Influenza em animais heterotérmicos
Influenza in heterothermics
Dalva Assunção Portari Mancini¹, Rita Maria Zucatelli Mendonça¹, Aurora Marques
Cianciarullo², Leonardo Setsuo Kobashi², Hermínio Gomes Trindade¹,
Wilson Fernandes³ e José Ricardo Pinto¹
RESUMO
O o b je ti vo f o i p e sq u i sa r Or to myxo vir us e m a n i m a i s h e te ro té rm i c o s. Co le to u - se sa n gu e d e se rp e n te s d o s gê n e ro s B o thr o ps e Cr o talus e d e sa p o e rã s d o s gê n e ro s Bu f o e Ra n a , p a ra a d e te c ç ã o d o s re c e p to re s d e h e m á c i a s e a n ti c o rp o s e sp e c í f i c o s, a o ví ru s i n f lu e n za , p e lo s te ste s d e h e m a glu ti n a ç ã o e i n i b i ç ã o d a h e m a glu ti n a ç ã o , re sp e c ti va m e n te . Pe lo te ste d e h e m a glu ti n a ç ã o , ve ri f i c o u - se q u e se rp e n te s e sa p o s e m c a ti ve i ro a p re se n ta ra m re c e p to re s e m su a s h e m á c i a s p a ra o ví ru s i n f lu e n za , h u m a n o e e q ü i n o d o ti p o A e ti p o B. O m e sm o o c o rre u c o m se rp e n te s re c é m c h e ga d a s. Qu a n to a o te ste d e i n i b i ç ã o d a h e m a glu ti n a ç ã o d o s so ro s d o s ré p te i s o b se rvo u - se tí tu lo s p ro te to re s d e a n ti c o rp o s a o s ví ru s i n f lu e n za ti p o A ( o ri ge n s h u m a n a e e q ü i n a ) e ti p o B. Co m so ro d e sa p o n ã o se o b se rvo u re a ç ã o d e i n i b i ç ã o d a h e m a glu ti n a ç ã o p o ré m , 8 3 ,3 % d a s rã s o b ti ve ra m m é d i a s d e 4 0 UIH p a ra a lgu m a s c e p a s. Co n c lu i - se q u e a n i m a i s h e te ro té rm i c o s p o d e m o f e re c e r c o n d i ç õ e s d e h o sp e d e i ro s a o s ví ru s i n f lu e n za , a ssi m c o m o su sc e p ti b i li d a d e à i n f e c ç ã o .
Pal avr as-chave s: Orto m yx o vi ru s. An i m a i s h e te ro té rm i c o s. Re c e p to re s. An ti c o rp o s e sp e c í f i c o s. Ví ru s i n f lu e n za .
ABSTRACT
Th e o b je c ti ve wa s to stu d y Or tho myxo vir us i n h e te ro th e rm i c a n i m a ls. Blo o d sa m p le s f ro m sn a k e s ( ge n u s B o thr o ps a n d Cr o talus) a n d f ro m to a ds a n d f ro gs ( ge n u s Bu f o a n d Ra n a ) we re c o lle c te d to e va lu a te the re d c e ll re c e pto rs a n d a n ti b o di e s sp e c i f i c to i n f lu e n za vi ru s b y th e h e m a gglu ti n a ti o n a n d h e m a gglu ti n a ti o n i n h i b i ti o n te sts, re sp e c ti ve ly. Bo th sn a k e s a n d to a d s k e p t i n c a p ti vi ty p re se n te d re c e p to rs i n th e i r re d c e lls a n d a n ti b o d i e s sp e c i f i c to e i th e r i n f lu e n za vi ru s typ e A ( h u m a n a n d e q u i n e o ri gi n ) o r i n f lu e n za typ e B. Th e sa m e wa s o b se rve d wi th re c e n tly c a p tu re d sn a k e s. Co n c e rn i n g th e i n f lu e n za he m a gglu ti n a ti o n i n hi b i ti o n a n ti b o di e s pro te c ti ve le ve ls we re o b se rve d i n the re pti le s’ se ru m , a ga i n st i n f lu e n za typ e A a n d typ e B. Un li k e th e to a d s, 8 3 .3 % o f th e f ro gs p re se n te d m e a n le ve ls o f Ab 4 0 HIU f o r so m e i n f lu e n za stra i n s. It wa s c o n c lu d e d th a t h e te ro th e rm i c a n i m a ls c o u ld o f f e r h o st c o n d i ti o n s to th e i n f lu e n za vi ru s a n d a lso su sc e p ti b i li ty to th e i n f e c ti o n .
Ke y-words: Orth o m yx o vi ru s. He te ro th e rm i c a n i m a ls. Re c e p to rs. Sp e c i f i c a n ti b o d i e s. In f lu e n za vi ru s.
1 . Lab o r ató r io de Vir o lo gia do Instituto B utantan, São Paulo , SP. 2 . Lab o r ató r io de Ge né tic a do Instituto B utantan, São Paulo , SP. 3 . Lab o r ató r io de He r pe to lo gia do Instituto B utantan, São Paulo , SP.
En de r e ço par a cor r e spon dê n ci a: Dr a. Dalva Assunç ão Po r tar i Manc ini. Divisão de De se nvo lvime nto Cie ntífic o /Lab o r ató r io de Vir o lo gia/IB . Av. Vital B r asil 1 5 0 0 , 0 5 5 0 3 -9 0 0 São Paulo , SP.
Te l: 5 5 1 1 3 7 2 6 - 7 2 2 2 r amal 2 1 5 2
e - mail: lab vir o l@ b o l. c o m. b r - dapmanc ini@ b utantan. go v.b r. Re c e b ido par a pub lic aç ão e m 8 /2 /2 0 0 3
Ac e ito e m 2 7 /2 /2 0 0 4
Par a me lho r e nte ndime nto so b r e a funç ão do r e c e pto r c e lular no r e c o nhe c im e nto do vír us i n f lu e n za, tê m sido de se nvo lvidas pe sq uisas r e lac io nadas a e spe c ific idade de
ligaç ão de sse vír us iso lado de vár ias e spé c ie s animais7 1 0 1 1.
B o s s a r t e c o ls4 ve r ific a r a m a tr a vé s da m ic r o s c o p ia eletrônic a, os fenômenos c onhec idos de adsorç ão ( através da
hemaglutinina) e subseqüente eluiç ão ( pela neuraminidase) do vírus in flu e n za sobre a membrana de e r itr ó c ito s de ave e
de hum ano . Essa inte r aç ão do vír us à c é lula ve r m e lha é
c o mpar ado ao que o c o r r e às c é lulas ho spe de ir as.
Os vírus in flu e n za tipo A mostram habilidade, entre seus subtipos, de ligaç ão aos rec eptores através dos terminais dos
ác idos siálic os, c ontendo oligossac arídeos, mas, são distintos quanto à espec ific idade de rec eptor, o que provavelmente os
diferenc ia quanto à virulênc ia aos hospedeiros5 6. Quanto ao
rec eptor possessing c ells ( VRPC) enc ontradas nos aparelhos
digestivo e respiratório, das aves e mamíferos, respec tivamente, é que são o fato r de te r minante na e spe c ific idade de te c ido e
da c lasse de ho spe de ir o s1 1 1 2.
Matr o so vic h e c o ls1 5 de mo nstr ar am que a e spe c ific idade
a r e c e pto r e s da c é lula po de r á não r e str ingir a tr ansmissão
ave -humano , mas sim a o utr as e spé c ie s, c o mo fito de utilizá-las c o mo ho spe de ir o s inte r me diár io s.
De ac o r do c o m o c o nhe c ime nto da ativaç ão pr o te o lític a
s o b r e a a tivida de de fus ã o e da in fe c tivida de do s vír us
e nve lo pado s, e studo s c o mpr o var am a impo r tânc ia da aç ão pr o te o lític a so b r e r e c e pto r e s de ste s vír us. A tr iptase CLARA e TL2 são ativado r e s do s vír us i n f lu e n za, Se n d ai, e do HIV, so b r e as c é lulas do tr ato r e spir ató r io e das c é lulas humanas
CD4 e T, respec tivamente. Inibido res da pro tease enc o ntrado s
ta n to n o m uc o h um a n o , c o m o n o s ur fa c ta n te pulm o n a r inativar am e sse s vir us i n vi tro3.
As r e ac tive o xyge n spe c ie s ( ROS) tamb é m são r e latadas
c o mo par tic ipante s no pr o c e sso de pato ge nia vir al, atuando
n a a tiva ç ã o do s fa gó c ito s q ue s e a s s o c ia m a o e s tr e s s e
o xidativo1 7 .
E s s e s r e l a to s d e e s tu d o s o b r e a i n te r a ç ã o d a he maglutinaç ão ( HA) do vír us i n f lu e n za ao s r e c e pto r e s das
c élulas fo ram verific ado s em ho spedeiro ho meo térmic o s, mas
n ã o fo r a m e n c o n tr a d o s e s s e s ti p o s d e r e l a to s c o m
he te r o té r mic o s.
A l i te r a tu r a te m r e p o r ta d o a i n c i d ê n c i a d e ví r u s r e s pir a tó r io s da fa m ília Pa r a m i x o vi r i d a e, e m a n im a is he te r o té r mic o s ( r é pte is)1 2 9 1 6.
Assim, c o m b ase na lite r atur a, e ste tr ab alho inve stigo u a inc idê nc ia de vír us da família Orth o m yx o vi ri d a e, do gê ne r o In f lu e n za vi ru s em serpentes e anuro s, mantido s em c ativeiro o u c aptur ado s r e c e nte me nte do hab itat natur al, c o m o b j e tivo
de identific aç ão de o utro s ho spedeiro s que po ssam c o labo rar
na e c o lo gia da influe nza, po r me io da adaptaç ão do vír us
ao s r e c e pto r e s das c é lulas de animais ainda não c o nhe c ido s
c o mo par tic ipante s no pr o c e sso de tr ansmissão de ssa vir o se .
MATERIAL E MÉTODOS
Animais heter otér micos. Serpentes adultas do s gênero s Bo th ro p s e Cro ta lu s alime ntadas c o m c amundo ngo s, se ndo
3 mantidas e m c ative ir o e m c aixas de made ir a te ladas e 6
e xe m pla r e s r e c é m c a ptur a do s do ha b ita t, o r iginá r ia s de
dife r e nte s r e giõ e s do Estado de São Paulo .
An fíb io s a n ur o s , 1 0 a n im a is do gê n e r o Ra n a, Ra n a
c a te s b e i a n a, po pula r m e n te c o n h e c ida c o m o r ã to ur o ,
o r iginár io s de r anár io da r e gião de Mo gi das Cr uze s, São
Paulo , 4 animais da me sma família, o r iginár io s de r anár io
da r egião de São Jo ão No vo , São Paulo e um animal do gêner o
B u f o, B u f o p a r a c n e m i s, m a n ti do e m c a ti ve i r o , to do s
alimentado s c o m r aç ão pr ó pr ia par a a espéc ie c o ntendo 4 0 %
de pr o te ína b r uta.
Co le ta d e s a n gu e . As a m o s tr a s de s a n gu e fo r a m c oletadas c om seringa e agulha desc artável, aproximadamente
0 , 5 mL de c ada animal, apó s pr é via de sinfe c ç ão lo c al e a
de vida c o nte nç ão do animal. O sangue fo i c o le tado da ve ia
c audal das se r pe nte s e punç ão c ar díac a do s anfíb io s anur o s.
Os anfíb io s anur o s fo r am ane ste siado s c o m b e nzo c aína
e m do sage m de 4 g da dr o ga pr é -diluída e m 4 0 mL de álc o o l
e tílic o PA se ndo no vame nte diluída e m 2 0 l de água, fic ando
o s animais ane ste siado s po r apr o ximadame nte 1 0 minuto s,
q uando pr o c e de u-se a c o le ta, se ndo o s animais mantido s
vivo s par a o utr as atividade s.
Para pesquisa de antic orpos, o sangue foi c oletado sem
antic oagulante e para o teste de hemaglutinaç ão, o sangue foi
c oletado c om o antic oagulante ALSEVER na proporç ão V/V.
Pr epar o das hemácias. Em tubo de c entrífuga c o ntendo a p r o x i m a d a m e n te 1 m L d e h e m á c i a s , fo i a d i c i o n a d o
apr o ximadamente 5 ml de so luç ão tampão PB S e c entr ifugado
a 7 0 0 r pm po r 1 0 minuto s. O so b r e nadante fo i de spr e zado e
adic io nado um me smo vo lume de PB S c o m le ve agitaç ão . A
o pe r aç ão fo i r e pe tida po r mais tr ê s ve ze s. No último c ic lo fo i
d e s p r e za d o o P B S , d e i x a n d o a p e n a s o s e d i m e n to d a s
he mác ias. A suspe nsão de he mác ias fo i de 0 ,5 % e m so luç ão
tampão fo sfato ( PB S) .
Re mo ç ã o de a ntic o r po s ine s pe c ífic o s do s o r o . Pr e par o do caol i m : fo i fe ita uma suspe nsão de Cao lim 2 0 % em água b idestilada, e apó s ho mo geneizaç ão fo i deixada
e m r e po uso a 4 ° C po r 2 4 h. Passado e ste pe r ío do , de sc ar to
u-se o so brenadante u-sendo substituído po r igual vo lume de água
bidestilada, c o m no va ho mo geneizaç ão e mantida em repo uso
po r 2 4 h a 4 ° C. Re pe tiu-se e sta o pe r aç ão po r mais uma ve z,
sendo que nesta última despr ezo u-se o so br enadante, fic ando
a suspe nsão so b r e fr ige r aç ão até o mo me nto do uso .
Tr atamento do so r o . Amo str a de so r o diluída a 1 :5 e m tampão fo sfato ( PB S) , pH 7 ,0 , fo i adic io nada de igual vo lume
de s us pe n s ã o de Ca o lim 2 0 % , q ue pe r m a n e c e u po r 2 0
minuto s à te mpe r atur a amb ie nte c o m agitaç ão fo r te a c ada 5
m in uto s . Pr o c e de u- s e c e n tr ifuga ç ã o a 2 0 0 0 r pm po r 3 0
minuto s. Em se guida adic io no u- se 5 0
µl de suspe nsão de
he mác ias de galo 5 0 % , pe r mane c e ndo a 4 ° C po r 6 0 minuto s
c o m a gi ta ç ã o s u a ve a c a da 5 m i n u to s . P r o c e de u - s e a
c entrifugaç ão do soro a 2 0 0 0 rpm por 3 0 minutos e separou-se
o s o b r e n a d a n t e ( s o r o t r a t a d o ) s e n d o d e s p r e za d o o
se dim e nto .
Vír us . Ce pa s do vír us i n f lu e n z a h um a n o e e q üin o , iso ladas na c idade de São Paulo , Estado de São Paulo , B r asil,
fo r a m m a ntida s e m c é lula s MDCK, a tr a vé s de pa s s a ge ns
suc e ssivas.
A/SP/1 /9 1 ( H1 N1 ) = ( A/Singapo r e /6 /8 6 )
A/SP/2 /9 5 ( H3 N2 ) = ( A/B e ij ing/3 5 3 /8 9 )
B - B /SP/1 /9 1 = ( B /Panamá/4 5 /9 0 )
A/Eq 1 /SP/5 6 ( H7 N7 ) = ( A/Eq 1 /Pr ague /1 /5 6 )
Técnica da hemaglutinação1 8.
Fo r am fe itas diluiç õ e s se r iadas na r azão do is, e m duplic ata, das c e pas vir ais e m
so luç ão tampão fo sfato ( PB S) , pH 7 , em mic ro plac as de fundo em “V”, no volume de 2 5
µl, a partir da diluiç ão 1 :2 , utilizando
mic r o diluido r e s de 2 5
µl de c apac idade . Apó s a diluiç ão , e m
c a da o r ifíc io , fo r a m a dic io n a do s 2 5
µl de s us pe n s ã o de
h e m á c i a s 0 , 5 % d e c a d a u m a d a s e s p é c i e s a n i m a i s ,c o nc o mitante me nte c o m as he mác ias de galo par a c o ntr o le da r e aç ão . As m ic r o plac as pe r m ane c e r am à te m pe r atur a
a m b i e n te d u r a n te 3 0 m i n u to s , a té q u e a s h e m á c i a s
adic io nadas no o rifíc io c o ntro le ( sem antígeno ) , depo sitaram no fundo do o r ifíc io . O título hemaglutinante vir al é o inver so
da maio r diluiç ão c apaz de aglutinar as he mác ias e m 2 5
µl
de dilue nte .
Ensaio co m fito hemaglutinina1 1. Utilizo u-se o e nsaio
Le c tin Phito he m aglutinina ( Difc o Lab o r ato r ie s- 3 1 1 0 - 5 6 ) para identific aç ão do s rec epto res ( glic o pro teinas) das c élulas
ve r me lhas do sangue de ho mo té r mic o s ( as de ave /galo ) e
hetero térmic o s ( serpentes e anfíbio s anuro s) , através do teste de he maglutinaç ão . Fo r am r e alizadas diluiç õ e s se r iadas, e m
duplic a ta , da s o luç ã o de fito h e m a glutin in a e m PB S, e m vo lume de 2 5µl, inic iando -se c o m diluiç ão 1 :2 e m plac as c o m fun do e m “ V” . Adic io n o u- s e o m e s m o vo lum e de
s us pe n s ã o de h e m á c ia s , de c a da um a da s e s pé c ie s , n a c o nc e ntr aç ão de 0 ,5 % , e m c ada diluiç ão .
Teste da inibição da hemaglutinação1 8 1 4. Amo str as
de soros dos animais previamente inativadas pelo c alor a 5 6 ° C po r 2 0 minuto s e po ste r io r me nte tr atadas pe lo Cao lim 2 0 %
fo r am em seguida diluídas, em diluiç õ es ser iadas, r azão do is,
a par tir de 1 :2 0 , e m 2 5
µl de PB S, e m plac as de fundo e m V
de 9 6 o r ifíc io s. Em c ada diluiç ão de so r o fo r am adic io nado s2 5 µL das c e pas vir ais a se r e m te stadas, pr e viame nte tituladas e m HA e c o nte ndo 4 unida de s he m a glutina nte s ( 4 UHA) .
De po is de agitadas, as plac as fo r am mantidas e m ge lade ir a a
4 ºC po r 6 0 minuto s. De po is de ste te mpo , fo i adic io nado e m c ada esc avaç ão da plac a, 5 0
µl de uma suspensão de hemác ias
de galo 0 , 5 % . As plac as fo r am m antidas e m te m pe r atur a amb ie nte po r 3 0 minuto s. O título do antic o r po inib ido r da
h e m a glutin a ç ã o fo i de te r m in a do pe lo in ve r s o da m a io r
d i l u i ç ã o d o s o r o c a p a z d e i n i b i r c o m p l e ta m e n te a hemaglutinaç ão das hemác ias. Co mo c o ntr o le negativo fo r am
utiliza do s 2 5
µl de PB S, 2 5
µl de so r o a 1 : 1 0 e 2 5µl de
h e m á c ia s e c o m o c o n tr o le po s itivo fo i e m pr e ga do s o r oantiinflue nza padr ão ( humano e e qüino ) .
Imuno micr o sco pia eletr ô nica1 4 1 9.
Fa se lí q u i d a: e m tub o de fundo c ô nic o c o m c a pa c ida de pa r a 1 , 5 m l, c o m
tampa, fo i adic io nado 0 ,1 ml de antic o rpo diluído a 1 :1 0 ( so ro
de se r pe nte s tr atado pe lo Cao lim) j untame nte c o m 1 ,0 ml de suspe nsão vir al se ndo mantido e m r e po uso a 4 ° C po r 1 8 h.
Centr ifigo u-se a 1 2 .0 0 0 r pm po r 6 0 minuto s e o so b r enadante e sgo tado e m c âmar a úmida po r 1 5 minuto s. O pr e c ipitado
fo i r e ssuspe nso e m so luç ã o ta m pã o PB S, pH 7 , 0 , se ndo
c o l o c a d o 1 0
µl d a s u s p e n s ã o s o b r e g r a d e m e tá l i c a
pr e viame nte r e ve stida c o m c o ló dio 2 % dur ante 1 minuto . Apó s r e mo ç ão do e xc e sso de mate r ial, adic io no u-se 1 0µl de PTA 2 % , pH 6 , 0 , po r 1 m in uto pa r a c o n tr a s ta ç ã o . Apó sr e mo ç ão do e xc e sso , as gr ade s fo r am de ixadas e m r e po uso
p o r u m a n o i te p a r a s e c a ge m . As p r e p a r a ç õ e s fo r a m e xaminadas ao mic r o sc ó pio e le tr ô nic o Mar c a Ze iss, mo de lo
EM1 0 9 .
RESULTADOS
De ac o r do c o m a té c nic a de he maglutinaç ão utilizada
ne ste tr ab alho , ve r ific a-se que 4 amo str as de he mác ias de
se r pe nte s fo r am r e ativas ao vír us i n f lu e n za c o m título s de hemaglutinaç ão igual o u maio r do que 4 UHA. Destes animais,
um e r a mantido e m c ative ir o e 3 e r am r e c é m c he gado s do
hab itat natur al ( Tab e la 1 ) . Co m r e laç ão ao s anur o s ( r ãs e
sapo ) , ve r ific o u-se título s de he maglutinaç ão de 4 UHA par a o vír us c o m he mác ias de 6 r ãs da r e gião de Mo gi das Cr uze s,
SP ( Tab e la 2 ) e par a 4 r ãs de São Jo ão No vo , SP ( Tab e la 3 ) .
As duas amo str as de he mác ias de sapo e m c ative ir o , fo r am
r e ativas ao vír us no te ste de HA, c o m o s r e spe c tivo s título s m é dio s: 6 4 UHA A ( H1 N1 ) , 1 6 0 UHA A ( H3 N2 ) e 5 1 2 UHA
par a o tipo B . Co m r e laç ão ao vír us i n f lu e n za e qüino , e ssas
amo str as apr e se ntar am: < 2 UHA ao A/Eq1 ( H7 N7 ) e 2 4 UHA
ao A/Eq2 ( H3 N8 ) ( Tab e la 4 ) .
Através do teste sorológic o de inibiç ão da hemaglutinaç ão
( IH) o b se r va- se q ue o s so r o s das se r pe nte s e m c ative ir o apresentaram títulos médios inibidores da hemaglutinaç ão para as c epas do vírus influe nza de: 1 7 3 ,3 UIH à c epa A ( H1 N1 ) , 2 4 ,4 UIH para A ( H3 N2 ) , e 1 1 9 ,9 UIH ao tipo B . Quanto aos sub tipo s do vír us influenza e q üin o , a s m e s m a s s e r pe n te s
Ta bela 1 - Nível de hem a glutina çã o de diferentes cepa s do vírus influenza co m hem á cia s de a nim a is hetero térm ico s ( serpentes) .
Animais
hemaglutinação-títulos médios em UHA
1 *Bo thro ps 5 * *Cro ta lus 6 * *Bo thro ps 9 * *Bo thro ps média controle
Cepas virais ja ra ra ca durissus te rrificus ja ra ra cussu ja ra ra cussu total ave( galo)
A ( H1 N1 ) 20 8 2 4 8 ,5 16
A ( H3 N2 ) 10 > 3 2 8 32 2 0 ,5 1 2 8
B 64 5 1 2 1 2 8 > 1 2 8 2 0 8 1 2 8
Eq1 ( H7 N7 ) 10 > 4 2 2 4 ,5 1 2 8
Eq2 ( H3 N8 ) 20 > 6 4 16 16 29 1 2 8
Fitohemaglutinina 64 1 2 8 NR 64 8 5 ,3 > 1 0 2 4 * em cativeiro; * * recém chegados do habitat natural; NR= não realizado
Ta bela 2 - Nível de hem a glutina çã o de diferentes cepa s do vírus influenza co m hem á cia s de a nfíbio s a nuro s ( rã s) da regiã o de Mo gi da s Cruzes, SP.
Animais
hemaglutinação-títulos médios em UHA
Cepas virais 1 2 4 8 10 11 media controle
total ave ( galo) A ( H1 N1 ) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 28 A ( H3 N2 ) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 64
B 6 1 3 ,3 8 14 9 6 9 ,3 3 4 1
Eq1 ( H7 N7 ) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 68
Eq2 ( H3 N8 ) 2 < 2 3 3 ,3 2 2 2 2 7 7
o b tive r am: 5 5 ,5 UIH ao A/Eq1 ( H7 N7 ) e 2 4 4 ,4 UIH ao A/Eq2
( H3 N8 ) . Aq ue la s s e r pe n te s r e c é m - c h e ga da s do h a b ita t natur al, apr e se ntar am o s se guinte s título s mé dio s de HI ao s
sub tipo s A ( H1 N1 ) : 2 3 ,3 UIH, 4 3 ,3 UIH ao A ( H3 N2 ) , 3 6 ,6
UIH ao A/Eq1 ( H7 N7 ) , 1 3 0 UIH ao A/Eq2 ( H3 N8 ) e 4 4 ,6 UIH ao tipo B ( Tab e las 5 e 6 ) .
Das de zo ito am o str as de so r o s, de 1 2 e xe m plar e s de anfíb io s anur o s ( r ãs) , fo r am o b tido s título s pr o te to r e s de
I H ≥4 0 . Sendo que, na região de Mogi das Cruzes, 3 rãs obtiveram títulos médios de IH= 1 2 0 , 3 6 0 e 5 0 ao subtipo A ( H1 N1 ) ; 3 obtiveram títulos médios de IH= 6 0 , 4 0 e 1 8 0 ao subtipo A ( H3 N2 )
e 2 alc anç ar am título s mé dio s de IH= 4 0 ao sub tipo e qüino
A/Eq 1 ( H7 N7 ) . Não o b tive r am título s ao tipo B e ne m ao
sub tipo A/Eq2 ( H3 N8 ) . Na região de São João Novo, observou-se que 5 animais obtiveram títulos médios de IH= 6 4 0 , > 8 0 , 1 6 0 ,
8 0 e > 1 6 0 para o subtipo A ( H1 N1 ) . Apenas uma das rãs
apresentou título médio de IH= 8 0 ao subtipo A ( H3 N2 ) , 1 6 0 ao
tipo B e 4 0 ao subtipo A/Eq2 ( H3 N8 ) . Outras duas rãs apresentaram títulos médios de IH= 4 0 ao subtipo A/Eq1 ( H7 N7 ) ( Tabelas 7 e
8 ) . As duas amostras de soro do anfíbio anuro ( sapo) não puderam
ser avaliadas pelo teste de IH.
A vis ua liza ç ã o do c o m ple xo de a ntíge no e a ntic o r po
o b tido pe lo so r o da se r pe nte c o m título mé dio de IH = 1 7 3 ,3 c o ntr a o antíge no vir al da c e pa do influe nza A ( H1 N1 ) c o m título HA= 3 2 UHA revelou rec onhec imento do vírus in flu e n za pe lo siste ma imune da se r pe nte . Co mple xo do antíge no e
Ta bela 3 - Nível de hem a glutina çã o de diferentes cepa s do vírus influenza co m hem á cia s de a nfíbio s a nuro s ( rã s) da regiã o de Sã o Jo ã o No vo , SP.
Animais
hemaglutinação-títulos médios em UHA
Cepas virais 13 14 15 16 média controle
total ave ( galo)
A ( H1 N1 ) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 8
A ( H3 N2 ) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 38
B 32 > 3 2 4 16 21 3 8 4
Eq1 ( H7 N7 ) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 32
Eq2 ( H3 N8 ) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 69
Fitohemaglutinina 32 64 64 64 56 1 2 8
Ta bela 4 - Nível de hem a glutina çã o de diferentes cepa s do vírus influenza co m hem á cia s de a nfíbio a nuro ( sa po ) m a ntido em ca tiveiro .
Amostra/animal hemaglutinação títulos médios em UHA
Cepas virais 1 2 média total controle ave ( galo)
A ( H1 N1 ) 64 64 64 1 2 8
A ( H3 N2 ) 2 5 6 64 1 6 0 1 2 8
B 5 1 2 5 1 2 5 1 2 1 0 2 4
Eq1 ( H7 N7 ) < 2 < 2 < 2 2 5 6
Eq2 ( H3 N8 ) 16 32 24 1 2 8
Ta bela 5 - Nível de a ntico rpo s inibido res da hem a glutina çã o a o s diferentes vírus influenza em so ro s de serpentes m a ntida s em ca tiveiro .
Animais
inibição da hemaglutinação-títulos médios em UIH
1 2 3
Bo thro ps Bo thro ps Bo thro ps média total soro padrão Cepas virais ja ra ra ca ja ra ra ca ja ra ra ca antiinfluenza
A ( H1 N1 ) 2 9 3 ,3 1 3 3 ,3 9 3 ,3 1 7 3 ,3 1 3 2 0
A ( H3 N2 ) 3 3 ,3 40 < 2 0 2 4 ,4 1 2 8 0
B 9 3 ,3 80 1 8 6 ,6 1 1 9 ,9 1 6 0
Eq1 ( H7 N7 ) 6 6 ,6 80 20 5 5 ,5 1 2 8 0
Eq2 ( H3 N8 ) 1 3 3 ,3 5 3 3 ,3 6 6 ,6 2 4 4 ,4 1 0 8 0
Tabela 6 - Nível de anticorpos inibidores da hem aglutinação aos diferentes vírus influenza em soros de serpentes capturadas do habitat natural.
Animais
inibição da hemaglutinação-títulos médios em UIH
4 5 6 7 8 9
Bo thro ps C. durissus Bo thro ps Bo thro ps C. durissus Bro thro ps Média Soro padrão Cepas virais ja ra ra ca terrificus ja ra ra cussu ja ra ra cussu terrificus ja ra ra cussu total antiinflueza
A( H1 N1 ) 20 < 2 0 20 > 4 0 40 > 2 0 2 3 ,3 76
A( H3 N2 ) 20 > 2 0 > 2 0 > 8 0 80 > 4 0 4 3 ,3 1 2 8
B 1 4 8 < 2 0 > 2 0 40 20 > 4 0 4 4 ,6 36
Eq1 ( H7 N7 ) 20 40 > 2 0 > 4 0 > 2 0 80 3 6 ,6 2 0 8
Eq2 ( H3 N8 ) 1 0 0 > 3 2 0 > 8 0 > 8 0 > 1 6 0 > 4 0 1 3 0 1 8 6
Ta bela 7- Nível de a ntico rpo s inibido res da hem a glutina çã o a o s diferentes vírus influenza em so ro s de a nfíbio s a nuro s ( rã s) da regiã o de Mo gi da s Cruzes, SP.
Animais
inibição da hemaglutinação-títulos médios em UIH
12 13 14 15 16 média soro padrão
Cepas virais total antiinfluenza
A( H1 N1 ) 6 4 0 > 8 0 1 6 0 80 > 1 6 0 1 6 5 80 A( H3 N2 ) < 2 0 > 2 0 80 < 2 0 > 2 0 24 40 B < 2 0 < 2 0 1 6 0 < 2 0 > 2 0 36 8 0 0
Eq1 ( H7 N7 ) 40 < 2 0 < 2 0 20 40 20 3 2 0
Eq2 ( H3 N8 ) > 2 0 < 2 0 40 < 2 0 < 2 0 12 1 6 0
Tabela 8 - Nível de anticorpos inibidores da hemaglutinação aos diferentes vírus influenza em soros de anfíbios anuros ( rãs) da região de São João Novo, SP.
Animais
inibição da hemaglutinação-títulos médios em UIH soro
média padrão
Cepas virais 1 2 3 5 6 7 9 total antiinfluenza
A( H1 N1 ) 20 1 2 0 3 6 0 20 20 20 50 8 7 ,1 40
antic orpo obtido c om soro humano e antígeno de influenza tipo
A também foi demonstrado c omo c ontrole positivo. Estes dados estão evidenc iados nas Figuras 1 e 2 , respec tivamente, onde as
imagens esc ur as demo nstr am a c o nc entr aç ão pr o téic a das
agregaç õ es de partíc ulas virais c o m o antic o rpo , c o nfo rme
demonstrado por Doane & Anderson8.
A Figura 3 apresenta o s níveis de antic o rpo s de IH nas serpentes mantidas em cativeiro ou capturadas do habitat natural.
Ob se r va- se q ue e sse s anim ais e m c ative ir o apr e se ntar am
maio r e s mé dias de título s de IH ao s sub tipo s A( H1 N1 ) ( 1 7 3 ,
3 UI H) , A/Eq1 ( H7 N7 ) ( 5 5 ,5 UIH) e A/Eq2 ( H3 N8 ) ( 2 4 4 ,4 UIH) e a o tipo B ( 1 1 9 , 9 UI H) , c o m pa r a do s à q ue la s s e r pe n te s
rec émc apturadas, c om exc eç ão do subtipo A( H3 N2 ) , ao qual
essas apresentaram maior média de título IH( 4 3 ,3 UIH) .
DISCUSSÃO
Co m b a s e n o s r e s ulta do s o b tido s n o s e x pe r im e n to s
d e s te tr a b a lh o o b s e r vo u- s e q ue a m a io r ia do s a n im a is h e te r o té r m ic o s a va lia do s , c o m o o s r é pte is ( s e r pe n te s ) e
a n fí b i o s a n u r o s ( s a p o s e r ã s ) , a p r e s e n to u e m s u a s
memb r anas das c élulas ver melhas r ec epto r es espec ífic o s ao s vír us i n f lu e n za humano e e qüino . Isto fo i o b se r vado atr avé s
de rec o nhec imento prévio das c élulas às glic o pro teínas da
fitohemaglutinina, usada c omo c ontrole, a qual c orresponderia às glic oproteínas da hemaglutinina situada nas espíc ulas do
envelope do vírus influenza. Passando-se então a c onfirmar
que os heterotérmic os apresentam rec eptores espec ífic os para
glic o pr o te ínas vir ais, q uando as he m ác ias tam b é m fo r am aglutinadas pelo s vír us i n f lu e n za. O c o nsider ável nível de
pr o te ç ã o im un o ló gic a , ve r ific a do n e s s e s a n im a is pe la s
sorologias ( IH e IME) , sugere a exposiç ão à influenza que os
induziu a resposta de antic orpos à infec ç ão viral.
Ob se r vando o me no r r e c o nhe c ime nto do vír us i n f lu e n za pe lo s r e c e pto r e s das he m ác ias do s anfíb io s ( r ãs) r e c é m c aptur ado s do hab itat, mas que apr e se ntar am r e spo sta de
a ntic o r po s c o ntr a e sse vír us, é po ssíve l c o nc e b e r q ue a tr a n s m is s ã o vir a l te n h a s e pr o c e s s a do de vido a o utr o s
de te r m in a n te s dife r e n c ia do s da q ue le s j á r e la ta do s a o s r e c e pto r e s da supe r fíc ie das c é lulas, c o mo ar gume ntam o s
auto r e s Car r o l e t al5 e Car r o l e Paulso n6. Isto ainda po de r á ter se aprimo rado c o m relaç ão ao s animais em c ativeiro , o nde o vír us i n f lu e n za pô de r e alizar me lho r sua adaptaç ão ao s
r e c e pto r e s das c é lulas do s ho spe de ir o s par a r e alizaç ão da infe c ç ão vir al1 3.
Assim, apó s avaliada a c apac idade de r e c o nhe c ime nto ,
tanto do s r e c e pto r e s das he mác ias do s he te r o té r mic o s ao s
Fi gu ra 3 - Ní ve i s d e a n ti c o rp o s c o n tra d i f e re n te s c e p a s d o ví ru s i n f lu e n za d e se rp e n te s m a n ti d a s e m c a ti ve i ro e re c é m c h e ga d a s d o h a b i ta t n a tu ra l.
Fi gu ra 2 - Co n tro le p o si ti vo d e m o n stra n d o a re a ç ã o d o ví ru s influe nza ti p o A ( Ag) c o m o so ro h u m a n o ( Ac ) .
V: Partíc ula viral; Cp: Co mplexo pro téic o antígeno -antic o rpo também intensamente c o ntrastado pelo PTA. Aumento : 1 5 0 .0 0 0 X. B arra: 1 0 0 nm. Fi gu ra 1 - Co m p le x o a n tí ge n o - a n ti c o rp o f o rm a d o p e la re a ç ã o d o
ví ru s influe nza ti p o A ( Ag) c o m o so ro d e se rp e n te ( Ac ) .
vírus influe nza, como dos seus anticorpos específicos a estes vírus, pode-se concluir que esses animais possuem, de alguma fo r m a , s us c e ptib ilida de à e s s a in fe c ç ã o vir a l. Há m a io r probabilidade de infectados entre aqueles mantidos em cativeiro, pois submetem-se à transmissão viral direta pelos tratadores. Porém, não se descarta esse tipo de ocorrência àqueles que ficam em habitat natural, devido à exposição a outros transmissores desses vírus, tais como as aves ( patos selvagens, aves migratórias e outras) , assim como mamíferos selvagens que co-habitam.
O assunto tratado neste trabalho é de muita importânc ia epidemiológica, devido ao vírus influe nza possuir capacidade potencial para rearranjos e recombinações genéticas, que até então estavam focalizadas em hospedeiros homotérmicos, mas que após estes resultados obtidos, também pode-se suspeitar da inclusão dos heterotérmicos neste processo. Portanto, pode-se considerar que estes animais estariam colaborando para assegurar e aumentar a característica epidêmica do vírus influenza, quando atingidos por este agente, o qual se apresenta de modo mais grave que aque le s que ainda não participavam da transmissão interespécies que este vírus se utiliza para sua potencialização. De acordo com relatos1 5, o vírus influe nza poderá não se restringir a transmissão ave-mamíferos, mas sim por novas espécies que possam ser os novos hospedeiros intermediários.
Através do expo sto , c o nc lui-se que a influenza também estaria sendo c irc ulada entre os animais heterotérmic os. Os c uidados c om estes animais em c ontenç ão ou rec ém-c hegados de se us hab itats natur ais é de gr ande validade par a amb o s, tanto ao s tr atado r e s, c o mo ao s pr ó pr io s animais mantido s e m c ative ir o , visando minimizar o s pr o b le mas de c o r r e nte s do c ar áte r e pidê mic o do vír us i n f lu e n za.
E s te tr a b a l h o c o l a b o r o u c o m o s e s tu d o s s o b r e ho spe de ir o s de sc o nhe c ido s do vír us i n f lu e n za, e ntr e o s animais he te r o té r mic o s, e m te r r itó r io B r asile ir o .
AGRADECIMENTOS
Agr adec emo s às B ió lo gas Simo ne No gueir a, Oilita Per eir a Fe r r az, à Mé dic a Ve te r inár ia Kathle e n Fe r nande s Gr e go e à Luzia da Pur ific aç ão , pe lo apo io té c nic o .
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