Síntese, caracterização e avaliação da citocompatibilidade in vitro de poliuretano como biomaterial na engenharia tecidual

PUCRS

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PRROOGGRRAAMMAADDEEPPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOOEEMMEENNGGEENNHHAARRIIAAEE T

TEECCNNOOLLOOGGIIAADDEEMMAATTEERRIIAAIISS

Faculdade de Engenharia Faculdade de Física Faculdade de Química

PGETEMA

SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOCOMPATIBILIDADE IN

VITRO DE POLIURETANO COMO BIOMATERIAL NA ENGENHARIA TECIDUAL.

CHRISTIAN VIEZZER BIÓLOGO

DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM

ENGENHARIA E TECNOLOGIA DE MATERIAIS

PUCRS

P

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TEECCNNOOLLOOGGIIAADDEEMMAATTEERRIIAAIISS

Faculdade de Engenharia Faculdade de Física Faculdade de Química

PGETEMA

SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOCOMPATIBILIDADE IN

VITRO DE POLIURETANO COMO BIOMATERIAL NA ENGENHARIA TECIDUAL.

CHRISTIAN VIEZZER BIÓLOGO

ORIENTADORA: PROF(A). DR(a). SANDRA MARA EINLOFT

CO-ORIENTADORA: PROF(A). DR(a). DENISE CANTARELLI MACHADO

Dissertação realizada no Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Tecnologia de Materiais (PGETEMA) da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia e Tecnologia de Materiais.

O último esforço da razão é

reconhecer que existe uma

infinidade de coisas que a

ultrapassam.

Agradeço a Providencia Divina por estar sempre presente na minha vida, guiando-me com a sua Luz e tornando tudo possível;

Agradeço a minha orientadora professora Dra: Sandra Mara Einloft, por todo apoio, pela credibilidade, orientação e confiança em mim depositada, o que tornou possível a realização deste projeto;

Em especial a minha co-orientadora professora Drª. Denise Cantarelli Machado que abriu as portas desse mundo fantástico que é a Ciência, que sempre acreditando e incentivando mostrou-me os caminhos da aprendizagem e do conhecimento acadêmico.

As Professoras (Rô e Jeane) e aos colegas do Laboratório de Organometálicos e Resinas (LOR) - PUCRS que sempre me auxiliaram na obtenção dos polimeros e conhecimento prestado;

Um especial agradecimento as colegas e amigas Vanusca e Tassiani pela contribuição com seus conhecimentos e “mão de obra”;

A todos os colegas dos Laboratórios de Biologia Celular e Molecular do IPB - PUCRS, pela compreensão, amizade e ajuda nos momentos de dificuldades;

Aos professores e funcionários do PGTEMA – PUCRS e pela contribuição para que este trabalho pudesse ser feito,

D

... 5

A

... 6

ÍNDICE ... 7

L

F

... 9

L

T

... 10

L

Q

... 11

L

S

... 12

RESUMO ... 13

ABSTRACT ... 14

1.

INTRODUÇÃO ... 15

1.1. Considerações Gerais ... 15

2.

OBJETIVOS ... 17

2.1. Objetivos Específicos ... 17

3.

REVISÃO

BIBLIOGRÁFICA ... 18

3.1. Biomateriais ... 18

3.1.1. Biocompatibilidade ... 20

3.1.2. Polímeros sintéticos biodegradáveis ... 21

3.2. Engenharia Tecidual (ET) ... 22

3.2.1. Matriz Extracelular ... 24

3.3. Poliuretanos como biomateriais ... 25

3.3.1. Poliuretanos (PUs) ... 25

3.3.2. Biocompatibilidade dos poliuretanos ... 29

3.3.3. Poliuretanos a partir de poli (caprolactona) - PCL ... 30

3.3.4. Avaliação de citotoxicidade em Biomateriais ... 32

4.

MATERIAIS

E

MÉTODOS ... 34

4.1. Síntese do Polímero ... 34

4.1.1. Preparação do filme de PU ... 35

4.2.1. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) ... 36

4.2.2. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ... 36

4.2.3. Ressonância Magnética Nuclear – 1H (1H-RMN) ... 36

4.3. Avaliação da Citotoxicidade in vitro ... 37

4.3.1. Cultura de Células ... 37

4.3.2. Teste por Meio de Extração ... 37

4.3.3. Ensaio de viabilidade celular pelo método do MTT ... 38

4.4. Avaliação da adesão Celular sobre o filme de PU... 39

4.5. Analise estatística ... 40

5.

RESULTADOS

E

DISCUSSÕES ... 41

5.1. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) ... 41

5.2. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ... 42

5.3. Ressonância Magnética Nuclear – 1H (1H-RMN) ... 45

5.4. Citotoxicidade pela redução do MTT ... 47

5.5. Adesão celular ... 51

6.

CONCLUSÕES ... 55

7.

PROPOSTAS

PARA

TRABALHOS

FUTUROS ... 56

Figura 3.2.1 Principais células envolvidas na resposta do hospedeiro. As variáveis intensidade e tempo são dependentes do tamanho da lesão criada no momento da implantação, tamanho, forma e das características físicas e químicas do biomaterial (Anderson, 2001). ... 23

Figura 3.3.1. Estrutura da cadeia principal de um poliuretano. ... 27

Figura 3.3.2. Estrutura da cadeia poliuretânica ( Dodge, 2003; Guelcher, 2008). .... 28

Figura 4.1.1- Sistema reacional utilizado para a síntese do polímero de poliuretano.35

Figura 5.2.1 Espectro de Infravermelho do (a) polímero de poliuretano (PU), (b) poli(caprolactona) (PCL) e (c) hexametileno diisocianato (HDI)... 42

Figura 5.5.1.Células de fibroblastos sobre filme de PU em 24h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x. ... 51

Figura 5.5.2.Células de fibroblastos sobre filme de PU em 48h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x. ... 51

Figura 5.5.3.Células de fibroblastos sobre filme de PU em 72h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x. ... 52

Tabela 5.1.1. Massas molares (Mw e Mn) do polímero de poliuretano (PU). ... 41

Tabela 5.2.1. Atribuições das bandas referentes ao espectro do PU, PCL e HDI. ... 43

Tabela 5.4.1. Valores da média e desvio padrão de absorbância nos períodos de 24, 48 e 72h. ... 47

Quadro 3.1. Uso de Biomateriais na áre médica ... 19

Quadro 3.3.1. Principais poliois utilizados para síntese de PU biodegradáveis (Guelcher, 2008). ... 26

Quadro 3.3.2. Principais poliisocianatos utilizados para síntese de PU biodegradáveis (Guelcher, 2008). ... 27

1_{H-RMN Ressonância Magnética Nuclear}

ATCC American Type Culture Collection DBTDL Dibutil dilaurato de estanho

DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco DPBS Solução salina tamponada com fosfato ECM Matriz extracelular

FAK Focal Adhesion Kinase ( quinase de adesão focal)

FTIR Fourier transform infrared (Infravermelho por Transformada de Fourier) GPC Gel Permeation chromatography (cromatografia de permeação em gel) HDI Hexametileno diisocianato

HE Hematoxilina e Eosina

HMDI 4,4- diciclohexametileno diisocianato

HPLC High performance liquid chromatography (cromatografia líquida de alta performance)

IP Índice de polidispersão

ISO International Standardization for Organization

MAPK ( Mitogen-activated protein kinase) proteína quinase ativada por mitógeno ME Meio de extração

Mn Massa molar numérica media g/mol MPa Mega Pascal kgf/cm2 MTT Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol]-2,5-difeniltetrazólio

Mw Massa molar ponderal média g/mol OD Optical density (densidade ótica) nm PCL Poli(caprolactona)

PEG Poli(etileno glicol) PU Poliuretano

Ras Proteína G pequena THF Tetrahidrofurano

δs Deformação angular simétrica

νas estiramento assimétrica

VIEZZER, Christian. Síntese, caracterização e avaliação da citocompatibilidade in vitro de poliuretano como biomaterial na engenharia tecidual. Porto Alegre - 2009. Dissertação. Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Tecnologia de Materiais, PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL.

A utilização de polímeros sintéticos na fabricação de biomateriais tem despertado a atenção de muitos pesquisadores, visando a criação de implantes que possam auxiliar na regeneração tecidual, através do contato de tipos celulares específicos com os polímeros sintéticos biodegradáveis. Os poliuretanos (PU) são considerados como um dos biomateriais mais versáteis atualmente utilizados devido suas ótimas propriedades mecânicas e sua compatibilidade tecidual. No presente trabalho, foi estudada a síntese de poliuretanos para uso como biomateriais utilizando hexametileno diisocianato e poli(ε-caprolactona) (PCL). O polímero sintetizado foi caracterizado por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e Ressonância Magnética Nuclear (1H-RMN). A sua citotoxicidade foi avaliada utilizando o ensaio de redução do sal de tetrazólio (MTT), também foi avaliado a adesão celular in vitro com fibroblastos de camundongos. Os resultados obtidos no presente estudo confirmaram a citocompatibilidade do polímero de PU que não interferiu no processo de adesão e proliferação celular.

VIEZZER, Christian. Synthesis and characterization and in vitro evaluation of polyurethane as biomaterial for tissue engineering. Porto Alegre. 2009. Master. Pos-Graduation Program in Materials Engineering and Technology, PONTIFICAL CATHOLIC UNIVERSITY OF RIO GRANDE DO SUL.

The use of synthetic polymers to manufature biomaterials has attracting attention of many researchers, aiming to develop of implants that can improve tissue regeneration by contact with specific cellular types in contact with biodegradable synthetic polymers. Polyurethanes (PU) are considered one of the most versatile biomaterials at present, due to it good mechanical properties and its tissue compatibility. In the present work the synthesis of poliurethanes to by use as biomaterials utilizing hexamethylene diisocyanate (HDI) and poly (ε-caprolactone)

(PCL) was evaluated. The synthesized polymer was characterized by Gel Permeation Chromatography (GPC), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR). In vitro cytotoxicity was also evaluated by tetrazolium salt reduction assay (MTT) and in vitro cellular adhesion with mouse fibroblast cells. The results obtained in confirmed the cytocompatibility of the PU polymer and that it did interfer with cell adhesion and proliferation.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Considerações Gerais

Biomateriais são uma parte importante dos cerca de 300.000 produtos para uso na área da saúde. No ano 2000, o mercado mundial de biomateriais foi estimado em 23 bilhões de dólares, com uma taxa de crescimento maior que 12% ao ano, chegando a movimentar em 2005 mais de 40 bilhões de dólares. No Brasil, a maioria das empresas do setor são de pequeno ou médio porte ou são subsidiárias de grandes corporações (Soares, 2006). A aplicação de materiais poliméricos biodegradáveis para finalidades médicas vem crescendo rapidamente, aplicando-se em diversas áreas biomédicas como, por exemplo, engenharia tecidual (ET), implantes de dispositivos médicos, órgãos artificiais, próteses, oftalmológica, odontológica, reparo ósseo e em outros campos diversos de atuações médicas. (Sittinger, 1996; Yang, 2007; Nichols, 2008).

Langer e Vacanti (1993) definem ET como sendo um campo interdisciplinar que aplica os princípios da engenharia e ciências da vida para o desenvolvimento de substitutos biológicos de modo que estes restaurem, mantenham ou possam melhorar a função do tecido ou mesmo do órgão por inteiro. A ET é hoje fundamental ao exercício da medicina regenerativa e o mercado potencial de produtos desenvolvidos via ET como pele, osso, cartilagem, entre outros tipos de tecidos é estimado em cerca de 100 bilhões de dólares ao ano (Woodfield, 2007).

proporcionando uma superfície adequada para a adesão, proliferação e diferenciação celular, minimizando as respostas inflamatórias inerentes ao organismo hospedeiro frente ao material utilizado. Deste modo, a ET usa a combinação de células, novos materiais, fatores bioquímicos e fisico-químicos para melhorar ou substituir as funções biológicas do tecido lesado (Vert, 2007).

Entretanto, os tecidos envolvidos exigem certas propriedades mecânicas e estruturais para suas funções adequadas, por isso é fundamental o conhecimento da anatomia do tecido ou órgão de interesse, bem como suas interações biológicas. A tentativa de simular estes mecanismos nos polímeros biodegradáveis resulta não só na análise da sua composição química, mas também da sua estrutura interna e suas interações com os tecidos, tornando-os cada vez mais próximos das matrizes dos tecidos encontrados nos organismos vivos, otimizando o desenvolvimento de novos materiais para a ET. Assim os polímeros de origem sintética ou natural são agentes promissores no estudo de fabricações de novos materiais, pois estes, sendo biodegradáveis, dão suporte ao crescimento celular e são absorvidos pelo organismo a medida que o tecido lesado é regenerado, não havendo a necessidade de uma nova intervenção cirúrgica para a retirada do polímero.

2. OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivo principal a avaliação da citocompatibilidade in vitro do polímero de poliuretano sintetizado a partir de hexametileno diisocianato e poli(ε-caprolactona) diol para ser utilizado como biomaterial na engenharia de tecidos.

2.1. Objetivos Específicos

A partir da síntese do poliuretano pretende-se:

• Caracterizar a sua estrutura química pelas técnicas de GPC, FTIR e 1_H-RMN.

• Avaliar a citotoxicidade in vitro das células expostas a extratos do polímero.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Biomateriais

influência considerável devido os avanços nas muitas áreas da ciência e biotecnologia.

Uma das definições correntes diz que os biomateriais são materiais sintéticos ou naturais; sólidos ou, às vezes, líquidos, utilizados em dispositivos médicos ou em contato com sistemas biológicos (Helmus & Tweden, 1995; Ratner, 2004). Segundo Williams (1987), biomateriais são quaisquer substâncias (outras que não drogas) ou combinação de substâncias, sintética ou natural em origem, que pode ser usada por qualquer período de tempo, substituindo parte ou todo um sistema que trata, aumenta, ou substitui qualquer tecido, órgão, ou função do corpo.

O uso de biomateriais, como indicado no Quadro 3.1, inclui a substituição de uma parte do corpo que perdeu a sua função devido a uma doença ou trauma e o uso destes materiais visando a melhoria da função, correção de anormalidades e ou até mesmo a cura. (Bronzino,1995; Kawachi, 2000).

Quadro 3.1. Uso de Biomateriais na áre médica

Área de problema Exemplo

Substituição por doença ou dano Osso, dente, máquina de diálise, artérias, veias, implantes de juntas de joelho

Participa na recuperação Suturas, Fixação ortopédica

Melhorar a função Válvula cardíaca, lentes intraoculares

Correção de função

Válvula cardíaca, próteses ortopédicas, tendões,

traquéia artificial

Auxilio para diagnóstico Agulhas, cateteres

Auxilio para tratamento Cateteres, drenos

Quanto ao tipo de material, os biomateriais podem ser polímeros sintéticos, metais, cerâmicas e macromoléculas naturais, que são manufaturados ou processados para se adequarem à utilização em dispositivos médicos, que entram em contato íntimo com proteínas, células, tecidos, órgãos e sistemas orgânicos (Jahno, 2006). A vantagem de se usar materiais poliméricos quando comparados com materiais metálicos e cerâmicos é a facilidade de manufatura, a capacidade de modelar a composição micro e macro-estrutural destes materiais, o custo razoável, bem como sua biodegradabilidade (Pathiraja, 1998; Sittinger, 1996).

Eufinger e Saylor (2001) classificaram os implantes de acordo com a fonte de obtenção. Os mesmos podem ser: (i) Autólogo: retirado do próprio paciente; (ii) Não autólogo: originário de outro ser vivo, podendo este ser: Homólogo: da mesma

espécie; Heterólogo: de outra espécie; e (iii) Aloplástico: com a utilização de

materiais biocompatíveis. A vantagem do implante aloplástico (utilizando materiais como resinas, polímeros, metais e cerâmicas) é que esses proporcionam estabilidade geométrica, podem ser obtidos em qualquer quantidade, os riscos da presença de agentes infecciosos são minimizados e não é necessário a retirada de um enxerto autólogo, o que aumentaria a morbidade da cirurgia e dor no período de pós-operatório.

3.1.1. Biocompatibilidade

A biocompatibilidade pode ser definida como a habilidade de um biomaterial, prótese, ou equipamento médico de desempenhar uma resposta apropriada no hospedeiro em uma aplicação específica, envolvendo a aceitação de um implante artificial pelo tecido circundante e pelo organismo como um todo (Anderson, 2001). Vale lembrar que o sucesso do biomaterial no organismo não depende só de fatores como propriedade do material e o contexto em que o material é usado, mas também, outros fatores, incluindo a técnica cirúrgica e a condição de saúde do paciente (Bouillaguet, 2006).

intimamente relacionados com o comportamento celular em contato com o biomaterial e, particularmente, a adesão celular com a sua superfície (Serrano, 2004). Conseqüentemente as características do material, tais como hidrofobicidade, energia de superfície, porosidade, carga e composição química, são de fundamental importância para a resposta do tecido em contato com o biomaterial (Dewez, 1998; Khorasani, 2006; Furth, 2007).

A reprodutibilidade em termos químicos, físicos e propriedades biológicas são fatores determinantes no desenvolvimento de novos materiais para aplicações biomédicas (Zadrahala, 1999), seguido da tolerância, adesão e proliferação celular e subseqüentemente formação do novo tecido. Sendo assim, o material não deve provocar uma resposta inflamatória crônica, não pode ser imunogênico ou citotóxico e deve proporcionar propriedades mecânicas adequadas para não quebrar durante o manuseio e as atividades normais do paciente (Anderson, 2001).

3.1.2. Polímeros sintéticos biodegradáveis

A utilização de polímeros sintéticos na construção de biomateriais tem despertado a atenção de pesquisadores há algumas décadas, visando a criação de implantes que possam formar novos tecidos, naturais, através do uso de tipos celulares específicos sobre polímeros sintéticos biodegradáveis (Vacanti, 1993), levando a uma integração total das células do doador e elementos mesenquimais presentes, incluindo vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos (Mooney, 1995).

Uma classe de polímeros sintéticos biodegradáveis são os poliésteres alifáticos obtidos a partir de poli(α-hidróxi ácidos) tais como poli(ácido láctico), poli(ácido glícólico) e poli(caprolactona) (Lee, 2002; Sahoo, 2007; Pektok, 2008). Estes polímeros podem sofrer degradação via hidrólise ou ataque enzimático (Howard, 2002) e os subprodutos provenientes entram em rotas metabólicas celulares onde são catabolisados ou são liberados via excreção normal.

em macrófagos e células gigantes de corpo estranho. A liberação de moléculas biologicamente ativas pela atividade dos macrófagos pode facilitar a degradação dos implantes, afetando a sua bioestabilidade (Guelcher, 2008).

O desenvolvimento de biomateriais tem como ênfase a criação de um material que permita uma resposta inerte ao tecido, produzindo componentes bioativos que forneçam uma reação fisiológica controlada no ambiente tecidual (Hench, 2002).

3.2. Engenharia Tecidual (ET)

A ET é um campo interdisciplinar que aplica os princípios da engenharia e ciências da vida para o desenvolvimento de substitutos biológicos de modo que estes restaurem, mantenham ou possam melhorar a função do tecido ou mesmo do órgão por inteiro (Langer e Vacanti, 1993). Segundo Nichols (2008), a engenharia tecidual como alternativa para medicina regenerativa tem como função a reconstrução tecidual através de equivalentes de tecidos para reparar as funções fisiológicas perdidas devido a doenças ou injurias, fazendo o uso de células e matrizes sintéticas ou naturais para condução e suporte do tecido em desenvolvimento, permitindo a gênese e manutenção de funções biológicas específicas.

A formação de um novo tecido envolve processos complexos cuja razão e as formas são afetadas por muitos fatores, tais fatores podem estar relacionados com o fenótipo da célula, densidade e distribuição espacial da célula (Cheng, 2006) e a superfície do biomaterial modula uma série de respostas celulares, tanto in vitro como in vivo (Keselowsky, 2004). Estas respostas incluem a adesão, sobrevivência, proliferação e diferença na expressão fenotípica (Allen, 2003; Brodbeck, 2001).

aguda, inflamação crônica, granulação do tecido, reação de corpo estranho e fibrose (Zdrahala, 1999). A figura 3.2.1 mostra os períodos da resposta-hospedeiro e as principais células envolvidas.

Figura 3.2.1 Principais células envolvidas na resposta do hospedeiro. As variáveis intensidade e tempo são dependentes do tamanho da lesão criada no momento da implantação, tamanho, forma e

das características físicas e químicas do biomaterial (Anderson, 2001).

Assim com o avanço da ET há a necessidade de desenvolver novos biomateriais, preferencialmente biodegradáveis, que possam fornecer um arcabouço para o crescimento, diferenciação e proliferação das células (Kirkpatrick, 2007), concentrando esforços na busca de materiais semelhantes ao tecido do doador.

3.2.1. Matriz Extracelular

A matriz extracelular (ECM) é composta por uma rede complexa de macromoléculas extracelulares (Alberts, 2004), fornecendo um ambiente organizado no qual as células podem mover-se e interagir uma com as outras de forma ordenada. A ECM tem um papel chave e essencial na sobrevivência, proliferação e migração das células em seu contato (Vakonakis, 2007). A ligação da célula à matriz extracelular necessita de proteínas de adesão celular transmembrana, que atuam como receptores da matriz e conectam-na com o citoesqueleto celular (Fodor, 2003). Certos receptores de superfície celular, incluindo algumas integrinas, podem ligar os componentes da ECM desse modo aderindo indiretamente às células umas as outras por meio de suas interações com a matriz. (Lodish, 2005).

As integrinas são os principais receptores usados pelas células para ligarem-se à ECM que quando ativadas pela matriz, também atuam como transdutores de sinais ativando diversas vias de sinalização intracelular (DeMali, 2003). Estudos recentes demonstram que ECM influencia profundamente no programa celular de crescimento, diferenciação e apoptose. A promoção ou supressão do crescimento pela ECM está associado igualmente com a estimulação ou inibição dos mediadores chaves responsáveis pelo ciclo celular, incluindo ciclinas, genes de respostas primárias (Boudreau, 1999) e vias de transdução de sinal intracelular tais como FAK, MAPK e Ras entre outras. (Hill, 1995; Fodor, 2003; Alenghat, 2002; Berrier, 2007).

3.3. Poliuretanos como biomateriais

3.3.1. Poliuretanos (PUs)

Quadro 3.3.1. Principais poliois utilizados para síntese de PU biodegradáveis (Guelcher, 2008).

Nos isocianatos o átomo de carbono apresenta-se como um centro deficitário de elétrons, o que torna estes compostos altamente reativos e suscetíveis a reações nucleofílicas. Reagem com compostos que apresentam na cadeia átomos de hidrogênio ativos, como grupos hidroxila de álcoois primários e secundários e, aminas primárias e secundárias, formando respectivamente ligações uretânicas e uréia (Wegener, 2001). Grupos hidroxila diálcoois terciários também reagem com isocianatos, mas devido ao impedimento estérico, a reatividade é baixa e a ligação uretana formada é degradada termicamente sob condições brandas (Bock, 2001). No Quadro 3.3.2 podemos ver os principais diiisocianatos utilizados na síntese de poliuretanos para uso médico(Guelcher, 2008).

Nome químico Estrutura

Poli (óxido de etileno) (PEO)

Poli (óxido de propileno) (PPO)

Poli (ε-caprolactona) (PCL)

Poli (D,L- lactideo)

Quadro 3.3.2. Principais poliisocianatos utilizados para síntese de PU biodegradáveis (Guelcher, 2008).

Poliuretanos lineares são polímeros nos quais a estrutura da cadeia principal é composta por uma unidade aromática ou alifática R1 e R2 ligada junto ao grupo polar uretano, em que o R2 constitui um grupo alifático, aromático ou radical alicíclico derivado do monômero isocianato e R1 é um grupo complexo derivado de um poliol como mostrado na Figura 3.3.1 (Krol, 2007).

Figura 3.3.1. Estrutura da cadeia principal de um poliuretano.

Nome químico Estrutura

1,6- hexametileno diisocianato (HDI)

1,4- butano diisocianato (BDI)

Diisocianato de éster metílico de lisina

(LDI)

Isoforona diidosianato (IPDI)

4,4'-diciclo-hexilmetileno (H12MDI)

A ligação uretana (–NH–COO–) é resultado da reação entre o grupo isocianato do diisocianato (–NCO) e o grupo hidroxila do poliol (–OH). Se um excesso estequiométrico de diisocianato for usado, a cadeia diuretânica é terminada em –NCO e o produto é chamado de pré-polimero com terminação–NCO (Sebenik, 2007). A Figura 3.3.2 mostra a estrutura da cadeia poliuretânica.

Figura 3.3.2. Estrutura da cadeia poliuretânica ( Dodge, 2003; Guelcher, 2008).

3.3.2. Biocompatibilidade dos poliuretanos

O Poliuretano está associado como um dos melhores materiais para aplicação biomédica devido as suas ótimas propriedades mecânicas, ao seu caráter polimérico segmentado, sua vasta disponibilidade de variações geométricas e excelente compatibilidade sanguínea e tecidual (Ghosh, 2004; Hasirci, 2007). Poliuretanos biodegradáveis são formados a partir de diisocianatos alifáticos com diferentes polióis podendo citar com exemplo poli (ácido láctico) (PLLA), poli (ácido glicólido) (PGA) e poli (caprolactona) (PCL) e extensores de cadeia como diois, diaminas e disulfetos (Jiang, 2007).

Em 1960 surgiu no mercado as primeiras PU com grau biomédico (Elastomer Biomer®) para implantes cardiovasculares, mas foi retirado do mercado em 1990 devido a micro-rachaduras na superfície do segmento flexível do polieter (Guelcher, 2008). Entretanto nos últimos anos uma variedade de elastômeros de PU vem sendo desenvolvidos para aplicações em ET como suporte para regenerações de tecido cardiovascular (Andrews, 2008) e músculo-esquelético (Klompmaker, 1996; Kavlock, 2007), regeneração nervosa (Borkenhagen, 1998) entre outros tipos de tecidos.

Marques (2002) estudou o efeito citotóxico de extratos de compósitos de PU em células L929, avaliando a atividade mitocondrial e morfologia destas células em diferentes períodos de tempo, demonstrando que o polímero exibiu uma citocompatibilidade podendo ser usado como biomaterial.

As ligações hidrogênio entre os grupos uretanos fornecem ao polímero de poliuretano uma boa propriedade de deformação elástica (Yelgor, 2001; Guelcher, 2007), tornando interessante o seu uso em tecidos que necessitam de uma apropriada elasticidade como, por exemplo, em tecidos moles.

Segundo Yin (2007) os PU elastoméricos baseadas em PCL-PEG- HDI para fabricação de tubos para regeneração de nervos periféricos em modelos in vivo possuem uma boa biocompatibilidade que, quando implantado em coelhos, em períodos de tempo curto e longo, não formam fibrose e inflamações crônicas.

Phan e colaboradores (2005) avaliaram uma membrana baseada em poliuretano (TegadermTM) para utilização em ET em pele. Os autores confirmaram que a membrana permitia a adesão celular e o crescimento de queratinócitos, mantendo uma característica similar ao longo da proliferação, quando comparado ao controle na placa de plástico de cultura. Sugeriram que a membrana TegadermTM poderia ser usada e modificada para ser empregada como material para engenharia de tecidos em pele.

Estes atributos incluem um grande número de propriedades físicas e mecânicas, funcionalidade química, e diversidades nas características específicas do polímero de PU.

3.3.3. Poliuretanos a partir de poli (caprolactona) - PCL

Os PUs derivados de PCL diol são considerados promissores na fabricação de implantes para uso clínico, pois apresentam pequena estabilidade hidrofílica e sofrem degradação frente a álcalis, o que torna este tipo de poliól atrativo para o uso na síntese de poliuretanos biodegradáveis. O PCL é considerado não tóxico e um material biocompativel (Kronenthal, 1975) e os produtos de sua degradação são metabolizados pelo ciclo do ácido tricarboxílico ou eliminados pela secreção renal (Kweon, 2003), mesmo que ainda não se saiba exatamente como ocorra a degradação dos poliuretanos in vivo, supõe-se que elas podem sofrer degradação nas ligações uretânicas ou uréias por ação enzimatica (Elliott, 2002; Zgrahala, 1999).

catalisador de estanho. Em seu estudo demonstraram que o aumento da proporção de BL reduz a cristalinidade do polímero e consequentemente aumenta sua degradação, corroborando com os achados de Loh (2008), Barikani (2007) e Huang, (1989) que demonstraram que o aumento da cadeia do poliéster aumenta a taxa de degradação do polímero. Propriedades de degradação dos polimeros utilizados na ET são de crucial importância para a seleção de biomateriais bem como o sucesso na regeneração de tecidos (Sung, 2004).

O poliuretano biodegradável sintetizado a partir de 1,4- butano diisocianato (BDI), tiramina como extensor de cadeia e poli (caprolactona) com massa molecular variando de 1100 e 2700 g/mol apresentam um aumento da temperatura de fusão de 21ºC para 61ºC e um aumento do módulo de estocagem a 37ºC de 52 para 278 MPa quando há um aumento do peso molecular do PCL, sugerindo que o aumento da cristalinidade do macrodiol de PCL contribui para as propriedades mecânicas do polímero (Kavlock, 2007).

Alperin e colaboradores (2005) demonstraram a proliferação de células-tronco embrionárias diferenciadas em cardiomiócitos sobre filmes de PU com PCL. A proliferação de miócitos mostrou uma contratilidade completa e algumas propriedades consistentes nos primeiros estágios de diferenciação de cardiomiócitos. Os autores concluiram que o filme de PU provia um material com propriedades mecânicas apropriadas para suportar a contratura celular.

3.3.4. Avaliação de citotoxicidade em Biomateriais

Equipamentos médicos e biomateriais implantados são freqüentemente avaliados em razão de sua reatividade biológica. O cultivo de células in vitro constitui uma valiosa ferramenta para se conhecer os mecanismos pelos quais os biomateriais podem produzir reações adversas a nível celular, sendo aceito como um ótimo método sensivel para testes de biocompatibilidade (Bricanti, 2006; Bhatia, 2008).

As culturas de células, preferencialmente obtidas de pacientes, bem como células-tronco (Vert, 2007), fibroblastos e outros tipos celulares que secretam quantidades suficientes de proteínas da matriz extracelular são mantidas por um determinado período para fornecer estruturas que sirvam para a reconstrução de tecidos lesados (Yang, 2007), simulando a matriz extracelular encontrada nos tecidos, proporcionando estrutura semelhante as dos órgãos.

Além de simular reações biológicas que ocorrem no organismo este método é considerado de baixo custo para o desenvolvimento do material (Hanks, 1996). Segundo Takamori (2006) os ensaios de citotoxicidade também podem ser utilizados na fase de desenvolvimento do produto, quando se deseja estabelecer a melhor proporção entre os componentes de um biomaterial ou quando se modifica um material já existente.

esses produtos no meio (solvente) para o contato com as células e assim avaliar a sua citotoxicidade.

Testes de contato direto e indireto utilizam escores visuais da interação material-célula, nos quais os biomateriais são avaliados baseados alterações morfológicas das células, incluindo a lise celular, o arredondamento, a difusão (extensão), a proliferação e o contato célula-célula (Bhatia, 2008). Já o método de extração é utilizado como alternativa para excluir os possíveis danos causados pelas interações mecânicas com o material ou contato com o agar, consequentemente aumentando a sensibilidade do procedimento do teste (Bricanti, 2006).

Os tempos de exposição aos materiais testados podem ser de curta duração, envolvendo períodos de até 4 horas ou de longa duração, correspondendo a períodos de 24 horas ou mais (Barile, 1994).

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Síntese do Polímero

O poliuretano (PU) foi sintetizado utilizando os seguintes reagentes: HDI (hexametileno diisocianato, Merck); PCL (ε-policaprolactona diol, MM= 2.000 g/mol, Acros Organics), DBTDL (dibutildilaurato de estanho, Miracema-Nuodex Ind.); acetona P.A. (Merck). Para o índice de acidez foi utilizado: acetona P.A. (Vetec) e solução KOH a 0,3359 M.

A reação da formação do poliuretano foi realizada em uma etapa sem a utilização de extensor de cadeia. Foi utilizado um reator de vidro com agitação mecânica acoplado a um condensador e um termopar para o controle da temperatura reacional (Figura 4.1.1).

Pesou-se 99,46 g (0,0497 mol) de PCL (Mn 2.000 g/mol) que ficou em agitação dentro do reator a 60°C, com 100 mL de sol vente acetona até completa solubilização. Após, adicionou-se 0,1157g (0,1832 mmol) de DBTDL e 10,06 g (0,0598 mol) de HDI com a ajuda de um funil de adição. A razão de NCO/OH utilizada foi de 1,20. Toda a reação foi feita em atmosfera inerte de N2.

A temperatura do sistema reacional foi mantida a 60°C e para controle de consumo do NCO, após 1 hora de reação foi realizado a titulometria com N-dibutilamina resultando em 0,19% NCO não reagido (residual NCO teórico = 0,78%). Ao fim da reação foi feito uma análise por infravermelho do PU sintetizado para verificar a redução da banda característica de NCO do diisocianato (≈ 2.270 cm-1).

Figura 4.1.1- Sistema reacional utilizado para a síntese do polímero de poliuretano.

4.1.1. Preparação do filme de PU

4.2. Caracterização do Polímero

4.2.1. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)

As análises por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) foram realizadas com HPLC pump-1515 isocrático utilizando detector de índice de refração Waters Intruments 2412 e THF como eluente.

4.2.2. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)

Os espectros de FITR foram obtidos em um espectrofotômetro Perkin Helmer-(célula de seleneto de zinco) em valores de transmitância através do filme de PU.

4.2.3. Ressonância Magnética Nuclear – 1H (1H-RMN)

4.3. Avaliação da Citotoxicidade in vitro

4.3.1. Cultura de Células

Todos os procedimentos experimentais foram realizados levando-se em conta o uso de técnicas assépticas para minimizar a contaminação microbiana. As células de fibroblasto de camundongos NIH-3T3 obtidas pela American Type Culture

Collection (ATCC CRL-1658) foram cultivadas em garrafas de 25 cm2 contendo meio

de cultura Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco), gentamicina

(Gibco) (0,025 g/L), estreptomicina/penicilina (Gibco) (0,1 g/L) e suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Gibco) em uma estufa (Sannyo) a 37oC em atmosfera úmida com 5% de CO2. O meio foi trocado a cada 48 horas.

Depois de atingida a confluência, as células foram lavadas com tampão DPBS (Gibco), após aspirado o DBPS, foram adicionados 3 mL tripisina-EDTA 0,05% (Gibico), para cobrir toda a superfície da garrafa com a solução e em seguida o frasco foi incubado na estufa à 37°C por 3 minuto s. Decorrido o tempo de incubação a cultura foi examinada no microscópio para verificar a remoção total das células da superfície da garrafa e foram adicionados 5 mL de SFB para inativar a ação da tripisina. Em seguida as células foram contadas com auxilio da câmara de Neubauer e plaqueadas em quatriplicata na densidade de 0,5x104 células por poço em placas de cultura de 96 poços.

4.3.2. Teste por Meio de Extração

(área) da amostra, não levando em conta a porosidade. Deste modo foram confeccionados corpos de prova a partir dos filmes de poliuretano com 3 cm2 e colocado em um mL de meio DMEM, o qual foi utilizado como solvente de extração. Os MEs foram incubados em estufa a 37ºC com 5% de CO2 por 24h e somente após este período os meios foram colocados sobre as culturas celulares. Todas as amostras foram esterilizadas com álcool 70º e lavadas com tampão DPBS e em seguida mantidas dentro da capela de fluxo laminar (Vecco) sobre lâmpada UV por duas horas.

Para a avaliação da atividade celular foi escolhida a fase log de crescimento,

pois esta é a fase de maior viabilidade celular e atividade metabólica e, por isso, é o período ideal para a experimentação e estudo (Peres, 2005).

4.3.3. Ensaio de viabilidade celular pelo método do MTT

Após cada período de incubação com o ME as culturas de células foram lavadas com tampão DPBS (100 µL) e logo após foram adicionadas no meio DMEM (50 µL/poço) contendo 10% da solução de MTT (Sigma) na concentração de 5mg/mL. As células foram incubadas por 4 horas em estufa (Sannyo) a 37ºC contendo 5% de CO2. Após a incubação, o meio com MTT foi aspirado e logo em seguida adicionado 100µL de DMSO (Sigma) foi adicionado para solubilizar os sais de formazan. A conversão do produto de MTT (medida da viabilidade celular) foi mensurada através da densidade ótica (OD) com espectrofotômetro Mircroplate

Reader (BioRad) a 570 nm. A média da OD para o controle negativo (DMEM)

representa 100% de viabilidade celular. Todas as amostras foram feitas em quatriplicatas e repetidas três vezes.

Os valores de viabilidade celular foram classificados segundo a norma

U.S. Pharmacopeia & the National Formulary (USP-NF18) conforme mostrado no

Quadro 4.3.1. Escala graduada para Teste de Meio de Extração (ME).

Grau Tipo de resposta Celular Comentários sobre a Resposta Celular

0 Nenhuma Resposta celular adversa não encontrada

1 Mínima Não mais do que 20% das células apresentam resposta adversa

2 Média Não mais do que 50% das células apresentam resposta adversa

3 Moderada Não mais do que 70 % das células apresentam resposta adversa

4 Severa Células apresentam aproximadamente resposta adversa completa

Adaptada a partir da USP23-NF18.

4.4. Avaliação da adesão Celular sobre o filme de PU

Para a adesão celular, os filmes de PU foram cortados com uma área de 1 cm2 e esterilizados com álcool 70º, seguido por lavagem com tampão DPBS e mantido sobre luz UV por duas horas. Posteriormente foram colocados em placas de cultura de 6 poços. Onde 1,5 x 104 células por poço foram cultivadas em placas separadas para os períodos de 24, 48 e 72 horas e incubadas em estufa a 37ºC contendo 5% de CO2. Sendo utilizado como controle a cultura de células sobre a placa de poliestireno.

lâminas foram observadas em microscópio óptico (Zeiss, Axiolab) acoplado a uma câmera digital (Olympus Qcolor3), para a aquisição das imagens.

4.5. Analise estatística

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

O polimero de PU obtido por reação em uma etapa com catalisador de estanho foi caracterizado por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e Ressonância Magnética Nuclear de Próton (1H-RMN) e estes serão discutidos nos itens 5.1. ao 5.3. A avaliação de citotoxicidade e adesão celular serão discutidas nos itens 5.4. e 5.5.

5.1. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)

Através do GPC obteve-se a massa molar numérica média (Mn), a massa molar ponderal média (Mw) e o índice de polidispersão (IP) do polímero de PU, descritas na Tabela 5.1.1.

Tabela 5.1.1. Massas molares (Mw e Mn) do polímero de poliuretano (PU).

Mw (g/mol) Mn (g/mol) IP (Mw/Mn)

PU 175625 120359 1,46

Solvente: THF

distribuição do peso moleculares influenciam diretamente nas propriedades mecânicas do material. Não foi encontrado na literatura dados referentes a massa molar de poliuretano sintetizado a partir do HDI e PCL para que fosse possível comparar os dados obtidos neste trabalho.

5.2. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)

Os espectros de FTIR do polímero sintetizado (a), PCL (b) e HDI (c) são mostrados na figura 5.2.1, sendo as atribuições das bandas realizadas em comparação aos valores das freqüências características para os grupos existentes na molécula, de acordo com a literatura (Silverstein, 1991).

Figura 5.2.1 Espectro de Infravermelho do (a) polímero de poliuretano (PU), (b) poli(caprolactona) (PCL) e (c) hexametileno diisocianato (HDI)

a

b

c

1.524 1.724

C=O

C=O 1.721

1.764

C=O 3.402

OH

Na Tabela 5.2.1 são apresentadas as atribuições das bandas características para o filme do polímero (PU), poliol (PCL) e diisocianato (HDI) respectivamente.

Tabela 5.2.1. Atribuições das bandas referentes ao espectro do PU, PCL e HDI.

Comprimento de onda (cm-1) Atribuição (PU)

3.382 νs NH (uretano)

2.936 – 2.865 νas CH2 - νs CH2

1.724 ν C=O (uretano + éster)

1.524 ν CN + δs NH (uretano)

1.461 δs CH2

1.237 ν C-O (uretano)

1.062 ν C-O (éster) + ν N-C (uretano)

Comprimento de onda (cm-1) Atribuição (PCL)

3.402 OH

2.941 – 2.865 νas CH2 − νs CH2

1.721 ν C=O (éster)

1.239 νas C-O (éster)

1.064 ν C-O

Comprimento de onda (cm-1) Atribuição (HDI)

2.936 – 2.860 νas CH2 − νs CH2

2.258 ν N=C=O

1.764 ν C=O

1.461 δs CH2

ν: estiramento; as: assimétrico, s: simétrico e δ: deformação angular.

Marcos-Ferández (2006) e Guan (2005). A banda característica do grupo NCO em torno de 2268 cm-1 é encontrada no espectro, mas com uma diminuição acentuada quando comparado a banda encontrada no espectro do HDI, deste modo confirmando a reação entre os grupos NCO do diisocianato com o poliol. Nas regiões de 2.936 cm-1 e 2.865 cm-1 do espectro de PU, observam-se as bandas características de estiramento assimétrico e simétrico de CH2, respectivamente. A banda na região de 1.724 cm-1(Tab. 5.2) é atribuída ao estiramento da carbonila (C=O) do grupo uretano e éster, referente a formação da ligação uretano (grupo – NHCOO–), com a diminuição concomitante do grupo isocianato (–NCO) em 2.268 cm-1 durante a reação (Zhang, 2000). Outra banda que caracteriza a formação do polímero pode ser observada em 1.062 cm-1 referente ao estiramento C-O proveniente do PCL e do estiramento N-C devido a ligação uretano.

Na Figura 5.2.1 no espectro do HDI aparece uma banda de alta intensidade em 2.258 cm-1 característico do estiramento simétrico do grupo N=C=O e na região de 1.461cm-1 referente a deformação angular do grupo metileno do diisocianato. As bandas características do estiramento assimétrico e simétrico das ligações (C–O) do poliéster ocorrem em 1.239 cm-1 e 1.064 cm-1, respectivamente.

5.3. Ressonância Magnética Nuclear – 1H (1H-RMN)

As analises do 1H-RMN nos permitem observar a formação do polímero de PU a partir de HDI e PCL. O espectro do polímero com os seus respectivos deslocamentos químicos é mostrado na Figura 5.3.1.

46

F

ig

ur

a 5

.3

.1

E

sp

ec

tro

d

e ₁

H

-R

M

N

d

o p

olí

m

er

o d

e P

U

5.4. Citotoxicidade pela redução do MTT

Os ensaios de citotoxicidade permitem um controle cuidadoso do ambiente físico-químico e fisiológico, fornecendo consistência na amostragem e reprodutibilidade dos dados, tais testes utilizam células de tipos específicos (Fresheney, 2001). Valores de absorbância mensurados pela redução do sal de formazan nas mitocôndrias estão diretamente relacionados com a viabilidade celular (Gomes, 2001).

A tabela 5.4.1 mostra os valores das médias das absorbâncias e seus desvios padrão e a tabela 5.4.2 mostra os valores médios de porcentagem da viabilidade celular e seus desvios padrões nos diferentes períodps de cultura de fibroblastos com o polímero (PU).

Tabela 5.4.1. Valores da média e desvio padrão de absorbância nos períodos de 24, 48 e 72h.

Grupo

Período de incubação em horas

24 48 72

PU 0,173±0,005 0,255±0,038 0,305±0,029

CN 0,231±0,003 0,326±0,007 0,333±0,019

CP 0,087±0,004 0,083±0,005 0,082±0,006

Tabela 5.4.2. Valores da média e desvio padrão de porcentagem de viabilidade celular nos períodos de 24, 48 e 72h.

Grupo

Período de incubação em horas

24 48 72

PU 75,03%±1,95 78,22±11,7 91,49±8,7

CN 99,85±1,32 99,89±1,9 99,90±5,8

CP 37,51±1,5 25,35±1,5 24,52±1,7

PU: Poliuretano, CN: controle negativo e CP: controle positivo

Culturas de células NIH3T3 expostas a extrato de PU

PU24h CN24h CP24h PU48h CN48h CP48h PU72h CN72h CP72h 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

*

*

**

**

**

periodos de cultura

% v ia b il id ad e ce lu la r

Figura 5.4. 1.Viabilidade celular por período de tempo. PU: polímero, CN: controle negativo (*p< 0,01)

e CP: controle positivo ( ** =p<0,01).

A viabilidade das células incubadas com extrato do meio com o polímero foi significativamente diferente (**p<0.01) ao controle positivo (CuSO4) nos diferentes tempos de cultura. Quando comparadas ao controle negativo apresentaram um p<0.01 (*) nos períodos de 24 e 48 horas e, no período de 72horas não foi observada diferença significativa em relação a viabilidade das células cultivadas em meio DMEM (CN).

Segundo Minnem e colaboradores (2005) a biocompatibilidade é o maior problema no desenvolvimento de novos materiais biodegradáveis utilizados na engenharia de tecidos e o método de MTT é utilizado como teste para avaliar a atividade metabólica das células expostas a estes materiais.

não apresenta resposta celular adversa e o grau 4 como material que apresenta uma resposta adversa severa. O PU sintetizado neste trabalho quando comparado ao controle negativo apresentou, conforme a norma USP 23-NF18, grau 2 e 1 na escala nos períodos de 24 e 48 horas, respectivamente, (p<0,01) o que corresponde a uma resposta celular adversa média a mínima. No período de 72 horas (p>0,05) apresentou grau 0 na escala correspondendo a nenhuma resposta adversa do biomaterial frente as culturas de células expostas ao extrato de PU.

Ao contrário os controles positivos apresentaram uma resposta celular severa a moderada com mais de 70% de danos nas células nos períodos de 48 e 72 horas (p<0,01) e em torno de 60% no período de 24 horas quando comparados aos controles negativos. Estes dados eram esperados uma vez que o cobre tem efeito citotóxico, demonstrando que a avaliação pelo método de MTT foi satisfatória.

Segundo Guelcher (2005), os poliuretanos sintetizados com PCL e PEG e diiisocianatos alifáticos apresentam uma alta viabilidade celular quando células de osteoblastos foram expostas ao polímero. Deste modo, a sua química não citotóxica faz destes poliuretanos bons candidatos para o desenvolvimento de implantes biomédicos.

Guan (2005) em sua laboriosa síntese de poliuretanos a partir de 1,4- butanodiisocianato, PCL, PCL-PEG-PCL, putrescina como extensor de cadeia e peptídeos como sítio ativo para degradação enzimática demonstrou que células de endotélio humano quando expostas aos extratos do polímero não apresentaram efeitos citotóxicos. Hyridia (2008) estudando a citocompatibilidade de PU em contato direto e extrato do polímero com fibroblastos demonstrou que não houve efeito citotóxico e nem lise celular.

um achado interessante, pois sugere que a proliferação dos fibroblastos ocorram de uma maneira moderada, minimizando a resposta primária das células em contato com o polímero.

5.5. Adesão celular

A Figura 5.5.1 mostra as células de fibroblastos cultivadas sobre o filme de PU em 24 horas. Figura 5.5.2 em 48 horas; Figura 5.5.3 em 72 horas e a Figura 5.5.4 demonstra as células sobre a placa de cultura (controle).

Figura 5.5.1.Células de fibroblastos sobre filme de PU em 24h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x.

Figura 5.5.2.Células de fibroblastos sobre filme de PU em 48h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x.

A

A B

Figura 5.5.3.Células de fibroblastos sobre filme de PU em 72h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x.

Figura 5.5.4. Células de fibroblastos sobre placa de cultura (poliestireno) aumento de 100x.

A análise por microscopia ótica das culturas de fibroblastos sobre o filme de PU nos períodos de estudo apresentam morfologia semelhantes as células do controle positivo (Figura 5.5.4), homogeneamente distribuídas, apresentando aspecto alongado, com inúmeros prolongamentos citoplasmáticos, e interações célula-célula de acordo como já descrito pelos autores (Lakard, 2004; Oezyurek, 2008). Neste estudo não foi avaliada a proliferação celular, mas podemos observar que as células aderidas nos filmes de PU apresentaram uma tendência crescente de proliferação com os períodos de cultura, isto é; maior número de células com períodos mais longos em cultura.

Para que ocorra a aderência das células nos materiais utilizados em cultura celular é necessário que a superfície de crescimento seja carregada negativamente.

Desta forma, os plásticos utilizados em placas de cultura são tratados afim de aumentar a sua carga líquida negativa na superfície, permitindo a aderência eletrostática das células (Peres, 2005).

Embora as células possam aderir primeiramente por forças eletrostáticas (Kung, 2005), elas necessitam que moléculas de adesão celular, e integrinas, se liguem ao substrato formando ligações químicas. A ativação ocorre por meio de estímulos locais, como mediadores solúveis (p.ex., citoquinas, fatores de crescimento, hormônio) ou interfaces sólidas, acompanhado pela mudança conformacional da sua estrutura tendo como resultado final a modulação da afinidade pelo ligante (Silveira, 2007). A adesão celular por meio das integrinas desencadeia uma série de vias de sinalização celular terminando em transcrição de genes responsáveis pela sobrevivência e proliferação celular (Lim, 2006). Outro fator importante desencadeado por essa interação célula-superfície é a secreção de proteínas da matriz extracelular.

A adesão celular está envolvida na integração com os biomateriais. A biocompatibilidade dos materiais está intimamente relacionada com o comportamento celular, quando em contato com estes, e, particularmente, com a adesão celular à sua superfície. A ligação, a adesão e a proliferação celular na superfície, fazem parte da primeira fase da interação célula-material (Anselme, 2000).

Dey (2008) avaliou a biocompatibilidade de PU em cultura in vitro de células 3T3 de fibroblastos e células musculares da aorta humana. O crescimento e proliferação dos fibroblastos e células musculares in vitro demonstrarou uma boa interação célula-matérial. Ensaios quantitativos confirmaram que as células cresceram e proliferaram sobre filmes de PU. O mesmo foi encontrado por Zia (2008) que demonstrou que células de fibroblastos são citocompativeis com filmes de PU.

modulam a regeneração do tecido lesado em contato com o implante, pois a atividade enzimática e hidrolítica dos macrófagos permitem o surgimento de espaços dentro da matriz polimérica, facilitando a proliferação celular e a deposição de uma nova ECM sintetizada pelos fibroblastos (Li, 2006).

Zhang (2000) utilizando células-tronco de medula óssea em arcabouços de PU mostrou que após 7 dias de cultura as células mantiveram uma morfologia similar as células que cresceram sobre a placa de estireno. Grad (2003) utilizou condrócitos sobre uma matriz porosa de PU e constatou que ao longo do período de culturas as células mantiveram o seu fenótipo. Corroborando as observações obtids no presente estudo onde as células mantiveram o mesmo fenótipo quando cultivadas sobre uma superfície de poliuretano.

6. CONCLUSÕES

A síntese do polímero de PU e analise da sua citocompatibilidade em culturas de fibroblastos permitiram concluir que:

• O polímero de PU sintetizado apresentou uma massa molar ponderal média de 175.625 g /mol, demonstrado pela analise por GPC.

• A analise por FTIR demonstrou os principais grupos de átomos característico do polímero de PU, pela presença das bandas de absorção em 3.382 cm-1 da ligação N-H, 1.724 cm-1 ligação C=O (uretano + éster), 1.524 cm-1 das ligações CN e NH, 1.237cm-1 C-O do uretano, e pela Ressonância Magnética Nuclear permitiu que fosse determinada a estrutura química do polímero.

• O teste do MTT mostrou que o PU não é tóxico e que os fibroblastos de camundongo aderem e proliferam sobre o filme de PU.

7. PROPOSTAS PARA TRABALHOS FUTUROS

• Avaliação de citocompatibilidade do polímero PU com diferentes células humanas.

• Quantificação da expressão de genes que codifica proteínas de adesão celular e matriz extracelular.

• Adsorção de proteínas sobre a superfície do polímero visando avaliar mais detalhadamente a interação proteína celular e polímero.

• Teste de degradação in vitro do polímero para definir sua taxa de degradação, bem como, síntese do polímero com extensores de cadeia com sítios ativos para degradação enzimática.

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