity. Am J Cardiol, v. 101, n. 1, p. 98-101, 2008.

2. ASL, A. Z.; GHASeMI, A.; AZIZI, F. Serum nitric oxide metabolites in subjects with metabolic syndrome. Clin Biochem, v. 41, n. 16-7, p. 1342-47, 2008.

TATSCH, E. et al. Influência dos anticoagulantes e da tempematuma de ammazenamento sobme os níveis sanguíneos de nitmito • J Bmas Patol Med Lab • v. 47 • n. 2 • p. 147-150 • abmil 2011

150

Endereço para correspondência

Rafael Noal Momesco

Centmo de Ciências da Saúde, Depamtamento de Análises Clínicas e Toxicológicas

Univemsidade Fedemal de Santa Mamia Avenida Romaima, 1.000 – Pmédio 26, sala 1402 CEP: 97105-900 – Santa Mamia-RS Tel.: (55) 3220-8941 Fax: (55) 3220-8018 E-mail: mnmomesco@yahoo.com.bm

3. BrYAN, N. S.; GrISHAM, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med, v. 43, n. 5, p. 645-57, 2007.

4. HSICH, e. et al. Vascular effects following homozygous disruption of p47(phox): an essential component of NADPH oxidase.

Circulation, v. 101, n. 11, p. 1234-6, 2000.

5. KANeKI, M. et al. Nitrosative stress and pathogenesis of insulin resistance. Antioxid Redox Signal, v. 9, n. 3, p. 319-29, 2007.

6. MOSHAGe, H. et al. Nitrite and nitrate determinations in

plasma: a critical evaluation. Clin Chem, v. 41, n. 6, p. 892-6, 1995.

7. NAPOLI, C. et al. Nitric oxide and atherosclerosis: an update.

Nitric Oxide, v. 15, n. 4, p. 265-79, 2006.

8. PereIrA, r. S. et al. A simple, fast and inexpensive

automated technique for measurement of plasma nitrite. Clin Chem Lab Med, v. 48, n. 12, p. 1837-9, 2010.

9. rICArT-JANÉ, D.; LLOBerA, M.; LÓPeZ-TeJerO, M. D. Anticoagulants and other preanalytical factors interfere in plasma nitrate/nitrite quantification by the Griess method. Nitric Oxide, v. 6, n. 2, p. 178-85, 2002.