Papel do sistema renina angiotensina nas alterações cardiovasculares do diabetes experimental: avaliações "in vivo" e "in vitro"

PAPEL DO SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA NAS ALTERAÇÕES CARDIOVASCULARES DO DIABETES EXPERIMENTAL: AVALIAÇÕES “IN VIVO” E “IN VITRO”.

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo – Escola Paulista de Medicina para

obtenção do título de Mestre em Ciências.

São Paulo

PAPEL DO SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA NAS ALTERAÇÕES CARDIOVASCULARES DO DIABETES EXPERIMENTAL: AVALIAÇÕES “IN VIVO” E “IN VITRO”.

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo – Escola Paulista de Medicina para

obtenção do título de Mestre em Ciências.

Orientação: Profa. Dra. Maria Cláudia Irigoyen

Co-Orientação: Profa. Dra. Dulce Elena Casarini

Profa Dra. Kátia De Angelis Lobo d’ Avila

São Paulo

ou para a filosofia: encontrar um problema, ver sua beleza e apaixonarmos-nos por ele; até que a morte nos separe, a não ser que obtenhamos uma solução. Mas ainda que encontremos uma solução, poderemos descobrir, para nossa satisfação, a existência de toda uma família de encantadores, se bem que talvez difíceis problemas-filhos, para cujo bem estar poderemos trabalhar, com uma finalidade em vista, até o fim de nossos dias.”

À minha família, meu tesouro, por todo amor, compreensão e fortaleza nos momentos difícies.

À Deus, por poder vivenciar tantas experiências e ter força para vencer as dificuldades.

À todos os meus amigos pelo apoio nos momentos difíceis me dando incentivo para continuar a trilhar meu caminho pela pesquisa.

Ao meu namorado e companheiro, Emerson, pelo amor e compreensão em todos os momentos estando sempre ao meu lado.

À Professora Dra. Maria Cláudia Irigoyen, pela compreensão e dedicação constante, dando confiança e oportunidade de trabalhar em seu laboratório e pelo ensinamento e amor à fisiologia.

À Professora Dra. Kátia De Angelis Lobo d’ Ávila pela oportunidade de estar em seu laboratório e aprender através de seu exemplo.

Páginas

Agradecimentos...vi

Lista de Tabelas...xiii

Lista de Figuras...xv

Lista de Abreviaturas...xxii

Resumo...xxvi

Abstract...xxx

1. INTRODUÇÃO...2

1.1. Diabetes Mellitus e Sistema Cardiovascular...3

1.2. Sistema Renina-Angiotensina Cardíaco...5

1.3. Sistema Renina Angiotensina e Cardiomiopatia Diabética...10

2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS...15

2.1.Objetivos Específicos...16

3. MATERIAIS E MÉTODOS...18

3.1. Animais...18

3.1.1. Procedimentos “in vivo”...18

3.1.2. Grupos Experimentais...18

3.1.3. Indução Do Diabetes Mellitus...19

3.1.4. Dosagem Dos Níveis Plasmáticos De Glicose...19

3.1.5. Tratamento com Inibidor da ECA...19

3.2. Análises Hemodinâmicas ...20

3.2.1. Ecocardiograma...20

3.2.2. Procedimento Cirúrgico...22

Volume...23

3.2.5. Análise dos Sinais...24

3.2.6. Determinação da atividade da ECA ...25

3.3. Procedimentos “in vitro”...27

3.3.1. Cultura de fibroblastos cardíacos...27

3.3.2. Protocolo Experimental...28

3.3.3. Tratamento com glicose...28

3.3.4. Determinação da atividade da ECA...28

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA...29

5. RESULTADOS...31

5.1. ESTUDOS REALIZADOS “in vivo”...31

5.1.1. Peso Corporal...33

5.1.2. Peso Coração...34

5.1.3. Razão Peso do Coração/Peso Corpóreo...35

5.2. Avaliação da Glicemia...36

5.3. Avaliações Ecocardiográficas...37

5.3.1. Medidas Morfométricas...38

5.3.2. Medidas de Função Sistólica...42

5.3.3. Medidas de Função Diastólica...44

5.4. Pressão arterial e freqüência cardíaca nos animais acordados...46

5.5. Função ventricular esquerda no período basal...47

5.7.1. Atividade da ECA no soro...56

5.7.2. Atividade da ECA no coração...58

5.7.3. Razão do substrato ZPhe e His Leu no soro e no coração...60

5.7.4. “Western Blotting”...62

5.8. Correleções da Atividade da ECA com medidas funcionais... 66

5.9. ESTUDO REALIZADO “in vitro”...70

5.9.1. Atividade da ECA celular após tratamento com glicose...70

6. DISCUSSÃO...74

6.1. Avaliações do peso corporal e da glicemia...74

6.2. Morfometria e função cardíaca: avaliações não invasivas (ecocardiográficas) e invasivas (cateterização do VE)...76

6.2.1. Efeitos do Diabetes...76

6.2.2. Efeitos do tratamento com Enalapril...79

6.3. Avaliações hemodinâmicas...82

6.4. Participação do SRA na função cardiovascular...85

6.4.1. Avaliações “in vivo”...85

6.4.2. Avaliações “in vitro”...90

7. SUMÁRIO E CONCLUSÕES...93

Páginas TABELA 1: Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores absolutos nos grupos estudados aos 15 dias de protocolo...40

TABELA 2: Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores corrigidos pelo peso corpóreo nos grupos estudados aos 15 dias de protocolo...40

TABELA 3: Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores absolutos nos grupos estudados aos 30 dias de protocolo...41

TABELA 4: Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores corrigidos pelo peso corpóreo nos grupos estudados aos 30 dias de protocolo...41

TABELA 5: Medidas ecocardiográficas de função sistólica nos grupos estudados aos 15 dias de protocolo...43

TABELA 6: Medidas ecocardiográficas de função sistólica nos grupos estudados aos 30 dias de protocolo...43

estudados aos 30 dias de protocolo...46

TABELA 9. Pressão arterial diastólica (PAD), sistólica (PAS) e média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) nos animais acordados nos grupos estudados...47

TABELA 10. Pressão sistólica ventricular (PSVE), freqüência cardíaca (FC) e pressão diastólica final (PDF) nos grupos estudados no período basal...49

TABELA 11. Derivadas de contração (+dP/dt) e de relaxamento (-dP/dt) do ventrículo esquerdo nos grupos estudados no período basal...50

Páginas FIGURA 1. Atividade da ECA no soro de animais diabéticos tratados por cinco dias com enalapril nas doses de 1mg/Kg, 10mg/Kg e 30mg/Kg. Esses grupos foram comparados aos animais controles. * p”YVFRQWUROH$129$WZR way, seguida de pós teste de Tukey)...32

FIGURA 2. Peso corporal dos ratos controle e diabéticos, tratados ou não com enalapril. * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVJUXSRVFRQWUROHHQDODSUL

(ANOVA-two way, seguida de pós-teste Tukey)...34

FIGURA 3. Peso do coração dos ratos controles e diabéticos, tratados ou não com enalapril. * p” YV JUXSR FRQWUROH S” YV JUXSRV FRQWUROH

enalapril; (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey)...35

FIGURA 4. Razão peso do coração (g) / peso (g) corpóreo dos ratos controle e diabéticos, tratados ou não com enalapril; ANOVA-two way, seguida de pós-teste Tukey)...36

enalapril. (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey)...37

FIGURA 6. Pressão sistólica ventricular (mmHg) no período basal, na sobrecarga de volume e durante o retorno. Os dados representam média ±

desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVJUXSRVFRQWUROHHQDODSULO

e *** p” YV JUXSR GLDEpWLFR (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...51

FIGURA 7. Freqüência cardíaca (bpm) no período basal, na sobrecarga de volume e durante o retorno. Os dados representam média ± desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVJUXSRFRQWUROHHQDODSULO (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...52

FIGURA 8. Pressão diastólica final (mmHg) no período basal, na sobrecarga de volume e durante o retorno. Os dados representam média ± desvio padrão; * p” YV JUXSR FRQWUROH S” YV JUXSR GLDEpWLFR (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...53

FIGURA 9. Derivada de Contração (mmHg/ seg) no período basal, na sobrecarga de volume e durante o retorno. Os dados representam média ± desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVJUXSRFRQWUROHHQDODSULO

sobrecarga de volume e durante o retorno. Os dados representam média ±

desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVFRQWUROHHQDODSULO

p” YV JUXSR GLDEpWLFR (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...55

FIGURA 11. Atividade da ECA (mU/mg de proteína) medida no soro utilizando o substrato ZPhe. Os dados representam média ± desvio padrão; * p” YV controle; ** p”YVJUXSRFRQWUROHHQODSULO (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...57

FIGURA 12. Atividade da ECA (mU/mg de proteína) medida no soro utilizando o substrato HHL. Os dados representam média ± desvio padrão; * p” YV controle; ** p”YVJUXSRFRQWUROHHQODSULO S”YV JUXSR GLDEpWLFR

Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...58

ZPhe-HL e HHL medida no soro nos grupos estudados. Os dados representam média ± desvio padrão; * p” YV JUXSR FRQWUROH S” YV JUXSR

diabético; (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...61

FIGURA 16. Razão das atividades enzimáticas da ECA entre os substratos ZPhe-HL e HHL medida no coração nos grupos estudados. Os dados representam média ± desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROH (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...62

FIGURAS 17 A e B. Análise por “ Western Blotting” do homogenato de tecido cardíaco de ratos controles (A) e diabéticos (B). As flechas indicam o peso molecular...63

FIGURAS 18 A e B. Análise por “ Western Blotting” do homogenato de tecido cardíaco de ratos controles enalapril (A) e diabéticos enalapril (B). As flechas indicam o peso molecular...64

FIGURA 19. Densidade da ECA medida no coração utilizando os anticorpos nos grupos estudados. Os dados representam média ± desvio padrão; # p”YV densidade da ECA 69 KDa no mesmo grupo; (Anova-Two way, seguida de pós-teste de Tukey)...64

desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVJUXSRFRQWUROHHQODSULO

*** p” YV JUXSR GLDEpWLFR (Anova-two way, seguida de pós-teste de Tukey)...65

FIGURA 21. Correlação entre a razão ZPhe/HHL no coração com a pressão diastólica final (PDF) no período basal entre a associação dos grupos controle e diabético...67

FIGURA 22. Correlação entre a razão ZPhe/HHL no coração, com a pressão diastólica final (PDF) no terceiro minuto de retorno entre a associação dos grupos controle e diabético...67

FIGURA 23. Correlação entre a razão ZPhe/HHL no coração, com a pressão diastólica final (PDF) no terceiro minuto de retorno entre os grupos controle e diabético tratados ou não com enalapril...68 FIGURA 24. Correlação entre a razão ZPhe/HHL no soro com a pressão diastólica final (PDF) no período basal entre os grupos controle e diabético tratados ou não com enalapril...69

controle (D-MEM com 5 mM de glicose, 88% células viávies), Controle de osmolaridade (D-MEM com 5 mM de Glicose + Manitol 20 mM, 92% células viáveis), 25 mM de glicose (D-MEM com 25 mM de glicose, 92% células viáveis)...71

FIGURA 27. Atividade da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) em culturas primárias de fibroblastos cardíacos após 48 hs de diferentes tratamentos. Situação controle (D-MEM com 5 mM de glicose), 100% de atividade; Controle de osmolaridade (D-MEM com 5 mM de Glicose + Manitol 20 mM), 97,17% de atividade; 25 mM de glicose (D-MEM com 25 mM de glicose), 185,1% de atividade. Os dados representam 5 diferentes ensaios, expressos através da porcentagem (%) de alteração em relação à situação controle. * p ≤

ANG I: Angiotensina I ANG II: Angiotensina II

AT1: Receptor de Angiotensina I AT2: Receptor de Angiotensina II bpm: Batimentos por minuto BSA: albumina bovina cm: centímetros CO2: Gás carbônico DC: Débito cardíaco DIA: Diástole

DIAVE: Diâmetro da cavidade do ventrículo esquerdo

DMEM: “Dulbeccos Modifieed Eagle Medium” = meio de cultura + dP/dT: Máxima derivada de contração

- dP/dT: Mínima derivada de relaxamento

DSVE: Diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo ECA: Enzima conversora de angiotensina I ev: Endovenosa

FBS: Soro fetal bovino FC: Freqüência cardíaca

FCVE: Freqüência cardíaca do ventrículo esquerdo FE: Fração de ejeção

FS: Fração de encurtamento g: gramas

Hz: Heartz

IDM: Índice de desempenho miocárdico InCor: Instituto do Coração

ip: intraperitorial KDa: Kilodáltons Kg: Kilo

M: Molar mg: Miligrama

mg/dl: Miligrama por decilitro mg/Kg: Miligrama por Kilograma mg/µl: Miligrama por microlitro Min: Minuto

ml: mililitro mM: milimolar

mmHg: milímetros de mercúrio

mmHg/seg: milímetros de mercúrio por segundo MVE: massa do ventrículo esquerdo

n: número de indivíduos na amostra NaCl: Cloreto de sódio

NaOH: Hidróxido de sódio P: polietileno

PA: Pressão Arterial

PBS: “Phosphate Buffer solution” = solução tampão fosfato PDF: Pressão Diastólica Final

pH: Concentração Hidrogeniônica

Pico E: referente ao pico de contração atrial

PP: Espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo em sístole e diástole PPVE: Espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo

P/S: Penicilina/Streptomicina

PSVE: Pressão Ventricular Sistólica PVE: Pressão Ventricular Esquerda Relação E/A: Relação dos picos E e A Rpm: rotações por minuto

SIV: Septo interventricular

SRA: Sistema Renina Angiotensina STZ: Estreptozotocina

TE: Tempo de ejeção

TRIV: Tempo de relaxamento isovolumétrico

VCF: Velocidade de encurtamento circunferencial da fibra miocárdica VE: Ventrículo Esquerdo

PAPEL DO SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA NAS ALTERAÇÕES CARDIOVASCULARES DO DIABETES EXPERIMENTAL: AVALIAÇÕES “IN VIVO” E “IN VITRO”.

Autora: Christiane Malfitano

Orientadora: Dra. Maria Claúdia Irigoyen

foi observado com o substrato HHL no soro e coração. Entretanto, observou-se uma ativação maior da ECA pelo substrato ZPhe, tanto no soro como no coração em relação ao substrato His Leu. Na análise da expressão proteica da ECA por “western blotting” no coração observou-se uma expressão protéica da ECA aumentada nos animais diabéticos e diabéticos tratados em relação aos controles com os dois anticorpos utilizados: alto peso molecular (136KDa) e de baixo peso (69KDa). Os resultados de expressão protéica aumentada da ECA, foram acompanhados de redução da atividade da enzima no tecido cardíaco. A atividade bioquímica da ECA analisada em cultura de fibroblastos cardíacos estava aumentada em torno de 85% após tratamento com glicose.

ROLE OF RENIN ANGIOTENSIN SYSTEM ON CARDIOVASCULAR CHANGES IN EXPERIMENTAL DIABETES: “IN VIVO” AND “IN VITRO” EVALUATION.

Author: Christiane Malfitano Adviser: Dra. Maria Claúdia Irigoyen

molecular weight (136KDa) and low molecular weight (69KDa). The increased ACE protein expression was accompanied by heart reduced ACE activity. Glucose treatment increased ~85% ACE activity in primary cardiac fibroblast cultures.

O advento e a popularização de novas metodologias ao longo das duas últimas décadas vem possibilitando um enorme avanço no conhecimento das bases moleculares de processos biológicos complexos. Uma das conseqüências imediatas deste processo é a unificação progressiva dos vários ramos da biologia experimental, permitindo que, atualmente, biologia celular, bioquímica, genética e fisiologia se desenvolvam de maneira indistinta através de abordagens experimentais fundamentais. Esta revolução nas ciências básicas está nos permitindo identificar e caracterizar, do ponto de vista estrutural, sistemas biológicos que até o momento permaneciam não elucidados.

O diabetes e a hipertensão arterial, são exemplos de doenças complexas onde vários genes interagem com diversos fatores ambientais para gerar um determinado fenótipo. Os mecanismos moleculares relacionados com estas disfunções estão sendo gradualmente esclarecidos com a utilização das técnicas de biologia molecular associadas às técnicas mais tradicionais vindas da biologia celular e fisiologia (Krieger e Dzau, 1991). Nesse aspecto, o diabetes, associado ou não à hipertensão, acumula evidências da existência de cardiomiopatia específica e independente, a qual é a principal causa de morte de portadores de diabetes (Wold, Relling et al., 2001).

regulação distinta e que exercem funções parácrinas e autócrinas juntamente com o SRA circulante endócrino (Dendorfer, Dominiak et al., 2005; Danilczyk e Penninger, 2006; Fleming, Kohlstedt et al., 2006). Desta forma, é fundamental que se conheça a regulação de cada um dos genes do SRA (angiotensinogênio, renina, enzima conversora de angiotensina I - ECA e receptor de angiotensina II) em cada tecido ou tipo celular, sob diferentes estímulos e sob diversas situações fisiológicas e/ou fisiopatológicas.

A seguir, serão apresentados alguns aspectos referentes as alterações que o diabetes mellitus promove no desenvolvimento da função miocárdica, bem como no remodelamento cardíaco influenciado pelo sistema renina angiotensina.

1.1. Diabetes Mellitus e Sistema Cardiovascular

As complicações cardiocirculatórias representam a maior causa de mortalidade e de morbidade entre os pacientes diabéticos. Os estudos de Framingham demonstram que o diabetes dobra o risco de desenvolvimento das doenças cardiocirculatórias no homem e triplica nas mulheres (Muir, Schatz et al., 1992). Os mesmos autores demonstraram, ainda, maior risco dos diabéticos apresentarem lesões coronarianas, maior risco para desenvolver insuficiência cardíaca congestiva, infartos recorrentes, arritmias e choque cardiogênico do que a população não diabética. Além disso, o diabetes, em geral, é associado a dislipidemia, observado-se aumento do LDL- colesterol e redução do HDL-colesterol (Malerbi e Franco, 1992).

1969), têm sido empregados no desenvolvimento do diabetes experimental em ratos, levando à hiperglicemia, polidispsia, poliúria e perda de peso (Yagihashi, 1995). Alguns estudos demonstraram que animais diabéticos apresentam diminuição do fluxo sanguíneo (Cameron, Cotter et al., 1991), alterações na reatividade do músculo liso e do endotélio (Tomlinson, Gardiner et al., 1992) e do músculo esquelético (De Angelis, Cestari et al., 2000), diminuição da contratilidade cardíaca (De Angelis, Oliveira et al., 2000) e aumento do estresse oxidativo (Pieper e Siebeneich, 1997); (De Angelis, Cestari et al., 2000).

1.2. Sistema Renina-Angiotensina Cardíaco

O sistema renina-angiotensina (SRA) desempenha um papel central na regulação da pressão arterial e na manutenção do balanço hidro-eletrolítico (Hackenthal, Paul et al., 1990; Johnston, 1990; Cowley, 1992; Brands e Granger, 1998; Stec e Sigmund, 2001; Skott, 2002). O consistente sucesso dos inibidores e

bloqueadores do SRA no tratamento de hipertensos indica fortemente que este

sistema tem um papel central na hipertensão (Inagami, 1998). As ações biológicas

do SRA são mediadas pelo octapeptídeo angiotensina II via receptores específicos de angiotensina chamados AT1 e AT2, com a maior parte de suas ações clássicas mediadas através do receptor AT1. Classicamente o SRA é visto como um sistema hormonal que envolve uma cascata proteolítica conectada a um sistema de

transdução, aonde a renina, uma enzima proteolítica sintetizada e estocada nas células justaglomerulares localizadas na arteríola eferente renal, cliva o

angiotensinogênio, seu substrato que é produzido no fígado, na porção N-terminal em um decapeptídeo, a angiotensina I (Ang I). Esta é convertida subseqüentemente em Ang II pela enzima conversora de angiotensina (ECA) primariamente na

circulação pulmonar. A ECA, uma dipeptidil-carboxipeptidade, por sua vez é predominantemente uma enzima ligada a membrana que é responsável pela produção de Ang II a partir do precursor inativo Ang I e também pela degradação da bradicinina em fragmentos inativos (Johnston, 1990).

baixas pressões de perfusão. A quantidade de sal que chega no túbulo distal é percebida pela mácula densa e determina a estimulação de liberação de renina

quando é baixa e inibe a liberação quando é alta. A estimulação beta-adrenérgica

libera e o bloqueio inibe a secreção de renina. Além disso, fatores humorais podem

influenciar a secreção de renina, sendo que o mais importante seria a própria Ang II

que inibe a secreção numa alça de retroalimentação negativa (Skott, 2002).

A angiotensina II está envolvida em uma série de funções cardiovasculares

como regulação do tônus vascular periférico e fluxo sangüíneo regional pela

vasoconstrição arteriolar, modulação da atividade simpática local, estimulação de

hiperplasia e hipertrofia celular, liberação de substâncias vasoativas do endotélio e

mediação de inflamação e reparo de tecidos (Johnston, 1990; Reid, 1992;

Ruiz-Ortega, Lorenzo et al., 2001; Stec e Sigmund, 2001; Navar, Harrison-Bernard et al., 2002). Também age promovendo retenção de sódio e água causando

conseqüentemente expansão do volume plasmático. Este efeito é mediado tanto

pelo aumento de secreção de aldosterona pelo córtex adrenal e estimulação direta

da reabsorção tubular de sódio como pelo seu potente efeito dipsogênico (Cowley,

1992), bem como através de alterações na hemodinâmica renal por modificações no

fluxo sangüíneo em medula renal (Cowley, 1997; Brands e Granger, 1998).

A ECA ou cininase II é uma enzima glico-proteica ancorada à membrana

celular onde os sítios catalíticos, presentes na porção N-terminal e C-terminal, estão

expostos na superfície extracelular. Suas ações são relacionadas à da produção da

Ang II a partir do precursor inativo Ang I, bem como da degradação da bradicinina

em fragmentos inativos. Apesar de geralmente não ser considerada o passo

limitante na síntese de Ang II, a ECA é o maior determinante final dos níveis de Ang

somática, ECA testicular e ECA solúvel sendo a isoforma somática a fração mais implicada na produção de Ang II. A ECA tem ampla distribuição no organismo incluindo vasos sangüíneos, coração, rins, adrenais, sistema nervoso central e trato

gastrointestinal, entretanto, o papel funcional em muitos locais ainda é

desconhecido. A principal contribuição da ECA na circulação é a geração de Ang II e

o controle da PA e da homeostase de líquidos corporais. A localização da ECA em tecidos específicos oferece a oportunidade de controlar a síntese de Ang II em nível celular. Portanto, um aumento da atividade da ECA em estados patológicos pode levar a aumento dos níveis de Ang II nos tecidos e na circulação (Johnston, 1990).

Apesar de existirem vias de produção de Ang II não associadas à ECA,

particularmente a quimase cardíaca, o uso de inibidores da ECA tem mostrado que este é responsável pela prevenção quase que total da conversão da Ang I em Ang II. Sugere-se que o sucesso dos inibidores da ECA no tratamento da hipertensão e da insuficiência cardíaca seja atribuído tanto a inibição da ECA tecidual como

plasmática (Dzau, Bernstein et al., 2001). É interessante observar a particular interação entre ECA e o endotélio. Na hipertensão existe disfunção endotelial,

evidenciada, por exemplo, por respostas vasodilatadoras dependentes do endotélio

diminuídas, as quais são melhoradas com o tratamento com inibidores da ECA. Os mecanismos desta resposta não são conhecidos, mas podem envolver a bradicinina,

pois se sabe que a bradicinina pode estimular a liberação de substâncias vasoativas,

particularmente o óxido nítrico e prostaglandinas das células endoteliais (Quaschning, Galle et al., 2003; Bolterman, Manriquez et al., 2005).

Outro meio de regular o SRA é através da expressão de receptores de Ang II, AT1 e AT2 nos tecidos alvo aonde o balanço entre a expressão relativa dos

Ang II (Wehbi, Zimpelmann et al., 2001).

Hoje, o SRA é visto de forma mais ampla, onde a multiplicidade de funções do sistema é produto também da ação “parácrina” e “autócrina” da Ang II e de alguns de seus metabólitos produzidos localmente, criando-se assim o conceito da existência de vários sistemas renina-angiotensina, distribuídos em diferentes órgãos (coração, vasos sangüíneos, medula adrenal, sistema nervoso central, etc.), como possuidores de ação complementar ao clássico SRA. Estes SRA locais parecem ter sua importância ligada ao fato de que exerceriam efeitos diretos sobre mecanismos regulatórios locais, que contribuiriam para um grande número de mecanismos homeostáticos teciduais de desenvolvimento mais lento, porém, de caráter mais permanente, como o crescimento celular, formação da matriz dos tecidos, proliferação vascular, modulação da função do endotélio e controle do processo de apoptose, particularmente, na fase de desenvolvimento embrionário.

O coração pode formar Ang I localmente e convertê-la em Ang II, a qual pode chegar a atingir concentrações duas a três vezes superiores às encontradas no plasma (Danser e Schalekamp, 1996). A mais importante evidência para um SRA local no coração é a presença de ECA (Lindpaintner, Wilhelm et al., 1987), a atividade de renina (Dzau e Re, 1987) e mRNA para renina e angiotensinogênio (Dzau, Brody et al., 1987) em células cardíacas.

Ang II estimula a produção dos fibroblastos cardíacos de ratos neonatos (Schorb,

Booz et al., 1993). Estes efeitos mitogênicos da Ang II são completamente bloqueados pelo losartan (bloqueador do receptor AT1), mas não pelo PD123319 (bloqueador receptor AT2), demonstrando que o receptor AT1 da angiotensina II induz a proliferação dos fibroblatos cardíacos. A Ang II também exerce efeitos sobre os fibroblastos cardíacos adultos (Crabos, Roth et al., 1994). Esse hormônio mostrou promover uma resposta hipertrófica em miócitos e hiperplásica em fibroblastos cardíacos de ratos (Sadoshima e Izumo, 1993).

Todos os componentes do SRA tem sido identificados no coração. Ang II pode ser detectada em ambos átrios e ventrículos e, em culturas de miócitos e fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Estudos em miócitos cardíacos de ratos indicam que esta célula sintetiza renina, angiotensinogênio e ECA (Dostal e Baker, 1999). Além de vias clássicas dependentes, renina e ECA, a Ang II pode também ser gerada por vias alternativas no coração, incluindo as quimases cardíacas. Em humanos, essas quimases, localizam-se no endotélio, interstício e células satélites do coração (Urata, Boehm et al., 1993). A presença de Ang I, Ang II e de receptores para Ang II já foi identificada em fibroblastos e miócitos de ratos neonatos (Dostal e Baker, 1992). Um conjunto de evidências sugere ainda que a Ang II no coração pode agir como um fator de crescimento, aumentando a síntese de proteínas relacionadas com a hipertrofia cardíaca (Miyata e Haneda, 1994).

anticorpo monoclonal anti-miosina; esta infusão, subseqüentemente, causou proliferação dos fibroblastos cardíacos e resultou em formação de cicatriz, indicando os efeitos cardiotóxicos da Ang II in vivo (Tan, Jalil et al., 1991). Então, Ang II in vivo, via receptor AT1, induz diretamente hipertrofia dos miócitos cardíacos, reprogramação gênica, e proliferação dos fibroblastos e subseqüente fibrose, independente do aumento da pressão arterial, indicando que a Ang II pode ser uma das chaves do desenvolvimento da patologia da hipertrofia cardíaca.

1.3. Sistema Renina Angiotensina e Cardiomiopatia Diabética

diabéticos. Além disso, (Wang, Wu et al., 1998), demonstraram, em culturas de células do túbulo proximal, aumento da expressão de angiotensinogênio em ratos hiperglicêmicos. (Dhalla, Liu et al., 1998), observaram em células de músculo liso, desenvolvido em meio de cultura contendo alta concentração de glicose, aumento

do crescimento celular quando comparado com o desenvolvido em meio com baixa

concentração de glicose.

Segundo alguns autores, a angiotensina II possui papel importante no

desenvolvimento da hipertrofia cardíaca, via ativação de receptores AT1 (Sadoshima e Izumo, 1993). Alterações estruturais do miocárdio ocorrem normalmente a$o longo do tempo, após agressões de diferentes etiologias, entre elas o diabetes mellitus. Tais alterações correspondem a uma condição de reestruturação e remodelação do miocárdio que pode desenvolver a hipertrofia ou hipotrofia do tecido. Essas alterações podem ocorrer em função da alteração do tamanho e número dos cardiomiócitos e/ou alteração da síntese de colágeno (Krieger et al., 1994).

A disfunção miocárdica ocorre freqüentemente em pacientes com diabetes mellitus, mesmo sem doença arterial coronariana, sustentando o conceito da cardiomiopatia primária diabética (Regan, Lyons et al., 1977). Anormalidades na função cardíaca, diminuição do pico de pressão ventricular, bem como, diminuição das derivadas de contração e relaxamento do ventrículo esquerdo, ocorrem em animais com diabetes por STZ (Litwin, Raya et al., 1990); (De Angelis, Oliveira et al., 2000). Aumento da massa e disfunção do ventrículo esquerdo foram observados em diagnósticos de pacientes com diabetes tipo II, com ou sem manisfestação de doença cardíaca (Vanninen, Mustonen et al., 1992; Di Bonito, Cuomo et al., 1996).

Rangel et al., 2001), mas outros acham ser independente do controle glicêmico (Beljic e Miric, 1994). Evidências clínicas e experimentais sugerem que embora a cardiomiopatia hipertrófica seja um resultado direto da elevação da pressão arterial, pode também estar associada com resistência à insulina, hiperinsulinemia e alteração da responsividade adrenérgica (Ohta, Kim et al., 1996); (Sowers, Standley et al., 1993). Na falta de doença arterial coronariana e hipertensão, mudanças estruturais e funcionais do miocárdio em pacientes com diabetes tem sido atribuidas à cardiomiopatia diabética (Bell, 1995; Stanley, Lopaschuk et al., 1997).

Sechi et al. (1984) verificaram que, duas semanas após a indução de diabetes com STZ em ratos, ocorreu aumento do número de receptores de angiotensina II no tecido cardíaco. Este aumento foi associado à elevação dos níveis de RNA mensageiro dos receptores AT1 e AT2, sem alterar a concentração de renina, sugerindo possível ativação do sistema renina angiotensina. Isto tem sido verificado tanto em átrios como em ventrículos de ratos diabéticos hipoinsulinêmicos (Sechi, Griffin et al., 1994).

Como podemos observar, existem contradições quanto a ativação do SRA como também estas contradições se estendem aos resultados descritos na literatura sobre o remodelamento cardíaco no diabetes mellitus (Vranes, Cooper et al., 1995) observaram em animais diabéticos aumento de 8% no tamanho do tecido cardíaco. Por outro lado, (Fiordaliso, Li et al., 2000), demonstraram que a injeção de STZ em ratos promoveu redução de 30% da quantidade de miócitos ventriculares e modesta reatividade hipertrófica das células remanescentes. Além disso, o bloqueio de receptores AT1 com losartan reduziu a formação de angiotensina II e preveniu a morte celular verificada em miócitos de ratos diabéticos.

Sabe-se que o desenvolvimento do diabetes promove alterações cardiovasculares importantes que interferem na sobrevida desses paciente. O estudo da função cardíaca (pelo ecocardiograma) e da função ventricular (pela cateterização do VE), bem como a importância do SRA na disfunção cardíaca do diabetes (a nível hemodinâmico e celular), é de grande valia para o entendimento das disfunções cardiovasculares decorrentes dessa patologia e para a busca de novas abordagens terapêuticas.

Neste trabalho testaremos a hipótese de que a ativação do SRA e, mais especificamente o aumento da atividade da ECA, está associada à disfunção cardíaca em animais diabéticos, independente de elevação da pressão arterial, uma vez que o modelo escolhido apresenta diabetes mellitus sem elevação da pressão arterial.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos Específicos

Os objetivos específicos deste trabalho são:

1. Avaliar em ratos controle e diabéticos tratados ou não com inibidor da ECA os seguintes parâmetros:

- Função cardíaca de forma não invasiva pelo ecocardiograma; - Pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) sistêmicas;

- Função ventricular, através da medida direta da pressão ventricular esquerda no basal e durante um protocolo de sobrecarga de volume;

- Atividade da enzima conversora de angiotensina I (ECA) no tecido cardíaco;

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar com dois meses de idade provenientes do Biotério da biotério da Faculdade Medicina Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos em caixas plásticas contendo 4 animais por caixa, a temperatura ambiente entre 22-24º C com luz controlada em ciclo de 12 horas (claro-escuro). A ração e água fornecidas "ad libitum". O protocolo foi aprovado pela Comissão Científica do InCor após aprovação da CAPPesq, e pela FADA (FUNDO DE AUXÍLIO AO DOCENTE e ALUNO) e O Comitê de Etica em pesquisa da Unifesp.

3.1.1. Procedimentos “in vivo”

Foram realizados estudos “in vivo” para avaliar a função ventricular e a atividade da ECA nos corações dos animais dos grupos experimentais.

3.1.2. Grupos Experimentais

Os animais foram divididos nos seguintes grupos: 1. Ratos saudáveis (acompanhados por trinta dias); 2. Ratos diabéticos por STZ (trinta dias);

2. Ratos saudáveis tratados com inibidor da ECA (trinta dias);

3.1.3. Indução Do Diabetes Mellitus

Os animais foram anestesiados com éter sulfúrico e o diabetes foi induzido

por uma única injeção endovenosa (e.v.) de estreptozotocina (STZ, 50 mg/Kg, ev, Sigma Chemical Company, St. Lous, MO, EUA) pela veia da cauda (Rerup, 1970). A STZ foi dissolvida em tampão citrato (0,01M, pH 4,5) e injetada cerca de 5 minutos após a diluição. Os animais foram mantidos em jejum por 12 horas antes da indução. O grupo controle foi injetado endovenosamente somente com tampão citrato. Os ratos diabéticos que apresentaram níveis plasmático de glicose inferior a 250 mg/dl ou superior a 400 mg/dl foram excluídos do experimento.

3.1.4. Dosagem Dos Níveis Plasmáticos De Glicose

Amostras de sangue (100 µl) foram coletadas dos diferentes grupos

experimentais para dosagem dos níveis de glicose sanguínea. Este procedimento foi

realizado através do aparelho Advantage- Roche.

3.1.5. Tratamento com Inibidor da ECA

3.2. Análises Hemodinâmicas

Após a indução ao diabetes mellitus, os animais foram submetidos às análises hemodinâmicas invasivas e não invasivas.

3.2.1. Ecocardiograma

do ventrículo esquerdo e a espessura do septo interventricular (SIV) e da parede posterior do ventrículo esquerdo (PP) em sístole e diástole. Após a realização das medidas foi calculada a massa do ventrículo esquerdo através da utilização da seguinte fórmula matemática: LVM = [(DDVE+SIV+PP)3-(DDVE)3]x1,047, onde 1,047 (mg/mm3_{) corresponde a densidade do miocárdio. Além da massa do ventrículo} esquerdo foi calculada a força de encurtamento do ventrículo esquerdo ( ' [(DDVE-DSVE)/DDVE]x100). Os índices de função sistólica do modo bidimensional

foram obtidos a partir do método de Simpson modificado, uma vez que é um método mais fidedigno para corações infartados do que aqueles obtidos apenas a partir do modo-M.

3.2.2. Procedimento Cirúrgico

No dia seguinte da avaliação ecocardiográfica (dia 30 do experimento), os animais foram anestesiados com ketamina (80 mg.kg-1) e xilazina (12 mg.kg-1) para colocação de cânulas de polietileno (PE–10, com diâmetro interno de 0,01 mm conectadas a uma peça de PE-50, com diâmetro interno de 0,05 mm). As cânulas foram preenchidas com soro fisiológico e posicionadas no interior da artéria e veia femurais esquerdas para registro da PA, freqüência cardíaca e administração de salina, respectivamente, as medidas foram realizadas 24 horas após a cirurgia com o animal acordado. A extremidade a ser conectada ao transdutor de pressão foi

fechada com pinos de aço inoxidável. As extremidades das cânulas de menor calibre (PE-10) foram introduzidas na luz das artéria e veia femurais (Fig.1 e 2). As cânulas foram fixadas com fio de algodão, na artéria e na veia e suas extremidades mais calibrosas foram passadas subcutâneamente, exteriorizadas no dorso da região cervical, fixadas com fio de algodão na pele. Após o término da cirurgia os

animais foram tratados com uma única injeção de penicilina (Benzetacil ,

Fontoura-Wyeth, 60.000 U).

Para canulação do ventrículo esquerdio para análise direta de PA, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg, ip) e entubados (Gelko – 14G). Um cateter de de polietileno P50 preenchido de salina foi utilizado para a canulação do ventrículo esquerdo (VE) via artéria carótida direita. O cateter foi inserido até o ventrículo e sua posição determinada pela característica da onda de

3.2.3. Registro da PA e FC com animal acordado

Vinte e quatro horas após a cirurgia de canulação, os registros de pressão pulsátil forneceram valores diretos da pressão arterial em todos os grupos

experimentais. A cânula arterial foi conectada a um tubo de polietileno (PE 50) e este a um transdutor eletromagnético (P23 Db; Gould-Statham) que, por sua vez, foi conectado a um amplificador (General Purpose Amplifier-Stemtech, Inc.). O sinal analógico da pressão arterial foi convertido para digital (Stemtech,Inc.), registrado em tempo real em microcomputador com sistema CODAS, com freqüência de amostragem de 2000Hz por canal.

3.2.4. Registro direto de Pressão Ventricular Esquerda e Sobrecarga de Volume

Antes da colocação do cateter P50 no ventrículo, a pressão arterial (PA) da carótida foi registrada durante 5 minutos através da conecção da canula arterial a um transdutor de pressão (Cobe – TRN 050) ligado a um amplificador de sinais (GPA-4 model 2; Stemtech, Inc). Logo após este registro, a canula foi posicionada no VE e, após 5 minutos de estabilização, a pressão ventricular (PVE) foi registrada durante 3 minutos. Os sinais analógicos da pressão foram digitalizados (CODAS -Dataq Instruments, Akron, OH, USA) com taxa de amostragem de 2000 Hz.

primeiro, segundo e terceiro minuto, e comparadas ao período basal.

Após as avaliações hemodinâmicas, os animiais foram sacrificados por decapitação, os corações coletados e guardados em freezer -80°C para posterior análise bioquímica. Os cadáveres foram colocados em sacos específicos para lixo biológico e mantidos em refrigerador para posteriormente serem insinerados pela empresa responsável.

3.2.5. Análise dos Sinais

Pressão Arterial, Freqüência Cardíaca, Derivada de Contração e Relaxamento do Ventrículo Esquerdo e Pressões Ventriculares

A análise foi feita utilizando-se programa comercial associado ao sistema de aquisição. Este programa permite a detecção de máximos e mínimos da curva de pressão batimento a batimento, fornecendo os valores de pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) pela integral da área sob a curva no tempo, derivação da onda de pressão ventricular esquerda e detecção de máximos e mínimos destas curvas batimento a batimento, fornecendo os valores das derivadas de contração (+ dP/dt) e de relaxamento (- dP/dt). A freqüência cardíaca (FC) foi determinada a

partir do intervalo entre dois picos sistólicos. A pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDF) foi determinada pela detecção manual do ponto de inflexão no traçado da onda de pressão diastólica do ventrículo esquerdo. Foram realizadas no mínimo detecções por registro.

obtidas foram analisadas em programa comercial para análise (Excel 5.0), onde calcula-se média e desvio padrão de PAM, PAS, PAD, FC,+dP/dt e –dP/dt para cada animal.

3.2.6. Determinação da atividade da ECA

Preparo dos tecidos

O tecido (coração) foi homogeneizado como descrito por (Oliveira, Santos et

al., 2000) em tampão borato 400 mM, pH 7, 2, contendo sucrose 340 mM e NaCl 900 mM (1 g tecido: 10 mL tampão), e congelados a -700C. O homogenato foi centrifugado a 3000 rpm, por 10 minutos (em centrífuga refrigerada a 40C), e o sobrenadante congelado a -700_{C para posteriormente ser realizado o ensaio} fluorimétrico para determinação da atividade da ECA.

Atividade da ECA

A atividade da ECA foi determinada em homogeneizados dos corações e no soro. A dosagem da atividade enzimática foi realizada de acordo com (Oliveira,

Santos et al., 2000). Foi incubados 20 µl de amostra de coração e 10uL de soro com 480 µl ou 490 µl dos substratos Hip-His-Leu e ZPhe-HL (5 mM) separadamente por 30 min para coração e 10 min para soro à 37oC. Após esse tempo a reação foi paralisada pela adição 1,2 ml de NaOH 0,34 N. O produto da reação, His-Leu, foi medido fluorimetricamente (365 nm para excitação e 495 nm para emissão) após a adição de 100 µl de uma solução de o-phthaldialdehyde (2 % em metanol) cuja

homogeneizado dos tecidos e soro foram adicionados após o término da reação com NaOH, com o objetivo de corrigir a fluorescência intrínseca das amostras. Todos os ensaios foram realizados em duplicatas. Em todos os experimentos foram feitas curvas-padrão, relacionando intensidade de fluorescência com a quantidade de produto formado (His-Leu). Os resultados estão expressos em nMoles His-Leu/ min/mg de proteína. A proteína foi determinada pelo método de (Bradford, 1976) em espectrofotômetro, utilizando como padrão albumina bovina (BSA, 1mg/ml).

“ Western blotting”

Alíquotas dos homogenatos (100µg) foram submetidas à eletroforese em gel

3.3. Procedimentos “in vitro”

Procedimentos “in vitro” foram realizados para avaliar a atividade da ECA em culturas de fibroblastos cardíacos tratados com glicose.

3.3.1. Cultura de fibroblastos cardíaco

Os ratos euglicêmicos foram anestesiados com pentobarbital sódico e desinfectados com álcool 70% para abertura da caixa torácica e exposição do coração, este rapidamente retirado. O coração foi lavado com uma solução de PBS+Penicilina e streptomicina. Os átrios foram desprezados e os ventrículos limpos e cortados em pequenos pedaços e transferidos para um tubo falcon contendo tampão de digestão à base de colagenase/tripsina/BSA. O tecido foi incubado a 37º C sob agitação durante 30 minutos. Após esse período o sobrenadante foi desprezado e novo tampão de digestão foi adicionado aos fragmentos de tecido para nova incubação por 20 minutos. O sobrenadante contendo células em suspensão foi aspirado e centrifugado para obtenção do pellet celular. Este foi

dos experimentos.

3.3.2. Protocolo Experimental

Após a extração dos fibroblastos cardíacos, as células foram cultivadas em D-MEM contendo 15% de FBS em garrafas de cultura T-25, quando as células atingirem confluência de 80% transferidas para placas 12 “ wells” para posterior

tratamento.

3.3.3. Tratamento com glicose

As células com 80% de confluência nas placas foram mantidas em DMEN+P/S, na ausência de soro. Os tratamentos com glicose iniciados no mínimo

após 24 horas nesta situação. Os tratamentos foram realizados usando uma concentração de 25mM de glicose adicionado ao meio de cultura durante 48 horas, as células controle serão tratadas com manitol com concentração 25mM, para controle de osmolaridade. Ao final, foram iniciados os experimentos de dosagem da atividade da enzima (ECA), descrita adiante.

3.3.4. Determinação da atividade da ECA

um tubo de ensaio mantido num banho a 37oC. A seguir, 200µl de homogenato

celular foram incubados com o substrato, até que a reação seja paralisada pela adição de NaOH (0,34 M). O produto da reação, His-Leu, foi medido fluorimetricamente (365nm/excitação e 495nm/emissão) após a adição de 100µl de uma solução de θ-phthaldialdeídeo. A detecção fluorimétrica deste dipeptídeo irá

refletir a atividade da ECA presente nos lisados celulares. Os valores de atividade da

ECA foram expressos em nMoles His-Leu/min./mg de proteína. A proteína foi determinada pelo método de Bradford (1976) em espectrofotômetro, utilizando como

comprimento de onda de 595nm utilizando como padrão albumina bovina (BSA, 1mg/ml).

4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os resultados a seguir são apresentados como média ± desvio padrão. O

5. RESULTADOS

5.1. ESTUDO REALIZADO “in vivo”

Os estudos “in vivo” de animais diabéticos por estreptozotocina (STZ) e animais controles serão descritos a seguir. A função cardíaca dos animais foi avaliada por medidas não invasivas, através da análise de ecocardiograma, e por medida direta da pressão ventricular esquerda. A influência do sistema renina angiotensina nessas variáveis cardíacas foi estudada a partir da realização de dois grupos experimentais:

1) Ratos controle euglicêmicos tratados com Enalapril por 30 dias;

2) Ratos diabéticos por STZ tratados com Enalapril por 30 dias (a partir do dia da indução do diabetes);

Foi realizado um estudo piloto para definição da dose de enalapril a ser usada no protocolo. Verificamos que a dose de 30mg/Kg inicialmente escolhida no início do projeto, apesar de já ter sido utilizada em outro estudo, induziu alterações nos grupos tratados. Os animais controles tratados com a dose de 30 mg/Kg apresentaram hipotensão e prejuízo na função ventricular. Os animais diabéticos não apresentaram melhora na função após esse tratamento. A partir desses resultados fizemos um

mostrados na figura abaixo. A atividade da ECA foi comparada àquela medida no soro de um animal euglicêmico não tratado com inibidor. Esse experimento foi realizado para verficarmos a eficiência de inibição da ECA, através das doses de enalapril utilizadas. Verificamos uma diminuição gradual e crescente da atividade da ECA nas doses 1, 10 e 30 mg/Kg de enalapril comparada à do soro de animais controles.

Figura 1. Atividade da ECA no soro de animais diabéticos tratados por cinco dias com enalapril nas doses de 1mg/Kg, 10mg/Kg e 30mg/Kg. Esses grupos foram comparados aos animais controles. * p”YVFRQWUROH$129$WZR

way, seguida de pós teste de Tukey).

A partir desses resultados optamos pela dose de 1mg/Kg, a qual em cinco

dias já havia promovido uma redução de ± 50% na atividade da ECA. Assim, esta dose poderia ser suficiente para bloquear o aumento da atividade da ECA após a indução do diabetes, sem induzir hipotensão marcante, a ponto de comprometer a função cardíaca.

1 10 100 1000

Controle 1 mg 10 mg 30 mg

Atividade ECA- soro

n

m

o

is

H

is

-L

eu

/m

in

/m

g

p

ro

te

ín

a

*

*

*

Controle 1 mg 10 mg 30 mg

Atividade ECA- soro

A seguir serão apresentados os resultados dos grupos não tratados e tratados com 1mg/Kg de enalapril. Na função ventricular analisada pelo ecocardiograma temos a avaliação de oito animais controles e diabéticos sem tratamento e seis animais controles e diabéticos tratados com enalapril. Na função ventricular avaliada pela cateterização do ventrículo esquerdo, temos 8 animais em cada grupo não tratado e 7 animais em cada grupo tratado. Serão também apresentadas a seguir as avaliações da atividade da ECA no coração e soro dos animais tratados ou não com enalapril, bem como as correlações da atividade da ECA com as medidas funcionais.

5.1.1. PESO CORPORAL

A figura abaixo mostra a evolução semanal do peso corporal dos grupos controle (n = 8), diabético (n = 8), controle (n = 11) e diabético enalapril (n = 11), do início do protocolo experimental até o sacrifício. Observamos que os ratos diabéticos (250 ± 9g; 237 ± 15g; 245 ± 23g; 235 ± 59g) apresentaram menor peso corporal comparados com ratos controles (243 ± 21g; 269 ± 22g; 299 ± 24g; 325 ± 20g) ao longo do protocolo experimental (1, 2, 3 e 4 semanas). O mesmo foi observado com o grupo diabético enalapril (244 ± 23g; 207 ± 21g; 226 ± 31g; 244 ± 31g) em relação aos controle enalapril (237 ± 32g; 285 ± 30g; 325 ± 35g; 350 ± 41g).

Figura 2. Peso corporal dos ratos controle e diabéticos, tratados ou não com

enalapril. * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVJUXSRVFRQWUROHHQDODSUL

(ANOVA-two way, seguida de pós-teste Tukey).

5.1.2. Peso do coração

A figura abaixo mostra o peso do coração nos grupos estudados. Observamos nos grupos diabéticos uma diminuição significativa do peso do coração em relação aos controles (controle 1,17 ± 0,15g e controle enalapril 1,1 ± 0,1g ), (diabéticos 0,87 ± 0,12g e diabéticos enalapril 0,8 ± 13g),sugerindo que os animais diabéticos tiveram perda de massa muscular cardíaca ao longo dos 30 dias.

100 250 400

1 2 3 4

semanas P es o c or por a l ( g )

Controle Diabético Controle Enalapril Diabético Enalapril ** * *

**

*

**

*

*

*

*

*

*

**

**

**

1 2 3 4

semanas P es o c or por a l ( g )

Controle Diabético Controle

Enalapril Diabético Enalapril ** * *

**

*

**

*

*

*

1 2 3 4

semanas P es o c or por a l ( g ) Controle

Figura 3. Peso do coração dos ratos controles e diabéticos, tratados ou não

com enalapril. * p” YV JUXSR FRQWUROH S” YV JUXSRV FRQWUROH

enalapri; (ANOVA-two way, seguida de pós-teste Tukey).

5.1.3. Razão Peso do Coração/Peso Corpóreo

A figura abaixo mostra a razão do peso do coração dos animais dividido pelo peso corporal no dia do sacrifício. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos.

0. 0.4 0.8 1.2 g 0 0.4 0.8 1.2 g

C o ntrole D ia bético Controle

E nalapril Diab é tico_{E nalapril} *

**

Controle Controle_{E nalapril} Diab é tico E nalapril

**

**

Controle Diabético Controle_{E nalapril} Diab é tico E nalapril *

**

Controle Controle_{E nalapril} Diab é tico E nalapril

**

Figura 4. Razão peso do coração (g) / peso (g) corpóreo dos ratos controle e

diabéticos, tratados ou não com enalapril; (ANOVA- two way, seguida de

pós-teste Tukey).

5.2. Avaliação da Glicemia

Observamos um aumento da glicemia nos ratos do grupo diabético (401 ± 35

mg/dl), comparados aos ratos do grupo controle (87 ± 23 mg/dl). Um aumento

significativo da glicemia também foi observado no grupo diabético enalapril (398 ± 56

mg/dl) quando comparado com os ratos do grupo controle enalapril (80 ± 6 mg/dl), conforme mostra a figura abaixo. Não houve diferença na glicemia entre os animais

diabéticos tratados ou não com enalapril. Podemos observar que o tratamento com

enalapril não diminuiu os valores de glicemia dos animais diabéticos, sendo estes

valores semelhantes aos dos animais não tratados. 0

0 .0 0 2 0 .0 0 4

C o n tro le D ia b ético C o n tro le

E n a la p ril

D ia b ético

E n a la p ril

g

/g

0 0 .0 0 2 0 .0 0 4

0 .0 0 2 0 .0 0 4

C o n tro le D ia b ético C o n tro le

E n a la p ril

D ia b ético

E n a la p ril

g

Figura 5. Glicemia (mg/dl) nos grupos controles e diabéticos, tratados ou não

com enalapril. * p” YV JUXSR FRQWUROH S” YV JUXSRV FRQWUROH

enalapril. (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey).

5.3. Avaliações Ecocardiográficas

Essas avaliações foram realizadas para verificar a função cardíaca, de forma não invasiva, analisando medidas morfológicas, de função sistólica e diastólica nos corações dos animais dos quatro grupos estudados. Essas medidas foram feitas no curso temporal do diabetes (15 e 30 dias após o tratamento e/ou indução com STZ) com ou sem tratamento comparadas com as obtidas em controles com idade

semelhante.

Foram avaliados por ecocardiograma 8 animais nos grupos controle e

diabético em 15 e 30 dias. Nos grupos tratados com enalapril, foram avaliados 6

animais nos grupos controle e diabético em 15 dias e, 5 animais no grupo controle e

8 animais no grupo diabético aos 30 dias. 0

200 400 600

C ontrole D iabético C ontrole

E nalapril D iabético E nalapril G li c o s e (m g /d l)

*

**

*

**

C ontrole D iabético C ontrole

E nalapril D iabético E nalapril G li c o s e (

*

**

*

**

C ontrole D iabético C ontrole

E nalapril D iabético E nalapril G li c o s e (m g /d l)

*

**

*

**

C ontrole D iabético C ontrole

5.3.1. Medidas Morfométricas

Foram realizadas medidas absolutas e corrigidas pelo peso corpóreo, do diâmetro da cavidade do VE (DIAVE) e espessuras da parede posterior do VE (PPVE) na diástole e do septo interventricular (SIV) na diástole nos quatro grupos de

animais diabéticos (15 e 30 dias) com ou sem tratamento com enalapril e nos grupos

controle com e sem enalapril conforme tabelas abaixo.

Tanto em 15 como em 30 dias de diabetes existe uma mudança morfométrica

importante, mostrada pelo aumento da cavidade do ventrículo esquerdo durante a

diástole (DIAVE) tanto em valores absolutos quanto em corrigidos, evidenciando

nesses animais uma dilatação maior do que no controle, normalmente associada

com uma piora na função diastólica. O tratamento com enalapril mudou pouco estes

achados, mantendo a cavidade maior nos diabéticos (15 e 30 dias) quando

comparados aos controles não tratados. Embora os valores absolutos dos diabéticos

enalapril estivessem menores do que os observados nos diabéticos não tratados

(tabela 1), no grupo controle enalapril o DIAVE estava maior que o controle não

tratado em 15 e 30 dias. Quando comparamos o DIAVE corrigido entre os grupos

diabéticos com 15 dias observamos uma diferença significativa do grupo diabético

enalapril comparado ao não tratado, sendo seu valor similar ao do grupo controle

(tabela 2).

A parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole (PPVEDIA) foi menor

no grupo diabético quando comparado ao grupo controle aos 15 e 30 dias em

valores absolutos e corrigidos. O tratamento com enalapril nos diabéticos aproximou

esses valores dos controles não tratados, sendo diferentes dos apenas diabéticos.

nos valores corrigidos pelo peso corporal (tabelas 1 a 4). Entretanto, chama a atenção o fato que o grupo controle tratado com enalapril durante 30 dias, mostrou uma redução significativa do PPVEDIA quando corrigida pelo peso corpóreo e comparada com o grupo controle não tratado (tabela 4) .

O septo interventricular na diástole (SIVDIA) estava reduzido nos diabéticos

quando comparado aos controles, ambos sem tratamento. Entre os grupos tratados

essa diferença não existe, mostrando uma recuperação do grupo diabético tratado

(em torno de 20% nos dois tempos de diabetes) quando comparado ao não tratado,

sem, entretanto, normalizar este parâmetro morfométrico, nos valores absolutos. Nos valores corrigidos do SIVDIA, as diferenças entre controles e diabéticos tratados

foram abolidas com 30 dias de tratamento (tabelas 1 a 4). Em 30 dias o SIVDIA

corrigido estava menor também no grupo controle tratado com enalapril, comparado

ao grupo controle sem tratamento.

A massa do ventrículo esquerdo (MVE) estava reduzida nos animais

diabéticos de quinze dias (0,36 ± 0.052g) quando comparamos com os controle (0,48 ± 0,9g). Com 30 dias existe uma redução nos animais diabéticos (0,39 ±

0,036g), porém a diferença em relação aos controles não foi significativa. Nos

animais diabéticos tratados com enalapril durante quinze dias encontramos um

aumento da MVE significativo (0,57 ± 0,12g), comparados ao grupo controle

enalapril (0,45 ± 0,05g) e controle (0,48 ± 0,9g), mostrando um ganho de massa

muscular nos animais diabéticos tratados, principalmente aos 30 dias de tratamento

onde os valores do grupo diabético tratado eram semelhantes aos controles (0,45 ±

Tabela 1. Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores absolutos nos

grupos estudados aos 15 dias de protocolo.

Grupos DIAVE (cm) PPVEDIA (cm) SIVDIA (cm)

Controle 0,632 ± 0,075 0,141 ± 0,015 0,141 ± 0,009

Diabético 0,703 ± 0,037 * 0,100 ± 0,015 * 0,100 ± 0,005 * Controle Enalapril 0,674 ± 0,048 * 0,139 ± 0,01 0,138 ± 0,008 Diabético Enalapril 0,683 ± 0,016 * 0,125 ± 0,008 * *** 0,119 ± 0,012 * *** DIAVE = cavidade do VE; PPVEDIA = Espessura da parede posterior do VE; SIVDIA = Espessura do septo interventricular; todas medidas em diástole. Dados representam media ± desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”

0,05 vs diabético. (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey).

Tabela 2. Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores corrigidos pelo peso

corpóreo nos grupos estudados aos 15 dias de protocolo.

Grupos DIAVE (cm/g) PPVEDIA (cm/g) SIVDIA (cm/g)) Controle 0.0025 ± 0.00034 0.00056 ± 0.00006 0.00056 ± 0.00006

Diabético 0.0032 ± 0.00028 * ** 0.00045 ± 0.00004* 0.00046 ± 0.00005 * Controle

Enalapril

0.0022 ± 0.00015 0.00046 ± 0.00004 0.00046 ± 0.00005

Diabético Enalapril

0.0027 ± 0.00021*** 0.00049 ± 0.00003 * 0.00047 ± 0.0004 *

0,05 vs grupo controle enalapril; *** p”YVGLDEpWLFR (ANOVA- two way,

seguida de pós-teste Tukey).

Tabela 3. Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores absolutos nos

grupos estudados aos 30 dias de protocolo.

Grupos DIAVE (cm) PPVEDIA (cm) SIVDIA (cm)

Controle 0,632 ± 0.07 0,143 ± 0,017 0,141 ± 0,01

Diabético 0,732 ± 0,064 * 0,100 ± 0,009 * 0,101 ± 0,009 *

Controle Enalapril 0,750 ± 0,015 * 0,142 ± 0,022 0,142 ± 0,02

Diabético Enalapril 0,668 ± 0,045 ** 0,126 ± 0,009 * *** 0,125 ± 0,007 * ***

DIAVE = cavidade do VE; PPVEDIA = Espessura da parede posterior do VE;

SIVDIA = Espessura do septo interventricular; todas medidas em diástole.

Dados representam media ± desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”

0,05 vs controle enalapril; *** p”YVGLDEpWLFR (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey).

Tabela 4. Medidas ecocardiográficas morfométricas em valores corrigidos pelo peso corpóreo nos grupos estudados aos 30 dias de protocolo.

Grupos DIAVE (cm/g) PPVEDIA (cm/g)) SIVDIA (cm/g)

Controle 0.0025 ± 0.00034 0.00056 ± 0.00006 0.00056 ± 0.00006

Diabético 0.0033 ± 0.00035 * ** 0.00049 ± 0.00003 * 0.00046 ± 0.00001

Controle

Enalapril

0.0022 ± 0.0004 0.00042± 0.00004 * 0.00042 ± 0.00004 *

Diabético

Enalapril

0.0028 ± 0.00033 ** 0.00056 ± 0.00008 ** *** 0.00053 ± 0.0009

SIVDIA = Espessura do septo interventricular; todas medidas em diástole. Dados representam media ± desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”

0,05 vs controle enalapril; *** p”YVGLDEpWLFR (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey).

5.3.2. Medidas de Função Sistólica

Foram realizadas avaliações da fração de ejeção (FE) e de encurtamento (FS), velocidade de encurtamento circunferencial da fibra miocárdica (VCF) nos quatro grupos de animais, aos 15 e 30 dias após a indução e/ou tratamento, como mostram as tabelas abaixo.

Os resultados demonstraram que o diabetes induz redução de parâmetros de função sistólica como velocidade circunferencial da fibra (VCF) com 15 e 30 dias, e também da fração de ejeção (FE) do VE com 30 dias. A função sistólica melhora

tanto com quinze quanto com trinta dias de diabetes após o tratamento com

enalapril. No grupo controle enalapril a FE e a FS estavam aumentadas comparadas

ao grupo controle em 15 dias. Não há mudanças da fração de encurtamento (FS) do VE com 15 e 30 dias entre controle e diabético não tratado. O enalapril normalizou

Tabela 5. Medidas ecocardiográficas de função sistólica nos grupos estudados aos

15 dias de protocolo.

Grupos FE (%) FS (%) VCF

Controle 74,4 ± 4,72 38,5 ± 3,77 0,004 ± 0,0008

Diabético 70,9 ± 2,71 ** 35,8 ± 2,21 0,003 ± 0,0002 *

Controle Enalapril 80,8 ± 2,93 * 44,4 ± 2,95 * 0,005 ± 0,0006

Diabético Enalapril 76,7 ± 8,8 41,2 ± 8,36 0,005 ± 0,0008 ***

FE = fração de ejeção; FS = fração de encurtamento; VCF = velocidade circuferencial da fibra miocárdica; todas medidas no VE. Dados representam media ± desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVFRQWUROH

enalapril; *** p”YVGLDEpWLFR ANOVA-two way, seguida de pós-teste Tukey).

Tabela 6. Medidas ecocardiográficas de função sistólica nos grupos estudados aos 30 dias de protocolo.

Grupos FE (%) FS (%) VCF

Controle 74,4 ± 4,72 38,5 ± 3,765 0,004 ± 0,0008

Diabético 69,4 ± 4,9 * 34,6 ± 3,77 0,003 ± 0,0005 *

Controle Enalapril 74,9 ±8,34 39,5 ± 6,65 0,004 ± 0,0006

Diabético Enalapril 76,8 ± 5,26 *** 40,8 ± 4,96 *** 0,004 ± 0,0009 ***

FE = fração de ejeção; FS = fração de encurtamento; VCF = velocidade circuferencial da fibra miocárdica; todas medidas no VE. Dados representam

media ± desvio; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVGLDEpWLFR

5.3.3. Medidas de Função Diastólica

Foram realizadas medidas do pico A e do pico E, da relação E/A, do Tempo Desaceleração do pico E e do tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV), nos quatro grupos de animais, em 15 e 30 dias após a indução e/ou tratamento, como mostram as tabelas abaixo (tabela 7).

O diabetes, induziu prejuízo na função diastólica evidenciado por redução do pico E (referente ao pico de contração atrial), aumento do tempo de desaceleração

de E e do tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) em 15 e 30 dias em relação aos controles.

As medidas de função diastólica como pico E, tempo de desaceleração E, e

tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV), melhoraram após tratamento com enalapril nos animais diabéticos, sendo os valores iguais aos dos controles e

significativamente diferentes entre os diabéticos não tratados e tratados, tanto em quinze quanto em trinta dias após a indução. Quando corrigimos o tempo de

desaceleração E pelo intervalo R-R, as diferenças foram mantidas entre os grupos.

Os valores de TRIV corrigidos pelo intervalo R-R, mantêm o aumento encontrado

entre diabético com 15 dias (2,47 ± 0,16 ms/bpm) e 30 dias (2,32 ± 0,21 ms/bpm)

comparados ao controle (1,99 ± 0,26 ms/bpm), e mantêm-se a redução para os animais diabéticos tratados em 15 dias (2,09 ± 0,16 ms/bpm) e em 30 dias (2,33 ± 0,26 ms/bpm) em relação aos diabéticos. Não foram observadas diferenças nas medidas de Pico A, e relação entre os picos (E/A) entre os grupos nos tempos

Tabela 7. Medidas ecocardiográficas de função diastólica nos grupos estudados aos

15 dias de protocolo.

Grupos VMPico A

(ms)

VMPico E

(ms)

Relação E/A Tempo

Desc. E

TRIV (ms)

Controle 0,32 ± 0,06 0,52 ± 0,1 1,62 ± 0,2 29 ± 4,7 31,6 ± 4,43

Diabético 0,28 ± 0,05 0,44 ± 0,04* 1,67 ± 0,44 39 ± 3,7 * 44,5 ± 4,37 * Controle

Enalapril

0,37 ± 0,08 0,59 ±0,12 1,53 ± 0,26 30 ± 5,6 27,6 ± 3,9

Diabético

Enalapril

0,32 ± 0,04 0,52 ± 0,08*** 1,62 ± 0,125 25 ± 7,2 *** 31,6 ± 2,3 ***

VMPico A = velociadade média do pico A; VMPico E = velociadade média do

pico E; Relação E/A = relação do pico E/A; Tempo Desc. = tempo de

desaceleração do pico E; TRIV = Tempo de relaxamento isovolumétrico da

fibra miocárdica. Dados representam media ± desvio padrão; * p” YV

Tabela 8. Medidas ecocardiográficas de função diastólica nos grupos estudados aos

30 dias de protocolo.

Grupos VMPico A

(ms)

VMPico E

(ms)

Relação

E/A

Tempo

Desc. E

TRIV

(ms)

Controle 0,32 ± 0,06 0,52 ± 0,1 1,62 ± 0,2 29 ± 4,7 31,6 ± 4,43

Diabético 0,36 ± 0,1 0,47 ± 0,14 * 1,3 ± 0,27 39 ± 3,7 * 40,6 ± 4,6 *

Controle

Enalapril

0,35 ± 0,02 0,59 ± 0,14 1,6 ± 0,44 36 ± 6,5 * 32 ± 7,2

Diabético

Enalapril

0,36 ± 0,1 0,58 ± 0,12 *** 1,3 ± 0,2 28 ± 4,1 *** 35,5 ± 7,2 ***

VMPico A = velociadade média do pico A; VMPico E = velociadade média do

pico E; Relação E/A = relação do pico E/A; Tempo Desc. = tempo de

desaceleração do pico E; TRIV = Tempo de relaxamento isovolumétrico da

fibra miocárdica. Dados representam media ± desvio padrão; * p” YV

grupo controle; *** p”YVGLDEpWLFR (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey ).

5.4. Pressão arterial e freqüência cardíaca nos animais acordados

Os resultados abaixo mostram uma diminuição significativa da pressão

siatólica (PAS), diastólica (PAD) e média (PAM), e da freqüência cardíaca (FC) nos

animais diabéticos acordados em relação aos controles não tratados. O tratamento

com enalapril não alterou o prejuízo na PA e na FC dos animais diabéticos. A PAS, a

Tabela 9. Pressão arterial diastólica (PAD), sistólica (PAS) e média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) nos animais acordados nos grupos estudados.

Grupos PAD (mmHg) PAS (mmHg) PAM (mmHg) FC (bpm)

Controle

N= 5 98 ± 8,6 131 ± 5,5 114 ± 3,8 371 ± 9

Diabético

N= 6 80 ± 4,7 * 111 ± 7,9 * 96 ± 6 * 309 ± 24 *

Controle Enalapril

n = 5

88 ± 4,5 * 120 ± 3,4* 103 ± 2,5 * 332 ± 10 *

Diabético Enalapril

N = 6

88 ± 7,3 109 ± 6 * ** 100 ± 6,2 * 325 ± 19 *

PAD = pressão arterial diastólica; PAS = pressão arterial siatólica; PAM = press ão arterial média; FC= freqüência cardíaca. Dados representam media ±

desvio padrão; * p”YVJUXSRFRQWUROHS”YVFRQWUROHHQDODSULO

p”YVJUXSRGLDEpWLFR (ANOVA- two way, seguida de pós-teste Tukey).

5.5. Função ventricular esquerda no período basal

Os resultados abaixo mostram uma diminuição significativa da Pressão

ventricular sistólica (PSVE) no grupo diabético quando comparado ao controle, o que

não se modificou pelo tratamento com enalapril. A FC mostrou-se reduzida nos