Fungos contaminantes e produtores de aflatoxinas em castanha do Pará (Bertholletia excelsa HUMB. & BONPL 1808).

FUNGOS CONTAMINANTES Ε PRODUTORES  D E AFLATOXINAS EM CASTANHA DO PARÁ(Bertholletia excel­ sa HUMB.& BONPL 1808). (*) 

Aurelia Lopes Castrillσn (**)  Adhemar Purchio (***) 

RESUMO 

Cem amoòthcu, de ca^tanhaò do Paha, psiocedenteá dos Eòtadoi do Amazona* e São Pau-lo, fipham anatíbadoA mico lógico e. toxicologicamcnte pana. afila.toxina& Β 7 £G1. íòoloa-òe 312

colÔyU&ò de. fiungoò, òcndo 9 7 do gêne.ho AòpeAgMuò, S3 do ghio.no PeiiicÂHÁim caAhCAtan

td, incluída* cm 23 gene.ho* difiche.nte*. Enthe Μ amo&tfiaò de k&pchgilZuA, 26 ficham a fila

toxígênlcoò, di6thihul.doi> cm 3 còpccícò: AApchgilfju filaviA Link (7S); AòpeAgilIuA ραΛα

òiXicaí» Speahe. (7) c AòpeAgillu* fifieAcvUi Subiam (/). ΌΟΔ 100 ext.hatoò de caòtanha* ana li*adoò3 fio ham poA<ctivo6 paxá afilat.oxi.na.

INTRODUÇÃO 

A castanha Ho Pará (castanha do Brasil) durante toda a sua trajetσria comercial so  fre açγo depredator ia. 0 atrito das sementes por ocasiγo do transporte, produz racha  duras na casca. 0 clima e o grau pluviomιtrico na ιpoca da safra,sγo fatores que favo­

recem a penetraçγo de insetos, parasitas e microorganismos atuando junto a amκndoa dete  riorando­a total ou parcialmente. Dentre os microorganismos responsáveis, os fungos fi  lamentosos saprσfitas, sao os que mais participam do processo. Presentes no solo, água,  vegetais e veiculados pelo ar, encontram­se em permanente contato com o produto, const_[  tuindo­se em principal ameaça γ sua integridade. 

Com referκncia a deterioraçγo da castanha do Pará, Bitencourt (19^9), examinando  os danos nas amκndoas, isolou diversas espιcies f٥ngicas inclusive Aspergillus fia vus. Posteriormente, Almeida & Azevedo (1950) assinalam a sensibilidade do produto ao  ataque dos Aspergillus, citando as espιcies A. flavus e A . orizae como responsáveis. 

Lin ( I 9 7 6 ) , analisando castanhas, isolou culturas do grupo A. flavus, aflatoxige­ nicos encontrando maior prevalκncia em A . parasiticus.

(*) Parte da tese apresentada para obtençγo do título de Doutor em Ciκncias, area de  Microbiologia e Imunologia, no Instituto de Ciκncias Biomιdicas da USP ­ SP:  (**) Instituto Nacional de Pesquisas da Amazτnia ­ CP 478, Manaus ­ AM. 

A presença de fungos nos alimentos alertou o s países importadores de grγos, no  sentido de fiscalizar mais intensamente estes produtos adgu i r i dos , estabelecendo ao ir.es τ α  tempo, padrões fixando a tolerância d o s níveis de contaminaçγo. 

A c j S T r U i h a do Para, que e mais consumida no estrangeiro, começou a sofrer metíí 

das restritivas apσs o evento de I960 na Inglaterra, em parte, por ser o alimento pro  veniente do Brasil (Lira, 1376). 

Considerando­se a importância dos fungos nos p r o c e s s o s de deterioraçγo nos produ­ tos alimentícios e de eventual produçγo de aflatoxinas nas amκndoas, alimento básico da

regiγo Amazτnica e fonte de divisas do p­sís, torna­se necessário a realizaçγo de pi.i.qur  sas sobre as espιcies f٧ngicas con Lain i nan t es e um estudo sobre a, f requeue ia de Aspergil  lus snp. produtores de aflatoxinas nÊS^ç. s^rb­j trato. 

MATERIAL Ε MΙTODOS 

0 material para a realizaçγo da pesquisa foi proveniente de usinas de bentficiamen  to, de mercados, feiras­1ivres, propriedades particulares e de supermercados existentes  na regiγo da grande Sao Paulo. 

As castanhas armazenadas procederam de regiões adjacentes dos chamados rios produ  tores da Amniτnia onde estγo localizados os castanhais: Purus, Solimoes, fíioNegroe ain  da dos pertencentes a algumas localidades da Bolívia. 

As amostras originárias de Manaus, faziam parte das safras de 1973/1983. As pro­ cedentes dos supermercados de Sao Paulo nao foi possível determinar, 

Usinas de benef i c i emento fornecedoras: CIEX (henef i c i aire π to e depσsito: America­ na, Londrina e Canadense); COIMEX (beneficiamento ­ COIMtX); I.B. Sabba); Rubem Me I o Cia,  Ltda. (beneficiamen to ­ Rubem Melo); propriedades particulares; Co I onia San to Antτnio(sí  tio Rosa de Maio/Manaus); Antonio Faustino; Mercado CEASA (Manaus) e Supcrmecados de Sac  Paulo e Municípios vizinhos. 

As usinas de beneficiamen to sao instaladas em grandes armazιns de alvenaria com  pe direito alto, aeraçao natural, temperatura ambiente variando entre 26 a 38°C , Para  evitar maior concentraçγo de umidade, as sementes sao reviradas f reqiien temen te, sistema  que diminui a contaminaçγo por fungos e outros mi croorgan i sriros , 

Todas as amostras foram identificadas segundo os locais de procedκncia, tipo, qua  1i dade e sa fra. 

Grupo I: Castanhas de usinas de beneficiamen to ­ desidratadas em casca esem cas  ca (50 amostras). Qe depσsitos ­ naturais em casca (10 amostras), qualidade boa e mis­ tas ; 

Grupo II: Castanhas de fe i ras­1 i vres recιm colhidas, em casca (1 5 amos t ras) , gua_  1i dade mi sta; 

Grupo IV: Castanhas de Supermercados naturais em casca ( 1 0 amostras), qualida­ de mista. 

Meios utilizados para o isolamento dos fungos

Agar­Sabouraud­glicose (Difco), acrescido de cloranfenicol (l00mg/l.000ml) p.H 

5 . 6 ; ágar­Cazpeck (Difco), p.H 7 - 3 ; ágar­batata (Difco), p.H 5.6-, meio de ADM  (Aspergillus differencial medium), para a detecçγo de fungos produtores de aflatoxinas  empregou­se o meio Yes (2¾ de extrato de levedura; 20¾ de sacarose) segundo Davis et al.

Culturas padrão

Aspergillus flavus ­ n° 3 5 1 7 e Aspergillus parasiticus ­ n° 135 utilizadas na pes  quisa como modelo, cedidas pela micoteca do Setor de Micologia do Instituto de Ciκncias  Biomιdicas da Universidade de Sao Paulo. 

As amostras do padrγo qualitativo de aflatoxinas BI e Gl foram cedidas pelo labo­ ratσrio de Micotoxinas do Instituto de Ciκncias Biomιdicas da Universidade de Sγo Paulo. 

Os fungos foram estudados em cultivo e características micromorfolõgicas, fisiolσ  gicas e identificaçγo final, segundo Raper et a l . ( 1 9^ 9 ) , Riddel (1950), Gilman ( 1 9 5 7 ) , Raper & Fennel 1 (Ί9 6 5 ), Barnet & Hunter (1972); Ainsworth et a l . (1973) , Bothast&Fennell 

( 1 9 72

· ) , von Arx (197*0, Pitt (1979), Cole et al . < 1981) , Lacaz et al . (1984) e Lodder  (1970). 

A extraçγo das toxinas foi segundo o mιtodo observado no Programa Nacional de Mo­ nitoraçγo e Controle de Micotoxinas (PMC ­ Micotoxinas), Sao Paulo, com base no mιtodo  de Lee U 9 & 5 ) e quantificadas de acordo com o mιtodo de Coomes & Feuell ( 1 9 6 5 ) .

As amostras de castanha em granel eram compostas de 1,0 kg e 5 ouriços de cada ori  cem. Depois de trituradas sem processo de desengorduramento, de cada uma delas foi to  mado uma alíquota de 1,0 g, e transferiu­se assepticamente, para um tubo de ensaio con­ tendo 20 ml de água destilada eagitaçγo por 10 minutos. Apσs 30 mi nutos de repouso, 0,lml  do sobrenadante era colocado em placas com γgar­Sabouraud­glicose, acrescido de cloran­ fenical (100 mg/1.000 ml). A partir de 2A horas ate 10 dias de incubaçγoa28°C, as pia  cas eram examinadas. Das colτnias isoladas, retirou­se fragmentos, para o exame micros  cσpico entre lâmina e lamínula, com o corante lactofenol azul de algodγo e foram feitos  repiques em tubos com ágar­Sabouraud­glicose (inclinado) para estudo morfolσgtco poste­ rior. 

Para a produçγo de aflatoxinas por Aspergillus sp. semeou­se fragmentos do fungo  no meio Y e s . Incubaçγo de 10 a 20 dias a 28°C, prazo suficiente para o crescimento da  colτnia. A seguir, filtrou­se o meio de cultivo em algodγo hidrτfilo livre de impurezas  utilizando­se um frasco de Erlemineyer de 250 ml. 

Conforme a necessidade da exclusγo de interferentes nos extratos, utilizou­se, i s o  ladamente ou em combinaçγo os mιtodos: precipitaçγo com acetato de chumbo neutro a 20Ύ,  coluna da silica­gel (Pons et al ., 1966), pur í f i caçγo dli reta na placa cromatográf i ca, rea_  lizando um primeiro desenvolvimento com ιter etílico (Nabney & Nesbitt, 1965). 

Para confirmar a análise, efetuou­se a cromatográfia de camada delgada bidimensio  nal (Schuller et al., 1973) e pela aspersγo de soluçγo de ácido Sulf٥rico a 501 sobre as  manchas fluorescentes da amostra e do padrγo. Os sistemas de solventes: Clorofσrmio­ace 

tona (90:10) e benzeno­acetato de etila­etanol ( 6 0 : 3 9 : 1 ) .

RESULTADOS 

Os resultados demonstram que das 100 amostras analisadas 3 foram positivas para  aflatoxinas BI e Gl. Na tabela I observa­se que procediam: da Usina Londrina  ( U L- 3 ) ,

castanhas desidratadas sem casca, qualidade boa; Usina 1.3. Sabbá (UIBS- 3 ) , castanha na  tural em casca, qualidade mista, pertencentes ao Grupo I e amostra de Supermercados  (SEL) de Sao Paulo, natural em casca, qualidade mista, integrada no Grupo IV. 

Λ análise dos extratos revela que os níveis variam de 0,1 a 2 , 2 5 ppm de aflatoxi­ na BI e de 0 , 0 7 5 a 1,5 ppm de aflatoxina Gl. 0 nível em termos de aflatoxinas, foi con  siderado elevado, muito elevado a baixo ou negativo, Tabela 1.

Das 100 amostras foram isoladas 3 1 2 colτnias de fungos, sendo de 23 gκneros dife­ rentes, Tabela 2 .

Na Tabela 3 , estγo demonstrados os percentuais <^os gκneros de fungos isolados de  85 amostras referentes ΰs usinas ( 6 0 ) , feiras-1ivre (10) , CEASA ( 5 ) e Supermercados(10).

Observa­se que houve predominância cios gκneros Aspergillus sp. e Penici Ilium sp.  A Tabela h, refere­se as amostras em ouriços (15) sob as designaçoes Camo ( 5 ), CSA 

( 5 ) e a AF ( 5 ) , das quais foram isoladas, predominantemente, Aspergillus sp., Penicil-lium sp. e Cephalosporium sp. 

0 gκnero Aspergillus spp. foi prevalente com 91 culturas pertencentes a sete gru­ pos (flavus, niger, nidulans, fumigatus, ochraceus e w e n t i i ) . 0 gκneroPenici11ium apre  sentou freq٧κncia significativa com 83 culturas e a segu i r, Absídia sp. ( 2 7 ) , Paecilomy_ ces sp. (18) e Cephalosporium sp. (13), Tabela 2 . Observou­se que, o n٥mero de le_  veduras, foi baixo, se comparado com o dos fungos filamentosos (Tabelas 2 , 3 6 Ύ ) .

Ana 1isando­se as 91 culturas de Aspergi1lus sp. verificou­se que 26 ( 2 8 , 5 7 ¾ ) eram  espιcies aflatoxigκnicas, entretanto, apenas 24 (26,37¾) foram positivas. 

Por outro lado, nota­se que das lh amostras aflatoxigκnicas, todas produzi ram afia  toxina BI (100Ύ) e somente 15 (62,50Ύ) foram aflatoxinas Gl positivas, Tabela 5 .

DISCUSSÃO 

Para a identificaçγo dos Aspergillus, alιm dos meios convencionais, empregou­se o  meio ADM (Aspergillus differencial medium) utilizado na determinaçγo da espιcie A. fla-vus. Entretanto, o resultado demonstrou que o ADM nao mostrou­se eficiente; tanto o A . flavus, A. parasiticus (grupo flavus) como o A . fresenii (grupo ochraceus), produziram  pigmento, variando apenas na intensidade da cor. Assim, essa peculiaridade nγo ι exclti  siva na denominaçγo de espιcie, como já foi demonstrado que outras espιcies do grupo fia vus e espιcies de outros grupos podem apresentar esse pigmento (Bothast& Fennel 1, 197*0.  Alιm das análises da presença de fungos e amostras tσxicas, verificou­se tipos de  deterioraçγo na castanha e alterações nas propriedades organolσpticas: observou­se que  os Zigomycetes, consomem a amκndoa totalmente, deixando a casca revestida internamente,  por uma camada miceliar branca e ΰs vezes cinza, segundo o gκnero presente. Outras es­ pιcies em conjunto, inclusive Dematiaceos, produzem deterioraçγo negra, crostosa e ino­ dora. A associaçγo de bactιrias e fungos, em geral, altera a cor da castanha (cinza es_  curo) e consistκncia (gelatinosa). Os gκneros Fusaríum sp. e Cephalosporium sp. danífj_  cam a amκndoa, modificando a sua consistκncia (mucõide), o cheiro (odor p٥trico)  e a de  terioraçγo parda que sσ foi detectada depois de cortar a castanha, produz odor ran_  coso, e na maioria destas amostras, ísolou­se AspergíIlus sp. e Penícíllíum sp. 

Detectou­se nos ouriços, a presença de larvas de inseto pertencente ΰ família Cur culionidae que, alιm de estragar a entrecasca (tornando­a quebradiça epu1veru1enta) pro  move sulcos rasos no mesocarpo. 

Os resultados relativos aos extratos das amostras, demonstraram que a de Supermer  cado apresentou nível de toxidez "muito elevado" para aflatoxinas BI e Gl,diferindo das  amostras oriundas de usinas que em termos de af 1 atoxina foi para BI, bai xo a mιd io epara Gl  baixo ouneqat i vo. Assim, na ocorrκncia das trκs amostras positivas cons ide rou­se: tempo de  estocagem, tipo de tratamento do produto e sanidade das amκndoas. Nas de supermercado,  período de estocagem desconhecido, naturais (sem beneficiamento) n٥mero elevado de con­ taminaçγo; as de usinas, com tempo de estocagem conhecido, contaminaçγo moderada, e tra  tamento adequado. 

A contaminaçγo maciça verificada em algumas amostras, por fungos do gκnero Asper-gillus, produtores de aflatoxinas BI e Gl, apresentaram­se isentas destas micotoxinas. 

Conclui­se neste trabalho que a castanha do Pará, diante de todas as agressões a  que ι submetida e considerando­se as suas propriedades nutritivas, nγo correspondeu ΰs  espectativas de ser um substrato favorável γ produçγo de aflatoxinas. Pesquisas devem  ser efetuadas para verificar, os fatores intrínsecos do produto na interferκncia de pro  duçγo de aflatoxina. 

SUMMARY 

One hundred *amptc* ofi Biazil nut* (ftom the State* ofi Amazona* and São Pauto, wexc

twztvz fiungi wziz isolated oi wkíck 91 ΜΖΊΖ Ο{ thz genua ^pzAgUlxii-, S3 o& th.ZQznu.oPe. niccti-iiun and thz lemaindzh. included 23 dif^eAe.nt geneAa. AmongòttheAòpeAgi^Iuà òamptzò,

26 ωζΛΖ pioduceAÁ α^ΙοΧαχλη, diAtAÁbutzá into tkuzz òpiLdizi: khpzfigHUiiib ^£αυα6 Link

[IS); AópzAgif&iA paAaA-vtícuò Spzc/Λζ (7) and AòpzAgittuò ^Kz&zniÃ. Subiam (7). 0/) the 100

ex٧iacXς of) analyòzd nutb, thh.zz WZAZ a&latoxÁn-poòitÁ.ve..

Tabela 1 . Análise quantitativa de aflatoxinas BI e Gl em farelo de amostras de castanhas  do Pará. 

Amostras Concentração de aflatoxinas (mg/kg)

BI Gl

UL ­ 3  0 , 1 0 , 0 7 5

UIBS ­ 3  0 , 2 5 0 , 8 7 5

SEL ­ 7 2,25  1,5

UL ­ 3: Usina Londrina.  UIBS ­ 3: Usina t ,B, Sabbγ.  SEL ­ 7­ _{Supermercado Eldorado.} 

Tabela 2. Freq٧κncia dos fungos encontrados nas amostras de castanha do Pará segundo o  total de culturas isoladas. 

Gêneros N9 Colônias de fungos iso lados

Freqüênc i a

Absidia sp.  27 8,65

1

Aspergillus sp.  91  29,16  % 

Candida sp.  3  0, 3 7 % 

Cephalosporium sp.  13 4,16 % 

Cireineila sp.  \ 0,32  Ύ 

Cladosporium sp.  3  0,97 % 

Cuninghamella sp.  k 1,29 % 

Fusa ri um sp.  8 2,56 % 

Geotrichum sp.  2  0,64 % 

Humicola sp.  k ₁ , 2 9 % 

Monascus sp.  2  0,64 % 

Mucor sp.  6  1 , 9 2 % 

Neurospora sp.  1  0,32 % 

Paecilomyces sp.  18  5,76  % 

Penicl11ium sp.  83 26,60 % 

Phlalophora sp.  3  0,97 % 

Gêneros N9 Colônias de fungos íso lados

Freqüência

Rhodotorula sp.  3  0 , 9 7 %

Rhízopus sp.  5 1,60 %

Saccha romyces s ρ.  5  1 ,60 % 

Syncephalastrum sp.  8 2,56 % 

Torulopsis sp.  3  0 , 9 7 %

Trichoderma sp.  8 2,56 % 

VerticiIlium sp.  5  1 , 6 0 %

FN 1 6 1 , 9 2 1

Total 312  100 %

FNI = Fungos nao identificados. 

Tabela 3 . Freq٧κncia de fungos isolados em castanha do Pará, procedentes de usinas de  beneficiamento, feiras­1ivres, CEASA (MAO­AM) e Supermercados (Grande Sγo Pau  lo). 

Gêneros Usina Fei ra-1ivre Ceasa Supermercados Total %

Absidia sp.  16 6 1 h 2 7 31, 7 6

Aspergillus sp.  63 h h 12 83 97,64 

Cand•da 1 1 2 2 , 3 5

Cephalosporium sp.  7 1  9 1 0 , 5 8

Circinella sp.  1 1 1,17

Cladosporium sp.  2 2 2 , 3 5

Cuninghamella sp.  3 1 t»  4,70 

Fusarium sp.  5 ] i  7 8,23 

Geotrichum sp.  1 1 1,17

Hunicola sp.  k k 4,70 

Monaseus sp.  2 2  _{2 , 3 5}

Mucoi sp.  h 1 1 6 7 , 0 5

Neurospora sp.  1 1 1,17 

Paec i1omyces s ρ.  11 k 3 18 21,17 

Penici11ium sp.  bb 5 6 δ  87,60 

Phialophora sp.  1  2  _{2 , 3 5}

Rhodotorula sp.  2 1  3 3 , 2 9

Rhízopus sp.  3 1 1 5 5 , 8 8

Gêneros Usina Fei ra-1ivre Ceasa Supe rme rcados Total %

Syncephalastrum sp.  6 1 1  8 9,41 

Torulopsis sp.  1 1 2 2 , 3 5

Trichodenma sp.  i  2 4  7 8 , 3 5

Verticillium sp.  1  2 3 3 , 5 2

FN 1  2 1  1  i  5 5 , 8 8

Total 165 27  14  33 239

FNI = Fungos nγo identificados 

Tabela 4 . Freq٧κncia de gκneros de fungos isolados de castanhas do Pará em ouriço, pro  venientes de diversas localidades de Manaus (AM). 

Gênero Local idades

CAMO CSA AF 

Total

Aspergillus sp.  Candida sp.  Cephalosporium sp  Cladosporium sp.  Fusarium sp.  Geotrichum sp.  Penici1lium sp.  Phialophora sp.  Torulopsis sp.  Trichoderma sp.  Vertici11ium sp. 

FNI 

Total

3

I o

1 

6 

]

1

2 

I

15 

8 53,33 

1  6 , 6 6

4  26, 6 6

l  6 , 6 6

1  6 , 6 6

1  6 , 6 6

9 6 0 , 0

1 6 , 6 6

1  6 , 6 6

1 6 , 6 6

2  13,33 

1  6 , 6 6

31 

TabeJa 5. Produçγo de aflatoxina BI e Gl por fungos isolados de castanha do Pará (10 a 

20 dias de cultivo em meio de  Y E S , a 2 8°C). 

Amostras Fungos Aflatoxina

Bl

(mg/200 ml) Gl

Total

UA ­ 2  Aspergi1 lus flavus 1, 0 0,75  1,75 

UA ­ 7  Aspergi1 lus flavus 0,0025  0,0018  0,0043 

UL ­ 3  Aspergi1 lus parasiticus 2,0  1,5  3,5 

UL ­ 7  Aspergi1 lus flavus 0,01  0,01 

UL ­ 9  Aspergi1 lus flavus 2,5  1,87  4,37 

U L1

­ 10 Aspergi1 lus parasi ticus 2,5  1,87 4,37  DC ­ 3  Aspergi1 lus parasi ticus 2,5  1,87  4,37 

DC ­ 9  Aspergi1 lus flavus 0,66  0,66 

UIBS ­ 3  Aspergi1 lus parasiticus 0,01  0, 0 0 7 5 0,175 

UIBS ­ 4  Aspergi1 lus parasiticus 0,002  0,002 

UCX ­ 3  AspergiI lus flavus

UCX ­ 7  Aspergi1 lus flavus 0, 0 0 1 0,001 

UCX ­ 8  Asperg i1 lus flavus 1,0  0,75  1,75 

UCX ­ 10 Aspergi1 lus flavus 3,33  1,87  5,2 

URM ­ I  AspergiI lus parasiticus 0, 2 5 0,25 

URM ­ 3  Aspergi1 lus flavus

URM ­ 7  Aspergi1 lus flavus 1,0  1 , o

CMA ­ 4  Aspergi J lus flavus 0, 0 5 0, 0 5

CMO ­ 5  Aspergi1 lus flavus 0,20  0,75  0,95 

AF ­ )  Aspergi J Jus fresen i i 0,20  0,20 

AF ­ 1  Asperg i1 lus flavus 0,33  0,25  0, 5 8

AF ­ 2  Aspergi1 lus paras ιticus 1 , o 0,75  1 ,75 

JEO ­ 1  Aspergi1 lus flavus 0,020  0,075  0,095 

SEL ­ 7  Aspergi1 lus flavus 1,0  2, 2 5 3,25 

SFM ­ 9  Aspergi1 lus flavus 0, 0 5 0,05 

SFM ­ 10  Aspergi1 lus flavus 0, 0 5 1,5  2,0 

R e f e r ê n c i a s b i b l i o g r á f i c a s

A l m e i d a . , F . i A « « v t ? t l o , P. C. ­ 1950. 0 y v i v fi> A s p e r g i l l u s ν a po J r ί ιΊ.Ί ο <!<, C.ist,ίiiIi.í do P a r i ,  B e l é m ­ PA. Para"  M e d i c o , 30:  j a n M s r , ,  1 9 * 5 . 

A r x ,  J .  A . vi.nl ­ Λ'}7'ι. T h e g e n e r a o f f u n g i s p o r u l a t i n g i n p u r e c u l t u r e . V.kJuk. .Γ. C r a me r . Ή 5 ρ .

D a m e t L , H . 1.. β H u n t e r , Η . Κ . ­ 1 9 7 ? . l l u s t r a t e d g e n e r a ο ί i n p e r l e c t f iiii^i . ! . r d . Min nen. p o l i s , B u r p . e s s . 2/,ι p .

B a r r o n , G . I . . - IS.'72. T h e g e n e r a o f I l y m p h o m y c e L e s f r o m s o i l . Sew Y o r k , Kuberl K . K r i e p e r . 3(v'i p.

B i o l o g y o f c o n i . d i . i l ι'ηην. ί ­ 1 9 3 ! . f;. Τ . C o l e , !;

; . K ^ n J r i c k ( < ­ d . ) , Nc­ν. · Vwt'U Λ ." '• < "• ':·• i'!'.:­ . v . 1 . i&5. p .

B i t e n c o u r t , Λ . A . ­ 19­Ί 1 . P o d r i d ô c s da c.i;;r.­mlu IIO 1 ' a r ã . B i o l ó g i c o ,  S. I ' . , 7 : 3 0 5 ­ 1 1 2 .

B o t h a s t , R, . 1 . Λ V t n n e l l , I ) . 1- ­ 1 9 7 4 . Λ  mw^íun For  r a p i d irj? π t i f i c o t i o n ei)uPi*ra t i o r

o f A s p e r g i l l u s f l a v u s a n d  r o l n t í d d t g an i srns,  M y c o l o g i a ,  η & : " ϊ & 5 ­ 3 & 9 , 

C o o m e s , Γ  ,  . ) , í  F r u e L I ,  . 4 . .J, ­  1 % S . Kiji-onurntlcd  p r o c e d u r e s  i ( ) r tl>o lit LííC C  i o n  a n d  c s t i  m u n i t i o n  o f  Λ Π ί ΐ ί σ κ ί π  fl  i n  g r o u n d n u t s ami ;>  r o n n d n u t πΐ ;.ι  11 • r ί  .ι Ί s , T r o p . P r o d . I n s t . R e p . , n .  1 Ν C 

D a v i s , Ά. I).; D i e n o r , U. I..; F,l J r i d j v : , ! ) , ­ !'X>f}. P r o d u c t i o n o f uf 1.0 Leo; i n s 13j ;ind (• by " A s p e r g i l l u s r i a v u s " i n α   s e m i Sya  t h e t it: niptl i υιρ . A p p l . M i c r o b i o l . , 1 4 : 1 7 3 ­ 3 0 .

D i f c o L a b o r a t o r i e s ­ 19 7 4 . M a n u a l o f d e h y d r a t e d c u l t u r e m e d i a and r e a g e n t s f o r m i c r o ­

b i o l o g i c a l a n d c l i n i c a l l a b o r a t o r y p r o c e d u r e s . V. o t l . Del r o i t .

The F u n g i ­ 1973, An a d v a u c c d t r e a L i s e . A i n s v o r t l i , (',, C , S p a r r o w , F. K. (• Λ. S. Sua Sslian (eds.). New Y o r k , AcJ'Jl'niic F r u s s , v . Ί Λ . ft'71 p .

G i l r n a n , J . C. - ) 9 ¾ ? . A r^anual o f s o i l f u n g i . 2 and eú. A r a e s . lot'.i S t a t e Co 1 ΐ e g c  P n i ç s .  '.Μ )  p . 

L a c i i z . ,  C . S­ ­  ' 9 7 7 .  M i e o l o ^ i a  m e d i c a ,  f u n g o s ; ,  a c t i n o m i c e t o s c  a l g a s  d c  i u l e r e s . s e  m e d i 

c o .  S o r v i e r ,  i ]

  i d . , ^.le Ι'.ίίΙο.  7 0 2 P. 

I.ee, W.  V . ­ iyn*j.  Q u a n t i I a L i v<> ik>  t e rminii t i c?n ui" a 1 ' .31 (Mfi'fl  i n  ^ r u u n d n u E  p r o d u c t s .  A n a l y s t .  ( L o n d o n ) ,  9 0 (lf>7C0  :3 0 5­ 1 0 7 . 

I . i n , '1-,  T . ­ 1 y 7 C» ­ Hif.n iiic  i d e n c e of, s f 1 at  o x i g e n ι  r L n hl^ i in  f i r . i z i ) .  n i : t .  F i l o p a L o l o g i a  ( L i m a ) , 11 : 2 ] ,  f r e s u m o ] . 

L i r a , M. U. ­  1 9 7 6 . A c.­j •  j . c i l v ι  ­1 Ρ­ · ri In'. 1 I r I i a  t * r t l # i i i ι ' α  .ι  Γ 1 ;j l η  >: ί  <.  ο ο  .  I n :  A n a i s Οϋ π  g r o s s o  d e  T o x i c o l o g i c  T r o p i c a l ,  l .  M a n a u s ,  p .  1 5 1 - 1 5 3 .

I , o d d e r ,  . 1 . ­  1 9 7 0 .  T h e  y e a s t s : a  t a x o n o m i c  s t u d y . 2.  i d . As­is 11­: rd ftm,  E i l s f t v i e r .  p .  0 0 1 ­ 1 3 0 8 . 

M c L P a n ,  J .  T . ­ l'J.'f'. Sou..­ ­ ­ l.1

 11. ­ ­ ί 1 |. i­ili 1 wni^ m' I Ll L r.jn­i  p n r1

 I, ν  ;α­, ι   a i d .  ο η : \ ' rt­.i r ί  ,.­ι ΐ  i n ste­i ^  " f r i ρι · Γη ι  i ι  .  . 1 , 1ϊ , Sòc:., A r t s . , / 4 : 1 7 ^ ­ 3 ^ 1 , [apuo1

li í t e­.il t*pu Γ t,, A . A . ­ ] 9 ΐ ] ] ,

N a h n i ' y , •). (• : ; í"j

3u, ί! . Κ . ­ Ι 9 ' Λ . Λ t rnpliotomtf t r i c r. • .•' •: • C o r du t e rir, • η i nu l h e a n a t o x i n s . A n a l y s t , 9 0 : 1 5 ^ ­ 1 ^ 0 .

P i t t , , 1 . 1 . ­ 1 9 7 9 . T h e G e n u a Pen i c i 1 li uni a n d i t s t e l e o r a o r p h i c K t a t e s f u p e n i c i 11 ium and T a l a i n o r y c e s , L o n d o n , .

-u\H!enii c PreidS, 6 i'j p .

Pons, W. Λ. Jr.; Cuculu, A. F.; Lee, L. S.; Robertson, J. Α.; Franz, A. 0.; Goldblatt ,1,. A. - 1966. Determination of afla toxins in agricultural products: use of aqueous ace tona for extration. J. Assoc:. Of f ic. Anal Cnem., 49:554-562.

Raper, Κ. Β. & Fennell, D. 1. - 1965. The genus Aspergillus. Baltimore, Williams S Wi_l kins (eds.) 686 p.

Ridell, R- W, - 1 950 . Permanent stained itrycological preparations obtained by slid culture. Mycologia, 42:26 5-270.

Schuller, P. L.; Verhulssonk, C. Α. Η.; Paulsch, W. Ε. - 1973. Analysis of aflatoxin Μ in liquid and powdered milk. Pure A p p l . Chem., 35:291-296.

Tropical Products Institute - 1962. Aflatoxin in groundnuts and groundnuts products: interpretation of physica-clieniical and biological test results. London, Τ. P. I. Mi nistry of Overseas Development, Londres, pg. 1.