1
BEATRIZ PARZEWSKI NEVES
O uso da vagina artificial interna para a coleta de
sêmen de touros bubalinos (Bubalus bubalis) com
diferentes experiências sexuais
Trabalho apresentado à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal.
Curso: Ciência Animal Área: Reprodução Animal Orientador: Prof. Marc Henry
Belo Horizonte
5
Dedico esse trabalho à minha família,
aos meus pais, Egberto e Rosangela,
meu porto seguro,
aos meus irmãos, Mariana e Pedro,
7 AGRADECIMENTOS
Aos meus pais pelo exemplo e pela dedicação, que me permitem continuar a sonhar. Aos meus irmãos, que foram meu apoio e minha torcida mesmo na distância. Sem vocês eu não seria nada. Ao Adriano, minha calmaria, por todo apoio, carinho e paciência, foi essencial.
Aos órgãos de pesquisa CNPq e INCT Pecuária pelo oferecimento de bolsa auxílio e financiamentos de projetos.
Aos professores Marcelo Rezende e Marcelo Chacur pela participação na banca e pelas sugestões oferecidas ao trabalho.
Aos professores do Setor de Reprodução, por dividirem seus conhecimentos e experiências. Aos professores Francisco Lobato e Nivaldo da Silva, pela concessão do Laboratório para o cultivo bacteriano.
Ao meu orientador, Marc Henry, pelo exemplo, pela determinação e pela exigência, sempre querendo nosso crescimento, minha eterna gratidão.
Aos colegas de orientação, May e Pat, pelas trocas de ideias e auxílio, Pacote, pela ajuda nas tabelas e nas coletas, Jaci, Gui e Marcus, pela ajuda nos dias de coleta. Aos que estiveram comigo nas coletas nas fazendas e às que estiveram comigo no laboratório, muito obrigada, não conseguiria sem vocês.
Ao Marcelino, por estar sempre com um sorriso no rosto, pela sua simplicidade e sua sabedoria, tornando o dia de trabalho mais suave.
Aos demais funcionários da Fazenda Modelo de Pedro Leopoldo, por ajudar sempre que necessário.
Aos senhores Marcelo, José Luiz, Márcio e Ronaldo, pela abertura de suas fazendas para nos receber, e aos seus funcionários, pela fundamental ajuda.
Aos colegas de pós-graduação: Cíntia, Clarice, Hariany, Natália, Pamela, Dimitri, Filipe e Carlos, pela companhia.
À Patrícia pelo auxílio estatístico, fundamental.
Às minhas amigas, Lala e Nat, pela boa companhia, entendendo meus dias de silêncio. Aninha, Bah e Carlinha, por entenderem minha ausência.
E a todos que torceram e rezaram por mim, e que de alguma forma me auxiliaram para chegar até aqui.
9
SUMÁRIO
RESUMO .... ………...……….12
ABSTRACT ... 13
1. INTRODUÇÃO ... 14
2. OBJETIVO GERAL ... 14
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 14
3. REVISÃO DE LITERATURA ... 15
3.1. COMPORTAMENTO SEXUAL DO MACHO ... 15
3.1.1. Avaliação do comportamento sexual do macho ... 16
3.1.2. Fatores que influenciam o comportamento sexual do macho bubalino ... 17
3.2. COLETA DE SÊMEN ... 18
3.2.1. Massagem das ampolas dos ductos deferentes ... 18
3.2.2. Coleta de espermatozoides da cauda do epidídimo ... 19
3.2.3. Eletroejaculação ... 19
3.2.4. Vagina artificial convencional ... 20
3.2.5. Vagina artificial interna ... 21
3.3. QUALIDADE DO SÊMEN BUBALINO ... 23
3.4. CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA DO SÊMEN ... 24
3.4.1. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen ... 25
4. EXPERIMENTO I – CARACTERÍSTICAS DO COMPORTAMENTO SEXUAL DE TOUROS BUBALINOS NA COLETA DE SÊMEN COM VAGINA ARTIFICIAL INTERNA E EFICIÊNCIA DO MÉTODO DE COLETA... 26
4.1. MATERIAL E MÉTODOS ... 26
4.1.1. Localização e animais experimentais ... 26
4.1.2. Vagina artificial interna ... 28
4.1.3. Comportamento sexual e coleta de sêmen ... 29
4.1.4. Análise estatística ... 29
4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 29
4.2.1. Considerações gerais ... 36
5. EXPERIMENTO II – AVALIAÇÕES DA QUALIDADE SEMINAL, DA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA DO SÊMEN E DA EFICIÊNCIA DE RECUPERAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES DO MÉTODO DE VAGINA ARTIFICIAL INTERNA... ... 37
5.1. MATERIAL E MÉTODOS ... 37
5.1.1. Localização e animais experimentais ... 37
5.1.2. Delineamento experimental ... 37
5.1.3. Coleta de sêmen ... 37
5.1.3.1. Vagina artificial interna ... 37
5.1.3.2. Vagina artificial convencional... 37
5.1.4. Avaliação da qualidade seminal ... 37
5.1.5. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen ... 38
5.1.6. Avaliação da eficiência de recuperação de espermatozoides ... 38
5.1.7. Análise estatística ... 39
5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 39
5.2.1. Avaliação da qualidade seminal ... 39
10
5.2.3. Avaliação da eficiência de recuperação de espermatozoides ... 42
5.2.4. Considerações gerais ... 43
6. CONCLUSÕES ... 43
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 44
ANEXO 1
...52LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Escore numérico e descrição de libido para bovinos, segundo Hultnas (1959)... 16Tabela 2 - Tempo de reação (TR) e agressividade sexual (AS) de touros bubalinos... 17
Tabela 3 - Características do ejaculado normal do bubalino... 23
Tabela 4 - Contagem de colônias bacterianas em amostras de sêmen de touros bubalinos coletadas com vagina artificial convencional... 25
Tabela 5 - Médias e desvios padrão do tempo de reação (em segundos) de acordo com a categoria de experiência sexual dos touros bubalinos estudados... 34
Tabela 6 - Eficiência do uso da vagina artificial interna para coleta de sêmen em búfalos...35
Tabela 7 - Ocorrências que impediram a coleta de sêmen com a vagina artificial interna...36
Tabela 8 - Características do sêmen fresco puro de touros bubalinos coletado pelos métodos de vagina artificial interna e vagina artificial convencional... 39
Tabela 9 - Valores médios de motilidade total, velocidade curvilínea (VCL), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade média da trajetória (VAP), linearidade (LIN) e frequência de batimento flagelar cruzado (BCF) dos espermatozoides de búfalos no sêmen fresco diluído coletado por vagina artificial interna e vagina artificial convencional... 41
Tabela 10 - Médias de Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC/mL) no sêmen fresco puro e no sêmen fresco diluído de touros bubalinos coletado pelos métodos da vagina artificil interna e convencional... 41
Tabela 11 - Eficiência de recuperação de espermatozoides dos métodos de vagina artificial interna e vagina artificial convencional... 42
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RESUMO
O objetivo deste trabalho foi testar o uso da vagina artificial interna para a coleta de sêmen de touros bubalinos. No Experimento I, 38 búfalos (Murrah e Mediterrâneo) foram avaliados durante a tentativa de coleta de sêmen com a vagina interna, divididos em 3 categorias de experiência sexual, Categoria 1: condicionados a coleta de sêmen com a vagina artificial convencional (n=9), Categoria 2: sem experiência sexual (n=14) e Categoria 3: com experiência sexual (n=15). No Experimento II, utilizando 6 búfalos Murrah, as amostras de sêmen da vagina interna foram comparadas às da vagina convencional nas qualidades macro e microscópicas, nos parâmetros do CASA, contaminação bacteriana (UFC/mL) e eficiência de recuperação de espermatozoides. No Experimento I, o uso da vagina interna permitiu a coleta de sêmen de 100% dos touros da Categoria 1, de 78,57% dos touros da Categoria 2 e de 46,67% dos touros da Categoria 3. No Experimento II, o volume do ejaculado e o número total de espermatozoides foram menores na vagina interna. Nos parâmetros do CASA, apenas Linearidade foi diferente, superior na vagina interna. O número médio UFC/mL nas amostras da vagina interna foi maior que da vagina convencional. A eficiência de recuperação de espermatozoides foi igual nos dois métodos. Recomenda-se a utilização da vagina artificial interna como método alternativo para a coleta de sêmen de touros bubalinos.
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ABSTRACT
The objective of this study was to test the use of internal artificial vagina to collect semen buffalo bulls. In the first experiment, 38 buffaloes (Murrah and Mediterranean) were evaluated while trying to semen collection with the internal vagina, divided into 3 categories of sexual experience, Category 1: conditioned to semen collection with conventional artificial vagina (n = 9 ), Category 2: without sexual experience (n = 14) and Category 3: sexually experienced (n = 15). In Experiment II, using 6 Murrah buffalo, the internal vaginal semen samples were compared to the conventional vagina in macro and microscopic characteristics in CASA parameters, bacterial contamination (CFU / mL) and sperm recovery efficiency. In Experiment I, the use of internal vaginal allowed semen collection 100% of the Category 1 bulls, of 78.57% of Category 2 bulls and 46.67% of Category 3 bulls. In Experiment II, the semen volume and the total number of sperm were lower in the internal vagina. The parameters of CASA, only Linearity was different, higher in the interna vagina. The average number CFU / mL in the internal vagina samples was higher than the conventional vagina. The sperm recovery efficiency was similar in both methods. It is recommended the use of internal artificial vagina as an alternative method for collecting water buffalo bulls semen.
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1.
Introdução
Em um sistema de produção como a bubalinocultura, onde o principal manejo reprodutivo é a monta natural (Ohashi et al.,2011), a predição da fertilidade do touro torna-se mais importante que a fertilidade individual das fêmeas, já que um touro é responsável pelo sucesso reprodutivo de muitas fêmeas (Prince, 1985). Por isso, para a seleção de reprodutores, além das características zootécnicas desejáveis, é importante a inclusão das avaliações da libido e da qualidade espermática. Se um reprodutor falhar em executar a monta ou em produzir sêmen de qualidade, ele deverá ser retirado do rebanho (Turner, 2010).
A realização do exame andrológico tem como princípio fundamental caracterizar o potencial reprodutivo dos touros e atender ao diagnóstico da saúde sexual, saúde hereditária e saúde reprodutiva, tanto no aspecto da capacidade de monta (potentia coeundi) quanto na capacidade
fecundante (potentia generandi) (Peña Alfaro, 2011). O exame andrológico deve ser indicado
para a seleção e preparação de touros antes da estação de monta ou para centrais de coleta, bem como nos casos de histórico de infertilidade individual (Peña Alfaro, 2011). No exame andrológico, no conjunto de exames específicos do aparelho reprodutor estão as avaliações do comportamento sexual e da qualidade do sêmen. A qualidade do sêmen não é avaliada apenas para predizer a fertilidade de um reprodutor, mas também para avaliar a melhor maneira de processar o ejaculado no laboratório (Den Daas, 1992).
Em touros bubalinos, Ohashi (2008) relata sucesso de coleta de sêmen por eletroejaculação, apenas em animais jovens. Segundo o autor, o animal adulto reage violentamente durante a tentativa de coleta de sêmen por este método, mostrando-se bastante sensível ao estímulo elétrico. O búfalo, apesar de ser uma das espécies mais facilmente condicionadas a servir na vagina artificial (Sansone, 2000), pode se tornar relutante ao serviço artificial, causando prejuízos na produção de sêmen (Prabhu e Bhattacharya, 1954; Prabhu, 1956). Muitas alternativas foram testadas na tentativa de reduzir esta recusa do touro ao serviço artificial, mas muitas vezes os animais voltam a refugar.
Considerando a frequente variabilidade de resposta de touros bubalinos à tentativa de coleta de sêmen pelo método da vagina artificial convencional e a baixa resposta ao método da eletroejaculação, este trabalho propõe testar um modelo adaptado do método de vagina artificial interna para a coleta de sêmen destes touros.
2. Objetivo geral
Avaliar o uso da vagina artificial interna como método de coleta de sêmen de touros bubalinos. 2.1. Objetivos específicos
Experimento I:
- Caracterizar o comportamento sexual do macho bubalino durante a coleta de sêmen com a vagina artificial interna.
15 Experimento II:
- Comparar a qualidade do sêmen e a contaminação bacteriana das amostras coletadas pelos métodos de vagina artificial interna e convencional.
- Comparar a eficiência de recuperação dos espermatozoides coletados pelos métodos de vagina artificial interna e convencional.
3. Revisão de literatura
3.1. Comportamento sexual do macho
Muitos comportamentos das espécies domésticas estão relacionados à automanutenção, principalmente os comportamentos não sociais, como a alimentação, a ruminação e o repouso. O comportamento sexual, entretanto, está relacionado com a manutenção da espécie e da genética (Shalash, 1984). O comportamento sexual de um touro inclui dois componentes: desejo sexual ou libido e a habilidade de monta (Chenoweth, 1983b). A libido é definida como a vontade e a ânsia para montar e para completar o serviço (Hultnas, 1959) e, a habilidade de monta pode ser caracterizada pela postura do macho durante o salto, a ejaculação e a desmonta (Chenoweth, 1981; Anzar et al., 1993).
Os eventos do comportamento sexual de um touro bubalino quando em contato com uma fêmea seguem alguns padrões (Shalash, 1984). Ao se aproximar de uma fêmea em estro, o búfalo realiza uma série de comportamentos que inclui o reflexo de Flehmen, os movimentos penianos curtos e a projeção de poucos centímetros do pênis (Johari, 1960). Antes do salto, o touro interage com a fêmea, realizando comportamentos classificados como estímulos táteis (Anzar et al., 1993). Dentre estes estímulos, são citados os comportamentos de cheirar, lamber o períneo da fêmea, cabecear e empurrar e apoiar o queixo (Anzar et al., 1993; Samo et al., 2005).
O reflexo de Flehmen foi descrito como o movimento de erguer a cabeça após cheirar a genitália da fêmea, levantando o queixo com a boca aberta, com a língua plana e com eversão dos lábios, fazendo com que as narinas fiquem parcialmente fechadas, possibilitando a inalação do odor sui generis, oriundo da genitália da fêmea investigada (Reinhardt, 1983). Este reflexo é
descrito em diversas espécies domésticas (Henry et al.,1987; Santos et al., 2006; Oliveira et al., 2007; Henry et al., 2009; Pacheco e Quirino, 2010) .
Em búfalos, a realização de repetidos reflexos de Flehmen durante a investigação de uma mesma fêmea foi relacionada ao estádio do estro da fêmea (Rajanarayanan e Archunan, 2004). A presença de 4-metilfenol e de trans-verbenol nas fezes de fêmeas em estro foram relacionados com o maior tempo de duração do reflexo de Flehmen e o número de montas realizadas pelo macho bubalino (Karthikeyan et al., 2013). Nesta espécie, o ato de monta é rápido, durando poucos segundos, e o impulso ejaculador é menos marcante que em bovinos. Depois da ejaculação, o búfalo desmonta vagarosamente e o pênis se retrai gradualmente para dentro da bainha prepucial (Jainudeen e Hafez, 1995).
16 sofrer influência das estações do ano (Dixit et al., 1984; Bhosrekar et al., 1992; Singh et al., 2001; Mandal et al., 2000; Samo et al., 2005).
3.1.1. Avaliação do comportamento sexual do macho
Para a seleção de um reprodutor de qualidade, a avaliação de sua capacidade reprodutiva deve ser baseada na libido e na qualidade seminal, pois como não há correlação entre estes parâmetros (Chenoweth, 1980) e a seleção por apenas um deles pode permitir a escolha de um reprodutor com baixa capacidade de servir, tanto a campo quanto na vagina artificial.
Uma das primeiras propostas para avaliar o comportamento sexual do macho bovino, foi feita por Hultnas (1959), que utilizou uma fêmea em estro contida e permitiu que o macho realizasse três tentativas para a coleta de sêmen na vagina artificial, durante um período de 10 minutos. Nesta proposta, o autor sugeriu que sejam avaliados: o cortejo sexual do touro diante da fêmea contida, o desejo de realizar o serviço, o seu comportamento ao completar o serviço na vagina artificial e o tempo de reação. A partir destas observações, Hultnas (1959) propôs a seguinte avaliação em escores:
Tabela 1. Escore numérico e descrição de libido para bovinos, segundo Hultnas (1959).
Escore Descrição
0 Nenhum interesse ou ausência de desejo sexual.
1 Pouco interesse em montar, farejar o posterior da fêmea e fazer vagas tentativas de monta, que podem esporadicamente levar ao serviço completo.
2 Montar depois de óbvias e repetidas hesitações, débil exploração e busca da vaca.
3 Monta comparativamente rápida, sem demonstrar ânsia, satisfatória exploração e busca da fêmea.
4 Monta rápida e concentração apenas na fêmea, boa exploração e busca da fêmea.
5 Monta ansiosa, muito boa exploração e busca da fêmea.
6 Ansiedade extrema para a monta, exploração extremamente árdua e busca intensiva da fêmea.
Fonte: Adaptado de Hultnas (1959).
A partir desta proposta, alguns pesquisadores (Osborne et al., 1971; Chenoweth, 1983a; Vale Filho, 1994; Pineda et al., 1997; Chaves et al., 2002; Oliveira et al., 2007; Dias, 2009) sugeriram outros modelos para a avaliação da libido do bovino.
17
Tabela 2. Tempo de reação (TR) e agressividade sexual (AS) de touros bubalinos.
TR (seg) Escore AS Escore
<5 6 Agressivo 4
6-15 5 Ativo 3
16-30 4 Lento 2
31-60 3 Tímido 1
61-120 2
121-300 1
>300 0 (Recusa a monta)
Fonte: Adaptado de Anzar et al. (1993).
Em bubalinos, o tempo de reação (Dixit et al.,1984; Tomar e Singh, 1996 e Kumar et al., 2008)
e os comportamentos realizados durante o período de coleta (Bhosrekar et al., 1992; Singh et al.,
2001 e Samo et al., 2005) também são critérios de avaliação da libido. Taha et al. (1984)
utilizando apenas o tempo de reação para avaliação da libido de búfalos mestiços, classificaram como reprodutores de boa libido animais que apresentaram tempo de reação próximo a 60 segundos, animais com tempo de reação próximo a 270 segundos foram classificados como reprodutores de libido média, e como baixa libido os animais que apresentaram tempo de reação próximo a 720 segundos.
3.1.2. Fatores que influenciam o comportamento sexual do macho bubalino A fêmea bubalina se comporta como um animal poliestral sazonal de dias curtos, em regiões mais distantes da linha do Equador, no sentido norte ou sul, apresentando interrupção da ciclicidade durante o verão, quando o período de luz diário é maior (Vale e Ribeiro, 2005). Em regiões mais próximas à linha do Equador, estas fêmeas apresentam comportamento poliestral contínuo, ou seja, ciclam o ano todo (Vale e Ribeiro, 2005). Em machos bubalinos, a influência da estação do ano sobre a capacidade reprodutiva do macho não está bem estabelecida. O tempo de reação não variou entre as estações do ano para os reprodutores da raça Murrah testados em um estudo realizado na Índia (Dixit et al., 1984). Contudo, neste estudo, a porcentagem de
búfalos que se recusaram a montar foi maior durante o verão se comparado ao inverno (Dixitet al., 1984), estes autores sugerem que a alta temperatura da estação iniba o comportamento do
macho. Em outro estudo (Mandal et al., 2000), também realizado na Índia, o tempo de reação
dos touros Murrah variou entre as estações do ano, sendo maior durante o verão e menor durante o inverno. A depressão sazonal na libido provavelmente pode ser atribuída a fatores ambientais, como o estresse térmico, a escassez de pastagem e a diminuição da disponibilidade de comida, ao invés de ser influenciada pelo aumento do foto-período no verão. Ohashi et al. (1988) sugerem que a coleta de sêmen do búfalo aconteça nas horas mais amenas do dia, devido a grande influência da temperatura sobre a libido deste animal.
18 corporal para realizar a monta dos animais mais velhos (Bhosrekar et al., 1992). A experiência sexual é um fator importante do comportamento sexual. Reprodutores bovinos e equinos treinados a servir a vagina artificial aprendem a depender de estímulos táteis, e ao aprender os padrões da cópula, o macho reduz a dependência dos centros sexuais neurais para o estímulo endócrino (MacDonald, 1975). A receptividade sexual da fêmea utilizada como manequim para a coleta de sêmen de búfalos condicionados parece não influenciar no tempo de reação destes machos (Prabhu e Bhattacharya, 1954).
Algumas condições clínicas podem estar associadas à baixa libido de reprodutores bubalinos. Casos de prolapso prepucial e degeneração testicular estão bem estabelecidos quanto a sua relação com o comportamento sexual e a fertilidade (Kumar et al., 2008). A laminite, a
dermatite escrotal e o aumento patológico do volume escrotal também podem ser relacionados com a baixa libido destes reprodutores (Kumar et al., 2008). Tanto a libido quanto a capacidade
de monta em touros bovinos são influenciadas por fatores genéticos, como a raça e a linhagem (Chenoweth, 1983a).
3.2. Coleta de sêmen
Para a coleta de sêmen são adotados métodos diferentes para cada objetivo. Uma amostra de sêmen para avaliação pode requerer apenas um pequeno volume, e o volume utilizado na inseminação artificial pode variar entre os indivíduos e as espécies (Sorensen, 1979). Em animais domésticos, o sêmen pode ser coletado por vagina artificial, eletroejaculação, estimulação manual das glândulas acessórias, dentre outros métodos (Stafford, 1995).
Na espécie bubalina, o método indicado para a coleta de sêmen é a vagina artificial convencional porque são animais facilmente condicionados ao serviço artificial (Sansone, 2000). Os métodos eletroejaculação e estimulação manual das glândulas acessórias são desaconselháveis para bubalinos, pois os animais são muito sensíveis aos estímulos elétricos (Ohashi, 2008) e a amostra de sêmen coletada pela massagem das glândulas acessórias apresenta menor qualidade quando comparada aos métodos de vagina artificial convencional e eletroejaculação (Ohashi et al., 2011).
Contudo, existem relatos de touros bubalinos de Centrais de coleta e processamento de sêmen, condicionados à coleta com vagina artificial convencional, que se tornaram resistentes ao serviço artificial (Prabhu e Bhattacharya, 1954; Prabhu, 1956; Cebran, 2012 - comunicação pessoal). Dificultando, desta forma, a manutenção de touros em programas de coleta continuada.
3.2.1. Massagem das ampolas dos ductos deferentes
19 Com a mão dentro do reto do touro as vesículas seminais são massageadas, com movimentos craniocaudais, e um líquido turvo flui pelo prepúcio. Na maioria dos casos, este líquido contém somente células epiteliais. De modo semelhante, as ampolas dos ductos deferentes são massageadas e um líquido turvo escoa pelo prepúcio, contendo apenas espermatozoides, na maioria dos casos. Em algumas situações, as ampolas são massageadas antes, mas melhores resultados são obtidos quando primeiro se massageia as vesículas seminais. Isto porque se evita que a vesícula libere células epiteliais diminuindo a qualidade da amostra coletada (Miller, 1934).
Palmer et al. (2005) demonstraram que amostras de sêmen coletadas de bovinos via massagem das ampolas dos ductos deferentes obtiveram menor porcentagem de motilidade e de espermatozoides vivos, quando comparadas às amostras de sêmen obtidas por eletroejaculação. Os autores sugeriram que a incapacidade de estimular a ereção com a massagem das ampolas estava relacionada com a menor qualidade da amostra de sêmen obtida por este método.
3.2.2. Coleta de espermatozoides da cauda do epidídimo
A coleta e a criopreservação dos espermatozoides da cauda do epidídimo podem ser a última chance e opção para preservação de células germinativas de animais de alto valor genético, reprodutores de idade avançada ou após a morte do animal (Barbosa et al., 2012).
Uma das técnicas proposta é de fluxo retrógrado (Garde et al.,1994). A cauda do epidídimo é separada do tecido adjacente por dissecação, o ducto deferente é lavado com o uso de seringa e cateter, injetando-se 5,0 mL de diluente à base de TRIS-gema de ovo, sem crioprotetor intracelular, fazendo com que os espermatozoides sejam carreados pelo diluente, extravasando pela incisão realizada na junção entre a cauda e o corpo do epidídimo. Todo procedimento é realizado sobre uma placa aquecedora. Tal técnica permitiu a colheita de células viáveis e que após a congelação poderiam ser utilizadas para inseminação artificial, sendo mantidas características semelhantes ao sêmen ejaculado (Barbosa et al., 2012). Cary et al. (2004) conseguiram maior motilidade pós-congelamento dos espermatozoides coletados da cauda do epidídimo do que daqueles coletados do sêmen ejaculado pelos mesmos equinos anteriormente. Além de ser uma técnica factível, contribuindo para a preservação de material genético de reprodutores superiores (principalmente animais jovens, que poderiam contribuir muito com o progresso genético e morrem precocemente), é economicamente viável, pois o valor de venda das doses do sêmen tende a se valorizar após a morte (Barbosa et al., 2012).
3.2.3. Eletroejaculação
Eletroejaculação é a palavra geralmente utilizada para indicar a obtenção de sêmen por estímulos elétricos através de eletrodos inseridos no reto. Apesar de já estar consagrada, a palavra pode estar sendo usada de maneira errônea, já que o sêmen raramente ou nunca é ejaculado no sentido estrito; ele escoa através do meato urinário externo sem a ajuda de contrações dos músculos estriados envolvidos no mecanismo de ejaculação verdadeiro (Brindley, 1981).
20 nervos ciáticos e lombares (Barker, 1958). Os primeiros relatos do seu uso na veterinária foram feitos por Dziuk et al. (1954), que o utilizaram na espécie ovina. A estimulação elétrica é um
dos métodos alternativos para a coleta de sêmen de reprodutores de alto valor genético que são relutantes ou incapazes de servir a vagina artificial (Dziuk et al., 1954). Contudo, sua principal utilização prática é a realização de exames andrológicos.
Em um estudo realizado com 18 touros bovinos, Dziuk et al. (1954) relataram sucesso na coleta de sêmen por eletroestimulação de 94,74% dos touros testados. Enquanto Austin et al. (1961) conseguiram sucesso na coleta com eletroejaculação de 100,0% dos touros testados, mas ao utilizarem os mesmos animais para a coleta com vagina artificial, o sucesso de coleta caiu para 86,0%. Apesar de permitir a coleta do sêmen, o uso do eletroejaculador não permite a avaliação da libido, uma das principais características reprodutivas (Ohashi, 2008).
O sêmen da eletroejaculação, quando comparado ao sêmen coletado com vagina artificial, apresenta algumas variações quanto as suas qualidades físicas e químicas. Na eletroejaculação, o volume do sêmen obtido e seu pH são maiores e sua densidade menor. Apesar do maior volume coletado, o número total de espermatozoides por ejaculado, não difere entre os dois métodos de coleta (Dziuk, 1954; Austin et al.,1961; Leon et al.,1991). A motilidade do sêmen
coletado por eletroejaculação é similar à do sêmen coletado com vagina artificial. Contudo, o sêmen coletado por vagina artificial apresenta maior concentração antes do resfriamento e melhor motilidade progressiva depois do congelamento (Leon et al., 1991).
Ohashi (2008) desencoraja o uso da eletroejaculação em touros bubalinos. Apesar de o autor relatar sucesso de coleta por eletroejaculação nesta espécie em animais jovens, em búfalos adultos, a reação durante a tentativa de coleta é violenta, visto como esta espécie mostra-se sensível ao estímulo elétrico. Além disso, o sêmen coletado através da eletroejaculação apresenta-se mais contaminado por bactérias e células de descamação do epitélio prepucial, em função da maioria dos animais ejacularem dentro da bainha prepucial.
3.2.4. Vagina artificial convencional
A vagina artificial é o método universal para a coleta de sêmen de rotina (Mies Filho, 1982). Neste método é utilizado um aparato que substitui a vagina da fêmea, e a coleta por ser realizada com uma fêmea ou manequim. O dispositivo não é ligado à fêmea de nenhuma maneira, mas manuseado pelo operador, que desvia o pênis para dentro do aparato no momento do coito, antes que o macho o introduza na fêmea. Assim, o sêmen é recebido dentro deste aparato. Algumas pequenas adaptações são feitas para as diferentes espécies de animais (Letard, 1935). É um método definido como parafisiológico, isto é, ele permite que seja mantida a libido normal do macho, a integridade do órgão reprodutivo externo, bem como as características biológicas do sêmen (Bonadonna, 1969). Por ele se obtém o líquido seminal em estado de pureza relativa e em condições de equilíbrio térmico e osmótico favoráveis ao processamento para sua aplicação na inseminação artificial (Mies Filho, 1962).
21 O modelo utilizado atualmente consiste basicamente em um cilindro rígido, de borracha ou Policloreto de Vinila (PVC), aberto nas duas extremidades. Em seu interior se acomoda um tubo flexível de borracha, que é fixado às bordas do tubo rígido por meio de tiras elásticas, formando um compartimento entre ambos. Neste compartimento são introduzidos água morna e ar, visando à obtenção de uma temperatura final de coleta entre 39,0 e 41,0°C. O volume e a pressão no interior do compartimento são controlados com o auxilio de uma válvula no cilindro rígido. Em uma das extremidades da vagina artificial convencional é acoplado um funil com um tubo graduado, onde será coletado o sêmen. A segunda extremidade forma a porção vulvar da vagina artificial convencional, na qual o pênis será introduzido (Reichenbach et al., 2008).
As dimensões da vagina artificial variam de acordo com a espécie sujeita a monta. Para bovinos, ela possui em média 40,0 cm de comprimento e 6,5 cm de diâmetro. Para ovinos e caprinos, a temperatura e método de coleta são os mesmos que indicados pra bovinos, mas a vagina artificial possui menor comprimento variando de 22,0 a 25,0 cm (Bearden e Fuquay, 1984). Para bubalinos, a vagina artificial deve ser mais curta que a utilizada para bovinos, com 25,0 a 30,0 cm para animais jovens e 30,0 a 35,0 cm para animais adultos acima de quatro anos, em função do menor tamanho do pênis bubalino em relação ao bovino (Ohashi, 2008). Para garantir que o equipamento utilizado não afete a qualidade do sêmen coletado, cuidados devem ser tomados na preparação da vagina artificial. Devem receber atenção, principalmente, a temperatura da água utilizada para preencher a vagina (Macmillan et al., 1966) e a composição da mucosa artificial (Flick e Merilan, 1988).
A coleta de sêmen por este método exige participação ativa do macho e se assemelha muito à situação de monta natural, permitindo a avaliação da libido e da habilidade de monta. Os machos necessitam de treinamento para servir a vagina artificial. O treinamento requer tempo e é desaconselhável para animais que não estão acostumados com a presença humana e sua manipulação (Palmer, 2005).
O touro bubalino é, possivelmente, o animal doméstico mais facilmente condicionado à colheita de sêmen através do método da vagina artificial, quando jovem (Sansone, 2000). Todavia, relata-se dificuldade de coleta de sêmen de touros bubalinos adultos, pois muitas vezes os animais se tornam bravios quando criados a campo. Os búfalos adultos que tenham sido utilizados como reprodutores a campo são mais difíceis de serem condicionados à coleta de sêmen com o uso da vagina artificial (Ohashi, 2008).
O búfalo pode se tornar relutante ao serviço artificial, dificultando a avaliação de sua fertilidade e causando prejuízos na produção de sêmen. Alternativas como mudar o local de coleta, trocar a manequim utilizada, utilizar fêmeas em estro ou fora do estro, utilizar machos como manequim, mudar o operador da vagina artificial, entre outras, foram testadas na tentativa de reduzir esta recusa do touro ao serviço artificial, mas muitas vezes os resultados positivos são transitórios e os animais voltam a refugar (Prabhu e Bhattacharya, 1954; Prabhu, 1956).
3.2.5. Vagina artificial interna
22 carneiros não treinados. Em animais treinados à coleta de sêmen com a vagina artificial convencional o sucesso de coleta foi de 100,0%, na vagina artificial interna. Os autores relatam ainda, que a qualidade do sêmen obtido pela vagina de vidro foi semelhante a do sêmen coletado pela vagina artificial convencional.
Barth et al. (2004) desenvolveram um modelo de vagina artificial interna para a coleta de sêmen de touros bovinos (Figura 1). Além de evitar o uso do estímulo elétrico, a vagina artificial interna permitiu avaliar a libido e a capacidade de monta do reprodutor.
Figura 1 - Foto da vagina artificial interna (Barth et al., 2004) mostrando seus componentes:suporte de metal com uma das extremidades em forma de circulo; haste inferior de metal ligada ao tubo de látex; tubo plástico flexível (a). As duas partes de metal conectadas pelo tubo plástico flexível (b). O tubo de látex adaptado ao suporte circular de metal que o mantém aberto (c), e a vagina artificial interna com o saco coletor acoplado (d).
No estudo de Barth et al. (2004) a vagina artificial interna foi utilizada para a coleta de sêmen de 96 touros das raças Charolês, Aberdeen Angus e Hereford. O uso deste método permitiu coletar sêmen de todos os touros que montaram e penetraram nas vacas (54,3% dos animais com um ano e 69,6% dos touros com dois anos). Ainda neste estudo, a coleta de sêmen por vagina artificial interna permitiu a detecção de problemas de monta em oito touros (4,8%) que haviam sido determinados como reprodutores potencialmente satisfatórios quando o sêmen foi coletado apenas por eletroejaculação.
23 animais, 11,1% dos touros seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas o exame físico e de qualidade seminal fossem empregados, demonstrando a importância da realização do exame funcional para a avaliação de um reprodutor (Cruz, 2007). Em touros bubalinos não há relatos na literatura do uso da vagina artificial interna para a coleta de sêmen.
3.3. Qualidade do sêmen bubalino
O principal objetivo da avaliação das características seminais é predizer a fertilidade de um reprodutor (Den Daas, 1992). As características do sêmen classicamente avaliadas são: cor/aspecto, volume, concentração, viabilidade, integridade de membrana e morfologia espermática (Sansone, 2000). As características seminais de touros bubalinos adultos, de acordo com Vale (1994), estão listadas na Tabela 3.
Tabela 3. Características do ejaculado normal do bubalino.
Característica Padrão normal
-Cor branco, branco-leitoso, com estrias escuras-acinzentadas
-Volume (ml) 3,0 (2,0 a 8,0)
-Turbilhonamento (0-5) > 3
-Motilidade (%) > 70
-Vigor (1-5) > 3
-Concentração 6 x 105 a 12 x 105
-Células espermáticas vivas (%) > 70
-Defeitos espermáticos (%) < 30
-pH 6.7 a 7.5
Fonte: Vale (1994).
O volume do ejaculado, o turbilhonamento, a concentração espermática e a motilidade variam com a idade. Búfalos da raça Murrah com idade menor que 36 meses apresentaram menores valores para estes parâmetros quando comparados a animais com mais de 36 meses de idade (Bhosrekar et al., 1992). O volume do ejaculado de touros jovens varia entre 1,0 e 3,0 mL, para búfalos adultos, plenamente maduros, o volume pode ficar entre 4,0 e 8,0 mL (Ohashi et al., 2011).
A motilidade é rotineiramente avaliada por estimação visual da porcentagem de células móveis. Uma pequena gota é depositada entre lâmina e lamínula, a 37,0°C, e examinada em microscópio óptico em aumento de 20 ou 40 vezes (Sansone, 2000). Vale (2011) classifica um ejaculado com boa motilidade aquele que apresentar pelo menos 80,0% de espermatozoides móveis, enquanto a motilidade pobre apresenta motilidade inferior a 20,0%.
24 aspectos físicos como motilidade espermática e concentração, realizam análises de morfologia espermática (Freneau, 2011). A idade tem um efeito significante na incidência de anormalidades espermáticas. Em média, a melhor qualidade seminal pertence a búfalos com idade entre três e quatro anos (Saeed et al., 1990). O percentual aceitável de anormalidades espermáticas para búfalos adultos é no máximo 30,0% (Vale, 1994; Vale, 2011). Os defeitos mais frequentemente encontrados no sêmen de touros bubalinos são defeitos de cabeça (5,18±2,08%) e de cauda enrolada (4,26±0,94%) (Saeed et al., 1990).
O pH do sêmen de búfalo, coletado através de vagina artificial varia entre 6,5 e 7,2. O sêmen do bubalino tem uma maior tendência a se acidificar, devido a sua maior concentração de açúcares, que quando são transformados em ácido lático, diminuem o pH do sêmen (Vale, 2011).
A influência da sazonalidade sobre a qualidade do sêmen de touros bubalinos ainda não está bem estabelecida. Segundo Ohashi (1988), esta influência da sazonalidade sobre o macho bubalino está relacionada com uma menor oferta de alimento, aumento de temperatura ambiental e raios solares, podendo ser superada com melhor manejo e alimentação. Em búfalos da raça Mediterrâneo, Castro et al. (2007) encontraram menor volume de ejaculado nos meses do verão no Brasil. Em Cuba, Ferrer et al. (2010) também encontraram diferença entre as estações do ano apenas para o volume do ejaculado, que foi maior no inverno. Em estudo realizado com búfalos na Tailândia (Koonjaenak, 2006) não houve diferença entre as estações do ano para nenhum dos parâmetros seminais avaliados (motilidade progressiva do sêmen fresco e após o descongelamento, concentração, volume e morfologia). Koonjaenak et al. (2007) encontraram diferença na congelabilidade do sêmen bubalino ao longo do ano, no inverno os espermatozoides apresentaram melhor integridade e estabilidade de membrana, além de melhor motilidade.
3.4. Contaminação microbiológica do sêmen
A coleta do sêmen não é um procedimento estéril e certo grau de contaminação bacteriana não pode ser evitado (Akhter et al., 2008). Durante a coleta de sêmen com vagina artificial pode ocorrer contaminação com bactérias da superficie do pênis e prepúcio, da área de coleta, com o equipamento e com os manipuladores (Thibier e Guerin, 2000). Apesar de adotar as melhores e mais adequadas condições de coleta, pode ser observada contaminação microbiana (Genovez et al., 1999). O estado higiênico do sêmen é importante para a viabilidade do espermatozoide e para a fertilidade da vaca inseminada (Jasial et al., 2000).
Na inseminação artificial é importante o controle eficiente da população de microrganismos no sêmen, prevenindo, assim, a introdução de doenças em animais, rebanhos, regiões e países em que ainda não estavam presentes. A contaminação com agentes não específicos pode ocorrer durante o processamento e armazenamento do sêmen, e não apenas da atmosfera, mas também de substâncias de origem animal adicionadas ao diluente do sêmen. Outras fontes de contaminação incluem os equipamentos e materiais que têm contato direto ou indireto com o sêmen, como os frascos em que é armazenado (Thibier e Guerin, 2000).
Estudos (Gangadhar et al., 1986; Brinda et al.,1994; Jasial et al., 2000) demonstram que o grau de contaminação do sêmen fresco de bubalinos com flora saprófita pode ser maior que 104
25 funções do espermatozoide e sua capacidade fecundante (Rana et al., 2012). Assim, é fundamental a adoção de práticas higiênicas durante a coleta e o uso de antibióticos apropriados no meio diluidor do sêmen.
3.4.1. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen
Existem numerosos métodos de contagem de colônias que diferem principalmente quanto aos meios usados para obter colônias separadas para a contagem. Em contagem de superfície, o inoculo é semeado na superficie da placa com ágar nutriente seco, enquanto em outros métodos, como o de pour plate, o inoculo é misturado ao ágar nutriente fundido que é imediatamente
distribuído e mantido à temperatura ambiente antes da incubação (Meynell e Meynell, 1970). A técnica preconizada pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para a espermocultura é a técnica de pour plate (Carvalho et al., 2012). Nesta técnica, quando o meio é vertido na
placa de Petri para ser misturado ao inoculo sua temperatura é de aproximadamente 45,0°C, assim, as bactérias aeróbias que serão isoladas devem ser capazes de suportar temporariamente a temperatura do ágar fundido (Gerhardt, 1994).
A microbiologia do sêmen de touros bubalinos se assemelha muito à de touros bovinos (Jasial et al., 2000). Os principais microrganismos encontrados no sêmen de búfalos, em ordem de maior frequência, são: Bacillus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Micrococcus spp., Staphylococcus aureus, Corynebacterium renale, Klebsiella
spp., Proteus spp., Enterobacter spp (Naidu et al., 1982; Bindra et al., 1994).
Os resultados de cinco trabalhos com contagem de colônias no sêmen de touros bubalinos que foram publicados entre 1982 e 2012 estão resumidos na Tabela 4.
Tabela 4. Contagem de colônias bacterianas em amostras de sêmen de touros bubalinos coletadas com vagina artificial convencional.
Referência Meio de cultura UFC/mL
Naidu et al., 1982 --- 9, 83 x 103
Bindra et al., 1994 PCA (ágar de contagem em
placas) 0,43 x 10
3
Shukla, 2005 --- 0,048 x 103
Akhter et al., 2008 Ágar triptose + extrato de
levedura 15,70 x 10
3
26
4. Experimento I
–
Características do comportamento sexual de touros bubalinos
na coleta de sêmen com vagina artificial interna e eficiência do método de coleta.
4.1. Material e métodos
Experimento aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal – UFMG sob o Protocolo CEUA nº 129/2014.
4.1.1. Localização e animais experimentais
O comportamento sexual de reprodutores bubalinos foi estudado em quatro situações distintas. A saber: na Fazenda A, foram utilizados quatorze tourinhos bubalinos, sem experiência sexual prévia e três touros com experiência sexual prévia, todos da raça Mediterrâneo; na Fazenda B, foram utilizados onze reprodutores, com experiência sexual prévia, sendo seis da raça Murrah e cinco da raça Mediterrâneo; na Fazenda C, um búfalo Murrah foi observado, com experiência sexual prévia e; na Fazenda D, uma Central de coleta e processamento de sêmen, onde os nove animais já estavam condicionados a coleta de sêmen com a vagina artificial convencional, todos da raça Murrah.
Fazenda A
Propriedade localizada no Estado do Espírito Santo (19°26’41,0’’S e 40°03’45,0’’O; altitude média: 28 m). A região é caracterizada pelo clima tropical, e, durante os cinco dias do experimento (17 a 21 de junho de 2014) a temperatura máxima foi 29,8°C e a mínima 18,9°C e umidade relativa do ar entre 83,5 e 93,5%.
Foram utilizados búfalos Mediterrâneo, que eram mantidos em regime extensivo, em pastagem de Brachiaria brizanta com suplementação de sal mineral ad libitum. Foram utilizados 14
tourinhos bubalinos com idade entre 19 e 30 meses. Os tourinhos foram selecionados de um plantel de 45 animais, com base na idade (≥ 18 meses) e na circunferência escrotal (≥ 25,0 cm).
Estes animais não possuíam experiência sexual prévia. Os três animais adultos (≥ 9 anos e
circunferência escrotal ≥ 29,0 cm) utilizados nesta propriedade eram mantidos como
reprodutores e permaneciam com as fêmeas, em regime de pastejo rotacionado. Como manequim, foram utilizadas oito fêmeas não gestantes, com boa condição corporal e porte compatível aos reprodutores avaliados. Apenas para os animais com experiência sexual foram utilizadas fêmeas em estro natural. O local utilizado para a coleta de sêmen era sombreado e não possuía tronco específico para coleta, mas a fêmea foi contida de modo que permitisse ao macho realizar o salto.
Cada touro foi observado pelo menos três vezes, durante os cinco dias, e observado em ordem aleatória. Para a avaliação do comportamento, os animais receberam as seguintes identificações: B1 a B17. Sendo que os animais B15, B16 e B27 possuíam experiência sexual prévia.
Fazenda B
27 Os animais eram mantidos em regime intensivo, com dieta baseada em silagem de milho e concentrado de fubá de milho, farelo de soja, caroço de algodão, farelo de trigo e mistura mineral. Foram utilizados onze touros bubalinos, com idade entre 3 e 10 anos e circunferência escrotal maior que 33,0 cm. Os touros possuíam experiência sexual prévia, e eram utilizados como reprodutores. Destes reprodutores, quatro eram mantidos separados das fêmeas e contidos individualmente, devido ao temperamento agressivo. Os outros sete reprodutores eram mantidos junto com as fêmeas, com a distribuição de um touro em cada lote com média de 60 fêmeas, com exceção dos dois touros mais novos, que eram mantidos no mesmo lote. Vinte fêmeas em estro natural foram utilizadas como manequim. O tronco utilizado para conter a fêmea manequim era específico para coleta de sêmen e estava em local não sombreado. Os búfalos utilizados pertenciam à raça Murrah (n=6) e Mediterrâneo (n=5).
Cada touro foi observado pelo menos seis vezes, e era levado para o local de observação em ordem aleatória. Os touros receberam as seguintes identificações para a análise do comportamento sexual: B18 a B28.
Fazenda C
Propriedade localizada no munícipio de Sete Lagoas, no Estado de Minas Gerais (19°33'41.2"S e 44°15'36.8" O). Região de clima tropical úmido, com registros de temperaturas máxima e mínima nos dias do experimento 29°C e 10°C, respectivamente.
O búfalo Murrah utilizado nesta propriedade era mantido em regime extensivo, com complementação com cevada durante o ano todo. O touro, com idade estimada de sete anos, era mantido como reprodutor, e durante os dias do experimento foi separado do lote de fêmeas. As observações aconteciam em dois períodos do dia: o primeiro iniciava de madrugada às 04h00min e encerrava às 07h00min, o segundo período começava às 11h00min e terminava às 12h00min. Às 03h00min o touro era levado ao lote de fêmeas para detecção de fêmea em estro, da mesma maneira às 10h30min no segundo período de observação do dia. A fêmea identificada em estro era utilizada como manequim para a coleta de sêmen.
O touro era observado por 20 minutos, em curral sombreado de aproximadamente 12m2, onde a
fêmea manequim com a vagina artificial interna era deixada solta. O animal foi observado em dezesseis ocasiões. O animal recebeu a identificação de B29 para a análise do comportamento sexual.
Fazenda D
Realizado na Central de coleta e processamento de sêmen, do Centro de Biotecnologia em Bubalinocultura, no Estado de Minas Gerais (19°38’20’’S e 44°02’57’’O; altitude média: 902 m). A Central é localizada em região de clima tropical úmido, as temperaturas máxima e mínima, durante o período do experimento, foram 30,0°C e 21,0°C, respectivamente, e a umidade relativa do ar durante este período variou entre 35,5 e 94,0%.
28 circunferência escrotal maior que 27,0 cm. Foram utilizadas três fêmeas como manequim, fora do estro, e a coleta acontecia em tronco específico para tal procedimento.
Os touros foram observados cinco vezes, e eram levados ao local de observação em ordem aleatória. Para análise do comportamento, os animais receberam as seguintes identificações: B30 a B38.
4.1.2. Vagina artificial interna
A vagina artificial interna é constituída por duas partes (Figura 2), uma é o anel de poliuretano com diâmetro de 6,5 cm e com largura de 2,5 cm e a outra é uma haste de aço inox, as duas peças se encaixam tornando possível o ajuste do comprimento do dispositivo de 24 a 30 cm. O anel de poliuretano é revestido por uma mucosa artificial, a mesma utilizada em vagina artificial convencional. As duas peças unidas são revestidas pelo saco plástico coletor estéril, que recebe o sêmen no momento da ejaculação do touro. O dispositivo completamente montado tem peso médio de 200g.
Para que seja introduzido na fêmea, o dispositivo deve ser completamente lubrificado em sua porção externa, com lubrificante à base de água, não espermicida (K.MED, CIMED, Brasil).
29 Antes da introdução do dispositivo, a fêmea tinha o reto esvaziado e a região perineal limpa com papel-toalha seco. A vagina artificial interna era então introduzida para além do esfíncter vestibular da fêmea. Após a monta, a vagina artificial é retirada da fêmea e o sêmen é transferido de dentro do saco coletor para um tubo graduado estéril e prontamente avaliado.
4.1.3. Comportamento sexual e coleta de sêmen
Após a colocação da vagina artificial interna na fêmea, o macho era introduzido no espaço de coleta. Os animais eram observados por tempo médio de dez minutos. Para os machos da Fazenda B, o tempo de observação foi estendido para 40 minutos, devido a fatores de distração no ambiente de coleta, como a passagem de lotes de fêmeas para a ordenha ou a presença de bezerros no curral de coleta. Os machos que realizavam a cópula eram imediatamente retirados do local de coleta, para retirada e substituição da vagina artificial interna e para a introdução de um novo macho. Os búfalos eram levados para a coleta de sêmen em ordem aleatória. Na fazenda C, onde a coleta acontecia semanalmente, caso o búfalo não ejaculasse na primeira tentativa lhe eram concedidas no máximo mais duas oportunidades no mesmo dia.
As informações de sucesso ou falha na coleta, do tempo de reação e dos eventos do comportamento sexual dos touros, durante o período em que permaneceram com a fêmea, foram registradas. O tempo de reação foi considerado o tempo entre a apresentação do macho à fêmea até a realização da monta completa. Os eventos do comportamento sexual do macho registrados foram:
Cheirar a fêmea; Lamber a vulva; Dar cabeçada; Pressão de queixo; Reflexo de Flehmen;
Exposição do pênis (>10,0 cm); Monta sem exposição;
Monta com exposição; Penetração sem o galeio; Penetração no ânus; Contração do prepúcio; Cheirar o chão;
Urinar;
Cheirar/lamber urina da fêmea. Estes eventos foram registrados quanto a sua frequência como sugerido por Altmann (1974).
4.1.4. Análise estatística
Os dados de comportamento sexual de cada touro foram analisados de forma descritiva, utilizando a proporção de cada evento no conjunto de todos os comportamentos que o animal realizou. Para a descrição dos comportamentos os animais foram divididos em três categorias: Categoria 1: búfalos condicionados a coleta de sêmen com vagina artificial convencional (B30 a B38); Categoria 2: búfalos sem experiência sexual (B1 a B14); Categoria 3: búfalos com experiência sexual (B15 a B29). A eficiência do método de coleta foi analisada descritivamente, avaliando a eficiência total de coleta de sêmen (nº de sucesso de coleta/ nº de tentativas); eficiência quanto aos animais que testaram a vagina artificial interna (nº de sucesso de coleta/ nº de animais que penetraram na vagina) e a eficiência quanto ao número de animais utilizados (nº de sucesso de coleta/ nº de búfalos).
4.2. Resultados e discussão
30 separadamente para o grupo de búfalos dos quais foi possível coletar sêmen e para o grupo dos quais não foi possível.
Na Figura 3, estão apresentados os eventos do comportamento sexual dos 27 touros dos quais foi possível coletar sêmen com a vagina artificial interna. Os dados foram representados pela proporção em que cada evento do comportamento era realizado por cada animal.
Os comportamentos de cheirar, lamber e reflexo de Flehmen estão relacionados com a identificação da fêmea (Santos, 2001). Apesar de todos os animais realizarem comportamentos de identificação, a intensidade com que cada um os realizou foi variável. Para o comportamento de cheirar a máxima proporção de ocorrência foi de 28,57% e a mínima foi de 2,56%. O comportamento de lamber apresentou a máxima proporção de ocorrência de 44,90%, enquanto houve dois (7,41%) animais que não o realizaram. O reflexo de Flehmen não foi realizado por outros dois (7,41%) animais, porém sua máxima proporção de ocorrência foi de 28,05%. Um estudo (Samo et al., 2005) realizado com seis búfalos da raça Kundhi, observou que os comportamentos mais frequentes dos búfalos ao se aproximarem da fêmea para a coleta de sêmen com vagina artificial foram: fungar (38,19%), cheirar (17,36%), pressão de queixo (37,5%) e reflexo de Flehmen (13,5%). No presente estudo, o comportamento de cheirar foi realizado por 100,00% (n=27) dos touros dos quais foi possível coletar sêmen com a vagina artificial interna. Ainda neste grupo de animais, os comportamentos de lamber e de reflexo de Flehmen foram realizados por 92,59% (n=25) e o comportamento de pressão de queixo foi realizado por 96,30% (n=26) destes animais, sendo que sua máxima proporção de ocorrência foi de 28,57%. A realização dos comportamentos de cheirar, lamber e de reflexo de Flehmen por uma grande porcentagem dos animais, 100,00%, 92,59% e 92,59%, respectivamente, demonstra a importância dos comportamentos de identificação da fêmea realizados pelo macho durante o cortejo sexual.
Os comportamentos de exposição do pênis (>10 cm) e de contração do prepúcio foram realizados por uma grande porcentagem de animais dos quais foi possível coletar sêmen com a vagina artificial interna, 88,89% (n=24) e 81,48% (n=22), respectivamente. A realização destes comportamentos foi considerada como indicativo de excitação sexual do macho antes do salto. A monta com exposição do pênis foi realizada por 96,30% (n=26) dos touros dos quais se coletou sêmen com a vagina artificial interna, e a monta sem exposição foi realizada por 74,07% (n=20) destes animais. Os comportamentos de monta com exposição do pênis e de monta sem a exposição são classificados como copulatórios (Santos, 2001). Os comportamentos pré-copulatórios foram entendidos como os comportamentos que o macho realiza para avaliar o grau de aceitação da fêmea à monta completa. Pôde-se perceber na Figura 3 que os animais que pertencem a Categoria 1 (B30 a B38) apresentaram padrões de comportamentos similares, o que pode ser consequência do condicionamento destes animais à coleta de sêmen com a vagina artificial convencional. Estes animais além de apresentarem padrões similares de comportamento, foram os únicos a apresentarem o comportamento de cheirar o chão do local de coleta, 8 dos 9 (88,89%) touros desta categoria realizaram tal comportamento. Acredita-se que este comportamento esteja relacionado com a identificação do local, assim como a identificação de odores da fêmea e de outros touros que já haviam passado pelo local de coleta.
31 ocasiões em que a vagina artificial interna saiu da posição correta dentro da fêmea (33,33%) e às ocasiões em que o dispositivo foi expulso pela fêmea após fortes contrações (66,67%). O comportamento inesperado de penetração no ânus, observado em 11 (40,74%) animais do grupo de sucesso de coleta e em 4 (36,36%) animais do grupo de não sucesso, também foi relatado por Cruz (2007) ao testar o modelo canadense de vagina artificial interna em touros bovinos da raça Devon. Segundo o referido autor, a ocorrência deste comportamento em 15,38% dos animais testados foi devida à falta de experiência sexual. No entanto, no presente estudo animais com experiência sexual também realizaram este comportamento. No estudo do pesquisador canadense Barth et al. (2004), detentor da patente da vagina artificial interna utilizada por Cruz (2007), o comportamento de penetração no ânus não foi relatado em touros das raças Charolês, Aberdeen Angus e Hereford. Provavelmente a ocorrência deste comportamento nas três categorias de experiências sexuais estudadas (animais condicionados, sem experiência e com experiência sexual) esteve relacionada com a inexperiência destes animais no processo de coleta de sêmen. Assim como os animais sem experiência sexual (Categoria 2), os animais condicionados (Categoria 1) não possuíam experiência de monta a campo, não tendo realizado nenhuma penetração na vagina antes da coleta de sêmen com a vagina artificial interna, este fato pode ter contribuído para que ocorressem penetrações errôneas no ânus da fêmea durante a tentativa de penetração na vagina. Enquanto os animais da Categoria 3 que realizaram a penetração no ânus apesar de possuírem experiência sexual, não possuíam familiaridade com o processo de coleta, sendo que o ambiente e a contenção da fêmea representavam situação adversa ao momento da monta natural. Esta adversidade pode ter causado insegurança no momento do salto, resultando em penetrações errôneas no ânus da fêmea.
34 O tempo de reação médio, em segundos, dos vinte e sete búfalos, foi apresentado (Tabela 5) de acordo com as categorias de experiência sexual (condicionados a coleta de sêmen com vagina artificial convencional, sem experiência sexual prévia e com experiência sexual).
Tabela 5. Médias e desvios padrão do tempo de reação (em segundos) de acordo com a categoria de experiência sexual dos touros bubalinos estudados.
Experiência sexual Tempo de reação
(s) X ± DP Tempo de reação máximo (s) Tempo de reação mínimo (s)
Categoria 1 247,39 ± 106,70 423,63 100,00
Categoria 2 406,46 ± 181,50 609,00 149,33
Categoria 3 429, 65 ± 228,51 820.50 120,00
Categoria 1= Búfalos condicionados a coleta de sêmen com vagina artificial convencional; Categoria 2 = Búfalos sem experiência sexual; Categoria 3 = Búfalos com experiência sexual.
Os valores médios do tempo de reação encontrados para as três categorias de animais estão dentro do intervalo de 60 a 900 segundos, relatado por Dixit et al. (1984) para touros Murrah. Contudo, Pawar e Nagpaul (1994) e Tomar e Singh (1996) relatam valores médios mais baixos, também para touros Murrah, de 32,6 e 66,10 segundos, respectivamente.
Nas fazendas (B e C) que possuíam os animais da categoria com experiência sexual, o local de coleta era situado ao lado e no caminho da sala de ordenha, sendo rota de algumas rotinas das fazendas, como passagem de bezerros e de lotes de búfalas para a ordenha. Em algumas ocasiões, os outros reprodutores se encontravam muito perto do local de coleta representando uma distração ou ameaça. Acredita-se que o valor médio do tempo de reação dos animais da Categoria 3 (com experiência sexual), que foi alto, tenha sofrido influência destes fatores do ambiente de coleta. Ohashi (2008) aconselha evitar a proximidade entre búfalos adultos, pois estes machos não permitem a presença de outro macho na mesma área, podendo ocorrer brigas violentas. A presença de odores estranhos à fêmea oriundos da manipulação para colocação do dispositivo pode ter dificultado o reconhecimento do estro da fêmea utilizada como manequim, aumentando o tempo de reação destes animais. Para os animais da Categoria 2 (sem experiência sexual), acredita-se que o valor médio do tempo de reação encontrado seja consequência da inexperiência sexual destes tourinhos. Segundo MacDonald (1975) touros que nunca tiveram contato com uma fêmea demandam mais tempo para conseguirem realizar a monta.
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Tabela 6. Eficiência do uso da vagina artificial interna para coleta de sêmen em búfalos.
Eficiência de animais teste (nº sucesso/ nº testes)
Búfalos com sucesso de coleta
Eficiência de coleta (nº sucesso/
nº tentativas)
Nº tentativas até a 1ª coleta
de sêmen
Categoria 1 100,00% (9/9) 100,00% (9/9) 57,75% (41/71) 1
Categoria 2 91,67% (11/12) 78,57% (11/14) 37,25% (19/51) 1 – 4
Categoria 3 87,50% (7/8) 46,67% (7/15) 14,39% (20/139) 2 – 8
Total 93,10% (27/29) 71,05% (27/38) 30,65% (80/261) 1 – 8
Categoria 1= Búfalos condicionados a coleta de sêmen com vagina artificial convencional; Categoria 2 = Búfalos sem experiência sexual; Categoria 3 = Búfalos com experiência sexual.
Os resultados encontrados para animais que de fato testaram a vagina artificial interna, ou seja, chegaram a penetrar na vagina da fêmea, demonstram que o modelo de vagina artificial interna utilizado permite a coleta de sêmen de touros bubalinos com alta eficiência.
Ao testar a vagina artificial interna canadense em touros Devon, Cruz (2007) relata sucesso na coleta de 86,5% dos touros testados (a experiência sexual era diferente entre os animais testados). Valor mais baixo de sucesso foi relatado no estudo original (Barth et al., 2004) da vagina artificial interna canadense. Os pesquisadores canadenses conseguiram coletar sêmen de 54,2% dos touros bovinos testados, quando os animais não possuíam experiência sexual e, de 69,6% quando os mesmos animais foram utilizados um ano depois, já com experiência sexual. Apenas os búfalos da Categoria 1 apresentaram sucesso de coleta superior aos sucessos de coleta dos reprodutores bovinos encontrados por Barth et al. (2004) e por Cruz (2007), provavelmente por que os búfalos desta categoria eram condicionados a coleta com a vagina artificial convencional. Os búfalos da Categoria 2 apresentaram resultados superiores aos do estudo de Barth et al. (2004), quando estes bovinos também não possuíam experiência sexual. No trabalho de Barth et al. (2004), cinco reprodutores bovinos eram colocados ao mesmo tempo no local de teste, e o número de tentativas por animal durante o período de teste não foi relatado. No estudo de Cruz et al. (2007), os machos bovinos eram colocados no local de coleta de dois em dois e o número de tentativas por macho durante o período de teste também não foi relatado. As diferenças de espécie e de metodologia podem justificar os resultados encontrados.
36 mais quatro vezes. Na Categoria 2, dos dez búfalos que ejacularam, após o primeiro sucesso de coleta, 54,54% (n=6) dos touros ejacularam pelo menos mais uma vez e 18,18% (n=2) ejacularam mais duas vezes. Na Categoria 3, dos sete búfalos que ejacularam, após o primeiro sucesso de coleta, quatro (57,14%) touros ejacularam pelo menos mais uma vez, um touro (14,28%) ejaculou mais duas vezes e dois (28, 57%) ejacularam mais cinco vezes.
Em 10,34% (n=27) das tentativas não foi possível coletar sêmen com a vagina artificial interna devido a acontecimentos relacionados ao dispositivo (Tabela 7). Acredita-se que a expulsão do dispositivo pela fêmea foi consequência do posicionamento incorreto dentro da vagina (anterior ao vestíbulo vagina) por inexperiência do operador ao colocá-lo, como também foi pela utilização de novilhas bubalinas, com o diâmetro do canal vaginal estreito, impedindo o correto posicionamento do dispositivo dentro da fêmea. Contrariamente, o desvio da posição dentro da fêmea aconteceu quando se utilizou como manequim, fêmeas adultas, que já haviam parido pelo menos uma vez. Nestas ocasiões, o canal vaginal da fêmea possuía um diâmetro maior, e, no momento da colocação ou retirada do dispositivo, criava-se uma bolsa de ar no canal vaginal, impedindo o correto posicionamento do dispositivo. A retirada do ar pela manipulação do aparelho reprodutivo via retal, antes da introdução da vagina artificial interna, reduziu este tipo de ocorrência.
Tabela 7. Ocorrências que impediram a coleta de sêmen com a vagina artificial interna.
Ocorrência Quantidade
Expulsão do dispositivo pela fêmea 10
Desvio da posição dentro da fêmea 12
Rompimento do saco coletor 5
4.2.1. Considerações gerais
Sempre que apresentados à fêmea para a tentativa de coleta de sêmen com a vagina artificial interna os touros realizaram pelo menos o comportamento de cheirar, tido como comportamento de identificação. Houve variação aparente de intensidade e de variedade de comportamentos realizados por búfalos que conseguiram sucesso na coleta e por aqueles que não conseguiram.
Com a utilização da vagina artificial interna foi possível coletar sêmen de 100% dos touros condicionados à coleta com vagina artificial convencional, de 78,57% dos tourinhos sem experiência sexual e de 46,67% dos animais com experiência sexual. As causas de falha na coleta não relacionadas aos animais foram: expulsão do
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5. Experimento II
–
Avaliações da qualidade seminal, da contaminação
bacteriana do sêmen e da eficiência de recuperação de espermatozoides do
método de vagina artificial interna.
5.1. Material e Métodos
Experimento aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal – UFMG sob o Protocolo CEUA nº 129/2014.
5.1.1. Localização e animais experimentais
Este experimento utilizou seis dos nove touros da Fazenda D, descritos no item 4.1.1. 5.1.2. Delineamento experimental
Para comparar o sêmen coletado pela vagina artificial interna ao coletado pela vagina convencional, o experimento foi delineado em blocos ao acaso, sendo o touro o bloco. Para balanceamento entre os métodos de coleta, no dia da coleta, os animais foram sorteados entre os dois métodos e as coletas aconteceram em ordem aleatória. Foram realizadas três coletas em cada método para cada um dos seis animais, totalizando trinta e seis ejaculados. Foram comparadas entre os dois métodos de coleta: as características macro e microscópicas, contaminação bacteriana dos ejaculados e a eficiência de recuperação de espermatozoides.
5.1.3. Coleta de sêmen
Para a realização das coletas de sêmen, os dispositivos utilizados eram higienizados e os sacos coletores dos dois métodos foram submetidos ao processo de esterilização por raio ultravioleta, por 20 minutos a 20,0 cm da fonte (Alexandre et al., 2008).
5.1.3.1. Vagina artificial interna
A vagina artificial interna e o seu modo de utilização foram descritos no item 4.1.2. 5.1.3.2. Vagina artificial convencional
O modelo utilizado consistia em um cilindro rígido de 30,0 cm, de Policloreto de Vinila (PVC), aberto em ambas as extremidades. Em seu interior era acomodado um tubo flexível de borracha, fixado às bordas do tubo rígido por meio de tiras elásticas, formando um compartimento entre ambos. Neste compartimento eram introduzidos água morna e ar, visando à obtenção de uma temperatura final de coleta entre 39,0 e 41,0°C. O volume e a pressão no interior do compartimento eram controlados com o auxílio de uma válvula presente no cilindro rígido. O sêmen era coletado em um tubo graduado estéril, que se encontrava acoplado ao saco estéril que envolvia o interior do cilindro.
5.1.4. Avaliação da qualidade seminal
Imediatamente após a coleta, cada ejaculado foi separado em duas alíquotas, uma para avaliação da qualidade e a outra para a avaliação da contaminação do sêmen (item 4.2.5).
