Jose Dias Resende Junior
ANÁLISE DAS MUTAÇÕES DOS GENES HFE,
FATOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA, GLUTATHIONA-S
TRANSFERASE, METILENOTETRAHIDROFOLATO-REDUTASE E O
RISCO DE DOENÇA VENO-OCLUSIVA HEPÁTICA EM PACIENTES
SUBMETIDOS A TRANSPLANTE ALOGÊNICO DE CÉLULAS
TRONCO HEMATOPOIÉTICAS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Jose Dias Resende Junior
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DOS GENES HFE,
FATOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA, GLUTATHIONA-S
TRANSFERASE, METILENOTETRAHIDROFOLATO-REDUTASE E O
RISCO DE DOENÇA VENO-OCLUSIVA HEPÁTICA EM PACIENTES
SUBMETIDOS A TRANSPLANTE ALOGÊNICO DE CÉLULAS
TRONCO HEMATOPOIÉTICAS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador:
Prof. Dr. José Salvador Rodrigues de Oliveira.
Co-orientadora:
Profª. Drª. Maria Stella Figueiredo.
Junior, José Dias Resende
Análise de polimorfismos dos genes HFE, fator V de Leiden, protrombina, glutationa-S transferase, metilenotetrahidrofolato e o risco de doença veno-oclusiva hepática em pacientes submetidos a transplante alogênico de células tronco
hematopoiéticas: Estudo clínico observacional. / José Dias Resende Junior. – São Paulo, 2009.
xxiv, 113f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Hematologia.
Título em Inglês: Analysis genetic polymorphisms of HFE, prothrombin, factor V Leiden, methylenetetrahydrofolate reductase, glutathione S-transferase in hepatic veno-occlusive disease after hematopoietic stem cell transplantation: a observe clinical study.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE HEMATOLOGIA
Chefe da disciplina de Hematologia e Hemoterapia: Profª. Drª. Maria Stella Figueiredo
iv
Jose Dias Resende Junior
ANÁLISE DA MUTAÇÃO DOS GENES HFE,
FATOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA, GLUTATHIONA-S
TRANSFERASE, METILENOTETRAHIDROFOLATO-REDUTASE E O
RISCO DE DOENÇA VENO-OCLUSIVA HEPÁTICA EM PACIENTES
SUBMETIDOS A TRANSPLANTE ALOGÊNICO DE CÉLULAS
TRONCO HEMATOPOIÉTICAS
Presidente da banca:
Prof. Dr. Jose Salvador R. De Oliveira
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Fábio Rodrigues Kerbauy
Prof. Dr. Helio Moraes de Souza
Prof. Dr. Israel Bendit
v
Dedicatória
Aos meus pais,
vi
À Ludmilla,
vii
Ao meu filho
viii
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Jose Salvador Rodrigues de Oliveira, por ter-me recebido, pela oportunidade a mim proporcionada, pela orientação científica e pelos ensinamentos em Transplante de Medula Óssea.
À Profª. Drª. Maria Stella Figueiredo, pelos conselhos, pela atenciosa ajuda, pelo apoio, pela leitura crítica e contribuições apresentadas.
À Profª. Drª. Mihoko Yamamoto, por seus ensinamentos.
À enfermeira Maria Aparecida, pela amizade, pela confiança e pela enorme dedicação em todos os momentos desse trabalho.
À Profª. Drª. Maria Gerbase de Lima e sua equipe, pela cooperação e pela possibilidade de realização dos exames em seu Laboratório.
Ao Prof. Dr. José Orlando Bordin, pelo estímulo à pesquisa, pelo exemplo e pelo apoio.
À Profª. Drª. Maria de Lourdes L. Ferrari Chauffaille, pelos seus preciosos ensinamentos.
À Profª. Drª. Gisele Wally Braga Colleoni, pelo apoio e estímulo constantes.
Ao Adriano, pela amizade,disponibilidade e pela parceria durante esse estudo.
A Drª. Adriana Seber, Medica Responsável pela Unidade de Transplante de Medula Óssea do Graac/IOP, pela inclusão de pacientes desta Instituição no estudo.
ix
Aos amigos Rodrigo Pavani e Alex Sandes, pela amizade e companheirismo desde os primeiros anos dessa jornada.
Aos amigos Carlos, Márcio e Klaus, pela amizade e parceria.
A Bruna e Arthur pela disponibilidade, companherismo e parceria
Aos amigos pós-graduandos, residentes, médicos e funcionários da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da UNIFESP, pela convivência agradável.
Aos colegas do Serviço de Hematologia e Transplante de Medula Óssea do Hospital Santa Marcelina, pela amizade e apoio.
Aos pacientes, que consentiram e fizeram parte deste estudo, pelo carinho e comprometimento com o tratamento, e a intensa e viva disponibilidade em colaborar com os avanços da medicina.
x
Esse trabalho foi desenvolvido com apoio financeiro da CAPES
xi Sumário
Dedicatória ... v
Agradecimentos ... viii
Lista de figuras ... xv
Lista de quadros ... xvi
Lista de tabelas ... xvii
Lista de abreviaturas... xxiii
Resumo ... xxiv
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Doença venoclusiva hepática ... 2
1.2 Glutationa S-transferase ... 4
1.3 Gene HFE (Hemocromatose Hereditária) ... 5
1.4 Mutação da protrombina ... 6
1.5 Fator V Leiden ... 7
1.6 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHF) ... 7
2. OBJETIVOS... 10
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 13
3.1 Casuística... 14
3.2 Metodologia ... 18
3.2.1 Extração e amplificação de DNA ... 18
3.2.2 Identificação da presença do polimorfismo ... 19
3.2.3 Glutationa-S Transferase (GST) ... 19
3.2.4 Gene HFE ... 24
3.2.5 Mutação da protrombina 20210G→A e Fator V Leiden G1691A ... 28
3.2.6 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) ... 30
3.3 Análise estatística ... 32
4. RESULTADOS ... 33
4.1 Estudo dos polimorfismos ... 34
4.1.1 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados ao Bussulfan ... 34
4.1.2 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados a ciclofosfamida ... 34
4.1.3 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados a TBI ... 35
4.1.4 Polimorfismo da GST - e condicionamentos Mieloablativos e Não-mieloablativos 36 4.1.5 Polimorfismo da GST - e uso de nutrição parenteral total ... 36
xii
4.1.7 Polimorfismo da GST - e enzimas hepáticas pré-TCTH do receptor ... 37
4.1.8 Polimorfismo da GST - e uso de vancomicina no TCTH ... 38
4.1.9 Polimorfismo da GST - e grupos de diagnostico ... 38
4.1.10 Polimorfismo da GST - e condicionammentos baseados em bussulfan ... 39
4.1.11 Polimorfismo da GST - e condicionamentos baseados em ciclofosfamida ... 40
4.1.12 Polimorfismo da GST - e condicionammentos baseados em TBI ... 40
4.1.13 Polimorfismo da GST - e condicionamentos Mieloablativos e Não-mieloablativos 41 4.1.14 Polimorfismo da GST - e uso de nutrição parenteral total ... 41
4.1.15 Polimorfismo da GST - e positividade do receptor ao CMV ... 42
4.1.16 Polimorfismo da GST - e enzimas hepaticas pré-TCTH ... 42
4.1.17 Polimorfismo da GST - e uso de vancomicina ... 43
4.1.18 Polimorfismo da GST - e grupos de diagnóstico ... 44
4.1.19 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados ao Bussulfan ... 44
4.1.20 Polimorfismo da GST e condicionamentos relacionados a ciclofosfamida ... 45
4.1.21 Polimorfismo da GST e condicionamentos relacionados a TBI ... 46
4.1.22 Polimorfismo da GST e condicionamentos mielo e não-mieloablativos ... 46
4.1.23 Polimorfismo da GST e uso de nutrição parenteral total... 47
4.1.24 Polimorfismo da GST e sorologia do receptor ao CMV ... 47
4.1.25 Polimorfismo da GST e enzimas hepáticas pré-TCTH ... 48
4.1.26 Polimorfismo da GST e uso de vancomicina ... 48
4.1.27 Polimorfismo da GST e grupos de diagnostico ... 49
4.1.28 Fator V de Leiden (Fator V Leiden G1691A) e condicionamento com Bussulfan .... 50
4.1.29 Fator V de Leiden e condicionamento com ciclofosfamida ... 50
4.1.30 Fator V de Leiden e condicionamento com TBI ... 51
4.1.31 Fator V de Leiden e condicionamentos mielo e não-mieloablativos ... 51
4.1.32 Fator V de Leiden e uso de nutrição parenteral total ... 52
4.1.33 Fator V de Leiden e sorologia do receptor ao CMV ... 52
4.1.34 Fator V de Leiden e enzimas hepáticas pré-TCTH ... 53
4.1.35 Fator V de Leiden e uso de vancomicina ... 53
4.1.36 Fator V de Leiden e grupos de diagnostico ... 54
4.1.37 Mutação da protrombina (mutação da protrombina 202021G→A ) e codicionamento contendo bussulfan ... 55
4.1.38 Mutação da protrombina e condicionamento contendo ciclofosfamida ... 55
4.1.39 Mutação da protrombina e condicionamento contendo TBI ... 56
4.1.40 Mutação da protrombina e condicionamentos mielo e não-mieloablativos ... 56
4.1.41 Mutação da protrombina e uso de nutrição parenteral total ... 57
xiii
4.1.43 Mutação da protrombina e enzimas hepaticas pre-TCTH ... 58
4.1.44 Mutação da protrombina e uso de vancomicina ... 59
4.1.45 Mutação da protrombina e grupos de diagnostico ... 59
4.1.46 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento contendo Bussulfan ... 60
4.1.47 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento contendo ciclofosfamida ... 61
4.1.48 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento com TBI ... 61
4.1.49 Mutação HFE – H63D e tipo de condicionamento mielo e não-mieloablativo ... 62
4.1.50 Mutação HFE – H63D e uso de NPT ... 62
4.1.51 Mutação HFE – H63D e positividade ao CMV no receptor ... 63
4.1.52 Mutação HFE – H63D e enzimas hepáticas pré TCTH ... 63
4.1.53 Mutação HFE – H63D e uso de vancomicina ... 64
4.1.54 Mutação HFE – H63D e grupos de diagnóstico... 64
4.1.55 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo bussulfan ... 65
4.1.56 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo ciclofosfamida ... 66
4.1.57 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo TBI ... 66
4.1.58 Mutação HFE – S65C e tipo de regime de condicionamento ... 67
4.1.59 Mutação HFE – S65C e uso de Nutrição parenteral total ... 67
4.1.60 Mutação HFE – S65C e positividade do receptor ao CMV ... 68
4.1.61 Mutação HFE – S65C e enzimas hepáticas pré-TCTH ... 68
4.1.62 Mutação HFE – S65C e uso de vancomicina ... 69
4.1.63 Mutação HFE – S65C e grupos de diagnóstico ... 69
4.1.64 Mutação MTHR C677T regime de condicionamento contendo Bussulfan ... 70
4.1.65 Mutação MTHR C677T e regimes de condicionamento contendo ciclofosfamida. ... 71
4.1.66 Mutação MTHR C677T e regimes de condicionamento contendo TBI ... 71
4.1.67 Mutação MTHR C677T e tipos de condicionamentos mielo a não-mielo-ablativos ... 72
4.1.68 Mutação MTHR C677T e uso de nutrição parenteral ... 73
4.1.69 Mutação MTHR C677T e positividade do receptor ao CMV ... 73
4.1.70 Mutação MTHR C677T e enzimas hepáticas ... 74
4.1.71 Mutação MTHR C677T e uso de vancomicina ... 75
4.1.72 Mutação MTHR C677T e grupos de diagnósticos ... 75
4.1.73 Resultados obtidos entre a associação de polimorfismos e características estudadas de predisposição à DVOH ... 76
4.1.74 Polimorfismo da GST - e diagnóstico DVOH ... 78
4.1.75 Polimorfismo da GST - θ e diagnóstico DVOH ... 78
4.1.76 Polimorfismo da GST - e diagnóstico DVOH ... 79
4.1.77 Fator V de Leiden e diagnóstico de DVOH ... 79
4.1.78 Mutação Protrombina e diagnóstico de DVOH ... 80
xiv
4.1.80 Mutação HFE S65C e diagnóstico de DVOH ... 81
4.1.81 Mutação MTHR C677T e diagnóstico de DVOH ... 81
4.1.82 Resultados analisados do estudo entre os polimorfismos e diagnóstico de DVOH .. 82
4.1.83 Regime de condicionamento contendo Bussulfan e DVOH ... 82
4.1.84 Regime de condicionamento contendo Ciclofosfamida e DVOH ... 83
4.1.85 Regime de condicionamento contendo TBI e DVOH ... 83
4.1.86 Análise dos tipos de condicionamentos e DVOH ... 84
4.1.87 Análise do uso de NPT e DVOH. ... 85
4.1.88 Análise da positividade sorológica do receptor ao CMV versus DVOH ... 85
4.1.89 Análise de alteração de enzimas hepáticas no pré-TCTH versus DVOH ... 86
4.1.90 Análise do uso de vancomicina e DVOH ... 86
4.1.91 Resultados da análise entre as variáveis de interesse do estudo e DVOH ... 87
5. DISCUSSÃO ... 94
6. CONCLUSÕES ... 103
7. ANEXOS ... 106
8. REFERÊNCIAS ... 109
Abstract
Bibliografia consultada
xv
Lista de figuras
Figura 1. Metabolismo da homocisteína. ... 9
Figura 2. PCR GST P1. ... 23
Figura 3. PCR GST M1 e T1. ... 23
Figura 4. PCR e Digestão C282Y. ... 27
Figura 5. Produtos da digestão do polimorfismo HFE H63D com a enzima de restrição Dpnll ou Mbol (Ferramentas). ... 27
Figura 6. Produto da Digestão do polimotfismo HFE S65C com a enzima de restrição HinfI. ... 28
Figura 7. Produto do PCR Multiplex para o Gene da Protombina. ... 29
Figura 8. Produto do PCR multiplex para o Gene do Fator V de Leiden. ... 30
xvi
Lista de quadros
Quadro 1. Critérios diagnósticos de DVOH ... 15
Quadro 2. Seqüência de primers utilizados para amplificação dos genes GST- μ e
GST- θ, seu sentido e tamanho do produto obtido. ... 19
Quadro 3. Análise dos resultados da PCR multiplex para diagnóstico de polimorfismo dos genes GST- μ e GST- θ ... 20
Quadro 4. Seqüência de primers utilizados para amplificação da GST- π, seu sentido
e tamanho do produto obtido. ... 21
Quadro 5. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação do
polimorfismo do gene GST- π e fragmentos obtidos após digestão. ... 22
Quadro 6. Relação dos primers, sentido e tamanho do produto da PCR para as
mutações C282Y, H63D e S65C do gene HFE ... 24
Quadro 7. Mutação do gene HFE analisada, localização, enzima de restrição utilizada e seqüência de clivagem específica. ... 25
Quadro 8. Fragmentos obtidos após digestão do produto de PCR e seu significado. ... 26
Quadro 9. Características mutação Protrombina (G20210A) e FVLeiden. ... 29
Quadro 10. Seqüência de primers utilizados para amplificação da MTHFR, seu sentido e tamanho do produto obtido. ... 30
Quadro 11. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação da
mutação C677T da MTHFR e fragmentos obtidos após digestão. ... 31
Quadro 12. Resultados de polimorfismos encontrados em cada paciente analisado do estudo, chamando atenção os pacientes grifados em vermelho, os quais
xvii
Lista de tabelas
Tabela A. Caracteristicas clínicas do estudo. ...16
Tabela 1. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento - BU. ... 34
Tabela 2. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento - CY. ... 35
Tabela 3. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento - TBI. ... 35
Tabela 4. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Tipo de
condicionamento. ... 36
Tabela 5. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e NPT. ... 36
Tabela 6. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e positividade ao
receptor ao CMV. ... 37
Tabela 7. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Enzimas Hepaticas Pré TCTH do receptor. ... 37
Tabela 8. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e uso de Vancomicina. ... 38
Tabela 9. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e grupos de
diagnostico. ... 39
Tabela 10. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento -
BU. ... 39
Tabela 11. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento -
CY. ... 40
Tabela 12. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento -
TBI. ... 40
Tabela 13. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e condicionamentos
xviii
Tabela 14. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e NPT. ... 42
Tabela 15. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e positividade do
receptor ao CMV ... 42
Tabela 16. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e enzimas hepáticas
pré-TCTH. ... 43
Tabela 17. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e uso da vancomicina. .... 43
Tabela 18. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Diagnóstico. ... 44
Tabela 19. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e condicionamentos
baseados em bussulfan. ... 45
Tabela 20. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e condicionamentos
baseados em CY. ... 45
Tabela 21. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e condicionamentos com TBI. ... 46
Tabela 22. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e Tipo de
condicionamento. ... 47
Tabela 23. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e NPT. ... 47
Tabela 24. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e sorologia do receptor ao CMV. ... 48
Tabela 25. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e enzimas hepática pré-TCTH. ... 48
Tabela 26. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e Vancomicina. ... 49
Tabela 27. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST e grupos de diagnostico. ... 49
Tabela 28. Distribuição da amostra quanto às variáveis. ... 50
Tabela 29. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Condicionamento - CY... 50
xix
Tabela 31. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e condicionamentos
mielo e não-mieloablativos. ... 52
Tabela 32. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e NPT ... 52
Tabela 33. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e sorologia do receptor ao CMV. ... 53
Tabela 34. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Enzima Hep. Pré
TCTH. ... 53
Tabela 35. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e uso de vancomicina. ... 54
Tabela 36. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e grupos de diagnostico. .. 54
Tabela 37. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e Condicionamento - BU. ... 55
Tabela 38. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
Condicionamento com CY. ... 55
Tabela 39. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
Condicionamento com TBI. ... 56
Tabela 40. Distribuição da amostra quanto às variáveis mutação da protrombina e
condicionamentos mielo e não-mieloablativos. ... 57
Tabela 41. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e NPT. .. 57
Tabela 42. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e sorologia do
receptor ao CMV. ... 58
Tabela 43. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e enzimas
hepáticas pré-TCTH. ... 58
Tabela 44. Distribuição da amostra quanto às variáveis mutação da protrombina e uso de vancomicina. ... 59
Tabela 45. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
xx
Tabela 46. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Condicionamento com Bu ... 60
Tabela 47. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e
Condicionamento-CY. ... 61
Tabela 48. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e
Condicionamento-TBI. ... 61
Tabela 49. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Tipo de
condicionamento. ... 62
Tabela 50. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e NPT. ... 62
Tabela 51. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e CMV Recp. ... 63
Tabela 52. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Enzima Hep. Pré TCTH. ... 63
Tabela 53. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Vancomicina. ... 64
Tabela 54. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Diagnóstico. ... 65
Tabela 55. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e condicionamento -com Bu. ... 65
Tabela 56. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Condicionamento -Cy ... 66
Tabela 57. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Condicionamento -TBI. ... 66
Tabela 58. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Tipos de
condicionamentos... 67
Tabela 59. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e NPT. ... 67
Tabela 60. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e CMV Recp. ... 68
xxi
Tabela 62. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e uso de
vancomicina. ... 69
Tabela 63. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e grupos de
diagnósticos ... 70
Tabela 64. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e
condicionamentos com Bu ... 70
Tabela 65. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e
condicionamentos com CY. ... 71
Tabela 66. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e
Condicionamento - TBI. ... 72
Tabela 67. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e Tipos de
condicionamentos mielo a não-mialoablativos. ... 72
Tabela 68. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e NPT. ... 73
Tabela 69. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e positividade do receptor ao CMV. ... 74
Tabela 70. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e enzimas
hepáticas pré-TCTH. ... 74
Tabela 71. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e vancomicina. ... 75
Tabela 72. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e grupos de
diagnóstico. ... 76
Tabela 73. Resultados do estudo de associação entre os polimorfismos e as demais
características de interesse na pesquisa. ... 76
Tabela 74. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e DVOH. ... 78
Tabela 75. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e DVOH. ... 78
Tabela 76. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e DVOH. ... 79
xxii
Tabela 78. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e DVOH. ... 80
Tabela 79. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e DVOH. ... 80
Tabela 80. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e DVOH... 81
Tabela 81. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e DVOH ... 81
Tabela 82. Resultados do estudo de associação entre os polimorfismos e a variável
DVOH. ... 82
Tabela 83. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - BU e DVOH. .. 83
Tabela 84. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - CY e DVOH. .. 83
Tabela 85. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - TBI e DVOH. . 84
Tabela 86. Distribuição da amostra quanto às variáveis tipos de condicionamentos:
mieloablativo e não-mieloablativo versus DVOH. ... 84
Tabela 87. Distribuição da amostra quanto às variáveis NPT e DVOH. ... 85
Tabela 88. Distribuição da amostra quanto às variáveis positividade sorológica do
receptor ao CMV versus DVOH ... 85
Tabela 89. Distribuição da amostra quanto às variáveis alterações de enzimas hepáticas pré-TCTH versus DVOH. ... 86
Tabela 90. Distribuição da amostra quanto às variáveis uso de vancomicina versus
DVOH ... 87
Tabela 91. Resultados do estudo de associação entre as variáveis de interesse e a
xxiii
Lista de abreviaturas
AIT Acidente isquêmico transitório
AVCI Acidente vascular cerebral isquêmico
DNA Ácido desoxirribonucléico
MTHFR Metileno-tetrahidrofolato redutase
RNA Ácido ribonucléico
TVP Trombose venosa profunda
TCTH Transplante de Medula Óssea
Bu Bussulfan
Cy Ciclofosfamida
TBI Irradiação corporal Total
HFE Hemocromatose hereditária
DVOH Doença veno-oclusiva hepática
GST Glutationa S-transferase
PAI-1 Inibidor da ativação plasminogênio
tPA Fator ativador do Plasminogênio
THT Tetrahidrotiofeno
HLA Antígeno de histocompatibilidade leucocitária
xxiv Resumo
Introdução: Polimorfismos genéticos estão associados com um aumento do risco de
tromboembolismo venoso (TEV) e outras doenças cardiovasculares. Estudos prévios sugerem que a doença venooclusiva hepática (DVOH), que se desenvolve intra transplante de medula óssea pode ser atribuída à polimorfismos gênicos. Objetivos: Avaliar a correlação entre polimorfismos genéticos e o risco de doença venooclusiva hepática no transplante de medula óssea e a associação com a presença de variáveis como o uso de vancomicina, drogas citotóxicas usadas no regime de condicionamento, presença de disfução hepática anterior ao transplante, presença de infecção por citomegalovírus, e grupos de doenças avaliáveis. Pacientes e
métodos: Este estudo caracteriza-se por um estudo clinico observacional
multicêntrico. Foram avaliados 120 pacientes, submetidos a transplante alogênico de medula óssea. Cada paciente foi avaliado propectivamente para DVOH, confirmado pelo critério de Seattle modificado, idade variando de 2 a 65 anos. Fatores de risco para DVOH severo foram analisados usando modelos estatisticos de avaliação. Detectamos simultaneamente através de PCR seguido de digestão e detecção através de eletroforese em gel de agarose, mutação do HFE C282Y, H63D, S65C; MTHFR C677T; Fator V de Leiden, Protrombina 20210A e glutationa S-tranferase.
Resultados: Neste estudo observacional de pessoas, submetidas a transplante de
medula óssea alogênico, a presença de disfução hepática pré transplante foi um fator de risco significante para DVOH. Nós tambem observamos uma associação entre a presença de mutação HFE S65C e disfunção hepática. Conclusões: Em resumo, nossos dados sugerem que disfunção hepatica observada pré transplante de medula óssea é um fator de risco estatisticamente significante para DVOH e que a presença da mutação do HFE S65C apresenta uma tendência ao desenvolvimento de dano hepático. Contudo, não evidenciamos associação dos polimorfismos estudados com DVOH.
Palavras chave: 1. Transplante de Medula Óssea. 2. Transplante de Células-Tronco
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1.1 Doença venoclusiva hepática
A doença venoclusiva hepática (DVOH) é uma síndrome clínica caracterizada por sobrecarga hídrica secundária à retenção renal de sódio, hepatomegalia dolorosa, rápido ganho ponderal, ascite e icterícia. Este quadro clínico se inicia, na maioria das vezes, dentro dos primeiros vinte dias após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). Alguns estudos relataram a ocorrência da DVOH tardia, que é conseqüente ao uso de regimes de condicionamento contendo bussulfan, onde as alterações sindrômicas são observadas após trinta dias. A incidência da DVOH varia de 10 a 60%, com mortalidade acima de 67% na forma grave (Kulkarni et al., 1999; DeLeve et al., 2002; Coppell et al., 2003; Senzolo et al., 2007).
A DVOH é clinicamente classificada em: 1- DVOH leve, que é autolimitada e geralmente resolve-se sem tratamento; 2- DVOH moderada quando requer tratamento; mas usualmente os pacientes se recuperam e 3- DVOH severa que é definida como dano hepático não resolvido até o dia 100 pós -TCTH ou que tem evolução fatal (McDonald et al., 1993; Litzow et al., 2002; Coppell et al., 2003).
A DVOH é resultado de lesões nas células endoteliais sinusoidais e nos hepatócitos da zona 3, do centro lobular do ácino hepático, desencadeadas por deposição de fibrina dentro do lúmen destes sinusóides e das vênulas hepáticas (Coppell et al., 2003).
Não há consenso, na literatura médica vigente, na abordagem terapêutica desta síndrome. Entre as medidas profiláticas mais efetivas na redução da DVOH, as mais admitidas são a redução da intensidade do condicionamento e o maior fracionamento da irradiação corporal total. Medidas de suporte como balanço hídrico, hemodiálise, paracenteses e restrição protéica com lactulose oral são úteis para reduzir o risco de progressão para encefalopatia hepática (Kulkarni et al., 1999; DeLeve et al., 2002; Litzow et al. 2002; Coppell et al., 2003; Senzolo et al., 2007).
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indeterminado, porém estudos “in vitro” e “in vivo” mostraram sua eficácia no estímulo à liberação da trombomodulina, do fator ativador tissular do plasminogenio (tPA), da prostaciclina e do prostaglandina E2, diminuição na geração de trombina, expressão do fator tissular, liberação do inibidor da ativação do plasminogenio (PAI-1) e atividade de endotelina (Kulkarni et al., 1999; Park et al., 2002; Coppell et al., 2003; Senzolo et al., 2007; Tay et al., 2007).
São fatores considerados como capazes de aumentar a predisposição à DVOH: 1)- Dano hepático pré-existente, secundário à irradiação abdominal, hepatite ativa, excessiva ingestão de álcool caracterizados por transaminases alteradas. 2)- Segundo TCTH, responsável pelo aumento em 20 % na incidência da DVOH. 3)- Regime de condicionamento de maior intensidade ablativa e terapia citotóxica empregada em tratamentos quimioterápicos anteriores. 4)-Tipo de transplante: estudos de coortes prospectivos e multicêntricos mostraram que receptores de transplantes alogênico são mais propensos a desenvolver DVOH do que no transplante autologo, 5)- Fatores genéticos como mutações e polimorfismos gênicos capazes de alterar o metabolismo das drogas usadas no regime de condicionamento (Kami et al. 1997; DeLeve et al., 2002; Vogelsang, Dalal, 2002; Coppell et al., 2003; Kumar et al., 2003).
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1.2 Glutationa S-transferase
Muitos agentes citotóxicos usados em TCTH são metabolizados pelo fígado, órgão principal na patogênese desta síndrome. Os hepatócitos da zona 3 são ricos em GST e citocromo P450, mas contém baixos níveis de glutationa. Estas enzimas em conjunto com glutationa convertem as drogas em substancias estáveis, solúveis em água e depuram espécies oxigênio reativas. A relativa deficiência de glutationa na zona 3 do hepatócito e nas células endoteliais sinusoidais confere maior sensibilidade destas células à injúria pelas toxinas geradas durante o regime de condicionamento. Sabendo que muitas drogas citotóxicas usadas nos regimes de condicionamento são consideradas como fatores causais mais significantes para desenvolver DVOH, baixos níveis intrínsecos ou droga-induzido de glutationa em hepatócitos poderiam contribuir para este dano (Bredschneider et al., 2002; Srivastava et al., 2004).
Os dois principais agentes citorredutores usados na terapia de condicionamento para TCTH, bussulfan e ciclofosfamida, envolvem a enzima glutationa s transferase (GST) e glutationa no processo de metabolização. A maior via de metabolização do bussulfan é a conjugação com glutationa na presença de GST e a oxidação do seu metabólito lipofílico resultante, tetraidrotiofeno (THT), pela enzima citocromo P450 antes da excreção deste. Por outro lado, a ciclofosfamida é inicialmente transformada pelo citocromo P 450 resultando no metabólito ativo 4-hidroxi-ciclofosfamida, o qual requer glutationa e GST para promover o seu metabolismo. Portanto, essas enzimas são um elo metabólico entre estas duas drogas, que freqüentemente são usadas seqüencialmente no TCTH (Bredschneider et al., 2002; Srivastava et al., 2004).
Existem quatro sub-famílias de GST descritas e denominadas GST A1, M1, T1 e P1, podendo estar associadas ao risco de desenvolvimento da DVOH. (Srivastava et al., 2004).
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polimorfismo nulo da Glutationa S-Transferase M1 comparado com o genótipo normal; isto foi devido ao dano dos hepatócitos mediado pelo metabolismo do bussulfan, através da diminuição do pool celular da glutationa.
1.3 Gene HFE (Hemocromatose Hereditária)
Outro polimorfismo que pode estar relacionado à predisposição da DVOH, é a presença do alelo C282Y, associado a hemocromatose hereditária do tipo 1 (Kallianpur et al., 2005). A hemocromatose do tipo 1 é geralmente relacionada ao funcionamento inadequado da proteína transmembrana HFE, sendo que esta proteína normalmente permanece na membrana celular formando um complexo com receptor de transferrina, onde provavelmente inibe a interação receptor de transferrina (Kallianpur et al., 2005).
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Portanto, o genótipo HFE C282Y, heterozigoto ou homozigoto, devido ao alto conteúdo de ferro hepático e níveis plasmáticos de ferro reativo, pode predispor a DVOH, pelo grande estresse oxidativo e depleção de antioxidantes hepáticos. (Kallianpur et al., 2005).
Kallianpur et al. (2005), analisaram o genótipo HFE associado a fatores de risco como uso de vancomicina, regime de condicionamento e diagnóstico, em uma população de 166 pacientes, submetidos a TCTH – 30(18,07%) destes pacientes desenvolveram a DVOH pelos critérios de Baltimore; Daqueles 166 pacientes, 13 eram heterozigotos para HFE C282Y, dos quais cinco (38%) apresentaram DVOH; sete eram homozigotos para esta mutação, apresentando DVOH em 3(43%). Concluindo que pacientes portadores de pelo menos um genótipo mutado do polimorfismo C282Y, predispõe a DVOH como fator independente, sendo que os portadores em homozigose elevam este risco em relação aos heterozigotos.
1.4 Mutação da protrombina
Outro fator genético descoberto em 1980, envolvido na etiologia do tromboembolismo, de herança autossômica dominante, caracterizado pela transição da arginina pela glutamina no nucleotídeo 20210 na região 3’ do gene do fator 2 da coagulação, foi associado ao aumento de protrombina. O aumento da protrombina resulta em formação aumentada de trombina e maior risco de tromboembolismo venoso (TEV). A mutação da protrombina, G20210A, é encontrada em 1-3% de indivíduos da população geral, e em 6-18% de pacientes com tromboembolismo venoso, sendo considerada a segunda anormalidade genética mais freqüente associada ao TEV (Duggan et al., 1999; Bauduer, Lacombe, 2005).
Devido ao excesso de geração de trombina, levando ao estado de hipercoagulabilidade secundário à variação genética, pode haver dano do endotélio vascular hepático e predisposição a DVOH (Duggan et al., 1999; Bauduer, Lacombe, 2005).
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polimorfismo da protrombina em pacientes que desenvolveram DVOH (13%), comparada a incidência da mutação na população geral que é de aproximadamente 1%, sugerindo um aumento do risco de DVOH.
1.5 Fator V Leiden
O fator V é uma molécula que é neutralizada pela proteína C ativada, a qual funciona como enzima proteolítica, digerindo a molécula do fator V em três sítios. A presença da troca de G-A na posição 1691 do gene resulta na substituição de arginina por glutamina na posição do aminoácido 506, ocorrendo resistência à neutralização pela proteína C ativada. Esta mutação está associada a um estado de hipercoagulabilidade e susceptibilidade aumentada para ocorrência de TEV. O fator V de Leiden, como é chamada esta mutação, aumenta o risco de trombose em aproximadamente três a oito vezes em heterozigose e 50 a 100 vezes em homozigose (Akar et al., 1997; Bauduer, Lacombe, 2005).
Esta mutação é altamente prevalente em diversas populações, sendo o defeito genético mais freqüente envolvido na etiologia das trombofilias, podendo ser um fator predisponente a desenvolvimento de DVOH (Bauduer, Lacombe, 2005).
Ertem e Akar (2000), analisando TCTH alogênico em 10 crianças com doenças diferentes, com presença de DVOH em 4 delas, notou-se a presença desta mutação em 3 pacientes. Conclui-se que a mutação do fator V de Leiden pode predispor a DVOH, apesar da pequena casuística estudada.
1.6 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHF)
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(metotrexato, ciclosporina, anticonvulsivantes), sexo, idade e a função tiroideana são importantes determinantes do nível da homocisteína (D'Angelo et al., 2003).
Defeitos genéticos envolvendo a enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), que participa do metabolismo intracelular de homocisteína, resultam em deficiência enzimática e hiperhomocisteinemia. Numerosas mutações na Metilenotetrahidrofolato foram identificadas, mas duas delas merecem citação: MTHFR C677T (em homozigose) é associada à produção de uma proteína termolábil com atividade enzimática reduzida, resultando em hiperhomocisteinemia leve a moderada (Kang et al., 1988); e a mutaçao A1298C (Friedman et al., 1999) que apresenta atividade semelhante, sem contudo induzir a produção de enzima termolábil.
Em uma metanálise (Den Heijer et al., 2005), foram analisados 53 estudos envolvendo 8364 casos, sobre a associação entre o genótipo 677TT da MTHFR e a ocorrência de TEV. O genótipo 677TT associou-se com aumento em 20% no risco (IC95% 8-32), quando comparado ao genótipo 677CC.
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THF: tetrahidrofolato; 5 MTHF: 5-metil-tetrahidrofolato; 5-10 MTHF: 5-10-metileno-tetrahidrofolato (Rodrigues, 2006).
Figura 1. Metabolismo da homocisteína.
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1- Verificar a presença da mutação dos genes da glutationa S-transferase e da metilenotetrahidrofolato redutase e as mutações dos genes da HFE, protrombina e fator V Leiden em pacientes submetidos ao TCTH alogênico, e a eventual associação destes com a DVOH.
2- Avaliar a importância dos fatores genéticos acima citados na gênese e severidade da DVOH.
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3.1 Casuística
Este projeto utilizou amostras de sangue periférico de pacientes submetidos a TCTH, assim distribuídos: 41 pacientes do Hospital São Paulo (HSP) (UNIFESP/EPM), 41 do Hospital Santa Marcelina (HSM) e 38 do Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP-GRAAC), totalizando 120 amostras analisadas. Estas amostras foram obtidas no período pré - TCTH.
Os dados clínicos dos pacientes foram compilados dos arquivos e bancos de dados das unidades de transplante destas instituições. 92 pacientes dispunham de DNA em biblioteca construída no laboratório de Histocompatibilidade da Disciplina de Imunogenética do Departamento de Pediatria da UNIFESP/EPM, onde pacientes e familiares têm seus testes de compatibilidade HLA executados. Esta biblioteca mantém alíquotas de DNA extraídas de células mononucleares de sangue periférico, obtidas no momento da tipagem HLA. A quantidade de DNA empregada em nossos ensaios foi de aproximadamente 80 - 100 nanogramas. Os demais vinte e oito pacientes tiveram suas amostras colhidas antes de iniciar o regime de condicionamento para o TCTH.
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No diagnostico clinico e de severidade da DVOH foram seguidos os critérios adotados por Seattle Modificado (Shulmann, Hinterberger, 1992), como no quadro abaixo, sendo também colocado em destaque critérios utilizados por outros autores, com finalidade comparativa:
Quadro 1. Critérios diagnósticos de DVOH
1 – Critério de Seattle (McDonald et al., 1984).
Desenvolvimento de pelo menos 2 de 3 quadros clínicos apresentados abaixo: 1- Icterícia
2- Hepatomegalia com dor no quadrante superior do hipocôndrio direito. 3- Ascite e ou ganho de peso inexplicado.
2 – Critério de Baltimore (Jones et al., 1987).
Desenvolvimento de hiperbilirrubinemia no soro > 2 mg/dL dentro de 21 dias após o TCTH e pelo menos 2 sinais clínicos e sintomas abaixo:
1. Hepatomegalia dolorosa
2. Ganho de peso superior a 5% do peso de entrada 3. Ascite.
3 – Critérios de Seattle Modificado (Shulman, Hinterberger, 1992).
Desenvolvimento de pelo menos 2 de 3 quadros clínicos dentro de 20 dias após o TCTH: 1. Hiperbilirrubinemia no soro > 2 mg/dL
2. Hepatomegalia com dor no quadrante superior do hipocôndrio direito 3. Ganho de peso > 2% do peso de entrada devido à retenção de líquido.
As características das variáveis analisadas que predispõem ao evento pesquisado, estão descritas abaixo, e sumarizadas na tabela A.
1. Regimes de condicionamento
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1200/m2) (Spitzer et al., 1989); (Cy120mg/Kg + TBI1200 + Flu90mg/m2)(Storb et al., 2001).
1B- Regimes de condicionamento à base de busulfan, constituindo-se nos seguintes condicionamentos: [(Bu16mg/Kg + Cy120mg/Kg) (Copelan et al., 1992), (Bu16mg/Kg + Flu90mg/m2) (Iravani et al., 2007); (Bu 16mg/Kg + Cy150mg/Kg); (Bu16mg/Kg + Cy120mg/Kg + VP16 1200mg/m2) (Spitzer et al., 1989); (Bu16mg/Kg + Mel200mg/m2); (Bu 8mg/Kg + ATG 40mg/Kg + Flu150mg/m2) (Schetelig et al.,2004).
1C- Regimes de condicionamento à base de irradiação corpórea total, aqueles que utilizaram TBI com: [(TBI1200 + Cy120mg/Kg) (Clift et al., 1991; Blaise et al., 1992); (TBI1320 + Cy120mg); (TBI + Mel140mg/m2). Outros protocolos: (Flu90mg/m2 + Mel140mg/m2); (IdaFlag); (Bu8mg/Kg -ATG40mg/Kg + Flu150mg/m2) (Schetelig et al., 2004).
1D- Os seguintes protocolos Cy120mg/Kg + Mel140mg/m2; Cy120mg/Kg + TBI1200; Cy120mg/Kg + Bu16mg/Kg; Cy150mg/Kg + Bu16mg/Kg + VP16-1200/m2 ; Cy120mg + TBI1200 + Flu90mg/m2; Bu16mg/Kg + Cy120mg/Kg; Bu16mg/Kg + Flu90mg/m2; Bu16mg/Kg + Cy150mg/Kg; Bu16mg/Kg + Cy120mg + VP16- 1200mg/m2; Bu16mg/Kg + Mel20mg/m2; TBI1200 + Cy120mg; TBI1320 + Cy120mg/Kg; TBI1200 + Mel140mg/m2 (Bearman et al., 1993) foram considerados como mieloablativos.
1E- Os os protocolos Mel100mg/m2; Flu90mg/m2 +TBI1200; Flu90mg/m2 + Mel140mg/m2; Ida-Flag; Bu8mg/Kg + ATG40mg/Kg + Flu150mg/m2 foram considerados como não-mieloablativos.
2. Uso de NPT(Nutrição parenteral). A indicação de NPT ocorreu nos pacientes com as seguintes condições clínicas: mucosite grau II ou superior, perda ponderal de 10% do peso de entrada, náuseas e vômitos incoercíveis e diarréia persistente.
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4. Alterações de função hepática pré-TCTH. A alteração de TGP e TGO foi considerada como variável de risco para toxicidade e DVOH (Jones et al.,1987; McDonald et al., 1993; Kami et al.,1997).
5. O uso da vancomicina pré-TCTH e intra-TCTH (McDonald et al., 1993).
6. As doenças foram agrupadas em: A – Leucose Aguda. B – Doenças Mieloproliferativas Crônicas, C – Doenças Linfoproliferativas Crônicas. D – Falência Medular.
As variáveis acima citadas, a associação entre elas e os polimorfismos foram analisados como fatores de risco para DVOH.
Tabela A. Caracteristicas clínicas do estudo.
Características Frequência (%) Valor p
Centro de Transplante
HSP 1-41(34%)
CSSM 2- 41(34%)
IOP-GRAAC 3- 38(32%)
Idade
Minimo 2 anos
Máximo 69 anos
Média 28,5 anos
Sexo Masculino 62(52%) p = 0,16
Feminino 58(48%)
Diagnosticos
Leucose Aguda 58(48%)
Doenças Mieloproliferativas Crônicas 30(25%)
Doenças Linfoproliferativas Crônicas 21(18%)
Falências Medulares. 11(9%)
Regimes de Condicionamento
contendo:
Bussulfan (Sim/Não) 67/53(56%/44%) p = 0,17
Ciclofosfamida (Sim/Não) 92/28(77%/23%) p = 0,17
Irradiação corpórea total (Sim/Não) 37/83(31%/69%) p = 0,85
Tipo de TCTH Mieloablativo 91(76%) p = 0,41
Não Mieloablativo 29(24%)
NPT Sim 43(26,7%) p = 0,11
Não 76(63,3%)
Vancomicina Sim 65(54%) p = 0,19
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CMV receptor Positivo 102(86%) p = 0,63
negativo 17(14%)
TGO/TGP/FA/GGT/Ferritina Elevada 1 – 12
Normais 2 – 108
O trabalho foi aprovado pelos Comitês de Ética das Instituições participantes (Anexo 1). Os pacientes em seguimento após o transplante assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).
3.2 Metodologia
3.2.1 Extração e amplificação de DNA
O DNA foi extraído através do método DTAB/CTAB (dodecyl trimethyl-ammonium bromide/cetyl trimethyl –ammonium bromide) de acordo com Gustincich et al. (1991).
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A concentração final do DNA foi de aproximadamente 100 ng/l e foi medida através de um espectrofotômetro (UltroSpec III, Pharmacia Biothech, Uppsala, Suécia) por meio da leitura das absorbâncias a 260, 280 e 320 nm. A pureza do DNA foi determinada pela razão (A260/A280), que esteve entre 1,65 e 1,80 (Gustincich et al., 1991).
3.2.2 Identificação da presença do polimorfismo
A partir do DNA extraído, foram utilizadas diferentes estratégias diagnósticas, a partir da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), para análise dos polimorfismos dos genes HFE, Fator V, Protrombina, Glutathiona-S Transferase (GST) e Metilenotetrahidrofolato-redutase (MTHFR). Em todas as amplificações utilizou-se termociclador Gene Amp/PCR System 9700 (Applied Biosystems).
3.2.3 Glutationa-S Transferase (GST)
Os genes da GST mu e teta, (GST- μ e GST- θ) respectivamente, foram amplificados por PCR multiplex (Wilson et al., 2000). O polimorfismo do gene GST π, foi identificado pela PCR seguido de digestão com enzima específica (Lu et al., 2006).
Para identificação do polimorfismo dos genes GST- μ e GST- θ foram utilizados primers específicos além de primers para o gene da globina beta que serviu como controle interno da reação, conforme descrito na Quadro 2.
Quadro 2. Seqüência de primers utilizados para amplificação dos genes GST-μ e GST-θ, seu sentido e tamanho do produto obtido.
Primer Seqüência Tamanho
GST-μ
GST μ (sense) 5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3' 215 pb
GST μ (antisense) 5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG 3'
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GST θ (sense) 5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 3' 480 pb
GST θ (antisense) 5' TCACCGGATCATGGCCAGCA 3'
-globina
H5 (sense) 5’ – GAAGAGCCAAGGACAGGTAC – 3´ 268 pb
H6 (antisense) 5’ – CAACTTCATCCACGTTCACC –3’
Esta reação foi feita para um volume final de 50l utilizando-se 0,2mM de cada DNTP; 10pmol de cada primer; 2,5mM de MgCl2; 100ng DNA genômico e 1,25U de Taq Polimerase (DNA polimerase termo estável, Invitrogen). Após desnaturação inicial de 2 minutos a 95ºC, foram realizados 40 ciclos assim determinados: desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 58°C por 1 minuto, e extensão a 72°C por 1 minuto. Após o ultimo ciclo, a mistura foi incubada em 72°C por 10 minutos.
Os produtos da reação foram observados em gel de agarose 2% em tampão TEB 1X por 1 hora a 80 volts sob coloração com brometo etídio para visualização sob iluminação ultravioleta. O resultado mostrou sempre a presença do fragmento da -globina de 268pb (controle interno da reação). Na presença de indivíduo normal para os genes GST- μ e GST- θ, observou-se também os fragmentos de 215 e 480pb. Já nos pacientes GST- μ nulo, somente o fragmento de 480pb pode ser visto, enquanto que naqueles GST- θ nulo foi visualizado apenas o fragmento de 215pb. Indivíduos negativos para ambos os genes apresentaram somente o controle interno (Quadro 3).
Quadro 3. Análise dos resultados da PCR multiplex para diagnóstico de polimorfismo dos genes GST-μ e GST-θ
Resultado GST- μ GST- θ -globina
Indivíduo normal 215pb 480pb 268pb
GST- μ nulo - - 480pb 268pb
GST- θ nulo 215pb - - 268pb
GST- μ e θ nulo - - - - 268pb
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Para pesquisa do polimrofismo da GST-π foi utilizada a PCR seguida por digestão do seu produto com enzima específica. No Quadro 4 estão relacionadas as seqüências dos primers, seu sentido e o tamanho do produto de amplificação obtido.
Quadro 4. Seqüência de primers utilizados para amplificação da GST- π, seu sentido e tamanho do produto obtido.
Primer Seqüência Tamanho
GST π (sense) 5’ – GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG – 3´
433 pb GST π (antisense) 5’ – AGCCACCTGAGGGGTAAG –3’
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3.2.3.1 Digestão do DNA amplificado pela enzima de restrição
Para identificação da mutação utilizou-se a enzima BsmAI nas seguintes condições: para cada reação foram utilizados Tampão 1x, 3,0mM MgCl2, 0,25mM de DNTPs (Trifosfato de Deoxiribonucleotideos), 0,3mM de Primer Sense, 0,3 mM de Primer Antisense e 1,5U de Taq Polimerase para um volume total de 25ul.(Invitrogem). As condições da PCR foram 94ºC por 5min de desnaturação inicial, seguidos por 5 ciclos onde a temperatura de anelamento decresceu em 1ºC a cada ciclo (1 ciclo: 30s a 94ºC, 30s a 64ºC, 30s a 72ºC), em seguida foram 25 ciclos de 94ºC por 30s, 59ºC por 30s, 72ºC por 30s e uma extensão final de 72ºC por 5min. Dez microlitos de produto da PCR (433pb) foram digeridos em 5 unidades da enzima de restrição BsmAI (Fermentas) a 37ºC, “overnight” em termomixer (Eppendorf); os produtos da digestão, listados no Quadro 5, foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2% nas mesmas condições descritas anteriormente.
Quadro 5. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação do polimorfismo do gene GST- π e fragmentos obtidos após digestão.
Mutação Enzima de Restrição Fragmentos (pb)
GST- π BsmA I
Normal Homozigoto Heterozigoto
328 e 105pb 222, 106 e 105pb 328, 222, 106 e 105pb
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Figura 2. PCR GST π.
O indivíduo 25 apresenta as bandas de 222, 106 e 105 pb definido como GG (mutado); os indivíduos 27 e 29 apresentam as bandas de 328, 222, 106 e 105pb definidos como AG (heterozigotos), enquanto que os demais apresentam as bandas de 328 e 105pb, considerados AA (não mutados).
Figura 3. PCR GST μ e θ.
Os indivíduos 126, 130, 131, 145, 150 e 155 apresentam fragmentos de 215pb (GST μ), 268pb
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3.2.4 Gene HFE
Para análise das mutações C292Y, H63D e S65C do gene HFE foi utilizada a amplificação de regiões específicas do gene HFE por PCR seguida de digestão enzimática dos sítios de mutação. A reação de PCR foi feita utilizando-se primers específicos (Simonsen et al., 1999; Feder et al., 1996) conforme relacionado no Quadro 6:
Quadro 6. Relação dos primers, sentido e tamanho do produto da PCR para as mutações C282Y, H63D e S65C do gene HFE
Primer Seqüência Tamanho
Mutação C282Y (Simonsen et al., 1999; Feder et al., 1996)
Cys-F6 (sense) 5´-TGCCTCCTTTGGTGAAGGTGACAC-3´ 343 pb
Cys-R5 (antisense) 5´-CTCAGGCACTCCTCTCAACC-3´
Mutações H63D e S65C (Simonsen et al., 1999)
His-F1 (sense) 5´-TCACACTCTCTGCAGTACCTCTTCATGG-3` 224 pb
His-R4 (antisense) 5´-TACACAGTGAACATGTGATCCCACC-3´
Para amplificação do fragmento que contem a mutação C282Y foram utilizados os primers Cys-F6/Cys-R5 (Simonsen et al., 1999; Feder et al., 1996). Nesta reação, feita para um volume final de 25l, utilizou-se 0,2mM de cada DNTP (deoxinucleotídeo); 10pM de cada primer; 2,5mM de MgCl2; 250ng DNA genômico e 0,675U de Taq Polimerase (DNA polimerase termo estável, Invitrogen). A reação consistiu de 35 ciclos assim determinados: desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 67°C por 30 segundos, e extensão a 72°C por 30 segundos. Após o ultimo ciclo, a mistura foi incubada em 72°C por 5 minutos. O fragmento obtido apresentava tamanho correspondente a 343pb (pares de base).
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MgCl2; 500ng DNA genômico e 1,25U de Taq Polimerase (Invitrogen). A mistura foi submetida às mesmas condições de amplificação descritas à cima, sendo observados um produto de amplificação equivalente a 224 pb.
Os produtos da reação foram observados em gel de agarose 2% em tampão TEB (tris-EDTA-botato) 1X por 1 hora a 80 volts sob coloração com brometo etídio para visualização sob iluminação ultravioleta.
3.2.4.1 Digestão do DNA amplificado pelas enzimas de restrição
As enzimas de restrição utilizadas são especificas para confirmação de cada mutação, conforme observado no Quadro 7.
Quadro 7. Mutação do gene HFE analisada, localização, enzima de restrição utilizada e seqüência de clivagem específica.
Mutação Localização Enzima de restrição Clivagem
C282Y Exon 4 Rsa I GTAC
H63D Exon 2 Dpn II GATC
S65C Exon 2 Hinf I GAnTC
Para a mutação C282Y foi utilizada a enzima Rsa I (Gibco-BRL ou New England Biolab) do seguinte modo: 10l do produto da PCR, 1l da enzima, 2l do tampão correspondente para um volume final de 20l. Esta mistura foi incubada por 4 horas a 37C. O produto da digestão foi visualizado, por luz ultravioleta, após eletroforese em gel de agarose a 2% com tampão TEB 1X por 1 hora e 30 minutos a 80 volts com brometo de etídeo. A identificação do indivíduo sem mutação, do heterozigoto e do homozigoto mutante foi feita segundo número de fragmentos obtidos após digestão conforme listado no Quadro 8.
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2l do tampão correspondente para um volume final de 20l. A incubação foi de 18hs a 37ºC e os produtos da digestão, listados no Quadro 8, foram visualizados sob luz ultravioleta após corrida em gel de agarose a 2% conforme descrito acima.
Para a mutação S65C, utilizou-se a enzima Hinf I (Gibco-BRL ou New England Biolab) conforme descrito: 5l do produto da PCR, 1l da enzima e 1l do tampão correspondente para um volume final de 10l. Após incubação a 37°C durante aproximadamente 18 horas, os produtos da digestão, listados no Quadro 8, foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2% nas mesmas condições descritas anteriormente.
Quadro 8. Fragmentos obtidos após digestão do produto de PCR e seu significado.
Enzima de Restrição
Fragmentos obtidos após digestão (pb)
Normal Homozigoto Heterozigoto
Rsa I 203 e 140 203, 111 e 29 203, 140, 111 e 29
Dpn II 118 e 105 224 224, 118 e 105
Hinf I 112 e 69 181 181, 112 e 69
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Figura 4. PCR e Digestão C282Y.
Os indivíduos 31, 32 e 33 represetam o produto da reação de PCR – banda de 343pb. Os indivíduos 31d e 32d representam o produto da digestão do PCR com a enzima RSAI, as bandas de 140 e 203pb indicam indivíduos normais. Não foram indentificados indivíduos heterozigotos e homozigotos (mutados).
Figura 5. Produtos da digestão do polimorfismo HFE H63D com a enzima de restrição Dpnll ou Mbol (Ferramentas).
O indivíduo 205 apresenta as bandas de 105, 118 e 223pb caracterizando heterozigoto mutado; os demais indivíduos são normais.
200 150 100
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Figura 6. Produto da Digestão do polimotfismo HFE S65C com a enzima de restrição HinfI. Os indivíduos 36 e 38 apresentam as bandas de 69 e 112pb, sendo portanto normais e os indivíduos 190, 201 e 205 apresentam as bandas de 69, 112 e 181pb, caracterizados como heterozigotos mutados. Não foram detectados indivíduos homozigotos mutados.
3.2.5 Mutação da protrombina 20210G→A e Fator V Leiden G1691A
As mutações da protrombina G20210A e FVL foram avaliadas simultaneamente pela técnica de multiplex utilizando-se amplificação por reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR) descrita por Gómez et al. (1998).
Para cada reação de multiplex foram utilizados Tampão 1x, 1,5mM MgCl2, 0,2mM de DNTPs (Trifosfato de Deoxiribonucleotideos), 20pmol de cada Primer Sense, 20pmol de cada Primer Antisense e 2,5U de Taq Polimerase para um volume de 50ul. As condições da PCR foram 94ºC por 05min de desnaturação inicial, seguidos por 30 ciclos com desnaturação a 94ºC por 45s, anelamento de 45s a 57ºC, e 1min a 72ºC de extensão, seguida por 72ºC por 5min de extensão final.
O produto da PCR de 345pb (G20210A) e 220pb (FVL) foi digerido a 37ºC/overnight com 2,5U da enzima Hind III e 2,5 U de Mnl I, respectivamente específicos para G20210A e FVL.
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mutação. O produto de 220pb após a digestão apresentou 3 fragmentos de 116, 67, e 37pb na ausência da mutação e 153 e 67pb, na presença do FVL.
Os produtos das digestões foram separados em gel de agarose low melting point a 2%, corado com brometo de etidio. Foi usando um marcador de peso molecular de 50pb.
Quadro 9. Características mutação Protrombina (G20210A) e FVLeiden.
Mutação Enzima de restrição
Fragmentos (pb)
PCR Normal Homozigoto Heterozigoto
G20210A Hind III 345 272, 73 249, 73,23 272, 249, 73, 23
FVL Mnl I 220 116, 67, 37 153, 67 153, 116, 67, 37
Figura 7. Produto do PCR Multiplex para o Gene da Protombina.
O indivíduo 89 apresenta as bandas de 272, 116, 73/67, 37pb, caracterizando ausência de mutação; o indivíduo 107 apresenta as bandas de 272, 249, 116, 73/67, 37/23pb, caracterizando um heterozigoto mutado.
50 100 150 200 250 300 350 89 107
58
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Figura 8. Produto do PCR multiplex para o Gene do Fator V de Leiden.
O indivíduo 130 apresenta as bandas de 272, 116, 73/67, 37pb, caracterizando ausência de mutação; o indivíduo 153 apresenta as bandas de 272, 153, 116, 73/67, 37pb, caracterizando um heterozigoto mutado.
3.2.6 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)
A pesquisa da mutação C677T da MTHFR foi realizada pela PCR seguida por digestão do produto da PCR com enzima específica segundo Frosst e cols. (1995) e Friedman e cols.(1999) (Quadro 10).
Quadro 10. Seqüência de primers utilizados para amplificação da MTHFR, seu sentido e tamanho do produto obtido.
Primer Seqüência Tamanho
MTHFR1 (sense) 5’ – TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA –3’
198 pb
MTHFR1 (antisense) 5’ – AGGACGGTGGCGGTGAGAGTG –3’
5 6
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Para esta amplificação foram utilizados os primers MTHFR1. Nesta reação, feita para um volume final de 50l, utilizou-se 0,2mM de cada DNTP; 10pM de cada primer; 1mM de MgCl2; 100ng DNA genômico e 2,5U de Taq Polimerase (Invitrogen). A reação consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos, seguida de 30 ciclos: desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, e extensão a 72°C por 30 segundos, além de extensão final a 72ºC por 5 minutos. O fragmento obtido apresentava tamanho correspondente a 198pb.
Os produtos da reação foram observados em gel de agarose 2% em tampão TEB 1X por 1 hora a 80 volts sob coloração com brometo etídio para visualização sob iluminação ultravioleta.
3.2.6.1 Digestão do DNA amplificado pela enzima de restrição
Para identificação do Fator V Leiden utilizou-se a enzima Hinf I nas seguintes condições: 5L do produto da PCR, 2,5U da enzima e 1L de tampão para um volume final de 10L. Após incubação a 37°C durante aproximadamente 18 horas, os produtos da digestão, listados no Quadro 11, foram separados por eletroforese em gel de agarose low melting a 2% nas mesmas condições descritas anteriormente (Frosst et al., 1995; Friedman et al., 1999).
Quadro 11. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação da mutação C677T da MTHFR e fragmentos obtidos após digestão.
Mutação Enzima de Restrição Fragmentos (pb)
MTHFR
(C677T) Hinf I(GANTC)
Normal Homozigoto Heterozigoto
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Figura 9. Produto da digestão com a enzima de restrição Hinfl do PCR do Polimorfismo MTHFR C677T.
Os indivíduos 38, 39 e 40 apresentam a banda de 198pb caracterizando normais; os indivíduos 44, 45 e 131 apresentam as bandas de 175 e 198pb caracterizando heterozigotos mutados.
3.3 Análise estatística
Os dados e as características clínicas foram comparados empregando-se os testes exatos de Fisher, utilizando análise univariada. Esse procedimento visou à obtenção de indicações do comportamento dos dados e ao enriquecimento das conclusões que foram tomadas ao final da análise. Assim, em cada seção, foram construídas tabelas de freqüências que mostram as distribuições conjuntas de interesse. Nas tabelas de resultados, aparecem com destaque as associações detectadas na amostra. Foram considerados significantes, os valores de p<0,05.
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4.1 Estudo dos polimorfismos
4.1.1 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados ao
Bussulfan
Foram analisados 102 pacientes, sendo que 55(53,9%) receberam condicionamento com busulfan, destes 36 (65,4%) foram normais para a mutação
GST - e 19 (34,6%) foram nulos. De 47 pacientes que receberam outros condicionamentos que não incluíram Bu, 27 (57,4%) foram normais e 20 (42,6%) nulos (p=0,661).
Tabela 1. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento - BU.
GST -
Condicionamento - BU
Total
Não Sim
Normal 27 36 63
Nulo 20 19 39
Total 47 55 102
4.1.2 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados a
ciclofosfamida
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Tabela 2. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento - CY.
GST -
Condicionamento – CY
Total
Não Sim
Normal 15 48 63
Nulo 12 27 39
Total 27 75 102
4.1.3 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados a TBI
Dezoito de 31 (58,06%) pacientes que receberam TBI foram normais para GST - e 13 (41,9%) nulos; 45 de 71 (63,4%) que não receberam foram normais e 26 (36,6%) nulos. (p=0,492).
Tabela 3. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento - TBI.
GST - Condicionamento – TBI Total
Não Sim
Normal 45 18 63
Nulo 26 13 39
Total 71 31 102
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4.1.4 Polimorfismo da GST - e condicionamentos Mieloablativos e
Não-mieloablativos
Apenas 11 de 102 pacientes receberam condicionamentos não-mieloablativos, destes 6 (54,5%) mostraram-se com GST - normal e 5 (46,5%) nulos. Dos pacientes que receberam condicionamentos mieloablativos, 57 (62,6%) de 91 foram normais e 34 (37,3%) nulos. A avaliação da toxicidade desencadeada pela normalidade do gene GST - ficou prejudicada pelo número baixo de pacientes que receberam condicionamentos não-mieloablativos (p- 0,745).
Tabela 4. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Tipo de condicionamento.
GST -
Tipo de condicionamento
Total Mieloablativo Não Mieloablativo
Normal 57 6 63
Nulo 34 5 39
Total 91 11 102
4.1.5 Polimorfismo da GST - e uso de nutrição parenteral total
Foram analisados 38 (37,1%) pacientes que receberam NPT de um total de 101 casos; destes, 25 (65,7%) foram normais para a mutação GST - e 13 (34,2%) foram nulos. De 63 (62,3%) pacientes que não receberam NPT, 38 (60,3%) foram normais e 25 (39,6%) nulos (p=0,673)
Tabela 5. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e NPT.
GST - NPT Total
Não Sim
Normal 38 25 63
Nulo 25 13 38
