UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ENGENHARIA
CAMPUS DE ILHA SOLTEIRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
PATRÍCIA FERREIRA ALVES
“Caracterização genética
de populações de
Caryocar
brasiliense
Cambess
.
e
Jatropha curcas
L.
, espécies
potenciais
na produção de biodiesel”
PATRÍCIA FERREIRA ALVES
“Caracterização genética
de populações de
Caryocar
brasiliense
Cambess
.
e
Jatropha curcas
L.
, espécies
potenciais na produção de bi
odiesel”
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia do Campus de Ilha Solteira - UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Agronomia. Especialidade: Sistemas de Produção
Prof. Dr. Mário Luiz Teixeira de Moraes Orientador
D
Dedico
Aos meus queridos pais,
José Alves Filho e Glória Ferreira Alves,
pelo amor, carinho, compreensão, pelo imensurável apoio e confiança depositados em todos esses anos de estudos e dedicação para alcançar os meu objetivos.
Ofereço
Aos meus irmãos William Ferreira Alves e Wederson D. Ferreira Alves, pelo incentivo, carinho, amizade nas horas mais difíceis e pelo meu filho,
Agradecimentos
A Deus, todo poderoso, pela saúde, graça, força, coragem, minhas alegria e a certeza da vitória.
Ao professor Dr. Mário Luiz Teixeira de Moraes, pela maravilhosa orientação e dedicação, assim como, pela paciência, incentivo, compreensão e confiança que teve comigo durante todo o desenvolvimento do trabalho.
Ao Coordenador do Projeto “Pinhão Manso”, professor Dr. Enes Furlani Júnior, pela oportunidades de realizar este projeto.
Aos funcionários que fazem parte do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, pela oportunidade da realização deste curso de doutorado.
Aos professores da Graduação e Pós-Graduação em Agronomia, da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, pelos ensinamentos durante minha formação acadêmica.
Ao pesquisador Alexandre Magno Sebbenn agradeço pela orientação na realização das estatísticas que muito contribuiu neste trabalho.
Aos professores componentes da banca examinadora desse trabalho, pelas sugestões e por atenderem prontamente ao nosso convite à banca.
A todos do Departamento de Fitotecnia, Tecnologia de Semente e Sócio-Economia, pelo apoio.
À Selma Maria Bozzite de Moraes, que desde da graduação depositou em mim sua confiança, a qual eu tenho como uma segunda “mãe”, sempre nos dando carinho, atenção, conselhos e amizade incondicional, me auxiliando tanto no profissional como no pessoal, o meu muito obrigada.
Aos colegas da pós-graduação Gustavo, Proença, Simone, Érica, Ana Eliza, Elza Militão, Mariana, Christian pela amizade durante o doutorado.
Aos funcionários da Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão: Alexandre (gaúcho), Alonso, Cambuim e Baiano e a todos os funcionários que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Ao José Cambuim pela ajuda na coleta dos dados e ensinamento de experiência de vida.
Em especial a Marcela, Ricardo e Evandro Tambarussi pela ajuda na concretização deste trabalho.
Ao meu querido Bruno Fontoura da Silva Colman pelo carinho, amor, compreensão, pela sua companhia nos momentos mais difíceis e de grandes alegrias.
A minha família que é o pilar de minha vida e sem o qual a mesma não teria sentido.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus de Ilha Solteira – SP, pela oportunidade na realização do curso de doutorado.
À Petrobras pela concessão da bolsa de estudo e apoio institucional. A CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
Enfim, agradeço a todos que direta ou indiretamente me ajudaram e me apoiaram, tornando possível a realização deste trabalho.
RESUMO
A crise do petróleo das últimas décadas, aliada à necessidade de desenvolvimento das economias com o consequente aumento da demanda por combustíveis e a crescente preocupação com o meio ambiente, revitalizou a busca por fontes alternativas de energia no Brasil e no mundo. No capítulo I é apresentado o pequi (Caryocarbrasiliense Camb.) , é uma das espécies das quais podem ser extraídos óleos para produção de biodiesel, produzido a partir de óleos vegetais, passou a ser fonte mais amplamente discutida, porém devido ao avanço das fronteiras agrícolas, os remanescentes desta espécie, símbolo do Cerrado, encontra-se em extinta em muitas regiões do Brasil. Diante disto, os objetivos deste estudo foram investigar por marcadores microssatélites o sistema de reprodução em amostras de progênies de polinização aberta de duas populações de C. brasiliense, uma localizada no interior de um talhão de eucalipto (POP-TE) e outra em um fragmento florestal que constitui a Reserva Legal (POP-RL), da Fazenda Curucaca, visando o melhoramento genético desta espécie que pode ser utilizada na produção de biodiesel. Assim, em termos gerais, os resultados obtidos demonstram que o isolamento espacial do fragmento da Reserva legal das árvores isoladas no interior do Talhão de Eucalipto pode aumentar a endogamia nas futuras gerações. No capítulo II, apresenta-se o pinhão-manso (Jatropha curcas L.), no qual ganha destaque no Programa nacional de Produção e Uso do Biodiesel criado pelo governo brasileiro. O pinhão-manso possui alto teor e qualidade de óleo presente em suas sementes para a produção do biodiesel. Porém, existe pouca informação disponível em relação à base genética e ao cultivo de J. curcas. Assim, o trabalho apresentado tem como objetivo avaliar, por meio de marcadores microssatélites, a diversidade genética e o sistema de reprodução em uma população de J. curcas, que formam uma população base, que pode proporcionar subsídios a um programa de melhoramento genético, desta espécie, na região do bolsão Sul-Mato-Grossense. Dessa forma, a presença de diversidade genética e o alto índice de indivíduos não aparentados, apesar das altas taxas de homozigotos, é uma situação muito favorável para se preservar este germoplasma e estabelecer um programa de melhoramento genético na região do bolsão Sul-Mato-Grossense a partir desta população base de J. curcas, o que contribuirá para tornar a região um polo de produção de biodiesel.
ABSTRACT
The oil crisis in decades, coupled with the need for development of the economies and the consequent increase in demand for fuel and the growing concern for the environment, has revitalized the search for alternative energy sources in Brazil and worldwide. In Chapter I Pequi (Caryocar brasiliense Camb.) Is presented, is a species of which oils to produce biodiesel, produced from vegetable oils, can be extracted became more widely discussed source, however due to the advancement of the frontiers farm, the remnants of this species, symbol of the Cerrado, is in extinct in many regions of Brazil. Given this, the objectives of this study were to investigate microsatellite markers for the playback system in samples of open-pollinated progenies of two populations of C. brasiliense, one located within a stand of eucalyptus (POP-TE) and another in a fragment forest which is the legal (POP-RL) Reserve, Treasury Curucaca, targeting the genetic improvement of this species that can be used to produce biodiesel. Thus, in general, the results show that spatial isolation of the fragment cool reservation of individual trees inside the stand Eucalyptus inbreeding can increase in future generations. In Chapter II, we present the jatropha (Jatropha curcas L.), which is highlighted in the National Program for Production and Use of Biodiesel created by the Brazilian government. The jatropha has high content and quality of this oil in its seeds for biodiesel production. However, little information is available regarding the genetic basis and the cultivation of J. curcas. Thus, the work presented is to evaluate, using microsatellite markers, genetic diversity and the mating system in a population of J. curcas, which form a base population, which can provide support for a genetic improvement program, this species, in the pocket-South Mato Grosso region. Thus, the presence of genetic diversity and the high rate of unrelated individuals, despite high rates of homozygotes, is a very favorable situation to preserve this germplasm and establish a breeding program in the pocket region Mato Grosso from this base of J. curcas, which will help to make the region a hub for the production of biodiesel population.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Produção de pirênios desenvolvidos e abortados em fruto de pequizeiro (Caryocar brasiliense). ... 35 Figura 2: A) Corte de pequi: mesocarpo interno (Me), espinhos (Es), endocarpo (En), semente (S). B) Corte de semente corada com sal de tetrazólio: tegumento (T), embrião (E), plúmula (P) e região da radícula (R). Fonte: DOMBROSKI (1997)... 37 Figura 3: Quantificação de DNA em gel de agarose a 0,8% de amostras dos frutos provenientes da Reserva Legal. ... 39 Figura 4: Quantificação da diluição de DNA em gel de agarose a 0,8% de amostras dos frutos provenientes da Reserva Legal. ... 39 Figura 5: Gel de poliacrilamida 5% contendo amostras de PCR das árvores reprodutivas e dos frutos procedentes da POP-RL com o primer CB 12. ... 422 Figura 6: Gel de poliacrilamida 5% contendo amostras de PCR das árvores reprodutivas e dos frutos procedentes da POP-TE com o primer CB 12 ... 423 Figura 7: Distribuição em classes para DAP e altura para os indivíduos de uma população de Caryocar brasiliense no interior de um povoamento de eucalipto (POP-TE) na Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas-MS. ... 49 Figura 8: Distribuição em classes para DAP e altura para os indivíduos de uma população natural de Caryocar brasiliense na Reserva Legal (POP-RL) da Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas-MS. ... 500 Figura 9: Ocorrência de regenerantes de Caryocar brasiliense em um talhão da POP-TE . 511 Figura 10: Árvore morta de Caryocar brasiliense no Talhão de eucalipto (POP-TE) ... Erro! Indicador não definido.2
Figura 14: Número de sementes por fruto e porcentagem de autofecundação em uma população natural de Caryocar brasiliense (POP-TE) na Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas-MS. ... 57 Figura 15: Número de sementes por fruto e porcentagem de autofecundação em uma população natural de Caryocar brasiliense (POP-RL) na Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas-MS. ... 58 Figura 16: Distribuição em classes para a ocorrência de uma, duas e três autofecundações para os indivíduos da população POP-TE de Caryocar brasiliense na Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas-MS. ... 600 Figura 17: Distribuição em classes para a ocorrência de uma, duas e três autofecundações para os indivíduos da população POP-RL de Caryocar brasiliense na Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas-MS. ... 611 Figura 18: Autocorrelação espacial de uma população de Caryocar brasiliense (POP-RL) em quinze classes de distância. A linha contínua indica a correlação (r) e as linhas amarela e cor-de-rosa indicam os limites superiores e inferiores do intervalo de confiança a confiança a 95% obtido por 10.000 permutações. ... 633 Figura 19: Autocorrelação espacial de uma população de Caryocar brasiliense (POP-TE) em dezessete classes de distância. A linha contínua indica a correlação (r) e as linhas amarela e cor-de-rosa indicam os limites superiores e inferiores do intervalo de confiança a 95% obtido por 1000 permutações. ... 655 Figura 20: Progênies de Jatropha curcas L. instalada na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão da Faculdade de Engenharia, localizada no municipio de Selviria-MS... 844 Figura 21: Frutos de Jatropha curcas L. (A e B), a planta e a identificação (C e D). ... 85 Figura 22: Quantificação de DNA em gel de agarose a 0,8% de amostras de folhas ... 87 Figura 23: Fragment Analyzer™ Automated CE System utilizado na genotipagem do DNA
... 88 Figura 24: Padrão geral do eletroferograma gerado peloFragment Analyzer™ Automated CE
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estimativa da taxa de cruzamento multiloco ( ), taxa de cruzamento entre indivíduos parentes (tˆm tˆs), correlação de paternidade (rˆp(m)) e número
efetivo de doadores de pólen (Nˆep) para algumas espécies arbóreas ... 24 Tabela 2. Classificação da ocorrência de autofecundações com base no número de caroços
de pequi por fruto segundo Collevatti et al. (2009) para Caryocar brasiliense ... 35 Tabela 3. Sequências dos primers SSR, sequência dos nucleotídeos e temperatura de
anelamento (Ta) para os oito locos SSR desenvolvidos por Collevatti et al. (1999) para Caryocar brasiliense ... 41 Tabela 4. Estimativas de médias, coeficientes de variação (CV), valores máximos e
mínimos, Assimetria e Curtose para os caracteres estudados: DAP e altura em duas populações naturais de Caryocar brasiliense: POP-TE (interior do povoamento de eucalipto) e POP-RL (Reserva Legal) na Fazenda Curucaca, em dezembro de 2008, no município de Três Lagoas – MS ... 48 Tabela 5. Estimativas de médias, coeficientes de variação (CV), valores máximos e
mínimos, Assimetria e Curtose para sobrevivência avaliada em dezembro de 2008 e 2010 em duas populações naturais de Caryocar brasiliense: POP-TE e POP-RL na Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas - MS ... 54 Tabela 6. Estimativas de médias, coeficientes de variação (CV), valores máximos e
mínimos, Assimetria e Curtose para presença de autofecundação nos frutos em duas populações naturais de Caryocar brasiliense: POP-TE (interior do povoamento de eucalipto) e POP-RL (Reserva Legal), avaliadas em dezembro de 2008, na Fazenda Curucaca, no município de Três Lagoas - MS ... 59 Tabela 7. Estimativas da diversidade genética dentro (HS) e entre (GST ) as populações
POP-RL e POP-TE de C. brasiliense e da diversidade estandardizada de Hedrick ( '
ST
G ) encontradas na Fazenda Curucaca, na região de Três Lagoas – MS... 62 Tabela 8. Diversidade genética e índice de fixação em oito locos microssatélites em
árvores matrizes e suas respectivas progênies de polinização aberta de Caryocar brasiliense, localizadas na POP-TE e na POP-RL, em que: k é o número de alelos nos locos; Ho é a heterozigosidade observada; He é a heterozigosidade esperada em Equilíbrio de Hardy-Weinberg; F é o índice de fixação... 68
Tabela 9. Estimativa de parâmetros do sistema de reprodução em duas populações de Caryocar brasiliense: POP-TE e POP-RL, na região de Três Lagoas-MS ... 73 Tabela 10. Estimativa de parâmetros do sistema de reprodução em duas populações de
Caryocar brasiliense: POP-TE e POP-RL, na região de Três Lagoas-MS... 74 Tabela 11.Estimativas das frequências dos pares de coancestrias entre: a) progênies de
irmãos de autofecundação: PˆIA; b) progênies de irmãos de autofecundação e
cruzamento: PˆAC; c) progênies de irmãos de autofecundação e cruzamento entre indivíduos parentes: PˆACCP ; d) progênies de irmãos completos:
IC
Pˆ ; e) progênies de meios irmãos: PˆMI; f) progênies de irmãos completos aparentados:
CP IC
Pˆ ; g) progênies de meios irmãos aparentados:
CP MI
Pˆ ; h) progênies de irmãos completos parentes e não aparentados: PˆICCP,np; i) progênies de meios irmãos parentes e não aparentados: PˆMICP,np em duas populações de Caryocar brasiliense: POP-TE e POP-RL, na região de Três Lagoas-MS... 76 Tabela 12.Sequências dos primers SSR descritos por Sun et al. (2008) para Jatropha
curcas... 91 Tabela 13.Diversidade genética, endogamia em uma população de Jatropha curcas ...
96 Tabela 14.Estimativa de parâmetros do sistema de reprodução na população de Jatropha
curcas L... 99 Tabela 15.Estimativa de parâmetros do sistema de reprodução em progênies de Jatropha
curcas L. tm é a taxa de cruzamento multilocos; tmts é a taxa de cruzamento entre parentes; rp(m) é a correlação multilocus de paternidade; Nep é o número
efetivo de pais polinizadores;
é a coancestria dentro de progênie; Ne(v) é o tamanho efetivo da progênie; média erro padrão da média 95% deprobabilidade... 101
Tabela 16.Estimativa de parâmetros do sistema de reprodução em progênies de Jatropha curcas L. tm é a taxa de cruzamento multilocos; tmts é a taxa de cruzamento entre parentes; rp(m) é a correlação multilocus de paternidade; Nep é o número
efetivo de pais polinizadores;
é a coancestria dentro de progênie; Ne(v) é otamanho efetivo da progênie; média erro padrão da média 95% de
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 11
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1. A espécie Caryocar brasilense Cambess. ... 14
2.2. A espécie Jatropha curcas L. ... 16
2.3. O impacto da ação antrópica sobre as florestas ... 18
2.4. Emprego de marcadores moleculares no estudo das espécies florestais ... 21
2.5. Sistema de reprodução em espécies arbóreas ... 22
3. CAPÍTULO I ... 27
INFLUÊNCIA DA PRESENÇA DE ÁRVORES ISOLADAS EM POVOAMENTOS DE EUCALIPTOS NA ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Caryocar brasiliense EM FRAGMENTOS DO ENTORNO. ... 27
RESUMO ... 28
ABSTRACT ... 29
3.1. INTRODUÇÃO ... 30
3.2. OBJETIVOS... 33
3.3. MATERIAL E MÉTODOS ... 33
3.3.1. Material ... 33
3.3.2. Métodos ... 34
3.3.2.1. Mensurações das árvores ... 34
3.2.2.2. Análise biométrica dos frutos ... 34
3.2.2.3. Análise molecular ... 36
3.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 43
3.4.1 Análise da diversidade genética, endogamia e equilíbrio de Hardy-Weinberg ... 44
3.4.2. Sistema de reprodução ... 44
3.4.3. Estrutura genética espacial ... 46
3.4.4. Distância genética entre populações ... 46
3.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 47
3.5.1. Sobrevivência e desenvolvimento em altura e DAP ... 47
3.5.2. Biometria de frutos e autofecundação ... 57
3.5.3. Divergência genética entre populações ... 62
3.5.4. Estrutura genética espacial ... 63
3.5.5. Diversidade genética ... 66
3.5.6. Sistema de reprodução ... 70
3.6. CONCLUSÕES ... 77
4. CAPÍTULO II ... 79
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE UMA POPULAÇÃO BASE DE Jatropha curcas L. PARA MELHORAMENTO NA REGIÃO BOLSÃO SUL-MATO-GROSSENSE. ... 79
RESUMO ... 80
ABSTRACT ... 81
4.1. INTRODUÇÃO ... 82
4.3. MATERIAL E MÉTODOS ... 84
4.3.1 Material ... 84
4.3.2 Métodos ... 86
4.3.2.1 Análise molecular ... 86
4.3.2.2. Análises estatísticas de parâmetros genéticos ... 92
4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 95
4.4.1. Diversidade genética e índice de fixação ... 95
4.4.2. Medida de coancestria estimada por análise de variância nas frequências alélicas. ... 97
4.4.3. Sistema de reprodução ... 98
4.5. CONCLUSÕES ... 103
1. INTRODUÇÃO
As crescentes preocupações ambientais tem renovado o interesse no uso de combustíveis obtidos a partir de fontes renováveis. Neste contexto, existe a possibilidade de uso do biodiesel que é tradicionalmente obtido por metanólise de triacilglicerídeos de origem vegetal ou animal, utilizando a catálise básica homogênea. Regularmente, o biodiesel é vendido misturado ao diesel de petróleo em mais de 30 mil postos de abastecimento espalhados pelo país. A produção desse tipo de biocombustível foi de 69 milhões de litros em 2006 para 2,7 bilhões de litros em 2011. Esse resultado que só tem aumentado credencia o Brasil como um dos maiores mercado mundiais de biodiesel, juntamente com a Alemanha e os Estados Unidos, que produzem e consumem este combustível renovável há muito mais tempo. Outros importantes mercados são a França, a Espanha, a Itália e a Argentina (MME, 2013).
O Brasil dirigiu sua atenção no final da década de 1990 aos projetos destinados à pesquisa do biodiesel. No entanto, foi a partir do lançamento do Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB), em dezembro de 2004, pelo Governo Federal, que o biodiesel avançou significativamente, tornando-se um valioso instrumento de geração de riqueza e inclusão social. O objetivo, na etapa inicial, foi introduzir o biodiesel na matriz energética brasileira, com enfoque na inclusão social e no desenvolvimento regional (MME, 2013).
Desde o lançamento do PNPB até o final de 2011, o Brasil produziu 8,3 bilhões de litros de biodiesel, reduzindo as importações de diesel em um montante de 5,3 bilhões de dólares, contribuindo positivamente para a Balança Comercial Brasileira (MME, 2013)
O biodiesel é um combustível biodegradável derivado de fontes renováveis como óleos vegetais e gorduras animais. Existem diferentes espécies de oleaginosas no Brasil que podem ser usadas para produzir o biodiesel. Entre elas estão a mamona, dendê, canola, girassol, amendoim, pinhão manso, pequi, soja e algodão. Matérias-primas de origem animal, como o sebo bovino e gordura suína, também podem ser utilizadas na fabricação do biodiesel. Esse biocombustível substitui total ou parcialmente o diesel de petróleo, em motores de caminhões, tratores, camionetas, automóveis e também motores de máquinas que geram energia.
que, independentemente da matéria-prima, as especificações do biodiesel devem basear-se nas propriedades físico-químicas do produto final. Entre as possibilidades de matéria-prima para produção do biodiesel tem-se o óleo de pequi (Caryocar brasiliense Camb.) e do pinhão-manso (Jatropha curcas Linn.). O pequi é um fruto oleaginoso do cerrado brasileiro e o seu óleo é composto, principalmente, pelos ácidos palmítico (41%) e oléico (54%). O pinhão manso é arbusto que possui frutos capsular com sementes oleaginosas, compostas principalmente, pelos ácidos oléico (43%) e linoléico (39,6%).
O pinhão-manso tem sido a grande aposta do agronegócio para a produção de biodiesel, vários países interessados na cultura do pinhão manso, principalmente Índia e China, têm coletado acessos de seus territórios e de outras partes do mundo, visando à caracterização da diversidade para conservação e melhoramento genético.
O melhoramento genético do pinhão manso busca selecionar materiais e gerar cultivares com elevado produtividade de grãos e teor óleo, sem toxidez (curcina e ésteres de forbol), resistente a pragas e doenças, colheita e adaptação às condições agroclimáticas das diferentes regiões do país. Já o pequi além de ter potencial melífero e medicinal (ROSA, 2004), seu uso mais expressivo é o alimentício, com o aproveitamento da polpa do fruto, sendo que o caroço é descartado, apesar de apresentar altos teores de óleo. Existem algumas iniciativas de grande escala para comercialização e/ou industrialização como biodiesel.
Antes de iniciar um programa de melhoramento, é necessária à coleta de material genético, a caracterização e a avaliação desses materiais. Essa caracterização pode ser realizada empregando-se marcadores ou descritores agronômicos, morfológicos e moleculares. O emprego de marcadores moleculares é mais preciso, devido serem baseados no DNA do indivíduo não sofrendo influência ambiental.
Diferentes tipos de marcadores moleculares encontra-se disponível para detecção da variabilidade genética em nível de DNA, como por exemplo, RAPD, AFLP, ISSR, SSR, RFLP, entre outros, visando a detecção de polimorfismo genético. Dentre esses marcadores, os Microssatélites ou SSRs (simple sequence repeats) para a caracterização de genótipos, já que estes são marcadores codominantes, multialélicos, altamente informativos, e de ampla utilização na maior parte das culturas (MORGANTE; OLIVIERI, 1993). O SSR é a técnica mais precisa e confiável e vem sendo usada com sucesso para estudos de diversidade genética em várias espécies (VANICE, 2010).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A espécie Caryocar brasilense Cambess.
A espécie Caryocar brasiliense, conhecida vulgarmente como pequi, é palavra de origem indígena que significa “casca espinhenta”, devido à característica de seu endocarpo (HERINGER, 1969). Apresenta outros nomes comuns como pequi (MT), piquiá-bravo, pequi (MG, SP), amêndoa-de-espinho, grão-de-cavalo, pequiá, pequiá-pedra, pequerim, suari, piquiá (LORENZI, 2002). A espécie pertence à família Caryocaraceae a qual possui apenas dois gêneros: Caryocar L. e Anthodiscus G. Mey. O gênero Caryocar possui dezesseis espécies, das quais doze ocorrem em território brasileiro. No Cerrado brasileiro são encontradas três espécies: C. brasiliense Camb., C. coriaceum Wittm e C. cuneatum Wittm. Contudo, em função de sua maior ocorrência, a primeira espécie é considerada a mais importante do ponto de vista socioeconômico, sendo as outras duas restritas a algumas áreas dessa região (BARRADAS, 1972).
É uma árvore hermafrodita com altura variando de 6 a 10 m, com ampla ocorrência e distribuição nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Goiás e Mato Grosso (cerrado) (LORENZI, 2002). A espécie floresce na época das chuvas com pico no mês de setembro. A inflorescência é do tipo racemoso e as flores possuem cálice e corola pentâmeros, estames numerosos, dispostos em dois ciclos, sendo o interno constituído por estames de filetes mais curtos; os filetes dos estames maiores e externos são vesiculosos no ápice e naqueles estames menores, as vesículas estão presentes em toda a sua extensão; ovário súpero gamocarpelar formado por três a cinco carpelos, um óvulo por loja e estiletes livres. As flores são de coloração branca, grandes, hermafroditas, cíclicas, de simetria radial com cinco a seis sépalas e o mesmo número de pétalas (OLIVEIRA, 1998).
O Pequi é uma planta semidecídua, heliófita, seletiva xerófita, característica do cerrado e campo cerrado. Ocorre geralmente em agrupamentos mais ou menos denso em determinados pontos e faltando em muitos outros dentro da área de dispersão. Ocorre tanto em formações primárias como secundárias e pioneiras (LORENZI, 2002).
O pequizeiro é uma planta auto compatível, porém, produz maior quantidade de frutos por fecundação cruzada. Suas flores são visitadas por morcegos, vespas, mariposas e aves, tendo sido observadas pelo menos cinco espécies de morcego envolvidas na sua polinização (GRIBEL, 1993). Seus frutos apresentam seis cm a 14 cm de comprimento, por seis cm a 10 cm de diâmetro, com seu peso variando entre 100 g e 300 g (SILVA et al., 1994). A semente é constituída de embrião, tegumento e vestígios de endosperma. O embrião apresenta hipocótilo extremamente desenvolvido (MELO, 1987). A casca (epicarpo e mesocarpo externo) representa cerca de 75% do peso do fruto (SOUZA et al., 2007). No fruto adulto o número de sementes varia normalmente de um a quatro, pois, embora existam ovários com cinco a seis óvulos, frutos com esse número de sementes são raros (BARRADAS, 1973).
Os frutos servem de alimento para uma série de animais que contribuem com a dispersão das sementes, que se dá por meio do caroço ou putâmen, que é a semente envolta por um endocarpo rígido. Também há evidencias de que roedores, como rato do campo, preá e paca, estão envolvidos na disseminação dessas sementes (BARRADAS, 1972).
É uma planta com dispersão tipicamente zoocórica, (MELO JÚNIOR et al.,2004) a Ema é o animal com maior potencial dispersor, a gralha e a Cotia podem atuar como dispersores de sementes a pequenas distâncias por sinzoocoria; para Gribel (1986) citado por Almeida et al. (1998) a dispersão dos frutos é realizada por dois vetores: um marsupial (Dilesphis albiventris) e um corvídeo (Cyanocorax cristatellus).
2.2. A espécie Jatropha curcas L.
Jatropha curcas L., conhecido como pinhão manso, recebeu esse nome botânico de Karl Von Linne em 1753. O nome do gênero Jatropha é derivado das palavras gregas “iatros” que significa médico e “trophe” que significa alimento (BECKER; MAKKAR, 2008). Nativa da América do Sul e América Central, encontrada em quase todas as regiões intertropicais e tropicais da Àsia, da Àfrica, da Austrália (JONGSCHAAP, 2007), devido à distribuição por portugueses pelas ilhas de Cabo Verde e Guiné Bissau (HELLER, 1996; BECKER; MARKKAR, 2008). No gênero Jatropha estão agrupadas cerca de 170 espécies de plantas herbáceas e arbustivas que apresentam as mais variadas propriedades e usos.
O pinhão manso pertence à família das euforbiáceas e ocorre naturalmente em diversos estados brasileiros onde é comum ser encontrado como cerca vivas e, nos quintais mais antigos, próximo a antigas moradias, onde era usado como fonte caseira de óleo para queimar (SATURNINO, 2005). Trata-se de uma das mais promissoras oleaginosas do Brasil devido à facilidade de adaptação da planta, que pode ser cultivada em mais de 90% do território nacional. Além disto, apresenta as seguintes vantagens de cultivo, baixo custo de produção, capacidade de produção em solos pouco férteis e arenosos, alta produtividade e facilidade de colheita das sementes. As sementes produzem um óleo de excelente qualidade, superior ao óleo de mamona, e semelhante ao diesel extraído do petróleo, para ser usado como combustível. As propriedades encontradas no biocombustível do pinhão-manso atendem às especificações da Agência Nacional de Petróleo (ANP) para o petrodiesel (PINHÃO MANSO, 2009). Após a extração do óleo, o pinhão gera cerca de 1 t de torta por hectare, e ainda pode ser usada para recuperação de solos (SHARMA et al.,2008), pois é rica em nitrogênio, fósforo e potássio e depois de desintoxicada usada como ração animal (BRASIL, 1985).
pode ser utilizada na conservação do solo, pois cobre com uma camada de matéria seca, reduzindo, dessa forma, a erosão e a perda de água por evaporação, evitando enxurradas e enriquecendo o solo com matéria orgânica decomposta.
Jatropha curcas normalmente atinge uma altura de 3-5 m, mas pode alcançar uma altura de 8-10 m sob condições favoráveis. O sistema radicular da planta prossegue através do desenvolvimento de uma raiz principal e quatro raízes laterais superficiais. As folhas são lisas, com cinco lobos abrangendo 10-15 cm e podem cair uma vez por ano, dependendo do seu genótipo (CARELS, 2009). As inflorescências terminais são flores unissexuais, na mesma inflorescência (cacho). A inflorescência é uma panícula, com flores femininas (cerca de 10-20%) nos ápices da haste principal e ramos de flores masculinas que são numerosos (cerca de 80-90%) e ocupam posições subalternas na inflorescência (RAJU et al., 2002). As flores masculinas abrem por um período de 8-10 dias, enquanto que as flores femininas abrem apenas 2-4 dias. Os resultados contínuos floração é uma sequência de fases de desenvolvimento reprodutivo de frutos maduros amarelos na base do ramo, os frutos verdes no meio, e as flores no topo (CARELS, 2009).
Após a polinização, as inflorescências formam uvas de 10 frutos verdes, 2-3 cm e comprimento com uma forma ovóide. Cada fruto normalmente tem três carpelos e o potencial para duas sementes por carpelo (KOCHHAR et al., 2008). No entanto, existem frutos com mais de três sementes por fruto e muitas vezes só uma, que dá 2,5 sementes por fruto, em média (CARELS, 2009).
Em regiões tropicais úmidas, ou sob condições irrigadas, ocorrem floração por grande parte do ano. Por causa da floração contínua, a produção ocorre durante 4 meses por ano e os frutos devem ser colhidos três vezes durante este período. O que dificulta a mecanização é o baixo número de flores femininas na ramificação, tornando a polinização inadequada, que é o principal fator que limita a produção de sementes de pinhão manso e, assim, no rendimento de óleo (CARELS, 2009).
Frutos de polinização cruzada são significativamente maiores, mais pesados e mais numerosos do que aqueles produzidos por autógamas, flores autopolinizadas. Portanto, não é surpreendente que as abelhas desempenham um papel positivo na polinização do pinhão (ABDELGADIR et al., 2008).
A poda é realizada através da eliminação das ramificações abaixo de 50 cm, ao longo 80 cm. Este processo permite a mecanização da colheita das frutas (CARELS, 2009).
A produtividade vegetal começa a ser estável após o primeiro ano, normalmente quando as árvores são 2-4 anos de idade. A produção econômica das plantas de Jatropha estende-se desde o primeiro ano após plantação até 40 anos (CARELS, 2009).
Um aspecto importante no estudo de novas espécies, caso do pinhão manso, é a caracterização molecular, utilizada como importante ferramenta para auxiliar os programas de melhoramento. O uso desta classe de marcadores é bastante promissor, pois os locos são os que apresentam maior frequência de mutações em todos os genomas e em todas as espécies animais e vegetais.
2.3. O impacto da ação antrópica sobre as florestas
A história e a evolução da humanidade sempre estiveram associadas à história das florestas. Seja pelos grandes benefícios obtidos pelo homem através da utilização de matérias-primas até a destruição de diversos ambientes florestais (LINS, 2004). A ocupação desordenada e práticas de atividades como a agropecuária, exploração mineral e obras de engenharia provocaram a fragmentação de maciços contínuos de vegetação. Florestas nativas foram relegadas à condição de ilhas de diferentes tamanhos e formas, as quais terão grandes influências sobre a genética de populações naturais de essências florestais (PAULA; RODRIGUES, 2002).
Dessa forma, a separação artificial do habitat natural leva à fragmentação, ou seja, à formação de fragmentos isolados que são envolvidos por uma matriz altamente modificada ou degradada, que pode ser constituída por culturas agrícolas ou outro tipo de atividade (ISHIHATA, 1999). A fragmentação não é originária exclusivamente da ação antrópica, eventos naturais como montanhas, lagos e outras formações vegetativas são capazes de diminuir, significativamente, o fluxo de animais, pólen e/ou sementes (VIANA, 1990).
aumento da divergência genética entre populações, através de eventos como aumento da deriva genética, aumento da endogamia, redução do fluxo gênico e aumento da probabilidade de extinção local (BALERONI, 2003).
Os principais efeitos genéticos observados na fragmentação de um contínuo florestal são: i) a diminuição da diversidade genética nas populações e espécies; ii) a mudança na estrutura genética populacional e iii) as modificações no sistema de cruzamento, alterando a composição dos agentes polinizadores ou mesmo, seus comportamentos individuais (YOUNG; BOYLE, 2001; PRIMACK; RODRIGUES, 2001; BALERONI, 2003). Os efeitos genéticos podem ser diferentes e mais complicados, devido às interações com as demais espécies que, também, podem estar sofrendo os efeitos dessa fragmentação (RIBAS e KAGEYAMA, 2004).
Informações como diversidade genética, estrutura genética e o sistema de reprodução de populações remanescentes de fragmentos florestais são importantes para o delineamento de estratégias para a conservação, melhoramento genético e exploração florestal sustentado de espécies arbóreas, visto que a diversidade genética é o fator responsável pela adaptação e sobrevivência de indivíduos diante de mudanças ambientais (RAJORA; PLUHAR, 2003), e o sistema de reprodução é o elo de ligação genética entre as gerações (SEBBENN, 2002).
A diversidade genética promove a matéria prima para adaptação, evolução e sobrevivência das espécies e indivíduos, especialmente sobre mudanças ambientais e condições de doenças. Reduções na diversidade genética podem predispor as espécies a alterações patológicas, reduzir a produtividade e limitar o melhoramento genético (RAJORA; PLUHAR, 2003). O conhecimento da biodiversidade de uma determinada população é imprescindível na elaboração de estratégias de conservação genética e também para a utilização de espécies, visando o melhoramento (ASSUNÇÃO, 2004).
A estrutura genética de populações de Caryocar brasiliense ocorrentes em fragmentos de cerrado brasileiro foi estudada por Collevatti et al. (2001). Não se detectou nenhum efeito da fragmentação na heterozigosidade ou na endogamia, muito provavelmente, decorrente do fato da fragmentação daquela área de cerrado ser recente (cerca de 60 anos) em comparação com o ciclo de vida da espécie. Além disso, a população sobrevivente à fragmentação era composta principalmente de indivíduos adultos. Assim, os autores alertam para a necessidade de se empregar em estudos deste tipo, não apenas indivíduos adultos, mas também jovens de forma a se identificar os efeitos contemporâneos da fragmentação sobre a população.
O modo de reprodução de uma espécie tem implicações nas taxas de endogamia e grau de parentesco das futuras gerações, já que tem um papel importante na determinação da constituição dos conjuntos genotípicos, na extensão em que os genes são trocados entre indivíduos e nas taxas de emigração e imigração (SEOANE et al., 2005). O sistema de reprodução, juntamente com os mecanismos de dispersão de pólen e sementes, determina, em parte, a estrutura genética das populações (HAMRICK; LOVELLESS, 1986). Seu conhecimento é de fundamental importância em programas de melhoramento e conservação genética porque permite delinear estratégias que otimizem a amostragem da variabilidade genética e a adoção de modelos genético-estatísticos adequados para a estimativa de parâmetros genéticos (SOUZA et al., 2003).
O incentivo a programas de conservação genética de determinadas espécies com risco ou não de extinção é de vital importância. A exposição de espécies arbóreas, a condições extremas de exploração e manejo inadequados pode levá-las à perda da variabilidade genética e a depressão endogâmica. A consequência da perda de variabilidade genética para uma espécie significa a redução no número de lócus heterozigoto das populações e principalmente ausência de adaptação. A depressão endogâmica, em condições adversas, promove a redução da sobrevivência de indivíduos inaptos e a geração de indivíduos de baixa fecundidade (AMOS; BALMFORD, 2001). A conservação dos recursos genéticos, mesmo para aquelas populações que estão fora da lista de espécies ameaçadas de extinção, é fundamental para as futuras gerações, no que diz respeito ao melhoramento da espécie e aproveitamento de genes específicos de interesse (FREITAS et al., 2006).
único. (GIUDICE et al., 2005). Não há hierarquia entre as formas de conservação in situ e ex situ. Em algumas situações a conservação ex situ é essencial e complementar à in situ, principalmente em espécies raras com risco de extinção (KAGEYAMA, 1987). Porém, a utilização exclusiva da conservação ex situ tem contribuído decisivamente para a sobrevivência de populações de espécies florestais que estão sendo fragmentadas (VALOIS, et al., 2001).
2.4. Emprego de marcadores moleculares no estudo das espécies florestais
A utilização de marcadores genéticos em estudos populacionais de espécies florestais tem demonstrado tratar-se de uma ferramenta de alto potencial (FREITAS et al., 2005). Nessas espécies, os marcadores moleculares têm sido utilizados tanto nos programas de melhoramento, visando ao aumento de produtividade e qualidade dos produtos, como à geração de dados genéticos (variabilidade genética, sistema reprodutivo, estrutura populacional) que permitem a elaboração de estratégias de conservação e melhoramento de espécies vegetais (PAULA, 2006).
Embora a aplicação da biologia molecular em espécies florestais tenha sido relativamente mais lenta do que nas espécies agrícolas, na última década houve grande aumento de publicações de recursos genômicos disponíveis para espécies florestais. Avanços recentes, em genética molecular de árvores, contribuíram para um melhor entendimento da organização do genoma, estrutura, função, e evolução de espécies florestais (GONZÁLEZ-MARTÍNEZ et al., 2006).
Estudos utilizando marcadores genéticos contribuíram, expressivamente, para a compreensão de fluxo de gene, hibridação, estrutura de população, deriva genética e sistema reprodutivo (NEWTON et al., 1999; OUBORG et al., 1999; HAMRICK; NASON, 2000; LINHART, 2000). Em espécies florestais, especificamente, a aplicação comum de marcadores moleculares foi utilizada para mensurar a diversidade genética (PETIT et al., 2005) testar hipóteses de glaciação relacionadas a padrões de migração (PETIT et al., 2003) caracterizar a expansão de genótipos particulares, mediada pela ação antrópica (GIL et al., 2004) e descrever a estrutura de reprodução e fluxo de gene (NASON et al., 1998; ADAMS; BURCZYK, 2000; SMOUSE; SORK, 2004).
No entanto, a descoberta de locos altamente variáveis tais como microssatélites, ou sequência simples repetida (SSRs), solucionou esse entrave, de maneira que o poder estatístico disponível para fazer a diferenciação entre grupos de espécies com risco de extinção é, atualmente, muito elevado (HEDRICK, 2001).
Dessa forma, os microssatélites têm sido a classe de marcadores moleculares mais extensamente usados em estudos de genética, com diversas aplicações incluindo a conservação genética, a genética de população, sistema de reprodução, teste de paternidade, e, também, para o estudo de populações de espécies florestais (DAYANANDAN et al., 1997; COLLEVATTI et al., 1999). Sua crescente utilização deve-se ao fato de que esses marcadores são codominantes, multialélicos, altamente reproduzíveis, polimórficos, têm grande resolução e estão baseados na reação da polimerase em cadeia (PCR) (OLIVEIRA et al., 2006). Marcador molecular, baseados em PCR, destaca-se por requerer um menor número de locos para fornecer uma estimativa satisfatória das relações entre indivíduos, no caso, de microssatélite de 30-40 locos (BLOUIN, 2003).
Embora os microssatélites sejam usados extensivamente em um número considerável dos estudos que cobrem as mais variadas áreas da genética, a dinâmica mutacional dessas regiões genômicas é pouco compreendidas (SCHLÖTTERER; HARR, 2000), embora se saiba que a taxa de mutacional desses locos é muito mais elevada do que a que ocorre em outras partes do genoma, variando de 10-2 a 10-6 nucleotídeos por loco a cada geração (SIA et al., 2000).
Em Caryocar brasiliense os marcadores microssatélites foram utilizados por Collevatti et al., (2001) no estudo da estrutura genética da espécie ocorrentes em fragmentos de cerrado brasileiro e em Jatropha curcas L. utilizados por Sun et al. (2008) na China.
2.5. Sistema de reprodução em espécies arbóreas
tempo de receptividade dos órgãos masculino e feminino favorecem a polinização cruzada, o que foi demonstrado por Costa (1988) para Anandenanthera falcata, Vochysia tucanorum e Xylopia aromatica três espécies que ocorrem no cerrado da região de Itirapina-SP.
Tabela 1. Estimativa da taxa de cruzamento multiloco (tˆm ), taxa de cruzamento entre indivíduos parentes (tˆm tˆs), correlação de paternidade (rˆp(m)) e número efetivo de doadores
de pólen (Nˆep) para algumas espécies arbóreas.
Espécies tˆm tˆm tˆs rˆp(m) Nˆep Autores Araucaria angustifolia 0,99 0,04 0,23 5 Sousa et al. (2005) Araucaria angustifolia - 0,08 - - Bittencourt e Sebbenn
(2007)
Araucaria angustifolia 0,99 0,11 0,20 5,1 Bittencourt e Sebbenn (2008)
Bagassa guianensis 0,98 0,05 0,19 5,2 Silva et al. (2008) Caesalpinia echinata 0,98 0,08 0,61 2 Giudice Neto et al.
(2005)
Cariniana legalis 0,96 0,07 0,28 4 Sebbenn et al. (2000) Caryocar brasiliense 1,00 0,19 0,16 7 Collevatti et al. (2001) Cecropia pachystachya 1,00 0,19 0,34 - Kageyama et al. (2003) Cedrella fissilis 0,92 0,09 0,12 9 Kageyama et al. (2003) Cedrela odorata 0,97 0,03 0,16 7 James et al. (1998) Ceiba pentranda 0,64 - 0,86 2 Lobo et al. (2005) Chorisia speciosa 0,93 0,17 0,60 2 Souza et al. (2003) Copaifera langsdorffii 0,93 0,47 0,78 4 Manoel (2011) Crytocarya moschata 0,86 0,11 0,38 3 Moraes (1997)
Enterolobium cyclocarpum 0,90 0,05 0,32 4 Rocha e Aguiar (2001) Eremantus erythropappus 0,96 0,04 0,38 3 Barreira et al. (2006) Eschweilera ovata 0,99 0,07 0,50 2 Gusson et al. (2006) Esenbekia leiocarpa 0,96 0,07 0,87 2 Seoane et al. (2001) Genipa americana 0,82 0,07 0,69 2 Sebbenn et al. (1998) Hevea brasiliensis 0,75 0,01 0,35 3 Furlani et al. (2005) Hymenaea courbaril 0,99 0,01 0,15 8 Santos (2002) Hymenaea courbaril 1,00 0,10 0,26 3,8 Lacerda e Kanashiro
(2008) Hymenaea courbaril var.
stilbocarpa 0,98 0,29 0,18 5,7 Feres et al. (2009) Hymenaea stigonocarpa 0,86 0,29 0,66 2 Moraes et al. (2007) Hymenaea stigonocarpa - - 0,32 3,8 Moraes e Sebbenn
(2011)
Tabela 1. (Cont...)
Espécies tˆm tˆm tˆs rˆp(m) Nˆep Autores Myracrodruon urundeuva 1,00 0,08 0,67 1,5 Moraes et al. (2004) Myracrodruon urundeuva 1,00 0,01 0,16 3 Viegas et al. (2011) Myracrodruon urundeuva - - 0,06 6 Gaino et al. (2010) Pachira quinata 0,92 - 0,47 2,1 Fuchs et al. (2003) Parapiptadenia rigida 0,97 0,02 0,36 3,0 Ribas (1999) Peltophorum dubiun 0,67 0,10 0,09 12,0 Mori et al. (2006) Samanea saman - - 0,03 37,0 Cascante et al. (2002) Senna multijuga 0,69 0,08 0,28 4,0 Ribeiro e Lovato (2004) Sextonia rubra 0,99 0,14 0,10 10,0 Veron et al. (2005) Symphonia globulifera 0,92 0,16 0,47 3,0 Degen et al. (2004) Symphonia globulifera 1,00 0,09 0,41 2,4 Carneiro et al. (2007) Tabebuia cassinoide 0,84 0,13 0,42 3,0 Sebbenn et al. (2001) Theobroma grandiflorum 1,00 0,05 0,93 2,0 Alves et al. (2003) Trema micrantha 0,89 0,19 0,63 2,0 Ribas (2003) e Ribas e
Kageyama (2004) Média 0,92 0,11 0,40 4,8
O sistema de reprodução é um importante determinante da estrutura e diversidade genética das populações naturais, pois estabelece o padrão da união dos gametas para formar a próxima geração (LIENGSIRI et al., 1999). Diversas variáveis ecológicas têm sido propostas como fatores que podem afetar os padrões de reprodução em espécies arbóreas, como por exemplo, o isolamento espacial (CASCANTE et al., 2002; FUCHS et al., 2003), a fenologia de florescimento (ODDOU-MURATORIO et al., 2006), a densidade de plantas (MURAWSKI; HAMRICK, 1991 e FRANCESCHINELLI; BAWA, 2000) e a atividade de polinizadores.
Entre esses fatores, tanto o isolamento temporal (diferenças na fenologia da floração) quanto o isolamento espacial de floração (baixa densidade) têm sido propostos como causas das altas taxas de autofecundação de algumas espécies arbóreas (MURAWSKI; HAMRICK, 1991; FUKUE et al., 2007).
O aumento da autofecundação pelo isolamento espacial de populações e indivíduos pode resultar em endogamia nos descendentes e depressão por endogamia subsequente, que é mais grave na espécie predominantemente de fecundação cruzada (NASON; HAMRICK, 1997). Além disso, pode reduzir a atividade dos polinizadores e aumentar a distância por recursos alimentares, impulsionando que muitos polinizadores invistam mais tempo de forrageamento dentro da mesma árvore, podendo ocasionar aumento da taxa de autofecundação e cruzamentos correlacionados (QUESADA et al., 2001; FUCHS et al., 2003).
Altos níveis de endogamia e deriva genética podem levar a diferenciação genética entre populações e, eventualmente, a especiação (COLLEVATTI et al., 2001).
O sistema de reprodução das espécies arbóreas pode ser medido como a proporção de sementes que resultam de cruzamentos ou autofecundação (MURAWSKI; HAMRICK, 1991). Em sementes provindas de cruzamento, a reprodução pode ser medida como a proporção de sementes provenientes do mesmo doador de pólen (cruzamento correlacionado) ou de doadores de pólen diferentes. Para isto, marcadores genéticos têm sido utilizados de forma eficiente para elucidar a taxa de cruzamento (ou autofecundação) em um conjunto de progênies de polinização livre, permitindo a avaliação do produto final do ciclo de dispersão de pólen (ASHLEY, 2010).
Pode-se caracterizar o sistema de reprodução de espécies arbóreas basicamente por dois modelos: o modelo aleatório e o modelo misto de reprodução (SEBBENN et al., 2001).
O modelo de cruzamentos aleatórios é o modelo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg. No modelo misto, a taxa de cruzamento pode ser estimada tanto pelo modelo de Equilíbrio de Endogamia de Wright (EEW), quanto baseado nos genótipos multilocos observados em progênies de mães conhecidas. No primeiro modelo (EEW), a endogamia é atribuída ao cruzamento entre aparentados ou autofecundação. Os modelos multilocos (RITLAND; JAIN, 1981) levam em consideração combinações genotípicas em todos os locos. As estimativas da taxa de cruzamento multiloco (tm) são obtidas por máxima
3. CAPÍTULO I
INFLUÊNCIA DA PRESENÇA DE ÁRVORES ISOLADAS EM
POVOAMENTOS DE EUCALIPTOS NA ESTRUTURA GENÉTICA DE
POPULAÇÕES DE
Caryocar brasiliense
EM FRAGMENTOS DO
RESUMO
A crise do petróleo impulsionou a procura por novas fontes de energias que não agride o meio ambiente com tanta ênfase como os derivados do petróleo. O biodiesel, produzido a partir de óleos vegetais, passou a ser fonte mais amplamente discutida. O pequi (Caryocar brasiliense Camb.) é uma das espécies das quais podem ser extraídos óleos para produção de biodiesel, porém devido ao avanço das fronteiras agrícolas, os remanescentes desta espécie, símbolo do Cerrado, encontra-se em extinta em muitas regiões do Brasil. Diante disto, os objetivos deste estudo foram investigar por marcadores microssatélites o sistema de reprodução em amostras de progênies de polinização aberta de duas populações de C. brasiliense, uma localizada no interior de um talhão de eucalipto (POP-TE) e outra em um fragmento florestal que constitui a Reserva Legal (POP-RL), da Fazenda Curucaca, visando o melhoramento genético desta espécie que pode ser utilizada na produção de biodiesel. Foram mapeadas, amostradas e genotipadas todas as árvores adultas reprodutivas existentes nas duas populações estudadas, sendo 118 árvores do talhão (POP-TE) e 60 árvores adultas situadas do interior da Reserva Legal (POP-RL). Em cada população foram coletados frutos de 20 árvores adultas reprodutivas para extração do DNA do embrião (20 frutos por matriz). Foram detectados 170 alelos nos adultos da Reserva legal e 169 nos adultos do Talhão, sendo obtido para os frutos de ambas as populações de cerca de 243 e 242 alelos, respectivamente. A heterozigosidade observada foi significativamente maior que zero nos adultos das duas populações (Ho=0,620; POP-TE) e (Ho=0,561; POP-RL) do que nas amostras dos frutos do Talhão (Ho=0,506) e da Reserva Legal (Ho=0,472). A heterozigosidade esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg foi maior que a observada em todas as amostras, indicando deficiência de heterozigotos. Consequentemente, o índice de fixação foi positivo e significativamente diferente de zero nos adultos da POP-RL (Fp=0,416) e POP-TE (0,353) e nos frutos da Reserva Legal (Fp=0,494) e Talhão ((Fp=0,457). Portanto, embora a população tenha altos níveis de diversidade genética, a maior parte desta diversidade genética está combinada nos genótipos em homozigose, que podem ser devido a excesso de homozigotos, provavelmente endogamia advinda de autofecundações e cruzamentos entre parentes, o que é indicado pelos desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em termos gerais, os resultados obtidos demonstram que o isolamento espacial do fragmento da Reserva legal das árvores isoladas no interior do Talhão de Eucalipto pode aumentar a endogamia nas futuras gerações.
ABSTRACT
The oil crisis boosted demand for new energy sources that do not harm the environment as strongly as those derived from petroleum. The biodiesel produced from vegetable oils, has become more widely discussed source. The pequi (Caryocar brasiliense Camb.) is a species of which can be extracted oils for biodiesel production, but due to the expansion of farming, the remnants of this species, symbol of the Cerrado, is in extinct in many regions of Brazil. Given this, the objectives of this study were to investigate microsatellite markers for the mating system in samples of open-pollinated progenies of two populations of C. brasiliense, one located within a stand of eucalyptus (POP-TE) and another in a forest fragment that constitutes the Legal Reserve (RL POP), aimed at the genetic improvement of this species that can be used to produce biodiesel. Were mapped, sampled and genotyped all adult reproductive trees existing in the two populations studied, with 118 trees of the field (POP-TE) and 60 adult trees located inside the Legal Reserve (RL POP). In each population were collected fruits of 20 adult reproductive trees for DNA extraction of the embryo (20 fruits per array). In each population were collected fruits of 20 adult reproductive trees for DNA extraction of the embryo (20 fruits per array). Were detected 170 alleles in adults of legal reserve and 169 adults in the Field, being obtained for the fruits of both populations of about 243 and 242 alleles, respectively. The observed heterozygosity was significantly higher in adults of two populations (Ho = 0.620; POP-TE, mean ± 95% CI) and (Ho = 0.561; POP-RL, mean ± CI 95%) than in the samples of the fruits of Field (Ho = 0.506) and the Legal Reserve (Ho = 0.472). The expected heterozygosity in Hardy-Weinberg equilibrium was higher than that observed in all samples, indicating deficiency heterozygotes. Consequently, the fixation index was positive and significantly different from zero in adult POP-RL (Fp = 0.416) and POP-TE (0.353) and fruits Legal Reserve (Fp = 0.494) and Field ((Fp = 0.457). Therefore, although the population has high levels of genetic diversity, most of this genetic diversity is combined in homozygous genotypes, which may be due to excess of homozygotes, probably inbreeding arising from self-pollination and crosses between relatives, which is indicated by deviations from Hardy-Weinberg equilibrium. In general, the results show that the spatial isolation of the fragment of the legal reserve of isolated trees within the Field of Eucalyptus may increase inbreeding in future generations
3.1. INTRODUÇÃO
O Cerrado constitui o segundo maior bioma do Brasil, abrigando uma alta biodiversidade e uma grande gama de recursos adaptados às condições ambientais que determinam sua existência (AB’SABER, 2003). Dentro de seus domínios podemos encontrar diferentes fitofisionomias que incluem formações florestais com a predominância de espécies arbóreas, savânicas compostas por arbustos e árvores dispersos sobre um estrato graminoso e campestres com o predomínio de espécies herbáceas e arbustivas (RIBEIRO; WALTER, 1998).
Este bioma foi considerado como um dos “hotspots” mundiais de diversidade (MYERS et al., 2000). No entanto, a cobertura original do cerrado está sendo reduzida em 40%, comprometendo a conservação da biodiversidade (SANO et al, 2010).
Dentre as espécies que se destacam no Cerrado encontra-se o pequizeiro, Caryocar brasiliense. A espécie pertence à família Caryocaraceae, a qual possui apenas dois gêneros e 25 espécies. O gênero Anthodiscus possui nove espécies e o gênero Caryocar dezesseis, das quais doze ocorrem em território brasileiro. As espécies são adaptadas a vários tipos de vegetação, sendo que a maioria ocorre em florestas tropicais úmidas, e são encontradas desde a Costa Rica até o Paraná, ocorrendo em pelo menos sete estados do Brasil.
O pequi é um importante produto florestal não-madeireiro desse bioma, que apresenta grande diversidade de produtos não-madeiros potencialmente viáveis para a exploração econômica muito utilizadas pelas famílias rurais tanto para consumo quanto para a comercialização. Dentre as principais características o fruto do pequi destaca-se com alto valor nutritivo do óleo presente em sua polpa e amêndoa (vitamina A). Suas aplicações não se restringe a indústria artesanal e culinária regional, apresenta também potencial de uso para a produção de combustíveis e lubrificantes (EMBRAPA, 2008).
Estudos têm mostrado do ponto de vista racional que é possível à utilização do óleo de pequi como matéria-prima para produção de biodiesel através da metanólise com catálise básica homogênea com conversão acima de 98%. O potencial como biocombustível se deve à vantagem comparativa com outras oleaginosas em termos de produção. Enquanto com o pequi pode-se produzir até 3.200 L/ha de biodiesel, a soja rende apenas 400 L/ha. (NOVA, 2006).
um todo. Nas últimas décadas esses impactos vêm se intensificando, o que acaba por impor barreiras que dão origem aos processos de fragmentação, onde grandes habitats são compartimentados em frações menores, as quais alteram áreas de vegetação nativa contínua dando forma a um mosaico de ambientes fragmentados e isolados (FORMAN; ALEXANDER, 1998). Diversos estudos vêm sendo realizados sobre espécies nativas do Cerrado para detectar as consequências da fragmentação, porém do ponto de vista genético muito pouco se conhece.
O Cerrado é considerado um recurso natural renovável que, se for manejado adequadamente, pode gerar ocupação permanente para um grande número de pessoas, fornecer matéria-prima para a indústria, além de preservar a biodiversidade, garantindo a conservação da fauna e flora nativas, bem como a manutenção da qualidade da água (POZO, 1997).
Com o avanço da fronteira agrícola no Cerrado, sob a forma de expansão de grandes lavouras com monoculturas, como a soja e de fazendas de reflorestamento de eucalipto têm impactado a região, caracterizando-se como as principais ameaças ao estoque natural do pequizeiro e a toda biodiversidade do bioma. A exploração extrativismo indiscriminada dos frutos pode afetar a produtividade e a diversidade natural da população, pois a maioria dos frutos de alta qualidade são coletadas, impedindo assim sua regeneração natural (MINISTÉRIO DE DESENVOLVIMENTO AGRÍCOLA, 2010)
Estrategicamente, a sustentabilidade das florestas combina a conservação da biovariabilidade genética e variabilidade genética com interesses econômicos e fins sociais. Para a sobrevivência das populações naturais de uma espécie, pressupõe-se a manutenção do dinamismo demográfico e de sua estrutura genética, assim como das interações com outras espécies do ecossistema. Para isso, os estudos sobre a ecologia das espécies são necessários, especialmente quando tratam de aspectos de dinâmica e movimento de alelos (TORIBIO; CELESTINO, 2000). A caracterização dos níveis de variabilidade genética e estrutura genética e o conhecimento da dinâmica do movimento dos alelos proporcionam as bases necessárias para a execução de estratégias que tratam de maximizar o aproveitamento em programas de melhoramento e conservação genética (RAJORA et al., 2000).
sua cadeia de produção, industrialização e comercialização representam 4,5 % do PIB brasileiro, tendo gerado um faturamento de US$ 8 bilhões em 2002, e empregado 6,5 milhões de pessoas, o que corresponde à cerca de 9% da população economicamente ativa do país (MDICE, 2005). Verifica-se, portanto a grande importância deste setor para o desenvolvimento nacional. Entretanto, frequentemente o setor florestal depara-se com questões genético-ecológicas que necessitam de subsídios científicos para serem solucionadas.
Uma dessas questões é a utilização de áreas para plantio de florestas. Muitas vezes, se faz necessário a utilização de espaços ocupados pela vegetação nativa. Em alguns casos após a implantação da cultura, alguns espécimes permanecem dentro da área de reflorestamento, dificultando o manejo do plantio e assim levantando questionamentos por parte das empresas reflorestadoras, a respeito da real importância ecológica e genética que justificaria a manutenção destes indivíduos dentro dos plantios.
Assim, uma forma de resolver essas questões é verificar o nível de diversidade genética, a ocorrência de alelos privados naquela população, e finalmente a participação destes indivíduos nos eventos de cruzamento e fluxo gênico dentro daquelas populações e entre populações adjacentes. Esta forma de abordagem permite investigar a contribuição destes indivíduos na manutenção da diversidade genética para suas gerações subsequentes, garantindo que genes relacionados à adaptabilidade a condições ambientais sejam preservados, e assim assegurando a matéria prima para a evolução e a preservação da espécie. Somado a isto, a partir deste estudo também é possível verificar se a endogamia está atuando naquela população em decorrência do baixo número de indivíduos, o que pode levar a depressão gênica tornando a população vulnerável.
3.2. OBJETIVOS
Com base em parâmetros genéticos obtidos na análise molecular de locos microssatélites (SSR), este trabalho teve por objetivo investigar o sistema de reprodução em amostras de progênies de polinização aberta de duas populações de C. brasiliense, uma localizada no interior de um talhão de eucalipto (POP-TE) e outra em um fragmento florestal que constitui a Reserva Legal (POP-RL), da Fazenda Curucaca em Três Lagoas-MS, utilizando oito locos microssatélites, visando à conservação e o melhoramento desta espécie que pode ser utilizada para a produção de biodiesel. Mais especificamente pretendeu-se responder as seguintes questões:
1. Existem diferenças na taxa de cruzamento em árvores que ocorrem isoladas dentro do plantio de eucalipto (POP-TE) em relação a árvores na reserva legal (POP-RL)?
2. As taxas de cruzamentos entre parentes e cruzamentos correlacionados são maiores, na POP-TE ou na POP-RL?
3. O tamanho efetivo dentro das progênies é maior na POP-TE ou na POP-RL?
4. Existe ou não necessidade da preservação de árvores isoladas de C. brasiliense no interior da cultura de Eucalyptus para a manutenção da base genética desta espécie na região?
3.3. MATERIAL E MÉTODOS
3.3.1. Material
3.3.2. Métodos
3.3.2.1. Mensurações das árvores
Com auxílio de uma suta ou paquímetro florestal foi mensurado o DAP (Diâmetro a altura do peito) em centímetros. A altura total das plantas foi mensurada em metros, utilizando-se de um medidor de altura do tipo Forestor Vertex (CAMPOS; LEITE, 2006). As plantas, também, foram avaliadas quanto a sua sobrevivência, atribuindo-se o valor 1 quando a planta estava viva e 0 quando morta. Com base nestes dados foram estimadas as médias (mˆ ), variância (Sˆ2), desvio padrão (Sˆ), coeficiente de variação (CV ), assimetria (
3
ˆ
A ) e curtose (Cˆ4) para cada uma destas características, em que:
n x
mˆ
i ; 1 ˆ ˆ 2 2 n m xS i Sˆ Sˆ2
m S CV ˆ ˆ . 100
3 3 3 . ˆ ˆ S n m xA
i4 4 4 . ˆ ˆ S n m x
C
iEstas estimativas foram descritas por Berquó et al. (1981), Beiguelman (1991), Andriotti (2003) e Resende (2007a). Para a obtenção destas estimativas utilizou-se o programa SELEGEN (RESENDE, 2007b).
3.2.2.2. Análise biométrica dos frutos
Tabela 2. Classificação da ocorrência de autofecundações com base no número de pirênios de pequi por fruto segundo Collevatti et al. (2009) para Caryocar brasiliense.
Nº de sementes abortadas Nº de autofecundações Nº de sementes/fruto (Pirênio)
0 0 4
1 1 3
2 2 2
3 3 1
4 4 0
Assim, a endogamia presente nestas populações de Caryocar brasiliense foi estimada de forma indireta, com base nas autofecundações.
Figura 1:Produção de pirênios desenvolvidos e abortados em fruto de pequizeiro (Caryocar brasiliense).
Fonte: Moraes (2007).
por fruto, em porcentagem, tomando-se o número total de frutos coletados na árvore como 100%. Essas amostras representavam a ocorrência de três, duas, uma e nenhuma autofecundação. Com base nestas informações foi obtida a média ponderada (wˆ ) da porcentagem de autofecundação existente na população. Essas amostras também foram distribuídas em classes, considerando: Aˆ (amplitude de variação), IC(intervalo de classe) e
NC(número de classe):
10 4 . 4 3 . 3 2 . 2 1 . 1 100
ˆ C C C C
w ) ( ) (max ˆ mínimo i imo i X X
A IC 0,5.Sˆ
IC A NC ˆ
Com base na inferência feita a autofecundação (sˆ) foi estimada a endogamia ( fˆ), ou seja:
s s f ˆ 2 ˆ ˆ (WRIGHT, 1978)
Para o número de pirênios por fruto também foram estimadas as médias (mˆ ), variância (Sˆ2), desvio padrão (Sˆ), coeficiente de variação (CV ), assimetria (
3
ˆ
A ) e curtose (
4
ˆ
C ),
3.2.2.3. Análise molecular
Figura 2: A) Corte de pequi: mesocarpo interno (Me), espinhos (Es), endocarpo (En), semente (S). B) Corte de semente corada com sal de tetrazólio: tegumento (T), embrião (E), plúmula (P) e região da radícula (R).
Fonte: DOMBROSKI (1997).
i) Extração de DNA
