FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ESTUDO MORFOFISIOMÉTRICO DE OVÁRIOS E
MATURAÇÃO OVOCITÁRIA
IN VITRO
EM BUBALINOS
E BOVINOS NAS DIFERENTES FASES DA ATIVIDADE
REPRODUTIVA
LUCIANA DA SILVA LEAL
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ESTUDO MORFOFISIOMÉTRICO DE OVÁRIOS E
MATURAÇÃO OVOCITÁRIA
IN VITRO
EM BUBALINOS
E BOVINOS NAS DIFERENTES FASES DA ATIVIDADE
REPRODUTIVA
LUCIANA DA SILVA LEAL
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária para obtenção do Título de Doutor
Área de concentração: Reprodução Animal
Orientadora: Profa. Dra. Eunice Oba
COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA
Autora: Luciana da Silva Leal
Título: Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade reprodutiva
Data: 05/05/08
Nome Assinatura
Profa. Dra. Eunice Oba ________________________
Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga _______________________
Profa. Dra. Mayra Elena Ortiz D’Ávila Assumpção _______________________
Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda ________________________
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DEDICATÓRIA
A DEUS, por estar sempre cuidando de mim.
Aos meus amados pais, Fernando e Maria de Lourdes, e irmãs, Fernanda e Debora, pelo apoio, dedicação, incentivo, confiança, respeito, torcida, alegrias... A vocês dedico todo o esforço, tentativas e amor incondicional!!!
AGRADECIMENTOS
À minha família, por estar sempre presente nas vitórias e nas dificuldades e por todo o amor dedicado.
À Profa. Titular Eunice Oba, pela orientação, oportunidade, incentivo e colaboração constante na realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga, pelo auxílio fundamental nas análises ultra-estruturais, por permitir a utilização do laboratório e tempo dedicado.
Ao Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes, pelo apoio diário, respeito e amizade sincera.
À Banca Examinadora (Professores Eunice, Fernanda, Mayra, Marcelo e Ohashi), pelas ótimas sugestões e idéias para a melhoria da tese.
À Profa. Dra. Lídia Raquel de Carvalho, pela realização das análises estatísticas.
À Carla F. Moya, Cláudia Barbosa Fernandes e Lílian Rigatto Martins, pela amizade, generosidade e colaboração incomensurável para a execução deste trabalho.
À Camila Dias Porto, pela amizade e processamento das amostras para as análises histológicas.
Aos docentes e funcionários do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelo convívio e dedicação diários.
Aos residentes, colegas de pós-graduação e de orientação, especialmente à Tatiana, Liani e Daniela, pela ajuda nas rotinas.
À estagiária Camila Chavier, pela colaboração na execução do projeto.
Aos funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências, pelo processamento das amostras para avaliação ultra-estrutural.
À Profa. Dra. Kunie I. Rabello Coelho e ao funcionário Carlão, por permitirem a utilização do microscópio eletrônico de transmissão no Departamento de Patologia Humana da Faculdade de Medicina.
Aos funcionários da pós-graduação, pela presteza e cordialidade.
Aos funcionários do Setor de Transportes, pela disponibilidade e boas horas de viagem.
Aos funcionários do Hospital Veterinário, pela presteza e convívio diário.
Aos funcionários dos frigoríficos Frigol, Better Beef e Frivale, pela colheita do material.
Às queridas amigas Fernanda, Marcella, Márcia, Soraya e Tatiana da turma XXXIII, pelo companheirismo.
Ao colega Ian Martin, pela idéia de classificar o corpo lúteo.
À bibliotecária Selma Maria de Jesus, pela elaboração da ficha catalográfica.
Ao Curso de Pós-graduação, pelo aprimoramento científico.
À CAPES, pela bolsa concedida e possibilidade de realização do doutorado.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Freqüência de búfalas e vacas gestantes e não gestantes segundo a forma do ovário...64
Tabela 2. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas...66
Tabela 3. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo o período de gestação das búfalas...67
Tabela 4. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo o período de gestação das vacas...68
Tabela 5. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo a espécie animal...71
Tabela 6. Freqüência da presença de folículos em búfalas e vacas não gestantes e nos períodos inicial, médio e final da gestação...73
Tabela 7. Mediana [10 e 30 quartis] dos números de corpos lúteos (N0 de CL) e folículos 7/ 6 mm (N0 de Fol 7/ 6 mm) segundo o estado reprodutivo das
búfalas e vacas...74
Tabela 8. Mediana [10 e 30 quartis] dos números de corpos lúteos (N0 de CL) e folículos 7/ 6 mm (N0 de Fol 7/ 6 mm) segundo o período de gestação das
Tabela 9. Mediana [10 e 30 quartis] referentes às presenças de corpo lúteo (CL) e folículos 7/ 6 mm segundo a espécie animal...76
Tabela 10. Freqüência da presença de corpo lúteo (CL) e a época do ano em búfalas...76
Tabela 11. Distribuição da freqüência de corpos lúteos (CL) segundo a classificação em búfalas e vacas...77
Tabela 12. Mediana [10 e 30 quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo (µm) segundo a classificação do folículo ovariano para as búfalas...84
Tabela 13. Mediana [10 e 30 quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo segundo a classificação do folículo ovariano para as vacas...85
Tabela 14. Média e desvio-padrão do número de células foliculares ao redor do ovócito segundo a classificação do folículo ovariano em búfalas e vacas...88
Tabela 15. Freqüência de folículos ovarianos de búfalas (n= 103) e vacas (n= 161) segundo a presença de vacúolos no ovócito...89
Tabela 16. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e TOT RECUP segundo a espécie animal...116
Tabela 17. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e TOT RECUP segundo a época do ano em vacas...117
Tabela 18. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e TOT RECUP segundo o período de gestação das búfalas...119
Tabela 20. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e TOT COR segundo a espécie animal...124
Tabela 21. Matriz de correlações de Spearman referentes às variáveis analisadas (GI, GII, GIII, DESN, EXP, TOT RECUP, VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e TOT COR) nas vacas...125
Tabela 22. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e TOT COR segundo o estado reprodutivo das búfalas...127
Tabela 23. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/NI e TOT COR segundo o período de gestação das búfalas...127
Tabela 24. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de progesterona (P4 p) (ng/mL) segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas...131
Tabela 25. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P4 p) (ng/mL) segundo o período de gestação das
búfalas...132
Tabela 26. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de progesterona (P4p) (ng/mL) segundo a presença de corpo lúteo (CL) em búfalas e vacas...132
Tabela 27. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de progesterona (P4 p) (ng/mL) segundo a época do ano em búfalas e vacas...135
Tabela 29. Mediana [10 e 30 quartis] concentração plasmática de insulina (µUI/mL) segundo o período de gestação das búfalas e vacas...136
Tabela 30. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração intrafolicular de progesterona (P4) (ng/mL) em folículos < e 7/ 6 mm em búfalas e
vacas...138
Tabela 31. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração intrafolicular de estradiol (E2) (ng/mL) em folículos < e 7 mm em búfalas...139
Tabela 32. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração intrafolicular de IGF-I (ng/mL) em folículos < e 7 mm em búfalas...140
Tabela 33. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis P4p, INSp, IGF-I Fol < 7/ 6 mm, IGF-I Fol 7/ 6 mm, P4 Fol < 7/ 6 mm e P4 Fol 7 /6 mm, segundo a
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Colheita do sangue no momento do abate...53
Figura 2. Dissecção de um ovário com o auxílio de tesoura e pinça anatômica para extrair os tecidos ao seu redor, permitindo melhor acurácia nas avaliações realizadas...54
Figura 3. Mensuração de um ovário com o auxílio de um paquímetro (a) e no detalhe o paquímetro digital (b)...54
Figura 4. Corpos lúteos seccionados ao meio para classificação e determinação do diâmetro médio utilizando-se paquímetro digital...55
Figura 5. Aspiração dos folículos antrais com auxílio de agulha 30 x 8 e seringa de 10 mL...56
Figura 6. Gotas de meio de maturação identificadas com o número da fêmea, contendo os CCOs em placa de Petri...57
Figura 7. Microscópio invertido Leica equipado com epifluorescência utilizado para a visualização dos ovócitos corados com Hoechst 33342...58
Figura 8. Ovários seccionados e fixados em solução de formalina 10%...60
Figura 9. Fragmentos de ovário em solução de glutaraldeído 2,5%...61
Figura 11. Ovários bubalinos com formato redondo (a); alongado (b; esquerda) e oval (b; direita)...79
Figura 12. Ovário bubalino com corpo lúteo cavitário (a); ovário bovino com corpo lúteo cavitário (b)...79
Figura 13. Classificações dos corpos lúteos bubalino. CL I (a); CLII (b, c); CLIII (d, e) e CL IV (f, g)...80
Figura 14. Classificações dos corpos lúteos bovino. CL I (a); CLII (b, c, d); CLIII (e, f)...81
Figura 15. Micrografias de folículos ovarianos bubalinos: primordial (a; 400x); primário (b; 400x); secundário em fase inicial (c; 400x); secundário em fase tardia (d; 400x); antral com antro menos desenvolvido (e; 100x) e pré-ovulatório (f; 50x). A: antro...91
Figura 16 Micrografias de folículos ovarianos bovinos: primordial (a; 400x); em transição (b; 400x, setas indicam células pavimentosas); primário (c; 400x); secundário (d; 400x); terciário (e; 400x); pré-ovulatório (f; 200x); complexo
cumulus oophorus (g; 400x); parede folicular de folículo pré-ovulatório (h; 200x). A: antro; CG: células da granulosa; CT: células tecais; N: núcleo; O: ovócito; ZP: zona pelúcida...92
Figura 17. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: espaço entre a membrana plasmática do ovócito e da célula da granulosa, iniciando-se a deposição de material da zona pelúcida, indicada pela seta (77.500x). CG: célula da granulosa; O: ovócito...98
Figura 19. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: organelas distribuídas no citoplasma do ovócito (5.750x). CG: célula da granulosa; L: lisossomo (vesícula digestória); N: núcleo; V: vesícula...100
Figura 20. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: prevalência de mitocôndrias circulares no citoplasma do ovócito (23.000x). A seta indica uma mitocôndria alongada. RE: retículo endoplasmático...101
Figura 21. Células da granulosa de folículo secundário bubalino (9.750x). A mais escura apresenta abundância em RE. A mais clara apresenta menos RE e mais mitocôndrias. C: centríolo; CGo: complexo de Golgi; M: mitocôndria; N: núcleo; RE: retículo endoplasmático...102
Figura 22. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário. A seta indica secreção de fluido (5.750x). MB: membrana basal...103
Figura 23. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário: espaço entre as células da granulosa (42.000x). As setas indicam gap junctions entre as células da granulosa...104
Figura 24. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: distribuição das organelas no citoplasma (3.250x). CG: célula da granulosa; M: mitocôndria; N: núcleo; Nu: nucléolo...109
Figura 25. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: mitocôndrias predominantemente de formato circular no citoplasma do ovócito (42.000x). A seta indica coated vesicle (vesícula coberta). CG: célula da granulosa; GM: grânulo mitocondrial; Mi: microvilosidades; O: ovócito; RE: retículo endoplasmático...110
Figura 27. Eletromicrografia de folículo primário bovino: microvilos (12.000X) - projeções do citoplasma do ovócito emitidas no citoplasma da célula da granulosa. CG: célula da granulosa; L: lisossomo; M: mitocôndria; N: núcleo; O: ovócito...112
Figura 28. Eletromicrografia de folículo primário bovino: complexo juncional
(30.000x). A seta indica gap junctions. ZA: zona de
aderência...113
Figura 29. Eletromicrografia de folículo primário bovino: mitocôndrias circulares com grânulos (7.000x). A seta aponta uma mitocôndria em processo de divisão. CG: célula da granulosa; L: lisossomo; O: ovócito; RE: retículo endoplasmático...114
Figura 30. Fotografia de complexos cumulus oophorus expandidos de búfalas após 22 a 24 horas de incubação observados em estereomicroscópio (aumento 40x)...129
Figura 31. Fotografia de ovócito de búfala (aumento 400x), no estágio de Metáfase II, corado com Hoechst 33342 visualizado em microscópio invertido equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e emissão, respectivamente)...129
Figura 32. Fotografia de zigoto bubalino partenoto (aumento 100x), visualizado em microscópio invertido equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e emissão, respectivamente)...130
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
AI: anáfase I
BEN: balanço energético negativo CCOs: complexos cumulus oophorus CG: célula da granulosa
CGo: complexo de Golgi CIV: cultivo in vitro
CL: corpo lúteo
DEG/ NI: degenerado/ não identificado DESN: desnudo
DNA: ácido desoxirribonucléico E2: estradiol
eCG: gonadotrofina coriônica eqüina EGF: fator de crescimento epidermal EXP: expandido
FF: fluido folicular FIV: fertilização in vitro
FSH: hormônio folículo estimulante GC: grânulos corticais
GH: hormônio de crescimento GI: grau I
GII: grau II GIII: grau III
GnRH: hormônio liberador de gonadotrofina hCG: gonadotrofina coriônica humana IA: inseminação artificial
IGF-I: fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I Insp: insulina plasmática
LH: hormônio luteinizante
MAPK: proteína quinase ativada por mitógeno MI: metáfase I
MIV: maturação in vitro
MOET: embryo transfer and multiple ovulation
µUI/mL: microunidades internacionais por mililitro NaCl: cloreto de sódio
OD: ovário direito OE: ovário esquerdo P4: progesterona
P4p: progesterona plasmática PBS: phosphate buffer saline
PIV: produção in vitro
PMSG: gonadotrofina sérica da égua prenhe QVG: quebra da vesícula germinativa
REL: retículo endoplasmático liso RER: retículo endoplasmático rugoso RNA: ácido ribonucléico
RNAm: ácido ribonucléico mensageiro SFB: soro fetal bovino
TCM-199: Tissue Culture Medium-199 TE: transferência de embriões
TI: telófase I
TOT COR: número total de ovócitos corados
TOT RECUP: número total de ovócitos recuperados UI: unidade internacional
SUMÁRIO
RESUMO...21
ABSTRACT...23
1. INTRODUÇÃO...25
2. REVISÃO DA LITERATURA...27
2.1. O Ovário...27
2.2. Ovogênese e Foliculogênese...29
2.3. Reinício da Meiose...30
2.4. Folículos Ovarianos...32
2.5. O Corpo Lúteo (CL)...36
2.6. Características Reprodutivas da Fêmea Bubalina...37
2.7. Características Reprodutivas da Fêmea Bovina...39
2.8. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)...41
2.9. Hormônios e IGF-I no Líquido Folicular...48
2.10. Insulina Plasmática...49
3. HIPÓTESE...50
4. OBJETIVOS...51
5. MATERIAL E MÉTODOS...52
5.1. Colheita do Sangue...52
5.2. Colheita e Avaliação Morfométrica dos Ovários...53
5.3. Recuperação e Seleção dos Ovócitos...56
5.4. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)...57
5.4.1. Avaliação da Maturação Nuclear...57
5.6. Processamento dos Ovários para Microscopia Eletrônica de
Transmissão...60
5.7. Dosagens Hormonais...61
5.7.1. Plasma...61
5.7.2. Fluido Folicular...61
5.8. Metodologia Estatística...62
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO...64
6.1. Morfometria do Ovário...64
6.2. Morfometria dos Folículos Ovarianos...82
6.3. Características Ultra-estruturais dos Folículos Ovarianos...93
6.3.1. Búfalas...93
6.3.2. Vacas...104
6.4. Recuperação e Qualidade do Ovócito...114
6.5. Maturação Nuclear Ovocitária in vitro...122
6.6. Concentração Plasmática de Progesterona e Insulina...131
6.6.1 Concentração Plasmática de Progesterona...131
6.6.2. Concentração Plasmática de Insulina...135
6.7. Concentração Intrafolicular de Progesterona, Estradiol e IGF-I...138
7. CONCLUSÕES...142
8. BIBLIOGRAFIA...145
RESUMO
LEAL, L.S. Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade
reprodutiva. [Morphophysiometric study of ovaries and in vitro maturation of oocytes during different phases of reproductive activity in bubaline and bovine]. 2008. 179f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de concentração: Reprodução Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2008.
Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária
mostrou um aparato celular especializado para a metabolização de substratos, produção de energia e síntese de hormônios esteróides. Além disso, foram identificadas microvilosidades e junções específicas entre o ovócito e as células da granulosa. Nas búfalas, a gestação influenciou negativamente o número de folículos ovarianos superficiais, a recuperação ovocitária e a taxa de ovócitos que estavam em estágio de metáfase II. Em ambas espécies (bubalina e bovina), a concentração plasmática de progesterona foi maior (p< 0,001) nas fêmeas gestantes (4,7 ± 2,1 e 8,5 ± 2,8 ng/mL, respectivamente) do que nas não gestantes (2,4 ± 2,6 e 3,6 ± 3,5 ng/mL, respectivamente). A concentração de insulina foi superior nas fêmeas não gestantes do que nas gestantes (4,2 ± 5,5 e 2,1 ± 1,3 µUI/mL, búfalas; p= 0,016) e (5,9 ± 5,8 e 3,4 ± 2,8 µUI/mL, vacas; p= 0,028) Os fluidos dos folículos < 7 mm (búfalas) e < 6 mm (vacas) apresentaram maior concentração de progesterona (207,6 ± 194,5 e 239,8 ± 133,7 ng/mL, respectivamente) e menor nível de IGF-I (187,7 ± 153,6 e 80,7 ± 98,0 ng/mL, respectivamente) comparados aos folículos 7 mm (búfalas) (76,3
± 171,1 ng/mL de P4 e 290,4 ± 177,7 ng/mL de IGF-I) e 6 mm (vacas) (104 ±
120,1 ng/mL de P4 e 165,6 ± 166,5 ng/mL de IGF-I). Comparando as espécies, o tamanho e o peso dos ovários foram menores (p< 0,001) para as búfalas (24,4 x 17,1 x 13,1 mm e 4,0 g/ comprimento, largura, altura e peso, respectivamente) do que para as vacas (30,9 x 21,7 x 15,4 mm e 7,7 g/ comprimento, largura, altura e peso, respectivamente). Nas búfalas, os índices de recuperação de todas as categorias de CCOs (grau 1: 25,9%; grau 2: 30,7%; grau 3: 10,2%; desnudos: 18,6 e expandidos: 14,6%) foram inferiores aos obtidos para as vacas (31,8; 30,6; 15,4; 4,5 e 17,7%, respectivamente). A porcentagem de ovócitos que atingiu o estágio de metáfase II também foi menor nas búfalas (63,4%; 242/396) do que nas vacas (67,8%, 696/1234). Foram observadas diferenças em todas as análises realizadas, indicando que cada espécie possui características fisiológicas próprias.
ABSTRACT
LEAL, L.S. Morphophysiometric study of ovaries and in vitro maturation of
oocytes during different phases of reproductive activity in bubaline and bovine. [Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade reprodutiva]. 2008. 179f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de concentração: Reprodução Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2008.
Researchers around the world have investigated the function of biological factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro
maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of embryo production and manipulation. The aim of the present study was to evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and
in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations; progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro
identified between granulosa cells and oocyte. In buffaloes, the pregnancy affected negativelly the number of ovarian follicles from surface, oocyte recovered and oocytes that were in metaphase II stage. In both species (bubaline vs. bovine), plasma progesterone concentration was higher (p< 0.001) for pregnant (4.7 ± 2.1, n= 33 and 8.5 ± 2.8 ng/mL, n= 36, respectively) than for non pregnant females (2.4 ± 2.6, n= 51 and 3.6 ± 3.5 ng/mL, n= 59, respectively). Insulin concentration was higher for non pregnant than pregnant animals (4.2 ± 5.5 e 2.1 ± 1.3 µUI/mL for buffaloes; p= 0.016) and (5.9 ± 5.8 and 3.4 ± 2.8 µUI/mL for cows; p= 0,028) The fluid from follicles < 7 mm (buffaloes) and < 6 mm (cows) had more progesterone concentration (207.6 ± 194.5 and 239.8 ± 133.7 ng/mL, respectively) and less IGF-I (187.7 ± 153.6 and 80.7 ± 98.0 ng/mL, respectively) when compared with follicles 7 mm
(buffaloes) (76.3 ± 171.1 ng/mL - P4 and 290.4 ± 177.7 ng/mL - IGF-I) and 6
mm (cows) (104.0 ± 120,1 ng/mL - P4 and 165.6 ± 166.5 ng/mL - IGF-I). Among the species, dimensions and weigth of ovaries were lower (p< 0.001) for buffaloes (24.4 x 17.1 x 13.1 mm and 4.0 g to length, width, thickness and weight, respectively) than cows (30.9 x 21.7 x 15.4 mm and 7.7 g to length, width, thickness and weight, respectively). In the buffaloes, the recovery rates of each COCs categories (grade 1: 25.9%; grade 2: 30.7%; grade 3: 10.2%; denuded: 18.6% and expanded: 14.6%) were lower than cows (31.8; 30.6; 15.4; 4.5 and 17.7%, respectively). The percentage of bubaline oocytes that reached metaphase II (63.4%; 242/396) was lower than bovine oocytes (67.8%, 696/1234). Differences were observed in all analysis, indicating that each species has its own physiological characteristics.
1. INTRODUÇÃO
A criação de búfalos tem despertado interesse crescente dos pecuaristas por sua comprovada rusticidade, produtividade de carne e leite e poder de tração. O rebanho mundial bubalino é de aproximadamente 174 milhões de animais e apresentou, nos últimos dez anos, um crescimento de 9,1% e um incremento de 70,6% na produção leiteira (FAO, 2005). O maior rebanho bubalino da América Latina encontra-se no Brasil, fato que pode fazer do país um grande exportador de material genético (OHASHI et al., 2003).
O búfalo possui fácil adaptabilidade às condições brasileiras e é caracterizado por apresentar boa eficiência reprodutiva e crescimento ponderal (BARUSELLI & CARVALHO, 2002).
A aplicação de biotécnicas da reprodução é importante em fêmeas bubalinas porque estes animais apresentam características reprodutivas particulares, tais como: expressão discreta do comportamento de estro e períodos longos de anestro pós-parto e intervalo entre partos, principalmente quando submetidos a uma dieta inadequada (MISHRA et al., 2008). O fato desta espécie apresentar índices reprodutivos inferiores aos bovinos está relacionado com manejo deficiente e/ou seleção inadequada, além do conhecimento não absoluto acerca da sua fisiologia (VALE & RIBEIRO, 2005).
Em bubalinos, uma fertilidade reduzida é observada com a aplicação de algumas biotecnologias sendo provavelmente decorrente de um menor número de folículos primordiais no ovário, pouca responsividade à estimulação hormonal, baixa recuperação de embriões e menor taxa de prenhez quando comparados aos bovinos (NEGLIA et al., 2003).
constituintes genéticos (DATTA & GOSWAMI, 1998; GASPARRINI, 2002; OHASHI et al., 2002).
O Brasil desempenha um papel importante na bovinocultura mundial porque é o maior criador comercial. Segundo os últimos dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o rebanho nacional bovino era de aproximadamente 207 milhões de animais em 2005.
Embora a transferência de embriões (TE) em bovinos seja rotineiramente empregada, a técnica apresenta variabilidade na resposta ovariana das doadoras ao estímulo hormonal e no número de estruturas viáveis recuperadas, além do mais, caracteriza-se pela estagnação nos resultados alcançados.
Os procedimentos de punção folicular e produção in vitro de embriões representam método alternativo ou complementar à TE, proporcionando a multiplicação de genótipos desejáveis, além de serem aplicados em fêmeas portadoras de transtornos reprodutivos adquiridos. No Brasil, essa associação tem sido empregada comercialmente com sucesso nos últimos anos, fazendo com que o país contribua com quase 50% do número total de embriões produzidos em laboratório no mundo (VIANA, 2003).
No entanto, a referida técnica apresenta custo elevado e entraves que precisam ser solucionados, tais como: resultados ainda não satisfatórios de produção de estruturas viáveis para transferência, dificuldade na criopreservação dos embriões, aumento na incidência de abortamentos, gestação nitidamente prolongada, anormalidades congênitas e maior mortalidade perinatal (GARCIA et al., 2003).
O conhecimento de como diferentes componentes do sistema in vitro
influenciam o desenvolvimento embrionário, fetal e placentário poderá resultar em método de cultivo mais confiável no sentido de produzir bezerros normais (PRESTES, 2005).
Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal estudar a fisiologia, morfologia e biometria dos ovários e folículos ovarianos, assim como a maturação ovocitária in vitro nas espécies bubalina e bovina, em diferentes fases da atividade reprodutiva.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. O Ovário
Os ovários de ruminantes são órgãos pares localizados no terço médio das superfícies laterais da entrada da pelve, suspensos pelo mesovário, na porção cranial do ligamento largo, conectados ao útero pelo ligamento ovárico e ao peritôneo parietal pelo ligamento suspensor do ovário (NUNEZ, 1993).
O ovário de búfala é ovóide e consideravelmente menor do que o da vaca (DYCE et al., 1996). Em búfalas adultas, Fadle et al. (1974) e Vale et al. (1982) descreveram medidas para o ovário direito (OD) de 24,0 e 25,4 mm (comprimento), 16,5 e 14,5 mm (largura) e 12,5 e 15,7 mm (espessura) e para o ovário esquerdo (OE) de 22,0 e 24,7 mm (comprimento), 15,5 e 14,1 mm (largura) e 14,0 e 14,8 mm (espessura), respectivamente. Em novilhas, Danell (1987) registrou para o OD 22,8 mm (comprimento), 18,2 mm (largura) e 14,2 mm (espessura) e OE 22,7 mm (comprimento), 16,6 mm (largura) e 13,8 mm (espessura). Parkale & Hukeri (1989), com base em 128 pares de ovários, encontraram as seguintes médias: 24,8 mm de comprimento, 16,7 mm de largura e 14,6 mm de espessura (OE); e 24,4 mm de comprimento, 17,4 mm de largura e 14,6 mm de espessura (OD). Para Vale & Ribeiro (2005), os ovários apresentaram em média, comprimento de 25 a 30 mm e largura de 14 mm.
Alvarez & Oba (1995) avaliaram a biometria ovariana de 18 búfalas superovuladas com FSH-p e PMSG (gonadotrofina sérica da égua prenhe). O comprimento e largura dos ovários foram respectivamente 30 e 33 mm (FSH; OE); 29 e 42 mm (PMSG; OE); 33 e 23 mm (FSH; OD) e 42 e 29 mm (PMSG; OD).
4,6 g (VALE & RIBEIRO, 2005). Danell (1987) observou peso médio de 3,44 ± 1,29 g (OE) e 3,59 ± 1,54 g (OD) em 30 novilhas bubalinas cíclicas avaliadas.
Nos bovinos, os ovários são geralmente ovais a aplanados lateralmente, medindo em média de 30 a 45 mm de comprimento; 15 a 20 mm de largura e 20 a 28 mm de “profundidade” (SISSON & GROSSMAN, 1981). De acordo com Sisson (1986), o peso dos ovários de vacas adultas varia de 15 a 20 g.
Em experimento realizado por Nascimento et al. (2003), os tamanhos dos ovários para vacas apresentando atividade ovariana luteal cíclica e vacas gestantes foram de 30,8 ± 0,7 (OD) e 30,2 ± 0,9 mm (OE); 33,0 ± 0,7 (OD) e 31,9 ± 0,8 mm (OE), respectivamente.
Chacur et al. (2006) descreveram valores médios de 27,5; 19,5 e 16,5 mm (OD) e 28,0; 18,3 e 15,6 mm (OE) para comprimento, largura e espessura, respectivamente, quando avaliaram ovários de vacas zebus não gestantes, recuperados em matadouro.
Danell (1987) detectou a presença de CL em 51,2% dos ovários esquerdos e 48,8% dos ovários direitos, revelando que a distribuição da ovulação é similar entre as gônadas. Entretanto, para vacas, ampla literatura descreve que a localização do CL é mais freqüente no ovário direito (HASLER et al., 1987; JAINUDEEN & HAFEZ, 1995; DEMCZUK et al., 1998; VIANA et al., 1999; SPELL et al., 2001; LEAL, 2004).
Sabe-se que as búfalas apresentam menor número de folículos primordiais e maior taxa de atresia folicular do que as vacas (DANELL, 1987; LE VAN TY
Além do mais, os ovários bubalinos também contém menor número de folículos antrais do que ovários bovinos (46,3 vs. 90 folículos 1mm por par de
ovários) (SETTERGREN, 1964; DANELL, 1987; KUMAR et al., 1997; PALTA & CHAUHAN, 1998; GUPTA et al., 2001).
2.2. Ovogênese e Foliculogênese
Na fêmea, a gametogênese é o resultado da associação de dois fenômenos que ocorrem no interior do ovário: a ovogênese e a foliculogênese (revisado por CARVALHO, 2005).
A ovogênese é definida como o processo de formação, crescimento e maturação do gameta feminino, que tem início na vida fetal e culmina anos depois, pouco antes da ovulação, no animal adulto (WASSARMAN & ALBERTINI, 1994).
As células germinativas primordiais, originárias no saco vitelínico, migram para a crista genital e proliferam-se por mitose. Completada a proliferação mitótica, após o crescimento celular e redistribuição das organelas citoplasmáticas, as células germinativas primordiais passam a ser denominadas ovogônias (BAKER, 1971).
Nos bovinos, as ovogônias também se dividem repetidas vezes por mitose (HILSCHER et al., 1974) e, em torno de 72 a 82 dias de gestação, algumas já iniciaram a primeira prófase meiótica e, então, passam a ser designadas ovócitos primários (ERICKSON, 1966; HILSHER et al., 1974).
A prófase meiótica é caracterizada pela sua longa duração sendo dividida em: leptóteno, zigóteno, paquíteno e diplóteno (RÜSSE, 1983; JORDÃO & ANDRADE, 2000). Neste último estágio, também chamado de núcleo dictiado, os ovócitos permanecem em repouso até pouco antes da ovulação, quando se reinicia a meiose em resposta à estimulação hormonal (BUCCIONE et al., 1990). Esses ovócitos não possuem a habilidade de reassumir a meiose ou de serem fertilizados, permanecendo os seus núcleos em um estágio de imaturidade conhecido como vesícula germinativa (VG)
(LANDIM-ALVARENGA, 2006). Ainda nesta fase, os ovócitos primários são circundados pelas células foliculares, formando assim, os folículos primordiais, caracterizando, desta forma, o início da foliculogênese (RÜSSE, 1983).
A foliculogênese é definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e finalizando-se com o estágio de folículo maduro ou pré-ovulatório (SAUMANDE, 1981; PICTON, 2001). Em ruminantes, a foliculogênese tem início ainda durante a vida fetal (RÜSSE, 1983).
Antes da formação do folículo, ocorre a colonização do ovário fetal por células mesonéfricas, que são fontes precursoras de células foliculares (PICTON, 2001). As células somáticas que acompanham a trajetória das células germinativas até a crista genital, circundam o gameta formando uma membrana basal deixando-o isolado. Tais células estão destinadas a tornarem-se células da granulosa, da teca e do estroma ovariano (ERICKSON, 1986). A interação entre as células da granulosa e o gameta é de fundamental importância para o desenvolvimento do ovócito, sendo que as trocas metabólicas entre esses dois tipos celulares ocorrem por meio de zonas de aderência e complexos intercomunicantes (EPPIG& SHROEDER, 1989).
2.3. Reinício da Meiose
O bloqueio da meiose é regulado em dois pontos: no estágio de diplóteno da primeira divisão meiótica, no qual os ovócitos se detêm por longos períodos de tempo, até o reinício do crescimento ovocitário, e no estágio de metáfase II, no qual permanecem até a fecundação (JORDÃO & ANDRADE, 2000). Na maioria dos vertebrados, o reinício da meiose é mediado pela interação entre receptores de membrana das células do cumulus e o LH (hormônio luteinizante). Esse sinal hormonal ativa o MPF (fator promotor de maturação) que induz a condensação cromossômica, ruptura do envoltório nuclear e formação do primeiro fuso meiótico (MURRAY, 1989; VERLHAC et al., 1994; JORDÃO & ANDRADE, 2000).
O MPF é um complexo protéico dimérico, composto por duas subunidades-chave: a p34cdc2 e a ciclina. A p34cdc2 é a subunidade enzimática com atividade de proteína quinase, e a ciclina é uma proteína regulatória que controla a capacidade da cdc2 em fosforilar proteínas-alvo adequadas (VERLHAC et al., 1994; JORDÃO & ANDRADE, 2000; NURSE, 2000).
Em mamíferos há evidências de que outros agentes, como as enzimas da família MAP quinase (proteína quinase mitógeno ativada) e fatores de crescimento também estão envolvidos nos eventos que ocorrem durante a maturação do ovócito e expansão das células do cumulus (NURSE, 1990; VERLHAC, et al., 1994; FISSORE et al., 1996).
horas, a MI de 12 a 15 horas, a AI e a TI de 15 a 18 horas e a MII de 18 a 22 horas (SIRARD et al., 1989; WU et al., 1997).
As diversas mudanças que ocorrem no citoplasma durante o desenvolvimento e maturação dos ovócitos são essenciais para a capacidade de desenvolvimento, aquisição da competência meiótica, fertilização e desenvolvimento embrionário. Os ovócitos com maturação nuclear normal, em tempo regular, mas que possuem uma assincronia entre maturação citoplasmática e nuclear, não serão fecundados ou não irão redundar em um desenvolvimento embrionário (BEVERS et al., 1997; BLONDIN et al., 1997; HYTTEL et al., 1997).
2.4.
Folículos
Ovarianos
O folículo ovariano é considerado a unidade funcional da gônada feminina (ARIYARATNA & GUNAWARDANA, 1997). Além disso, é uma estrutura altamente organizada, constituída essencialmente pelo ovócito circundado por células foliculares e demarcado por uma membrana basal que os separa do estroma ovariano (LANDIM-ALVARENGA, 2006).
2.4.1. Função dos Folículos Ovarianos
O folículo ovariano apresenta duas funções principais: proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do ovócito e produzir hormônios esteróides, como o estrógeno e o estradiol e peptídeos, como inibina A e B, ativina e folistatina (GORDON, 1994a; LANDIM-ALVARENGA, 2006).
2.4.2. Classificação dos Folículos Ovarianos
• Folículos primordiais: são os primeiros folículos formados no ovário e
encontram-se em estágio de quiescência. Consistem em um ovócito primário centralizado, circundado por uma única camada de células da granulosa de forma pavimentosa e demarcado por uma membrana basal (ERICKSON, 1986; EPPIG, 1991; HIRSHFIELD, 1991; FORTUNE, 1994; EPPIG & O’BRIEN, 1996; LANDIM-ALVARENGA, 2006);
• Folículos primários: representam o primeiro estágio de crescimento
folicular. Caracterizam-se pela presença de um ovócito centralizado, circundado por uma camada de células da granulosa de forma cúbica (HULSHOF et al., 1994; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Nesse tipo de folículo, as células da granulosa aumentam em número e tornam-se mais volumosas (VAN DEN HURK et al., 1997);
• Folículos secundários: caracterizam-se pela presença de um ovócito
centralizado, circundado por duas ou mais camadas de células da granulosa de forma cúbica (HULSHOF et al., 1994; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Nos folículos secundários, em estágios mais avançados, as fibras de tecido conjuntivo se organizam paralelamente à membrana basal para formar a camada de células tecais (VAN DEN HURK et al., 1997), podendo então ser identificadas células tecais diferenciadas, bem como uma membrana hialinizada, denominada zona pelúcida (FIGUEIREDO, 1995);
• Folículos terciários: consistem em um ovócito circundado pela zona
pelúcida, corona radiata e células do cumulus. Possuem ainda células foliculares, uma pequena cavidade contendo líquido folicular (antro), uma membrana basal e duas camadas de células tecais (FIGUEIREDO, 1995; LANDIM-ALVARENGA, 2006);
• Folículos pré-ovulatórios (cuja nomenclatura antiga era De Graaf):
2.4.3. Morfologia e Ultra-estrutura dos Folículos Ovarianos
Os folículos primordiais têm cerca de 40 µm (vacas) e 35 µm (búfalas) e apresentam um ovócito (20 µm, na maioria das espécies) rodeado por uma camada de 4 a 8 células achatadas da granulosa. O ovócito pode apresentar um formato que varia de esférico a ovóide (HULSHOF et al., 1992; VAN WEZEL & RODGERS, 1996; FAIR et al., 1997a; PRIEDKALNS & LEISER, 1998; PICTON, 2001; MONDADORI et al., 2007). No ooplasma, visualizam-se numerosas vesículas com distribuição homogênea, que apresentam membrana, mitocôndrias, associadas ou não aos retículos endoplasmáticos liso (REL) e rugoso (RER). Em pequeno número observam-se complexos de Golgi (CGo) e gotas lipídicas (FAIR et al., 1997a; HYTTEL et al., 1997).
Os folículos primários apresentam diâmetro de 60 a 100 µm (vacas) e 25 a 80 µm (búfalas) e o ovócito é rodeado por uma camada completa de 11 a 20 células da granulosa de forma cubóide. O ovócito é geralmente esférico e apresenta abundância de mitocôndrias de forma alongada e em divisão e aumento nos números de REL e RER, refletindo o crescimento dos requerimentos de energia e de síntese de lipídios e proteínas pelo ovócito. Complexos de Golgi e polirribossomos também estão presentes (FAIR et al., 1997a; HYTTEL et al., 1997; KUMAR et al., 1997).
Nos folículos primordial e primário, as comunicações entre as células da granulosa e o ovócito são mediadas por endocitose (HYTTEL et al., 1997).
As principais modificações observadas durante a fase de desenvolvimento do ovócito são: formação das junções intercomunicantes entre o ovócito e as células somáticas circundantes; desenvolvimento e deslocamento do CGo, REL e das gotas lipídicas para a periferia do ovócito; formação dos grânulos corticais (GC) e zona pelúcida; diferenciação da mitocôndria; quebra dos centríolos e deposição ou síntese dos RNAm maternos para a produção de proteína do ovócito, das células somáticas e mais tarde para o desenvolvimento (FAIR et al., 1996; HYTTEL et al., 1997).
neste ponto do desenvolvimento que o folículo parece tornar-se responsivo ao FSH (hormônio folículo estimulante) (FAIR, 2003). Quando duas a três camadas de células da granulosa são formadas, é possível a identificação de células tecais em torno da membrana basal (SCARAMUZZI et al., 1993). O estágio de folículo secundário é também associado aos primeiros sinais detectáveis de síntese de RNA (ácido ribonucléico) no ovócito (FAIR et al., 1997b).
Um aspecto importante durante o crescimento do ovócito é seu alto grau de atividade transcricional. O acúmulo de RNAm (ácido ribonucléico mensageiro), ribossomos e polipeptídeos no ovócito, durante a fase de crescimento, é crucial para o desenvolvimento posterior. Os ovócitos bovinos que não estão completamente desenvolvidos no momento da fertilização in vitro falham em alcançar o estágio de blastocisto (FAIR & HYTTEL, 1997).
Em búfalas, Kumar et al. (1997) relataram diâmetros médios de 20 a 30 µm (ovócito); 50 a 100 µm (folículo); 30 a 60 µm (ovócito) e 100 a 300 µm (folículo) para folículos secundários e terciários, respectivamente.
A transição para o estágio de folículo terciário é caracterizada pela continuada proliferação e diferenciação das células foliculares em células da teca interna e externa, lâmina basal, células do cumulus e a formação de fluido na cavidade antral (DRIANCOURT, 1991). Em bovinos, o aparecimento do antro ocorre em folículos com 120 a 160 µm de diâmetro (MONNIAUX et al., 1993). No momento da formação da teca interna é possível detectar a expressão de RNAm para receptor de LH nas células tecais (XU et al., 1995).
À medida que o folículo cresce e o antro é formado, as células da granulosa se separam em dois subtipos: células do cumulus que são íntima e metabolicamente ligadas ao ovócito e células murais, que formam a parede do folículo (GILCHRIST et al., 2004). Em folículos terciários mais desenvolvidos, as células da granulosa imediatamente ao redor do ovócito, tornam-se colunares e radialmente dispostas, formando a corona radiata (PRIEDKALNS & LEISER, 1998). As células da granulosa têm características estruturais de células secretoras de proteínas, notavelmente um extensivo RER (PRIEDKALNS & LEISER, 1998).
citoplasma do ovócito (gap junctions) (RODRIGUEZ & FARIN, 2004). A comunicação entre as células do cumulus e o ovócito é bidirecional e, além das junções gap, é mediada por sinais parácrinos (GANDOLFI et al., 2005).
As gap junctions são compostas por proteínas conhecidas como conexinas e se localizam entre as células da granulosa e entre estas e as superfícies de membrana do ovócito e das células da granulosa que o circundam. Essas junções intercomunicantes permitem a transferência direta para o ovócito de moléculas de baixo peso molecular, tais como: íons, metabólitos da glicose, nucleotídeos e aminoácidos necessários para o seu crescimento, assim como pequenas moléculas reguladoras como o AMPc (EPPIG, 1991; GANDOLFI et al., 2005). As moléculas maiores também são transferidas por essas junções, mas de forma indireta, ou seja, após se ligarem a seus receptores celulares (DODE, 2006). Após o pico de LH há uma evidente diminuição do fluxo de substâncias e ocorrem mudanças morfológicas nas gap junctions. A maturação do ovócito parece estar correlacionada negativamente com o número de gap junctions por células (LARSEN et al., 1986).
Durante a maturação, o nucléolo se compacta, sugerindo a diminuição da atividade transcricional. Do mesmo modo, ocorrem mudanças na organização do citoplasma tais como: um contínuo desenvolvimento dos estoques de lipídios, redução do aparelho de Golgi, redistribuição de ribossomos, rearranjo das mitocôndrias e alinhamento dos GC próximo à membrana plasmática (HYTTEL et al., 1997). Antes da ovulação, as células da granulosa assumem características secretoras de esteróides e são encontrados, especialmente, RER e mitocôndrias com crista tubular (PRIEDKALNS & LEISER, 1998).
2.5. O Corpo Lúteo (CL)
manutenção do próprio CL durante o período compreendido entre a ovulação e a implantação, quando ocorre o reconhecimento materno da gestação.
A avaliação do CL fornece informações importantes sobre o estado reprodutivo da fêmea e possibilita a adequação de procedimentos de manipulação ou sincronização do ciclo estral (VIANA et al., 1999).
O CL das búfalas está comumente inserido no estroma ovariano sendo geralmente menor do que na vaca, podendo atingir um peso máximo de 2,3 g e um diâmetro máximo de 15 mm (ROY & MULLICK, 1964). Figueiredo et al. (1997) encontraram diâmetro luteal máximo de 17,7 mm em animais da raça Nelore. Na mesma raça, Neves et al. (2002) reportaram em animais gestantes e não gestantes diâmetro luteal de 18,4 e 18,7 mm; 15,3 e 16,4 mm para ovários esquerdo e direito, respectivamente.
De acordo com Ireland et al. (1980) existem quatro mudanças prontamente identificáveis na aparência do CL bovino após a ovulação. Segundo esses autores, os diâmetros dos CL nos estágios I, II, III e IV variaram de 5 a 15; 16 a 20; 16 a 20 e <10 mm, respectivamente.
2.6. Características Reprodutivas da Fêmea Bubalina
Os búfalos de água domésticos são classificados em búfalo de pântano e búfalo de rio, de acordo com o habitat e uso. O búfalo de rio (2n= 50) prefere água fresca sendo criado para produção de leite e carne. Já o búfalo de pântano (2n= 48) prefere água turva e barrenta e foi primariamente utilizado para tração e secundariamente para carne (GANGULI et al., 1998; HUFANA-DURAN et al., 2004; PRESICCE, 2007).
regiões equatoriais onde a função reprodutiva é influenciada principalmente pela oferta de alimentos. Nestas regiões, o búfalo é um animal poliéstrico contínuo. Os efeitos sazonais na função reprodutiva são comandados pela melatonina, que é um hormônio sintetizado pela glândula pineal (BITTMAN & KARSCH, 1985; ZICARELLI, 1994; ZICARELLI & VALE, 2002).
Existe na literatura internacional um conceito errôneo de que o búfalo é um animal tardio ou de baixa performance reprodutiva. O fato dessa espécie apresentar índices de fertilidade inferiores aos bovinos parece estar relacionado com manejo deficiente e/ou de seleção inadequada (VALE & RIBEIRO, 2005). Porém, certa vantagem é observada na criação de búfalos em climas tropicais, pois são mais bem adaptados ao estresse térmico do que os bovinos (VILLARES, 1994; ZICARELLI, 1994).
O grupo de pesquisa de Baruselli analisou a divergência folicular em 19 novilhas cíclicas da raça Murrah. O mecanismo de divergência folicular é definido como o início da diferença na taxa de crescimento entre os dois maiores folículos, estabelecendo-se a dominância de apenas um deles, o qual poderá se tornar ovulatório (GIMENES et al., 2005).
No experimento de Gimenes et al. (2005), a determinação do diâmetro dos dois maiores folículos e do momento esperado para a ocorrência do desvio folicular foi realizada de duas maneiras: análise visual do gráfico de cada novilha (1) e modelo matemático de Regressão Linear Segmentada (2). O momento de divergência folicular avaliado pelos métodos 1 e 2 foi de 63,2 ± 5,65 e 61,9 ± 4,94 horas após a ovulação, respectivamente. Já para diâmetros foliculares no momento do desvio, os resultados foram de 7,2 ± 0,3 (folículo dominante; FD) e 6,4 ± 0,3 mm (folículo subordinado; FS) no método 1 e 7,3 ± 0,3 (FD) e 6,3 ± 0,3 mm (FS) no método 2. Não houve diferença estatística entre os dois métodos.
Devido às semelhanças na dinâmica e no padrão de dominância folicular entre as espécies bubalina e bovina, as tecnologias de MOET utilizadas em bovinos são, via de regra, adaptadas aos bubalinos (BARUSELLI et al., 1997).
No entanto, Baruselli et al. (1999) verificaram por exames ultra-sonográficos, que as búfalas apresentam resposta ao tratamento superovulatório, seguida de ovulação e formação de CL. Porém, a taxa de recuperação embrionária não é compatível com a resposta ovariana. Esses pesquisadores sugeriram que o número reduzido de embriões recuperados pode ser devido a uma falha na captação de ovócitos pelo oviduto (BARUSELLI et al., 2000).
Na ausência de ovulação, os folículos anovulatórios de búfalas superestimuladas secretam altas concentrações de estradiol (E2) (SCHALLENBERGER et al., 1990). O desequilíbrio na proporção estrógeno: progesterona pode interferir nos mecanismos de captação dos ovócitos pelas fímbrias (HUNTER, 1988; MISRA et al., 1998).
2.7. Características Reprodutivas da Fêmea Bovina
Nos bovinos, cada ciclo estral apresenta duas ou três ondas de crescimento folicular (SAVIO et al., 1988; SIROIS & FORTUNE, 1988; GINTHER et al., 1989) e, eventualmente, uma ou quatro (SIROIS & FORTUNE, 1988; RHODES et al., 1995; FIGUEIREDO et al., 1997). Uma nova onda folicular ocorre, aproximadamente, a cada 10 dias (6 a 15 dias de variação) e precedendo o início de cada onda, existe um aumento da secreção de FSH (ADAMS et al., 1992a; ADAMS et al., 1992b; HAMILTON et al., 1992; SUNDERLAND et al., 1994; GONG et al., 1995; GINTHER et al., 1996).
granulosa, que conferem maior responsividade ao LH em relação aos folículos menores (CROWE, 1999).
Em novilhas holandesas, o desvio e a subseqüente dominância ocorrem, em média, 2,8 dias após a emergência da onda, quando o futuro folículo dominante tiver 8,5 mm (GINTHER et al., 1996). Em animais da raça Nelore, Sartorelli et al. (2005) reportaram que o desvio ocorreu 2,8 dias após a ovulação, quando o maior folículo atingiu 5,7 mm em novilhas (n=8) e, 2,4 dias após a ovulação, quando o maior folículo atingiu 6,1 mm em vacas não lactantes (n=11).
O desenvolvimento das biotecnologias de MOET possibilitou o aumento dos índices reprodutivos em fêmeas bovinas, maior intensidade de seleção, diminuição do intervalo entre gerações, maior disponibilidade de animais para reposição (PENNA, 1993) e, além disso, também permitiu que uma fêmea de elevado padrão zootécnico fosse utilizada de uma forma mais racional, fornecendo um grande número de descendentes, num curto espaço de tempo (FERNANDES, 1994). No entanto, apresentam custo elevado e variação nos resultados, devido aos fatores que influenciam a resposta ovulatória de doadoras, que afetam a fertilização e a viabilidade embrionária e aqueles relacionados ao programa e manejo animal (ARMSTRONG, 1993).
Mesmo assim, as fêmeas bovinas são mais eficientes do que as fêmeas bubalinas na recuperação de embriões. Adams (1994) relatou taxas de recuperação de embriões de 62 a 78% em relação ao número de ovulações e de 63 a 80% em relação ao número de CL. Em vacas de raças taurinas, Gradela et al. (1996) obtiveram índice de recuperação de embriões de 78% e para Leal et al. (2005), as taxas de recuperação de embriões foram de 57,51 e 50,09% considerando-se o número total de CL à palpação retal e à ultra-sonografia, respectivamente.
Diferenças nas fontes de obtenção dos ovócitos, maturação ovocitária, técnicas de preparação espermática, condições de fecundação e ambiente de cultivo têm efeito sobre o desenvolvimento e qualidade dos embriões (FARIN et al., 2001).
A viabilidade econômica da referida técnica está diretamente ligada à eficiência dos laboratórios; não somente com relação ao incremento na produção, mas principalmente com a obtenção de embriões capazes em estabelecer crescimento e gestação normais (GARCIA et al., 2003).
A despeito do custo, variação nas taxas de produção de embriões viáveis para transferência, reduzida criotolerância embrionária e incidência de gestação prolongada, distocia, mortalidade perinatal e anomalias congênitas no recém-nascido (GARCIA et al., 2003), o Brasil contribui com quase 50% do número total de embriões produzidos em laboratório no mundo (VIANA, 2003).
2.8.
Maturação
Ovocitária
in vitro
(MIV)
A maturação ovocitária é definida como o reinício e término da primeira divisão meiótica, do estágio de quebra da vesícula germinativa até a fase de metáfase II, acompanhada da maturação citoplasmática necessária para a fertilização e desenvolvimento embrionário (CHA & CHIAN, 1998).
Os ovócitos reiniciam a meiose espontaneamente quando isolados de seus folículos, ou seja, retirados da ação inibitória das células foliculares e cultivados
in vitro (SIRARD & COENEN, 1993). As células da granulosa apresentam um papel regulatório no desenvolvimento do ovócito, afetando o perfil de fosforilação das proteínas (CECCONI et al., 1991). O contato funcional entre as células do cumulus e o ovócito durante a maturação é essencial para expressão da total competência ovocitária (ALI et al., 2005).
2.8.1. Fatores que afetam a competência do ovócito
II. Nos trabalhos em que os ovários são provenientes de vacas de abatedouros, estes normalmente são transportados em solução salina a 0,9% de NaCl aquecida a 30-35ºC. O tempo transcorrido entre a obtenção dos ovários e o início da colheita varia entre grupos de pesquisa, mas não parece afetar a viabilidade dos ovócitos quando realizado no período de até 3 horas (GONÇALVES et al., 2002).
O fluido folicular (FF) tem sido utilizado para o transporte de ovócitos bovinos com resultados satisfatórios, quando o tempo de transporte é relativamente curto. O fluido folicular proporciona graus variáveis de bloqueio da meiose, possibilitando maior sincronia entre maturação nuclear e citoplasmática. Entretanto, para períodos mais prolongados de transporte, o bloqueio produzido pelo FF pode determinar redução no futuro desenvolvimento embrionário (VIZCARRA et al., 2000; LEHMKUHL, 2001; LEIVAS et al., 2005).
A maioria dos ovócitos provenientes de folículos antrais é capaz de completar a maturação nuclear, mas somente os competentes têm a capacidade de ter desenvolvimento embrionário normal (SIRARD et al., 2006).
Os benefícios obtidos com suplementações no meio de maturação são geralmente modestos e mesmo nos melhores resultados, aproximadamente metade dos ovócitos ainda falha em atingir o estágio de blastocisto (DODE, 2006).
Alguns autores acreditam que existe uma correlação evidente entre o tamanho dos folículos e a competência dos ovócitos. Segundo Dode et al. (2000), ovócitos provenientes de folículos de maior diâmetro apresentam maior potencial de desenvolvimento do que aqueles provenientes de folículos de menor diâmetro. No entanto, para Seneda et al. (2001), a qualidade dos complexos cumulus oophorus originados de folículos 4 mm e > 4 mm de
vacas Holandesas foi similar.
pode ter um pequeno aumento no período final do desenvolvimento folicular (DODE et al., 2000; GANDOLFI et al., 2005).
Diferente do que ocorre in vivo, os ovócitos utilizados para a PIV são normalmente obtidos de folículos de 3 a 8 mm, que não são expostos às mudanças pré-ovulatórias do ambiente folicular, e são menos competentes do que os ovócitos de folículos acima de 8 mm (HENDRIKSEN et al., 2000).
Em bovinos, Lonergan et al. (1994) obtiveram 66 e 34% de blastocistos a partir de ovócitos de folículos maiores (6 a 8 mm) e menores (2 a 6 mm), respectivamente.
Existem autores (HAGEMANN et al., 1997) que acreditam que a competência do ovócito é influenciada pelo estágio do ciclo estral e outros não (ARLOTTO et al., 1996). Hagemann et al. (1997) relataram que ovócitos de vaca colhidos durante os dias 2 e 10 do ciclo foram mais viáveis para utilização na FIV. Abdoon & Kandil (2001) recuperaram maior porcentagem de ovócitos de boa qualidade de ovários de búfalas cíclicas nos dias 1 a 3 e 10 a 16 do ciclo estral.
O estudo realizado por Abdoon & Kandil (2001) indicou que o status
reprodutivo da fêmea, no momento do abate, pode afetar o número de folículos ovarianos e a qualidade dos ovócitos aspirados. O número total de folículos superficiais foi menor em ovários de búfalas em anestro do que em cíclicas ou gestantes. Ainda com relação às búfalas em anestro, a porcentagem de ovócitos considerados bons foi menor do que a porcentagem de ovócitos ruins e desnudos, indicando que a maioria dos folículos ovarianos nesta categoria de búfalas deve ser atrésica. Em ovários de búfalas gestantes também foi recuperada elevada porcentagem de ovócitos desnudos.
Dominguez (1995) reportou que a gestação não afetou a qualidade ovocitária, sendo que a proporção de ovócitos viáveis foi similar entre vacas cíclicas e prenhes. Porém, vacas prenhes apresentaram menor número de folículos considerados médios (4 a 9 mm) e grandes (10 mm) do que vacas
Manjunatha et al. (2007a) determinaram o desenvolvimento in vitro da competência de ovócitos de búfalas derivados de ovários de vacas de abatedouro em vários estágios do ciclo estral e status folicular. Os ovários foram divididos em 5 grupos: grupo 1 - ovário com CL hemorrágico e sem FD; grupo 2 - ovário com CL maduro e funcional e FD; grupo 3 - ovário com CL maduro e funcional, sem FD; grupo 4 - ovário com CL em regressão e FD e grupo 5 - ovário sem estrutura luteal e com folículos pequenos. As taxas de clivagem foram mais elevadas (p< 0,05) nos grupos 1 (59,6%) e 3 (59,2%).
2.8.2. Considerações Gerais da MIV em Bubalinos
Muitos ovócitos de bubalinos falham em se desenvolver até o estágio de blastocisto após a FIV e esse fato tem sido atribuído à qualidade do ovócito no início da maturação (MANJUNATHA et al., 2007a).
A despeito de uma série de fatores que afeta a taxa de maturação, a colheita de ovócitos de alta qualidade capazes de maturarem in vitro é um fator limitante, particularmente em espécies como a bubalina em que o procedimento de FIV é ainda menos desenvolvido (TOTEY et al., 1992).
O meio de MIV utilizado pela maioria dos pesquisadores tem sido o TCM-199 (Tissue Culture Medium) suplementado com SFB (soro fetal bovino), FSH, LH e estradiol, sendo que pode ser usado também eCG (gonadotrofina coriônica eqüina) e hCG (gonadotrofina coriônica humana) em substituição ao FSH e LH, respectivamente (SANTOS et al., 2002).
Em búfalas, Ravindranatha et al. (2003) determinaram que a temperatura de incubação de 38,5ºC durante a MIV foi considerada ótima, em comparação com 36,5, 37,5 e 39,5ºC.
(tratamento 4). O maior índice de MII foi atingido no período de 23 a 25 horas com o meio 4 (90,9%).
Em búfalas de rio, Gasparrini et al. (2008) avaliaram a maturação nuclear 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 horas após o início da MIV e concluíram que a maioria dos ovócitos bubalinos completa a maturação nuclear entre 21 (89%) a 24 horas (90%). Com 15 e 18 horas de cultivo, os resultados foram de 6 e 32%, respectivamente. Para Ganguli et al. (1998) maior tempo foi requerido para a maturação nuclear in vitro (57% 24 horas e 64% 30 horas). Já Neglia et al.
(2001) observaram que, 19 horas após a MIV, 87% dos núcleos estavam em metáfase II.
Para búfalos de pântano, o melhor resultado de maturação foi verificado após 30 horas de cultivo (76%) do que 24 (70%) e 29 horas (72%) (KAMONPATANA & CHUANGSOONGNEON, 1994).
Meios de maturação com FSH, LH e estradiol e com EGF e IGF-I (juntos ou não) foram testados por Purohit et al. (2005) com grande sucesso. As taxas de maturação foram 46,6% (controle: meio de cultura, piruvato e antibióticos), 74,7% (controle + hormônios), 63,2% (controle + EGF), 64,7% (controle + IGF-I) e 81,0% (controle + EGF + IGF-IGF-I).
É sabido que o desenvolvimento de embriões mamíferos in vitro é afetado negativamente pelo aumento do estresse oxidativo que ocorre sob as condições de cultivo. O dano oxidativo dos componentes celulares interfere com a própria função celular. A maioria das células mamíferas possui sistemas antioxidantes eficientes como a catalase ou superóxido dismutase, tão bem como os compostos thiol que agem como tampões metabólicos (DEL CORSO
et al., 1994).
aminoácidos, sínteses de DNA (ácido desoxirribonucléico) e proteínas e redução de dissulfitos (LAFLEUR et al., 1994).
Em alguns grupos de pesquisa, já é prática a utilização de antioxidantes no meio de maturação de ovócitos bubalinos. Gasparrini et al. (2006) compararam o efeito da suplementação do meio de MIV com cisteamina, cisteína e as duas associadas. A adição dessas substâncias não afetou a porcentagem de MII, contudo incrementou o processo de clivagem. Em outro experimento, em que conferiram a ação de doses distintas de cisteamina (0, 50, 100 e 200 µmol/L) na clivagem, determinaram que a cisteamina na concentração de 50 µmol/L apresentou melhor efeito.
2.8.3. Considerações gerais da MIV em Bovinos
Para que todos os eventos da maturação ovocitária ocorram in vitro, é necessário que os meios utilizados durante este processo simulem as condições encontradas in vivo. Os meios podem ser divididos em simples ou complexos. Os simples são constituídos de uma fonte salina acrescida de uma fonte energética e um tamponante de pH (LEIVAS et al., 2004).
Com relação à atmosfera gasosa, o CO2 é utilizado para controlar o pH dos meios tamponados com bicarbonato (BOONE & SHAPIRO, 1990). O HEPES vem sendo muito utilizado como tampão para evitar grandes variações de pH nos meios de maturação e de cultivo embrionário (MONTAGNER et al., 2000).
Vários constituintes têm sido adicionados ao meio para aumentar a taxa de maturação, tais como: SFB, soro de fêmea em estro, hormônios, líquido folicular e fatores de crescimento e ainda co-cultivo com células do cumulus e células da granulosa (revisado por SANTOS et al., 2002).
A maioria dos laboratórios tem optado pela suplementação do meio com SFB, gonadotrofinas (FSH e LH) e estradiol em condições controladas de atmosfera e temperatura (GARCIA et al., 2003).
provavelmente são decorrentes das distintas concentrações e fontes hormonais utilizadas (COELHO et al., 2002).
O efeito positivo de gonadotrofinas, como o FSH, na maturação in vitro, é mediado pelas células do cumulus, pela ação específica direta ou mediante interação com fatores de crescimento celular e/ou receptores (HARPER & BRACKETT, 1993).
Alves et al. (2001) avaliaram a adição de 10, 20 e 40 µg/mL de FSH ao meio de maturação e constataram que nas duas últimas concentrações, o processo de maturação dos ovócitos bovinos foi retardado ou inibido, visto que as taxas de MII foram inferiores (55,5 e 50% para 20 e 40 µg/mL e 81,8% para 10 µg/mL).
Coelho et al. (2002) compararam o uso da eCG (gonadotrofina coriônica eqüina) e hCG com FSH e LH no meio de MIV em vacas, e obtiveram taxas de clivagem e formação de blastocisto de 60 e 13,9% e 61,2 e 10,6% para os primeiro e segundo protocolos, respectivamente, não apontando diferença entre eles.
A adição de GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) ao meio de maturação foi pesquisada. CALEGARI et al. (2003) averiguaram que o GnRH apresentou habilidade em promover a maturação dos ovócitos bovinos em substituição ao FSH, apesar de não ter ocorrido expansão das células da granulosa.
Para aumentar e melhorar o desenvolvimento embrionário, principalmente em condições sub-ótimas de cultivo é comum a utilização de fatores de crescimento já que, de acordo com algumas pesquisas em diversas espécies animais, estes fatores modulam a sobrevivência, a proliferação e a diferenciação de células foliculares, agindo e interagindo com gonadotrofinas (MONNIAUX et al., 1997).
A adição de células da granulosa ao meio de MIV parece favorecer a produção de blastocistos, entretanto Coelho et al. (1998) não observaram este efeito. Esses pesquisadores explicam que isto pode ter ocorrido porque a concentração das células da granulosa utilizada não foi previamente determinada e para que tal efeito ocorra é necessária uma concentração de no mínimo 1 x 106/mL (CRISTER et al., 1986).
O acréscimo de antioxidantes (ß-mercaptoetanol, cisteína e cisteamina) ao meio de maturação pode prover aumento nos índices de MII, como demonstraram de Matos & Furnus (2000) e Gotardi et al. (2005).
2.9. Hormônios e IGF-I no Líquido Folicular
Progesterona, estradiol, LH, FSH e fatores de crescimento podem afetar potencialmente a competência do ovócito durante a PIV de embriões. Baixas concentrações de IGF-I e outros fatores de crescimento, seguidas por mudanças hormonais que ocorrem durante a fase de dominância possibilitam a indução da atresia folicular e alteram a competência do ovócito (MELO et al., 2005).
O conteúdo esteróide no fluido folicular reflete a capacidade de síntese das células da granulosa e da teca (ZAIN et al., 1997). A progesterona e o 17ȕ
estradiol do fluido folicular, produzidos pelas células somáticas do folículo, são os dois maiores reguladores do desenvolvimento folicular e da atresia. A atresia em folículos pode ser caracterizada por crescimento e decréscimo na produção de progesterona e estradiol, respectivamente, pelo folículo (SPICER
et al., 1987). A variação nas concentrações desses hormônios esteróides no FF indica mudanças nas taxas de produção destes pelas células foliculares, que também pode ter efeito no ovócito.
na P4 iniciando-se aproximadamente 20 horas após o pico de LH (DIELEMAN
et al., 1983; FORTUNE & HANSEL, 1985).
Ao mesmo tempo em que as gonadotrofinas apresentam um papel primário no controle do crescimento e desenvolvimento folicular ovariano, outros fatores estão envolvidos no processo da foliculogênese. O IGF-I é um de muitos fatores de crescimento, com funções especialmente na regulação das células da granulosa e potentes ações na proliferação, diferenciação e esteroidogênese destas células. Não obstante, também há participação do hormônio de crescimento e da insulina. Ademais, existe uma completa interação entre as gonadotrofinas, fatores de crescimento, esteróides e outros hormônios no controle do desenvolvimento folicular (SOUZA et al., 2007).
O IGF-I também está envolvido na estimulação do folículo primordial, como tem sido demonstrado em ovelhas, ratas, porcas e mulher, por instigar a proliferação e diferenciação das células da granulosa (ADASHI, 1992; MONNIAUX & PISSELET, 1992). Outros fatores de crescimento podem modular a ação do IGF-I, por exemplo: altas concentrações de EGF em folículos pequenos podem promover a ação proliferativa do IGF-I, e baixas concentrações de EGF nos folículos maiores podem promover a ação de diferenciação das células da granulosa (HSU et al., 1987).
2.10.
Insulina
Plasmática
Muitos pesquisadores verificaram que concentrações elevadas de insulina circulante apresentam efeitos benéficos na reprodução de fêmeas bovinas. Para isso, diversos experimentos avaliaram as implicações do fornecimento de dietas de diferentes níveis energéticos na fertilidade. Entretanto, até o momento, esse efeito benéfico só foi verificado nas vacas de raças européias, pois em estudo de Martins et al. (2008) com fêmeas azebuadas, as inter-relações entre glicose-insulina-IGF-I não ficaram bem definidas.
