CAROLINA MELONI VICENTE
O PAPEL DOS PROTEOGLICANOS NA ADESÃO CELULAR
DURANTE A TUMORIGÊNESE: UM MODELO IN VITRO PARA O
ESTUDO DA INTERAÇÃO CÂNCER-ESTROMA
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo
–
UNIFESP, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
Vicente, Carolina Meloni
O papel dos proteoglicanos na adesão celular durante a tumorigênese: um modelo in vitro para o estudo da interação
câncer-estroma. Carolina Meloni Vicente – São Paulo, 2009. xvi, 72 p.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina.
Título em Inglês: The Role of proteoglycans on cell adhesion during tumorigenesis: a model to study tumor-stroma interactions in vitro.
Esta tese foi desenvolvida no Laboratório de Biologia
Molecular da Disciplina de Biologia Molecular
–
Departamento de Bioquímica
–
Universidade Federal
de São Paulo, durante o curso de pós-graduação em
Biologia Molecular, com auxílio financeiro das
entidades: CNPq, FAPESP e FADA-UNIFESP. A
autora foi bolsista CNPq.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular
CAROLINA MELONI VICENTE
O PAPEL DOS PROTEOGLICANOS NA ADESÃO CELULAR
DURANTE A TUMORIGÊNESE: UM MODELO IN VITRO PARA O
ESTUDO DA INTERAÇÃO CÂNCER-ESTROMA
BANCA EXAMINADORA
TITULARES
Profa. Dra. Célia Regina Cavichiolo Franco
Profa. Dra. Telma Maria Tenório Zor
Profa. Dra. Fernanda Wanderley de Oliveira
SUPLENTE
A meus pais, por tornarem
este, e todos os meus sonhos
Agradecimentos
Agradeço à Universidade Federal de São Paulo, onde este trabalho foi realizado, e a Profa. Dra. Helena Bonciani Nader, pela oportunidade de iniciação na carreira científica.
À minha orientadora, Profa. Dra. Leny Toma, por me ensinar a fazer ciência. Por estar sempre disposta a me instruir, transmitindo conforto e segurança. Pela confiança, paciência e pelo carinho. Por fazer com que eu queira aprender cada vez mais.
A todos os professores da Disciplina de Biologia Molecular, que transformam conteúdo em conhecimento: Dra. Yara M. Michelacci, Dra. Lúcia O. Sampaio, Dra. Marimélia A. Porcionatto, Dra. Maria Aparecida S. Pinhal, Dr. Ivarne L. S. Tresariol, Dr. João Roberto Maciel Martins, Dr. Hugo P. Monteiro, Dra. Giselle Zenker, Dra. Luciana Vasquez. À Isabel, Elsa e Aline por todo o suporte técnico.
À Dra. Ritchelli Ricci e a Ms. Vivien Jane Coulson-Thomas, pelos ensinamentos e por tornarem qualquer trabalho divertido. Pelas preciosas dicas que deixam tudo mais fácil. Pelo companheirismo e pela amizade.
Às meninas do quinto andar, pela agradável convivência diária: Ana Paula, Carol Ariza, Caroline, Thaís, Yvette, Michele e Layla. A todos os meus colegas do laboratório, que contribuíram, de alguma forma, para a realização deste trabalho.
A meus pais, pelo apoio incondicional. Vocês são meus maiores exemplos. A toda minha família, por estar sempre a meu lado.
Ao CNPq pelo suporte financeiro.
ÍNDICE GERAL
ÍNDICE DE FIGURAS... xi
ÍNDICE DE TABELAS... xii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS... xiii
RESUMO... xv
ABSTRACT... xvi
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1. Matriz Extracelular... 1
1.2. Componentes da Matriz Extracelular... 3
1.2.1. Colágenos... 3
1.2.2 Laminina... 3
1.2.3. Fibronectina... 5
1.2.4. Proteoglicanos e Glicosaminoglicanos... 7
1.2.4.1. Ácido Hialurônico... 9
1.2.4.2. Condroitim Sulfato... 10
1.2.4.3. Dermatam Sulfato... 11
1.2.4.4. Queratam Sulfato... 11
1.2.4.5. Heparina... 12
1.2.4.6. Heparam Sulfato... 12
1.3. Família dos Sindecans... 13
1.3.1. Sindecam-2... 15
1.4.Câncer Colorretal... 17
2. OBJETIVOS... 19
3. MATERIAL... 20
3.1. Linhagens celulares... 20
3.2. Meios de cultura, tampões e soluções... 21
3.3. Enzimas... 22
3.4. Radioisótopos... 22
3.5. Anticorpos e marcadores fluorescentes... 22
3.5.1. Anticorpos primários... 22
3.5.2. Anticorpos secundários... 23
3.5.3. Marcadores Fluorescentes... 23
3.6.1. Coomassie Brilliant Blue G... 23
3.6.2. Azul de Toluidina... 23
3.7. Glicosaminoglicanos padrões... 24
3.8. Outros materiais... 24
3.9. Aparelhos... 25
4. MÉTODOS... 27
4.1. Cultura de Células... 27
4.1.1. Cultura das linhagens Caco-2, HCT-116 e fibroblastos... 27
4.1.2. Preparo de matriz extracelular estromal... 28
4.2. Marcação Metabólica de Glicosaminoglicanos Extraídos das LinhagensCelulares... 28
4.2.1. Incorporação de [35S]-Sulfato de sódio para Análise Estrutural de Glicosaminoglicanos... 28
4.2.2. Extração de GAGs marcados metabolicamente com [35S]-sulfato de sódio... 29
4.2.3. Eletroforese em gel de agarose... 29
4.2.4. Quantificação dos GAGs marcados metabolicamente... 30
4.3. Western Blotting de Proteínas de MEC Estromal... 30
4.4. Curva de Crescimento celular (ensaio com MTT)... 31
4.5. Ensaio de Adesão Celular... 32
4.5.1. Placas recobertas por proteínas de matriz... 32
4.5.2. Bloqueio de Sindecam-2... 32
4.6. Imunocitoquímica... 33
4.6.1. Marcações Externas... 33
4.6.2. Marcações Internas... 34
4.6.3. Coloração do núcleo... 34
4.6.4. Controles... 34
4.6.5. Observação do material... 34
4.7. Ensaio de Citometria... 34
4.8. Análise de Expressão Gênica... 35
4.8.1. Extração de RNA Total... 35
4.8.2.QUANTIFICAÇÃO DO RNA... 36
4.8.3. Desenho dos Primers... 36
4.8.4. RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)... 36
4.8.5. PCR em Tempo Real... 38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 39
5.1. Efeito da matriz extracelular de fibroblastos na síntese de glicosaminoglicanos em células de câncer colorretal... 39
5.2. Crescimento de Células de Carcinoma Colorretal na Presença de Matriz Extracelular Estromal... 41
5.3. Análise da Expressão Gênica de Proteoglicanos de Superfície e de Matriz Extracelular em Células de Câncer colorretal durante Interação com Matriz Extracelular Estromal... 42
5.4. Influência da Matriz Extracelular Estromal na síntese de Sindecam-2 na linhagem HCT-116... 46
5.5. Localização de Sindecam-2 na linhagem de Câncer colorretal HCT-116... 50
5.6. Participação de Sindecam-2 na indução da formação de Fibras de estresse... 54
6. CONCLUSÕES... 58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 59
8. ANEXOS... 69
8.1. Parecer do Comitê de Ética Institucional... 69
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação esquemática da estrutura da Laminina-332... 5
FIGURA 2: Representação esquemática da estrutura da fibronectina... 6
FIGURA 3: Região de ligação da cadeia de glicosaminoglicano ao esqueleto protéico... 7
FIGURA 4: Unidades estruturais dos Glicosaminoglicanos... 9
FIGURA 5: Representação esquemática de sindecans de mamíferos... 14
FIGURA 6: Representação esquemática da estrutura do Sindecam-2... 16
FIGURA 7: Síntese de GAGs marcados metabolicamente com [35S]Na2SO4 na linhagem Caco-2 na presença ou ausência de matriz de fibroblastos... 40
FIGURA 8: Síntese de GAGs marcados metabolicamente com [35S]Na2SO4 na linhagem HCT-116 na presença ou ausência de matriz de fibroblastos... 41
FIGURA 9: Ensaio de crescimento celular de células de carcinoma colorretal HCT- 16... 42
FIGURA 10: Expressão dos sindecans e versicam nas linhagens de câncer colorretal na presença de matriz extracelular estromal... 44
FIGURA 11: Distribuição do Versicam na MEC de Fibroblastos... 46
FIGURA 12: Presença de Sindecam-2 e Integrina 5 1 por citometria de fluxo... 47
FIGURA 13: Presença de Sindecam-2 em células HCT-116 cultivadas em diferentes proteínas de MEC por citometria de fluxo... 48
FIGURA 14: Presença de Sindecam-2 em células HCT-116 cultivadas sobre Fibronectina por citometria de fluxo... 49
FIGURA 15: Presença de Fibronectina na MEC de Fibroblastos por Western Blotting... 50
FIGURA 16: Presença de Sindecam-2 e de F-actina em células HCT-116 por microscopia confocal... 51
FIGURA 17: Presença de Sindecam-2 e de Interina 5 1 em células HCT-116 por microscopia confocal... 52
FIGURA 18: Presença de Sindecam-2 e de Fibronectina em células HCT-116 por microscopia confocal... 53
FIGURA 19: Distribuição dos filamentos de actina da linhagem HCT-116.. 54
FIGURA 20: Ensaio de adesão de células HCT-116 em MEC estromal com bloqueio de Sindecam-2 utilizando anticorpo específico visualizadas por microscopia confocal... 56
ÍNDICE DE TABELAS
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AH ácido hialurônico
APC adenomatous polyposis coli
Bcl apoptosis regulator Bcl-2 protein
c-erbB erythroblastic leukemia viral oncogene
CA carbohydrate antigen
cDNA DNA complementar
CEA carcinoembryonic antigen
CS condroitim sulfato
Da Dalton
DCC deleted in colorectal carcinoma
DEPC Dietilpirocarbonato
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DS dermatam sulfato
EBSS solução salina dalanceada de Earle
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
família ERM ezrina, radixina e moesina
FGF-2 fibroblast growth factor
GAG Glicosaminoglicano
HB-EGF heparin-binding epidermal growth factor
Hep heparina
HS heparam sulfato
K-Ras Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
kDa kilodaltons (1.000 Da)
KS queratam sulfato
MEC matriz extracelular
nm nanômetros
PBS phosphate buffered saline
PDA tampão 1,3-diaminopropano acetato
PDGF platelet-derived growth factor
PG Proteoglicanos
PKC proteína quinase C
SFB soro fetal bovino
TGF- transforming growth factor beta
VEGF vascular endothelial growth factor
RESUMO
Durante a metástase, as células perdem seu contato tecidual original, movem-se pela matriz extracelular (MEC), invadem o sistema linfático e/ou sanguíneo, extravasam e formam novos tumores. Devido a isso, essas células tumorais precisam modificar sua adesão célula-MEC. Receptores de adesão exercem papéis cruciais na transformação neoplásica de células normais através da indução de comportamentos celulares e morfológicos específicos do câncer. Isto implica que células tumorais provavelmente expressam e utilizam um conjunto distinto de receptores de adesão celular durante e carcinogênese.
Sindecam-2 é um proteoglicano transmembrânico de heparam sulfato (HS) que participa da formação de domínios especializados na membrana plasmática e funciona diretamente como um vínculo entre o ambiente extracelular e a organização do citoplasma cortical. Em diversas linhagens celulares de câncer colorretal, a expressão de sindecam-2 encontra-se aumentada, quando comparada com linhagens normais, e este aumento parece ser crítico para o comportamento das células cancerosas, uma vez que regula sua adesão e proliferação, e, portanto, sua atividade tumorigênica.
ABSTRACT
During metastasis cells lose their original tissue contacts, move through the extracellular matrix (ECM), enter the lymphatic and/or blood system, extravasate and subsequently form new tumors. Therefore, these tumor cells must experience changes in cell-ECM adhesion. Adhesion receptors play crucial roles in the neoplastic transformation of normal cells through the induction of cancer-specific cellular behavior and morphology. This implies that cancer cells likely express and utilize a distinct set of adhesion receptors during carcinogenesis.
Syndecan-2 is a transmembrane heparan sulfate (HS) proteoglycan which has been implicated in the formation of specialized membrane domains and functions as a direct link between the extracellular environment and the organization of the cortical cytoplasm. In several colon-rectal cancer cell lines, syndecan-2 is highly expressed compared to normal cell lines. This increase appears to be critical for cancerous cell behavior since it regulates adhesion and proliferation and therefore the tumorigenic activity.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Matriz Extracelular
Os tecidos de organismos multicelulares são constituídos por células especializadas, sendo o espaço extracelular preenchido pela matriz extracelular (MEC). Esta matriz é composta por um conjunto de agregados supramoleculares secretados localmente pelas células, e constituído por colágenos, proteoglicanos (como o versicam) e glicosaminoglicanos (como o ácido hialurônico) e glicoproteínas (fibronectina, laminina, vitronectina, entactina, entre outras), que mantém as células associadas possibilitando a organização dos tecidos e, como conseqüência, a sobrevivência celular.
Existem duas categorias principais de MEC. O primeiro tipo é a membrana basal, que interage diretamente com o tecido epitelial, e é constituída principalmente de colágeno IV, lamininas, entactina e proteoglicanos de heparam sulfato. O segundo tipo é a matriz intersticial, que constitui o restante da MEC no corpo. A matriz intersticial é constituída por muitos colágenos incluindo os tipos I e III, que juntamente com a fibronectina contribuem para a força mecânica do tecido. Adicionalmente, a matriz intersticial possui tenascina e proteoglicanos que promovem a hidratação tecidual, e são regiões de interação com fatores de crescimento (ERLER; WEAVER, 2009).
Além de sua função estrutural, a MEC desempenha um papel complexo na regulação do comportamento das células, influenciando seu desenvolvimento, migração, proliferação, forma e função (MARASTONI et al., 2008). Esses eventos ocorrem graças à interação entre as moléculas da MEC e os receptores da superfície celular, como integrinas e proteoglicanos de heparam sulfato.
Enquanto em processos fisiológicos, a integridade dos tecidos é mantida pelo estroma, no câncer, contudo, a invasão tecidual é dirigida por este (De WEVER et al., 2008). Miofibroblastos e fibroblastos associados ao câncer são importantes componentes do estroma tumoral e a mudança no estroma está associada à invasão e metástase (De WEVER; MAREEL, 2003). Cargas mecânicas induzem fibroblastos a aumentarem a síntese, secreção e deposição de muitos componentes de MEC e enzimas relacionadas, como a enzima LOX (lisil oxidase) (ERLER et al., 2009). Essas modificações na MEC corroboram para a ativação de fibroblastos e maximizam a progressão tumoral. Evidências morfológicas desta participação incluem: desmoplasia, constituída por fibroblastos e MEC; inflamação e resposta imune, representadas por linfócitos, macrófagos e células dendríticas; e angiogênese, evidenciada por vasos sanguíneos recém formados e vasos linfáticos.
Muitos componentes da MEC e enzimas de remodelamento encontram-se elevados em pacientes com câncer. A superexpressão de metaloproteinases foi demonstrada tanto no estroma turmoral quanto nas células cancerosas. Os colágenos fibrilares normalmente têm um baixo metabolismo, que está aumentado durante o remodelamento da MEC, e que caracteriza a evolução tumoral (ERLER; WEAVER, 2009).
1.2. Componentes da Matriz Extracelular
1.2.1. Colágenos
Os colágenos são uma família de proteínas fibrosas encontradas em todos os animais multicelulares. Essas proteínas são secretadas pelas células do tecido conjuntivo e por uma grande variedade de outros tipos celulares, sendo as mais abundantes em mamíferos. Além de sua função estrutural, as moléculas de colágeno estão envolvidas na hemostasia, cicatrização, adesão e migração celular.
A principal característica de uma molécula de colágeno típica é a estrutura longa e rígida de sua fita tripla helicoidal, na qual três cadeias polipeptídicas de colágeno, denominadas cadeias , são enroladas umas nas outras. As cadeias são formadas por unidades repetitivas Gly-X-Y, onde Y é freqüentemente prolina ou hidroxiprolina e X é um aminoácido qualquer. Devido à estrutura em anel, a prolina estabiliza a conformação da hélice em cada cadeia , enquanto que a glicina é espaçada regularmente a cada dois resíduos por toda a região central da cadeia , permitindo que as três hélices da cadeia se agrupem firmemente para formar a estrutura final da molécula de colágeno (PROCKOP; KIVIRIKKO, 1995).
Cerca de 30 tipos de colágeno diferentes já foram identificados (LeBLEU et al., 2007). Os principais colágenos encontrados em tecido conjuntivo são os tipos I, II, III, V e XI, sendo o tipo I o principal colágeno da pele e dos ossos, e também o mais comum. Os principais tipos de colágenos são relacionados na tabela 1.
1.2.2 Laminina
TIPO FORMA POLIMERIZADA DISTRIBUIÇÃO TECIDUAL
Formadores de fibrilas (Fibrilar)
Associados a fibrilas
Formuladores de rede
Transmembrana Outros I II III IV XI IX XII IV VII XVII XVIII fibrila fibrila fibrila
fibrila (com tipo I)
fibrila (com tipo II)
associação lateral com fibrilas tipo II
associação lateral
rede em forma de camada
fibrilas ancoradouras
não conhecida
não conhecida
ossos, pele, tendões, ligamentos, córnea, órgãos internos
cartilagem hialina, notocorda, humor vítero do olho
pele, vasos sanguíneos, órgãos internos
mesma para tipo I
mesma para tipo II
cartilagem hialina
tendões, ligamentos
lâmina basal
abaixo do epitélio escamoso estratificado
hemidesmossomos
lâmina basal ao redor de vasos sanguíneos
Estruturalmente, cada trímero de laminina apresenta forma de cruz com um grande domínio globular (domínio LG) em sua base. O domínio LG, localizado no C-terminal da cadeia , representa o principal sitio de interação de lamininas com moléculas da superfície celular, como integrinas e sindecans (Figura 1). Já o N-terminal de cada uma das três cadeias é importante para interações com outras moléculas da MEC (SUGAWARA, et al. 2008).
Lamininas são as principais glicoproteínas presentes na membrana basal. Além de manterem a integridade de diferentes tecidos, servem como substrato para a migração celular em tecidos danificados ou para a disseminação de células tumorais malignas. Promovem ainda o crescimento celular, regeneração de nervos, cicatrização, diferenciação e proliferação celulares (EKBLOM et al. 1998).
1.2.3. Fibronectina
Fibronectina é uma glicoproteína multifuncional encontrada no plasma e na MEC dos tecidos. A molécula funcional de fibronectina consiste em duas subunidades similares ou idênticas de 220-250 kDa. Que são unidas por duas pontes dissulfeto próximas ao C-terminal, formando um dímero. Cada monômero é composto pela combinação de três domínios homólogos repetidos, denominados tipos I, II e III. A fibronectina plasmática é secretada na forma de dímero solúvel por hepatócitos diretamente na circulação. Umas das formas de fibronectina é secretada pelas células e depositada na MEC em forma multimérica arranjada em fibrilas (WHITE; BARALLE; MURO, 2008).
A fibronectina fibrilar possui sítios de ligação para diversos componentes da MEC que são usados para orquestrar a montagem de várias outras proteínas, incluindo colágenos I e III, fibrinogênio, trombospondina-1, decorim e biglicam (Figura 2). Além disso, fornece suporte estrutural para a adesão celular, e ao mesmo tempo em que ligam-se a receptores de adesão, como integrinas, participam da transdução de sinais que promovem a dinâmica de actina, migração e proliferação celulares e apoptose. Finalmente, controlam a disponibilidade de fatores de crescimento, por exemplo regulando sua ativação a partir de uma forma latente, como ocorre com o TGF- (LEISS et al., 2008).
FIGURA 1: Representação esquemática da estrutura da Laminina-332. E sítios de ligação a receptores
Fibronectina interage com integrinas através de sítios específicos na proteína. Integrinas são receptores transmembranicos heterodiméricos de superfície celular formados por subunidades e que ligam a MEC a actina intracelular do citoesqueleto e regulam sinais de transdução em cascatas de sinalização (WHITE; BARALLE; MURO, 2008). Embora um grande número de integrinas possa ligar-se a fibronectina, o receptor clássico é a integrina 5 1. Esta integrina reconhece o sítio de ligação RGD, localizado em uma repetição do domínio tipo III.
Já é bem estabelecido que a fibronectina contém dois sítios de ligação à heparina, nomeados Hep-I e Hep-II nos domínios N- e C-terminal, respectivamente. Hep-I é essencial para a incorporação de fibronectina a MEC. O domínio Hep-II serve para a ligação de heparam sulfato de superfície na adesão celular à fibronectina (LEISS et al., 2008). KUSANO et al. (2000), demonstrou que células P29, de carcinoma de pulmão de Lewis, aderem a fibronectina através de integrina 5 1 e sindecam-2. Células knockdown para sindecam-2 não formaram fibras de estresse. Este estudo estabeleceu que cadeias de heparam sulfato ricas no dissacarídeo IdoA(2OS)– GlcNS(6OS) são necessárias para a interação do sindecam-2 ao domínio Hep-II da fibronectina.
1.2.4. Proteoglicanos e Glicosaminoglicanos
Proteoglicanos (PG) são macromoléculas complexas, que podem ser constituídas em até 95% ou mais por carboidratos. São substâncias polianiônicas de alto peso molecular, constituídas por pelo menos uma cadeia de glicosaminoglicano (GAG), ligado covalentemente a um esqueleto protéico. Com exceção do ácido hialurônico e do queratam sulfato, os glicosaminoglicanos são encontrados nos tecidos ligados covalentemente a um resíduo de serina do esqueleto protéico através do tetrassacarídeo: Xilose – Galactose – Galactose - Ácido glucurônico (Figura 3) formando os proteoglicanos.
SER
ASP
SER - O - GalNac
GlcN ac Gal
-Gal - AS
- N - Glc NAc - GlcNAc - Man
Man - GlcN Ac -
Man - GlcN Ac -
- O - Xil - Gal - Gal - Glc A - (CS, D S, H S ou Hep)
(KS - c artilagem)
(KS - c órnea)
Os proteoglicanos formam soluções de alta viscosidade, absorvendo grandes volumes de água. Isso lhes permite atuarem na estabilização e no suporte de elementos fibrosos e celulares dos tecidos, além de contribuírem na manutenção do equilíbrio de água e de sais do corpo (KJELLEN; LINDAHL, 1991).
São constituintes da superfície celular e matriz extracelular. Nesses compartimentos têm sido implicados em exercer importantes funções na interação célula (DIETRICH; MCDUFFIE; SAMPAIO, 1977; DIETRICH, 1984),
FIGURA 3: Região de ligação da cadeia de glicosaminoglicano ao esqueleto protéico.
matriz (Le BARON et al.,1989), organização da membrana basal (KLEINMAN et al., 1983), controle da difusão de macromoléculas (KANWAR; LINKER; FARQUHAR,1980), e também interações com uma variedade de ligantes como fatores de crescimento (GAMBARINI et al., 1993).
Segundo Dietrich (1991), os glicosaminoglicanos são cadeias polissacarídicas sintetizadas por células do tecido conjuntivo como constituintes normais de muitos tecidos. Embora sejam reconhecidas seis classes diferentes de glicosaminoglicanos, certas características são comuns. As longas cadeias heteropolissacarídicas não ramificadas são formadas, em grande parte, por unidades dissacarídicas repetidas, nas quais um dos açúcares é uma hexosamina e o outro, um açúcar não nitrogenado. A hexosamina pode ser uma glucosamina ou galactosamina (glucosamina ou D-galactosamina), e o açúcar não nitrogenado, um ácido urônico (D-glucurônico ou L-idurônico) ou um açúcar neutro, representado pela galactose (no caso do queratam sulfato). Outros constituintes comuns dos glicosaminoglicanos são grupos sulfato, ligados por ligação éster a certos monossacarídeos ou, por ligação amida, ao grupo amino de glucosamina.
As carboxilas dos ácidos urônicos e os grupamentos sulfatos contribuem para a natureza polianiônica altamente carregada dos glicosaminoglicanos. Tanto sua carga elétrica como sua estrutura macromolecular ajudam em seu papel biológico como lubrificantes e como elementos de sustentação no tecido conjuntivo (KJELLEN; LINDAHL, 1991).
A presença de glicosaminoglicanos durante o desenvolvimento embrionário, bem como sua distribuição na escala filogenética vem sendo estudada desde os anos 70 pelo nosso laboratório e estes estudos demonstraram a presença dos glicosaminoglicanos desde espongiários até mamíferos superiores, estando presentes em todos os filos que apresentem organização tissular e em quantidades variáveis de um ou mais tipos de glicosaminoglicanos (DIETRICH; MCDUFFIE; SAMPAIO, 1977; NADER; DIETRICH, 1977; SAMPAIO; DIETRICH; FILHO, 1977).
1.2.4.1. Ácido Hialurônico
O ácido hialurônico (AH) é muito diferente dos demais glicosaminoglicanos. Não é sulfatado, não é ligado covalentemente à proteína e é o único glicosaminoglicano não limitado a tecidos animais, sendo produzido também em bactérias.
É classificado como um glicosaminoglicano devido às suas similaridades estruturais com os demais polímeros, uma vez que é constituído exclusivamente por unidades dissacarídicas repetidas contendo N-acetilglucosamina e ácido D-glucurônico. Embora o hialuronato tenha a estrutura química menos complexa de todos os glicosaminoglicanos, as cadeias podem atingir pesos moleculares de 105 – 107 Da.
O alto peso molecular, o caráter polieletrolítico e o grande volume que ocupa contribuem para as propriedades do hialuronato como lubrificante e para absorver choques. Assim, é encontrado, predominantemente, no líquido sinovial, no humor vítreo e no cordão umbilical (FRASER; LAURENT, 1989).
Um dos maiores constituintes da matriz extracelular é o ácido hialurônico , este liga PGs a outras moléculas dentro de agregados macromoleculares (LAURENT; FRASER, 1992). O aumento na síntese de ácido hialurônico está associado à progressão maligna em certos tipos de tumores humanos, incluindo câncer de mama, onde o nível de AH é considerado um indicador prognóstico confiável (TOOLE, 2004).
1.2.4.2. Condroitim Sulfato
As unidades dissacarídicas repetitivas características do condroitim sulfato (CS) são constituídas por ácido -D-glucurônico unido por ligação (1-3) à N-acetilgalactosamina-O-sulfatada. A sulfatação pode ocorrer na posição 4 ou na posição 6 de N-acetilgalactosamina, havendo assim condroitim 4-sulfato e condroitim 6-sulfato (MICHELACCI; DIETRICH, 1976). São componentes proeminentes de cartilagens, tendões, ligamentos e aorta e também foram isolados de cérebro, rim e pulmão (POOLE, 1986).
O condroitim 6-sulfato parece também estar relacionado com o mecanismo de divisão celular, impedindo o contato entre as células (DIETRICH; ARMELIN, 1978; DIETRICH; MONTES DE OCA, 1978; DIETRICH, 1984), e foi observado um aumento de condroitim 6-sulfato em diversos tecidos neoplásicos (SAMPAIO; DIETRICH; FILHO, 1977; DIETRICH et al., 1978; DIETRICH et al., 1980).
1.2.4.3. Dermatam Sulfato
Dermatam sulfato (DS), anteriormente denominado condroitim sulfato B, difere dos condroitim sulfatos por apresentar, além do ácido -D-glucurônico, o ácido -L-idurônico (IdoA) ligado a um resíduo de N-acetil-galactosamina, com ligações intradissacarídicas do tipo -1,3 para o ácido glucurônico, e -1,3 para o ácido idurônico. As ligações interdissacarídicas são do tipo -1,4.
Variações no teor e na posição da sulfatação foram também observadas para o dermatam sulfatos de diferentes origens. Assim, a galactosamina que ocorre preferencialmente sulfatada em C-4 (N-acetilgalactosamina-4-sulfato) pode, também, ser sulfatada em C-6 ou em ambas posições; além disso o ácido idurônico pode ser sulfatado na posição C-2 (MALMSTROM; FRANSSON , 1971). Também foram descritas estruturas híbridas para dermatam sulfato purificados de vários tecidos de mamíferos, ficando claro que o número e a distribuição das diferentes unidades dissacarídicas ao longo da molécula varia de um DS ao outro (POBLACIÓN, MICHELACCI; 1986).
1.2.4.4. Queratam Sulfato
1.2.4.5. Heparina
A heparina (Hep) possui a maior densidade aniônica que qualquer outra macromolécula biológica conhecida (NADER et al., 1989). Apresenta resíduos de ácido idurônico (70-80%) e D-glucurônico (20-30%), com sulfatação no C2 do ácido L-idurônico (70-90%) e raramente sulfatada no ácido D-glucurônico. A glucosamina é usualmente sulfatada nas posições N- e C6 (DIETRICH, 1968; DIETRICH, 1969). As ligações intradissacarídicas são do tipo -1,4 para o ácido idurônico e -1,4 para o ácido glucurônico. As ligações interdissacarídicas são do tipo -1,4.
É um componente intracelular de mastócitos sendo capaz de ligar-se a várias proteína de MEC como fibronectina, vitronectina, laminina, colágenos e a uma série de fatores de crescimento, como EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblasts growth factor), e VEGF (vascular endothelial growth factor) (FAHAM et al., 1998; IOZZO; SAN ANTONIO, 2001).
A heparina é utilizada clinicamente desde 1936, devido ao seu potente efeito anticoagulante, na prevenção e tratamento de trombose venosa profunda (FAREED et al., 1989). Este efeito é mediado pela antitrombina, uma proteína plasmática que inibe a ação das serino-proteases da cascata da coagulação sanguínea.
1.2.4.6. Heparam Sulfato
Heparam sulfato (HS) contém vários tipos de unidades dissacarídicas formadas por ácido -D-glucurônico e -L-idurônico ligados a D-glucosamina, podendo ser N-acetilada (GlcNAc), N-sulfatada (GlcNS), N-N-acetilada 6-sulfatada (GlcNAc,6S) ou N,6-dissulfatada (GlcNS,6S). Ocorre também uma pequena proporção de resíduos de ácido
As cadeias de heparam sulfato podem estar ligadas a diferentes esqueletos protéicos, pertencentes às famílias sindecam, glipicam ou perlecam. São sintetizados pela maioria dos tipos celulares, sugerindo-se que seja, componentes universais de células animais (DIETRICH; MONTES DE OCA, 1970)
O heparam sulfato está envolvido em importantes funções como reconhecimento célula-célula e controle do crescimento celular, através da interação com fatores de crescimento, tanto em vertebrados como em invertebrados (NADER et al., 1999), como também regula importantes rotas de sinalização celular (LIN, 2004). Está presente, de um modo geral, na superfície das membranas plasmáticas, e também, na matriz extracelular; isso implica que tal molécula esteja estrategicamente posicionada para regular interações entre as células e o seu meio, que são de importância fundamental para o crescimento e desenvolvimento normal e para a manutenção de funções celulares (NADER et al., 2004).
1.3. Família dos Sindecans
O termo sindecam vem da palavra francesa syndein, originada da palavra grega
syndetikos, que significa ligar, conectar. Assim, o sindecam serviria como ponte para ligar os componentes da matriz extracelular à actina do citoesqueleto (SAUNDERS, et al., 1989). Os sindecans consistem de uma família altamente conservada de quatro membros de proteoglicanos de heparam sulfato transmembrânicos, expressos em padrões específicos durante o desenvolvimento e de acordo com o tipo celular (BERNFIELD et al., 1992, 1993; DAVID, 1993; KIM et al., 1994; CAREY, 1997; LOPES et al., 2006).
Os domínios transmembrânicos são relativamente estáveis evolutivamente, já que apenas alguns aminoácidos diferem entre vertebrados; contém regiões de interação com outras proteínas de membrana e regiões para localização em compartimentos membranosos. Os domínios citoplasmáticos possuem duas regiões invariáveis, uma região comum (C1) próxima à membrana contendo uma serina e uma tirosina, e uma região C-terminal (C2), separadas por uma região variável em comprimento e composição (V) (LOPES; DIETRICH; NADER, 2006). Os domínios citoplasmáticos de sindecans interagem com proteínas do citoesqueleto, com proteínas-quinases e com fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (Ptdlns) (KREUGER, et al., 2006).
Os sindecans são capazes de interagir com uma série de ligantes pelas cadeias de heparam sulfato. Entre esses ligantes estão os componentes da matriz extracelular (colágeno tipos I, III e V; fibronectina, trombospondina, tenascina), e os fatores de crescimento (FGF, HB-EGF, PDGF e VEGF). Os membros da família dos sindecans estão envolvidos com importantes funções celulares, incluindo proliferação celular, adesão célula-matriz e adesão célula-célula (DIETRICH, 1984; BERNFIELD et al., 1999; PORCIONATTO; NADER; DIETRICH, 1999).
Devido às suas funções, os sindecans têm sido correlacionados e amplamente estudados em diversos tipos de cânceres. A expressão do sindecam-1 encontra-se diminuída em um grande número de carcinomas escamosos, incluindo cérvix uterino, pulmão, cabeça e pescoço, gástrico, oral, mama, colorretal e tumores de fígado (HAN et al., 2004). Contudo, o oposto também parece verdadeiro: um aumento da expressão de sindecam-1 foi reportado em câncer de próstata, de pulmão, de mama e de pâncreas. Esses dados sugerem que não há uma simples correlação entre a expressão de sindecam-1 e carcinogênese, mas interações moleculares mais complexas devem estar envolvidas. Sindecam-4 tem sido extensivamente estudado quanto a seu papel em sinais de transdução via adesão focal e fibras de estresse, que dependem de dinteraçoes de seu domínio citoplasmático com proteína quinase C (PKC) e fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (LOPES; DIETRICH; NADER, 2006). Contudo, sua função em células de câncer é menos estudada. Estudos demonstram uma diminuição de sindecam-4 em células de carcinoma colorretal (PARK et al., 2002), mas pouco se conhece sobre as mudanças de expressão de sindecam-4 durante a carcinogênese.
1.3.1. Sindecam-2
Sindecam-2, também conhecido como Fibroglicam, foi originalmente caracterizado bioquimicamente como um dos principais proteoglicanos de heparam sulfato expresso na superfície de fibroblastos de pulmão (MARYNEN et al., 1989). É expresso principalmente por células mesenquimais e tem importante papel no desenvolvimento, diferenciação, organização do citoesqueleto de células tumorais, adesão e migração e organização de matriz (HAN et al., 2004).
Assim como outros sindecans, pode conectar interações com a MEC para a formação de complexos maiores na membrana plasmática e organização de filamentos de actina. O domínio citoplasmático C1 do sindecam-2 interage com proteínas da família ERM (ezrina, radixina e moesina) que estão implicados na organização do citoesqueleto cortical de actina e na ativação da quinase de adesão focal (FAK) (ESSNER et al., 2006). Esta interação permite ao sindecam-2 formar uma ligação entre o citoesqueleto e a MEC em células migratórias (Figura 6). Adicionalmente, sindecam-2 interage com moléculas de sinalização celular, como FGF-2, VEGF e
Sindecam-2 tem sido implicado em dois principais tipos de cânceres. O primeiro envolve ligação à fibronectina, formação de adesão focal e migração em células de carcinoma de pulmão de Lewis (KUSANO et al., 2000). O segundo, adesão e migração de carcinomas colorretais, onde sua expressão encontra-se aumentada de 2-5 vezes (BEAUVAIS; RAPRAEGER, 2004).
Enquanto os exatos mecanismos moleculares pelos quais o sindecam-2 medeia a tumorigênese não são totalmente elucidados, quatro importante aspectos devem ser considerados. Primeiramente, sindecam-2 coopera com integrinas na transdução de sinais. KUSANO et al., (2000) demonstraram que tanto o sindecam-2 quanto integrina 5 1 participam na formação de fibras de estresse em células P29 derivadas de carcinoma de pulmão de Lewis.
FIGURA 6: Representação esquemática da estrutura do Sindecam-2. (A) O core protéico do
Segundo, devido à suas cadeias de heparam sulfato, é capaz de ligar-se a moléculas de sinalização celular, como fatores de crescimento, que promovem a proliferação de células de câncer. Além disso, o sindecam-2 pode regular a atividade de proteínas secretadas, como metaloproteinases, que têm importante função na metástase tumoral (MUNESUE et al., 2007).
Em terceiro, a expressão aumentada de sindecam-2 poderia gerar novos ligantes solúveis através do desprendimento (shedding) de seu domínio extracelular (HAN et al., 2004). Este domínio solúvel poderia ligar-se a receptores carcinogênicos, bem como a diversas proteínas e fatores de crescimento. Por último, sindecam-2 pode cooperativamente regular a tumorigênese através de mecanismos genéticos sabidamente importantes no carcinoma colorretal, como as cascatas que envolvem Wnt, K-ras,
TGF-e p53. SindTGF-ecam-2 podTGF-e atuar como um corrTGF-ecTGF-eptor para um dos rTGF-ecTGF-eptorTGF-es dTGF-e membrana envolvido no câncer.
1.4. Câncer Colorretal
O câncer colorretal abrange tumores que atingem o cólon (intestino grosso) e o reto. Tanto homens como mulheres são igualmente afetados, sendo uma doença tratável e freqüentemente curável quando localizada no intestino (sem extensão para outros órgãos).
Segundo o INCA (Instituto Nacional de Câncer), o número de casos novos de câncer de cólon e reto estimados para o Brasil no ano de 2008 é de 12.490 casos em homens e de 14.500 em mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado de 13 casos novos a cada 100 mil homens e 15 para cada 100 mil mulheres. O câncer de cólon e reto em homens é o terceiro mais freqüente na região Sudeste. Nas regiões Sul e Centro-Oeste ocupa a quarta posição. Nas regiões Nordeste e Norte, ocupam a quinta e sexta posição, respectivamente. Para as mulheres é o segundo mais freqüente na região Sudeste, o terceiro mais freqüente nas regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste, enquanto na região Norte é o quinto mais freqüente.
sedentarismo. Também são fatores de risco doenças inflamatórias do cólon como retocolite ulcerativa crônica e Doença de Cronh; algumas condições hereditárias (Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) e Câncer Colorretal Hereditário sem Polipose (HNPCC).
O diagnóstico da doença é feito através de biópsia endoscópica com estudo histopatológico. A cirurgia é o seu tratamento primário, retirando a parte do intestino afetada e os linfonodos próximos a esta região. Após o tratamento cirúrgico, a radioterapia associada ou não à quimioterapia é utilizada para diminuir a possibilidade da volta do tumor (recidiva).
O câncer colorretal possui genes críticos já bem estabelecidos: 40% têm uma mutação pontual específica em K-Ras, 60% têm mutações inativadoras ou deleção em p53, e mais de 60% tem mutação no gene supressor de tumor APC. Trabalhos adicionais têm revelado como estes genes levam a uma divisão celular incontrolada e à metástase (HAN et al., 2004).
Encontram-se disponíveis conjuntos para dosagem em soro periférico de CEA, CA 242, CA 19-9 e CA 72-4. Por imunohistoquímica podem ser determinados no tecido: proteína p53, angiogênese, c-erbB-2, E-caderina, DCC e Bcl-2, relevantes como marcadores tumorais. São diversas as pesquisas atuais em torno de substâncias que poderão constituir eficientes marcadores tumorais no câncer colorretal (telomerase; CD44; metaloproteinases; c-erbB, E-caderina, Bcl), dosados no soro periférico ou nos tecidos do paciente (BAKER et al., 2000; WIELENGA et al., 2000). Estudos clínicos não demonstraram até o momento marcador perfeitamente eficaz; no entanto, é possível que o marcador ideal se encontre entre as substâncias em estudo.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Analisar a síntese de glicosaminoglicanos e proteoglicanos em linhagens de câncer colorretal (Caco-2 e HCT-116), durante a interação com a matriz extracelular de fibroblastos, e correlacionar esses compostos com os fenômenos envolvidos na tumorigênese, como proliferação e adesão celulares.
2.2. Objetivos Específicos
- Verificar o crescimento de células de carcinoma colo-retal na presença de matriz extracelular estromal;
- Analisar a expressão gênica de proteoglicanos de superfície e de matriz extracelular em células de câncer colo-retal durante interação com matriz extracelular estromal; - Confirmar o efeito da matriz extracelular estromal na síntese de sindecam-2 na linhagem HCT-116;
- Avaliar a localização de sindecam-2 na linhagem de câncer colo-retal HCT-116, bem como sua co-localização com proteínas de matriz extracelular;
3.
MATERIAL
3.1. Linhagens celulares
Para os estudos realizados no presente trabalho, foram utilizados:
Linhagem Caco-2
ATCC® número: HTB-37™
Organismo: Homo sapiens (humano) Morfologia: epitelial
Órgão: cólon
Doença: adenocarcinoma colorretal
Linhagem HCT-116
ATCC® número: CCL-247™
Organismo: Homo sapiens (humano) Morfologia: epitelial
Órgão: cólon
Doença: carcinoma colorretal
Fibroblastos
Cultura primária (gentilmente cedida pelo Dr. Walter Pinto Júnior)
Organismo: Homo sapiens (humano) Morfologia: fibroblastos
3.2. Meios de cultura, tampões e soluções
Para o cultivo das linhagens, Caco-2 e fibroblastos, foram utilizados:
Meio de cultura DMEM - Mistura de nutriente, com L-glutamina, sem bicarbonato de sódio (Gibco Life Technologies, Rockville, MD, EUA). O meio DMEM foi acrescido de 3,7g/l de bicarbonato de sódio e 2,6 g/l de HEPES;
Penicilina/Estreptomicina - liofilizada em pó, sendo respectivamente 10.000U e 10mg/ml, em solução de cloreto de sódio 0,9% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA);
10% soro fetal bovino (SFB) (Cultilab Mat Cult Cel Ltda - Campinas/SP). Para o cultivo da linhagem HCT-116 foram utilizados:
Meio de cultura RPMI - Mistura de nutriente, com L-glutamina, sem bicarbonato de sódio (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, EUA). O meio RPMI foi acrescido de 2,4g/l de bicarbonato de sódio e 2,6 g/l de HEPES; Penicilina/Estreptomicina - liofilizada em pó, sendo respectivamente 10.000U e 10mg/mL, em solução de cloreto de sódio 0,9% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA);
10% de soro fetal bovino (Cultilab Mat Cult Cel Ltda - Campinas/SP). Outras soluções utilizadas para o cultivo das células
Solução EBSS (solução salina balanceada de Earle sem cálcio e sem magnésio) preparada em nosso laboratório, contendo NaCl 116mM; KCl 5mM; Na2HPO4 8mM; KH2PO4 1,46mM; NaH2PO4.1H2O 1mM; NaHCO3
8mM (todos da Merck, Darmastadt, Alemanha); D-glucose 1% e vermelho de fenol 0,01% (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, EUA) em um litro de água destilada, previamente passada em sistema Milli-Q (Millipore, MA, EUA);
PBS "phosphate buffered saline" 0,1M preparado em nosso laboratório, utilizando NaCl 137mM; Na2HPO4 15,22mM, KH2PO4 1,5mM e KCl
Laminina foi purificada a partir de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) de camundongos segundo Kleinman, (1998);
Fibronectina foi purificada a partir de plasma humano segundo Akiyama et al., (1989);
Colágeno tipo I foi adquirido comercialmente da Sigma Chamical Co. (St. Louis, USA).
3.3. Enzimas
Maxatase - protease alcalina P126 (Biocon do Brasil Indústria Ltda - RJ, Brasil);
Solução Tripsina/EDTA em PBS – 0,2% de tripsina , 0,02 % de EDTA e vermelho de fenol (Cultilab Mat Cult Cel Ltda - Campinas/SP)
3.4. Radioisótopos
[35S]-sulfato de sódio livre de carregador do Laboratório de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN, São Paulo, SP, Brasil) – Registro da Comissão de Energia Nuclear processo nº. 104.695/70 (matrícula 12679) – validade: 31/05/2010. Número de registro HBN AP- 0842.
3.5. Anticorpos e marcadores fluorescentes
3.5.1. Anticorpos primários
Anticorpo policlonal anti-Sindecam-2 humano produzido em coelho (Santa Cruz);
Anticorpo monoclonal anti-Versicam humano (large PG - 270428) produzido em camundongo (Seikagaku);
Anticorpo policlonal anti-Fibronectina humana produzido em cabra ou camundongo (Santa Cruz).
3.5.2. Anticorpos secundários
Anticorpos anti-IgG de camundongo, coelho ou cabra produzidos em burro e conjugados com Alexa 594 ou Alexa 488 (Molecular Probes Eugene, OR, EUA).
3.5.3. Marcadores Fluorescentes
Faloidina - toxina produzida pelo cogumelo Amanita faloide, que se liga especificamente aos filamentos de actina (F-actina). Faloidina conjugada com Alexa 488 (Molecular Probes Eugene, OR, EUA).
DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindole, dihidrocloride) - para visualização dos núcleos celulares (Molecular Probes Eugene, OR, EUA);
3.6. Corantes
3.6.1. Coomassie Brilliant Blue G
Foi utilizado para a quantificação de proteínas em solução (SPECTOR, 1978). O reagente foi preparado em nosso laboratório, Coomassie Brilliant Blue G 117µM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA), etanol 4,8% e ácido fosfórico 8,5% (Merck, Darmstadt, Alemanha) diluídos em água destilada.
3.6.2. Azul de Toluidina
Fair Lawn, NY, EUA), etanol 50% e ácido acético 1% diluídos em água destilada, o excesso de corante foi removido pela mesma solução, sem o corante.
3.7. Glicosaminoglicanos padrões
Heparam sulfato purificado de pâncreas bovino como descrito por Dietrich e Nader (1974);
Condroitim 4-sulfato e condroitim 6-sulfato, extraídos respectivamente de cartilagem de baleia e de tubarão (Seikagaku, Kogyo Co, Tóquio, Japão); Dermatam sulfato, extraído de mucosa intestinal bovina (Opocrin Laboratories, Modena, Itália).
3.8. Outros materiais
Agarose (BioRad Laboratories, Inc.Richmond, CA, EUA);
Albumina sérica bovina (BSA) Fração V (Sigma Chemical Co.St. Louis, MO, EUA);
Brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON) (Merck Darmstadt, Alemanha);
Câmara de Neubauer (Abbott);
EDTA - Etilenodiamino tetracetato (Sigma Chemical Co.St. Louis, MO, EUA);
Etanol absoluto (Merck Darmstadt, Alemanha);
Sistema de filtração para 500mL com membrana de acetato de celulose 0,22µm, Modelo 25942, da (Corning Laboratory Sciences Co., NY, EUA); Formaldeído 20% em ampola (Electron Microscopy Science Ft. Washington, PA, EUA);
Glicina (Merck Darmstadt, Alemanha);
Lamínulas para cultivo de células com 12mm de diâmetro (Glastécnica, São Paulo, SP, Brasil);
Líquido de cintilação: Ultima Gold (Packard Instruments Company Inc.Downers Grove, IL, EUA);
Meio de montagem aquoso Fluoromount-G (Electro Microscopy Sciences, Ft. Washington, PA, EUA);
Membrana de diálise Spectrapor com poro de 6000 a 8000 kDa (Spectrum Medical Industries, Houston, TX, EUA);
Papéis Whatman nº 1 e 3MM (W & R Balston Ltda, Inglaterra);
Placas de cultura, “multiwell” de 6, 24 e de 96 poços (Nalge Nunc International Corporation Naperville, IL, EUA);
Placas para cultura de poliestireno de 35x10mm e 60x10mm (Falcon, New Jersey, EUA);
Saponina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA);
Tubos para centrífuga de 15 ou 50mL estéreis (Corning Laboratory Sciences Co., NY, EUA);
Unidade filtrante para seringa com membrana de acetato de celulose 0,22 m (Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA);
Amicon Ultra-15 unidade filtrante para centrifugação com membrana de celulose para 10.000Da (Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA);
Uréia ultrapura (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA);
3.9. Aparelhos
Além dos aparelhos usuais de laboratório foram utilizados:
Agitadores: Vortex-Genie 2 modelo G250 (Scientific Industries Bohemia, NY, EUA) e Corning Stirring Plate (Corning, NY, EUA);
Câmaras para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e col. (1968), manufaturado pela (Técnica Permatron Ltda São Paulo, SP, Brasil);
Centrífuga de eppendorf modelo 5415C (W Brinkman Instruments, Inc. estbury, NY, EUA);
CycloneTM Sistema de estoque de fósforo (Packard Instrument Company Meriden, CT, EUA), com software OptiQuantTM, para análise de imagem; Contador de cintilação TRI-CARB 2100TR (Packard Meriden, CT. EUA); Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, EUA); Espectrofotômetro Spectronic 2000 (Baush & Lomb Rochester, NY, EUA) e Espectrofotômetro U-2000 Hitashi (Tóquio, Japão);
Estufa (Soc. FABBE Ltda, São Paulo, SP, Brasil); Fluxo laminar horizontal (Vecco, Campinas, SP, Brasil);
Fontes de corrente contínua e reguláveis desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP, Brasil);
Incubadora de CO2 modelo 315 acoplada a torpedos de CO2 pelo Gas Guard
modelo 3030 (Forma Scientific Marietta, OH, EUA);
Lâmpada de U.V. de alta intensidade modelo UVG-11 (Ultra-Violet Products Inst. San Gabriel, CA, EUA);
Leitor de ELISA EXL800, Universal Microplat Reader (Bio-TEK Instruments, Inc.);
Medidor de pH modelo 125, da (Corning Laboratory Sciences Co., NY, EUA);
Microagitador magnético modelo PC-161 (Corning Laboratory Sciences Company, NY, EUA);
Microscópio invertido de campo claro e contraste de fase, modelo TE-100, com câmera fotográfica digital acoplada, modelo Coolpix 990, ambos (Nikon, Nippon Kogakuk Tóquio, Japão);
Microscópio de Fluorescência Nikon Eclipse E600 (Nikon, Nippon Kogakuk Tóquio, Japão);
Microscópio confocal de varredura a laser LSM-510 NLO (Zeiss Carl, Jena, Alemanha).
Citômetro de fluxo FACsCalibur (Becton Dickinson, CA, USA).
4.
MÉTODOS
4.1. Cultura de Células
4.1.1. Cultura das linhagens Caco-2, HCT-116 e fibroblastos
Células da linhagem Caco-2 e fibroblastos foram mantidos em meio DMEM enriquecido com 10% de SFB a 37°C sob tensão de 5% de CO2. A linhagem HCT-116 foi mantida sob as mesmas condições descritas acima, porém em meio RPMI. Para o subcultivo, placas de 60x10mm (Falcon, New Jersey, EUA) de células confluentes foram lavadas com uma solução de EBSS para total remoção do SFB. Em seguida, foi adicionada solução de Tripsina/EDTA em PBS – 0,2% de tripsina, 0,02 % de EDTA. As placas foram mantidas no fluxo laminar de 3 a 4 min. para que as células se desprendessem.
4.1.2. Preparo de matriz extracelular estromal
Fibroblastos foram plaqueados em placas de Petri de 35mm de diâmetro (5.105
células/ml meio) e cultivados durante 3 dias. As células foram então lavadas com EBSS e mantidas durante 20 min. em PBS contendo 0,025% de EDTA, para que se desprendessem mantendo a matriz extracelular (SOBUE et al., 1983). As células soltas foram aspiradas e as placas foram lavadas gentilmente 3 vezes com EBSS e monitoradas em microscópio óptico, para garantir que todas as células foram removidas. As linhagens de câncer colorretal foram então cultivadas na presença de MEC dos fibroblastos durante 3 dias. Como controle, utilizou-se células cultivadas em placa de cultura na ausência da MEC.
4.2. Marcação Metabólica de Glicosaminoglicanos Extraídos das Linhagens Celulares
4.2.1. Incorporação de [35S]-Sulfato de sódio para Análise Estrutural de Glicosaminoglicanos
As linhagens de câncer colorretal foram cultivadas em um número de 3x105 células, em placas de Petri de 35mm de diâmetro (grupos controle e com MEC estromal) por 3 dias, até atingirem subconfluência. Para a marcação metabólica, realizada do 3° para o 4° dia de cultivo, as células foram lavadas 3 vezes com EBSS e a seguir foi adicionado meio de marcação. O meio de marcação continha [35S]-sulfato de
sódio em uma concentração final igual a 100µCi/ml com SFB previamente dialisado contra NaCl 0,15M em membrana de diálise Spectrapor com poro de 6000 a 8000kDa (Spectrum Medical Industries, Houston, TX, EUA). As células foram mantidas por 24h a 37oC sob tensão de 5% de CO2. Após o tempo de incubação, o meio foi removido e
separada para a dosagem de proteínas, utilizando-se o reagente Coomassie Brilliant Blue G (SPECTOR, 1978).
Dessa forma foram obtidas as marcações metabólicas com [35S]-sulfato de sódio da célula, meio de cultura e matriz extracelular das linhagens estudadas.
4.2.2. Extração de GAGs marcados metabolicamente com [35S]-sulfato de sódio
Após a marcação metabólica, o extrato celular, o meio de cultura e a matriz extracelular foram submetidos à proteólise com Maxatase (4mg/ml em Tris-HCl 50mM, pH 8.0 contendo 1,5mM NaCl) a 60ºC por 24h. Após a proteólise as amostras foram centrifugadas a 5.000xg por 15min. para remoção de material insolúvel. Após a centrifugação, acrescentou-se HS padrão (100 g) como carrier e adicionou-se 3 volumes de etanol ao sobrenadante e as amostras foram mantidas a -20ºC por 24h. Os glicosaminoglicanos precipitados por etanol foram coletados por centrifugação a 5.000xg por 30min. Em seguida, os GAGs foram analisados por eletroforese em gel de agarose em tampão PDA.
4.2.3. Eletroforese em gel de agarose
de azul de toluidina 0,1% (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NY, EUA) em ácido acético 1% e etanol 50% por 15min., o excesso de corante foi removido por uma solução de ácido acético 1% em etanol 50%, a seguir os géis foram secos à temperatura ambiente. Depois de secos os géis foram expostos a um filme radiosensível
Multipurpose (Packard Instruments Co.) por 24h e submetidos à varredura em um sistema de análise de imagem.
4.2.4. Quantificação dos GAGs marcados metabolicamente
Os GAGs marcados com [35S]-sulfato de sódio foram identificados em sistema de análise de imagem, Cyclone® (Storage Phosphor System –Packard Instr.), “scanner” de radioatividade, que realiza a leitura de um filme ao qual os géis ficam expostos por tempos variáveis, dependendo dos níveis de radioatividade das amostras. A quantificação dos compostos marcados com o radioisótopo foi realizada com o “software” Opti Quanti®.
A quantidade total de cpm de cada amostra foi calculada com base nos valores obtidos para a alíquota submetida à eletroforese. A concentração de proteína de cada amostra foi determinada em uma alíquota do extrato celular utilizando-se o método de dosagem por Coomassie Blue segundo descrito por Spector (1978).
4.3. Western Blotting de Proteínas de MEC Estromal
Para obtenção de proteínas de MEC estromal, fibroblastos foram cultivados em placas de cultura até a confluência e removidos com EDTA 0,025%. A MEC remanescente na placa foi raspada em PBS como auxílio de “scrappers” e as proteínas foram concentradas por centrifugação a 4oC em tubos com membranas de poros 10.000 Da (Millipore).
eletroforética, as proteínas do gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose em sistema úmido, em tampão Tris 25mM, glicina 200mM e metanol 4% a 400 mA por 2h.
Após a transferência das proteínas, a membrana de nitrocelulose foi incubada em solução de leite desnatado 2,5% em TBS (0,1M pH 7,4) sob agitação branda por 2h a temperatura ambiente, a fim de bloquear os sítios inespecíficos da membrana. Esta foi então incubada overnight a 4oC com anticorpo primário anti-Fibronectina humana produzido em camundongo (1:1000), diluído em TBS com BSA 1%.
A seguir foram realizadas lavagens sucessivas com TBST (Tween 0,05%) antes da incubação com o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase (1:2000), diluído em TBS com BSA 1% por 1h a temperatura ambiente. Após lavagens sucessivas, a membrana foi incubada no escuro em solução de DAB (3,3’-diaminobenzidine) 0,05mg/ml em PBS na presença de NiCl2 0,2% por 15 min.
Posteriormente, adicionou-se 1 l de H2O2 porml de solução até a revelação das bandas.
A reação foi interrompida lavando-se a membrana com água.
4.4. Curva de Crescimento celular (ensaio com MTT)
4.5. Ensaio de Adesão Celular
4.5.1. Placas recobertas por proteínas de matriz
Placas de Petri foram previamente recobertas com proteínas de matriz extracelular: colágeno I (50 g/ml), laminina (50 g/ml), ou fibronectina (50 g/ml), diluídas em PBS e esterilizadas antes do uso. As placas permaneceram na estufa a 37o C, sob tensão de 5% CO2, por 2 horas. Posteriormente, as placas foram mantidas a 4o C,
por 12 horas, até o momento do ensaio.
No momento do ensaio, a solução de PBS foi aspirada da placa e esta foi lavada com PBS estéril. Os sítios de ligação inespecífica foram então bloqueados pela incubação com 1% de BSA em PBS por 1 hora em estufa, nas mesmas condições citadas acima. Como controle, foram utilizadas placas não recobertas com proteínas de matriz, contendo apenas solução de BSA 1%.
Ao final, células da linhagem HCT-116 foram tripsinizadas e plaqueadas em uma concentração de 2.105 células/ml meio e mantidas por diferentes tempos em estufa. Após os períodos de incubação, as células foram submetidas a ensaio de citometria, conforme descrito posteriormente.
4.5.2. Bloqueio de Sindecam-2
Placas multiwell com 24 poços foram recobertas com MEC estromal, conforme descrito anteriormente. Células HCT-116 foram tripsinizadas e pré-incubadas com anticorpo Anti-Sindecam-2, IgG (grupo controle) ou na ausência de anticorpos, durante 1 hora a 37ºC sob tensão de 5% CO2. As células foram então plaqueadas em uma
4.6. Imunocitoquímica
Para o preparo da MEC estromal, fibroblastos foram cultivados sobre lamínula circular de 12mm de diâmetro durante 3 dias, como mencionado em Métodos acima. Após a obtenção da matriz, células da linhagem HCT-116 foram cultivadas sobre as lamínulas em uma concentração de 1x105 células/ml meio, a 37ºC sob tensão de 5% de CO2, por 4 dias. Os controles foram cultivados sob as mesmas condições, porém na
ausência da MEC.
4.6.1. Marcações Externas
Após esse período de cultivo, o meio foi removido e as células lavadas 5 vezes em meio DMEM na ausência de SFB. A seguir, as células foram incubadas com anticorpo primário, em PBS [1x] contendo 5% de SFB por 1h a 4ºC. Ao final da incubação, as células foram lavadas por cinco vezes em PBS e então fixadas em formaldeído 2% em PBS por 30 min. à temperatura ambiente. Após a fixação, as células foram lavadas 2 vezes em PBS, e uma vez em PBS contendo 0,1M de glicina (para bloquear os radicais aldeídicos) e 2 vezes em PBS. Posteriormente, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com marcador fluorescente, diluído 1:200 em PBS, previamente centrifugado 10min. a 10.000rpm a 4ºC (anticorpos primários e secundários utilizados estão descritos em materiais). A incubação do anticorpo secundário foi realizada por 40min. no escuro. A seguir, as células foram lavadas cinco vezes em PBS.
4.6.2. Marcações Internas
4.6.3. Coloração do núcleo
Para os ensaios descritos acima, as células foram incubadas com DAPI 1:1.000 em PBS com 0,01% de saponina por 15min., com o objetivo de visualizar os núcleos celulares.
A seguir, as lamínulas foram lavadas 5 vezes em PBS, mergulhadas rapidamente em água bidestilada e montadas em lâminas histológicas com Fluormont G.
4.6.4. Controles
Os controles para os experimentos de imunomarcação foram realizados omitindo-se o anticorpo primário.
4.6.5. Observação do material
As lâminas foram observadas e analisadas em microscópio de fluorescência Nikon E–600 e em microscópio confocal LSM – 510 NLO (Zeiss, Alemanha).
4.7. Ensaio de Citometria
As células foram cultivadas e extraídas com EDTA 0,025% em PBS. Para cada amostra, foram utilizadas 106 células. Depois de extraídas, as células foram lavadas com PBS e fixadas com 2% de paraformaldeído em PBS por 30 min. As células foram lavadas com glicina 0,1% e permeabilizadas em saponina 0,01%, ambas diluídas em PBS.
