Desenvolvimento e caracterização físico-química de sistemas líquido cristalinos contendo palmitato de retinol: quantificação química, avaliação da atividade antioxidante, estudos de liberação e bioadesão in vitro

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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEPARTAMENTO DE FÁRMACOS E MEDICAMENTOS

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE

SISTEMAS LÍQUIDO CRISTALINOS CONTENDO PALMITATO DE

RETINOL: QUANTIFICAÇÃO QUÍMICA, AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE, ESTUDOS DE LIBERAÇÃO E BIOADESÃO IN VITRO

PAULA LACERDA OLIVEIRA

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEPARTAMENTO DE FÁRMACOS E MEDICAMENTOS

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE

SISTEMAS LÍQUIDO CRISTALINOS CONTENDO PALMITATO DE

RETINOL: QUANTIFICAÇÃO QUÍMICA, AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE, ESTUDOS DE LIBERAÇÃO E BIOADESÃO IN VITRO

PAULA LACERDA OLIVEIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Prof. Dr. Maria Virgínia Scarpa Co-orientador: Prof. Dr. Marlus Chorilli

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Folha de Aprovação

Presidente e Orientador - Prof. Dr. Maria Virgínia Scarpa

Co-Orientador – Prof. Dr. Marlus Chorilli

1º Examinador – Prof. Dr. Eneida de Paula

2º Examinador – Prof. Dr. Sandra Helena Pulcinelli

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Dedicatória

D

Dedico este trabalho e todas as etapas da minha vida à:

Deus, meu Senhor e Criador, que sempre me deu forças para seguir o seu caminho, ainda que muitas vezes eu não entendesse o próposito d’Ele para mim.

“As pessoas podem fazer seus planos, porém é o Senhor Deus quem dá a última palavra (Provérbios 16.1).”

Aos meus pais CCláudio e SSílvia por inúmeros motivos ... pelo grande amor e carinho que me deram, pela educação e princípios de vida e inclusive pelo grande esforço em me proporcionarem os estudos.

Aos meus irmãos MMário e CCaio que sempre estiveram muito presentes na minha vida, desde a nossa infância muito feliz.

À minha querida aavó Vera que sempre foi e é uma boa lembrança de doçura que tenho no meu coração. Ao meu avô Kléber “in memorian” pelas boas lembranças que tenho da minha tenra infância na sua companhia.

Aos meus tios RRenata, MMárcia, SSérgio, JJohn, CCésar e SStela por todos os bons momentos que passamos juntos.

Aos meus queridos primos que os guardo no coração pelo grande amor que há entre nós: MMaurício, MMarina, Fernando, TThiago, MMurilo, SSabrina, SSerginho e AAlexandre.

Ao meu querido namorado RRafael, um pessoal tão querida e que tanto eu admiro, chegou trazendo imensas alegrias e a certeza de Deus na minha vida. Sentirei muitas saudades dos momentos muito felizes e

descontraídos que tivemos em Araraquara.

E às minhas mais que amigas, às “irmãzinhas”, JJemima, RRenata e TThais que foram a família que Deus me deu enquanto eu estive em Araraquara. E com muito carinho à querida JJemima pela grande irmã, amiga e

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Agradecimentos

Tenho especial agradecimento à minha orientadora pprof. Dr. Maria Virgínia Scarpa pela oportunidade de realizar este trabalho e pela oportunidade de amadurecimento pessoal e profissional que me trouxe durante os anos em que eu estive na sua companhia.

Ao meu co-orientador pprof. Dr. Marlus Chorilli que vem me acompanhando na minha vida acadêmica e científica desde a minha época de graduação. Agradeço muito seu carinho, atenção e colaboração!

À todos os professores e funcionários que de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho. Em especial, aos pprof. Dr. Marcos Antônio Corrêa e pprof. Dr. Wagner Villegas pela disponibilização de matérias-primas e aos pprof. DDr. Anselmo Gomes de Oliveira, DDr. Iguatemy Lourenço Brunetti, DDr. Maria Palmira Daflon Gremião e DDr. Vera Lúcia Borges Isaac pela disponibilização de uso dos equipamentos em seus laboratórios. E também com especial agradecimento aos funcionários MMaria de Fátima, MMargarete, AAngélica, Giovani, Dudu, Matheus, Osmar, Ilza e Marcos pela atenção e ajuda que sempre prestaram.

Ao pprof. Dr. José Paschoal Batistutti pelo auxílio que me deu em alguns cálculos referentes à validação analítica efetuada neste trabalho.

Aos pprof. Dr. Marcos Antônio Côrrea e DDr. Leila Aparecida Chiavacci pelas valiosas sugestões no meu exame geral de Qualificação, que muito colaboraram para o amadurecimento de idéias deste trabalho. Às prof. DDr. Eneida de Paula e DDr. Sandra Helena Pulcinelli pela grande contribuição na lapidação final do trabalho.

À empresa DDow Corning do Brasil®_{que gentilmente forneceu os silicones utilizados neste trabalho. Ao}_CNPQ

pela bolsa financeira de estudos concedida.

Aos estagiários BBete e DDaniel pela colaboração, sempre com muita dedicação, que prestaram na realização de algumas etapas deste trabalho. Às colegas de mestrado VVanessa e VVânia que colaboraram na realização dos testes de atividade antioxidante in vitro, em especial, à Vânia pelo nosso reencontro no laboratório depois de termos morado juntas.

Aos colegas de trabalho pela oportunidade de levar um “pedacinho” da contribuição de cada um de vocês na minha vida: FFlávia Ribeiro, EEliete, FFlávia Chiva, FFlávia Fiorentino, LLucélia, RRudy, CCris Laignier, SSílvio, JJosi, Gisela, FFernanda, BBruna, AAna Paula, JJuliana,GGuilherme Emerick, GGrazi, PPatrícia, LLetícia, JJack, Geysi, BBruna, Márcia, JJu e EElô.

Ao meu querido RRafael pelas vezes que me buscou tão tarde da noite na faculdade, sempre com muita alegria, boa vontade e disposição. Te amo tanto, meu Amor !!!

Aos funcionários da Biblioteca que sempre prestaram seus serviços com muito carinho e dedicação: AAna, RRita, Max, CCamila e MMoacir. Às funcionárias CCláudia, LLaura, SSônia e ÂÂngela, da seção de Pós-Graduação, pela competência que sempre realizaram seu trabalho. E aos funcionários da portaria da Unesp (OOlívia, CChico e

(7)

Epígrafe

“ Quando estiver em dificuldade

E pensar em desistir,

Lembre-se dos obstáculos

Que já superou.

OLHE PARA TRÁS.

Se tropeçar e cair,

levante,

Não fique prostrado,

Esqueça o passado.

OLHE PARA FRENTE.

Ao sentir-se orgulhoso,

Por alguma realização pessoal,

Sonde suas motivações.

OLHE PARA DENTRO.

Antes que o egoísmo o domine,

Enquanto seu coração é sensível,

Socorra aos que o cercam.

OLHE PARA OS LADOS.

Na escalada rumo às altas posições

No afã de concretizar seus sonhos,

Observe se não está pisando em alguém

OLHE PARA BAIXO.

Em todos os momentos da vida,

Seja qual for sua atividade,

Busque a aprovação de Deus!

OLHE PARA CIMA.

Nunca se afaste de seus sonhos,

pois se eles se forem,

você continuará vivendo,

mas terá deixado de existir. “

Charles Chaplin (1889-1977)

Ó Senhor Deus, eu te agradeço de todo

o coração; diante de todos os deuses eu canto

hinos de louvor a ti. Por causa do teu amor e da

tua fidelidade, eu me ajoelho virado para o teu

santo Templo e dou graças a ti. Pois tens

mostrado que o teu nome e as tuas promessas

estão acima de tudo. Quando te chamei, tu me

respondeste e, com o teu poder, aumentaste as

minhas forças.

Ó Senhor Deus, todos os reis da terra te

louvarão quando ouvirem falar das tuas

promessas. Eles cantarão a respeito das coisas

que tu, ó Senhor, tens feito, pois grande é a tua

glória. Tu estás lá nas alturas, mas assim

mesmo te interessas pelos humildes, e os

orgulhosos não podem se esconder de ti.

Quando estou cercado de perigos, tu me

dás segurança. A tua força me protege do ódio

dos meus inimigos; tu me salvas pelo teu poder.

Tu cumprirás tudo o que me prometeste. O teu

amor dura para sempre, ó Senhor Deus. Não

abandones o trabalho que começaste.

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RESUMO

As hipóteses mais modernas baseiam o processo de envelhecimento cutâneo em duas teorias: o intrínseco (ou cronológico) e o extrínseco (ou fotoenvelhecimento). Tanto no envelhecimento intrínseco como no extrínseco, as principais alterações da pele são caracterizadas por formação de rugas, flacidez e perda da elasticidade. O palmitato de retinol (PR) é um análogo sintético da vitamina A indicado topicamente para prevenir ou retardar algumas mudanças estruturais e funcionais da pele associadas ao processo de envelhecimento cutâneo, porém é um princípio ativo que apresenta estabilidade química limitada frente à umidade, oxigênio, ácidos, metais e exposição à luz. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema líquido-cristalino à base de silicone para a liberação prolongada e maximização da estabilidade do palmitato de retinol. Utilizando-se o método de titulação da fase aquosa, foram construídos dois diagramas ternários de fases, ambos constituídos por Procetyl AWS®_{(tensoativo) e água e por silicone DC 5330}®_{(fase oleosa no}

diagrama 1) ou silicone DC 5329®_{(fase oleosa no diagrama 2). Nos estudos de estabilidade}

preliminar, as formulações do diagrama 1 (A, B, C e D) e do diagrama 2 (E, F, G e H) foram avaliadas nos seguintes estudos: microscopia de luz polarizada, centrifugação, pH, condutividade eletrolítica, índice de refração e reologia. Dentre estas formulações estudas preliminarmente, a formulação GPR foi selecionada para ser conduzida aos estudos posteriores após a incorporação de

1% do princípio ativo, pois demonstrou a formação de fases líquido-cristalinas evidenciadas sob luz polarizada no microscópio óptico, apresentou-se compatível com o pH fisiológico da pele, apresentou pequeno coeficiente de variação das medidas realizadas referentes aos parâmetros físico-químicos e menor capacidade de desestruturar a bicamada lipídica da pele em função de possuir menor concentração de tensoativo. A metodologia analítica validada para a quantificação química do palmitato de retinol acrescido na formulação GPR demonstrou que o prazo de validade do produto

esteve compreendido entre 135 e 150 dias à 5,0 ± 2,0ºC e 25,0 ± 2,0ºC e entre 7 e 15 dias à 40,0 ± 2,0ºC. Com a realização do estudo da atividade antioxidante e do perfil de liberação in vitro, verificou-se que a formulação GPR também foi capaz em aumentar a estabilidade funcional e

prolongar a liberação do palmitato de retinol. O estudo de bioadesão in vitro no analisador de texturas em associação com o método reológico oscilatório elucidou de modo conclusivo que a maior capacidade de fixação das formulações testadas à pele do modelo animal utilizado esteve diretamente relacionado com o predomínio do comportamento elástico (G’) em tais formulações.

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ABSTRACT

Current hypotheses based on the process of skin aging in two theories: the intrinsic (or chronological) and extrinsic (or photoaging). Both in the extrinsic as intrinsic aging, the main skin disorders are characterized by wrinkles, flaccidity and loss of elasticity. Retinyl palmitate (RP) is a synthetic analogue of vitamin A given topically to prevent or delay some structural and functional changes of the skin associated with aging, but is an active principle that has limited chemical stability against moisture, oxygen, acids , metals and exposure to light. Thus, the aim of this study was to develop liquid crystalline system silicon-based for extended release and maximizing the stability of retinyl palmitate in order to optimize the use of topically active principle in the prevention and / or mitigation of aging skin. Using the method of titration of the aqueous phase, was built two ternary phase diagrams, both consist of Procetyl AWS ® (surfactant) and water and silicone DC 5330 ® (oil phase diagram 1) or silicone DC 5329 ® (phase oil in diagram 2). In preliminary studies of stability, the formulations of the diagram 1 (A, B, C and D) and the formulations of the diagram 2 (E, F, G and H) were evaluated in the following studies: polarized light microscopy, centrifugation, pH, electrolitic conductivity, refraction index and rheology. Among these formulations studied preliminarily, the formulation G RP-loaded was selected to be conducted to further studies, since it showed the formation of liquid crystalline phases evidenced by polarized light in an optical microscope, presented consistent with the physiological pH of skin, had a small coefficient of variation of measurements related to the physicochemical and less ability to disrupt the lipid bilayer of the skin due to have a lower concentration of surfactant. The validated analytical methodology for chemical quantification of retinyl palmitate loaded in the formulation G liquid-crystalline, which demonstrated the validity of the product was between 135 and 150 days to 5.0 ± 2.0 ° C and at 25, 0 ± 2.0 ° C and between 7 and 15 days to 40.0 ± 2.0 ° C. With the implementation of the study of antioxidant activity and the release profile in vitro, it was noted that the formulation GPR was also

able to increase the functional stability and prolong the release of retinyl palmitate. The study of bioadhesion in vitro in texture analyzer in combination with the oscillatory rheological method elucidated conclusively that the greatest binding capacity of test preparations to the skin of the

animal model used was directly related to the predominance of elastic behavior (G’) in such

formulations.

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LISTA DE ABREVIATURAS

A = área;

AA = atividade antioxidante;

Abs = absorbância;

ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária; A/O = água em óleo;

C934P = carbopol 934P; C940 = carbopol 940;

CE = condutividade eletrolítica;

CMCNa = carboximetilcelulose sódica; CMC = concentração micelar crítica; CV = coeficiente de variação; DPPH = 2,2-difenil-1-picril-hidrazila; DNA = ácido desoxirribonucléico;

DP = desvio padrão;

EHL = equilíbrio hidrófilo-lipófilo;

EO = oxietilênicas;

F = força;

Fr = fator de recuperação; IL-10 = interleucina-10;

INCI = do inglês, International Nomenclature of Cosmetic Ingredients;

INMETRO = Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial; IR = índice de refração;

MMP-1 = metaloproteínase-1 da matriz; O/A = óleo em água;

OECD = do inglês, Organization for Economic Co-Operation and Development; PBS = tampão fosfato de sódio (abreviatura em inglês, Phosphate buffered saline) PCA = 2-pirrolidona-5-ácido carboxílico;

pH = potencial hidrogeniônico;

PO = oxipropilênicas;

p/p = peso / peso;

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RE = Resolução; rpm = rotações por minuto;

SCCL = do inglês, Stratum Corneum Cathepsin L-like protease;

SF = separação de fases;

SLO = sistema líquido opaco; SLT = sistema líquido transparente; SST = sistema semitransparente; SVO = sistema viscoso opaco; SVT = sistema viscoso transparente; TNF-α = fator alfa de necrose tumoral; TEA = teste de estabilidade acelerada; TEP = teste de estabilidade preliminar; UI = unidades internacionais;

UV = ultravioleta;

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LISTA DE SÍMBOLOS, UNIDADES E GRANDEZAS

Símbolos

dy = altura da camada molecular tan δ = ângulo de fase;

o_C _{= graus Celsius;}

k = coeficiente de consistência;

k = constante da velocidade de liberação; [ ] = concentração;

r2 = coeficiente de correlação linear;

λ = comprimento de onda;

λmáx. = comprimento de onda de máxima absorção;

ςrelativa = densidade relativa;

G = energia livre de Gibbs;

Гi =excesso superficial positivo; Lα = fase líquido cristalina lamelar;

HI = fase líquido cristalina hexagonal normal;

HII = fase líquido cristalina hexagonal reversa;

Q = fase líquido cristalina cúbica; n = índice de escoamento;

® = marca registrada;

m = massa;

| | = módulo;

G’ = módulo de armazenamento, ou elástico;

G” = módulo de perda, ou viscoso; ± = mais ou menos;

% = porcentagem;

Qreal = quantidade da substância ativa liberada em μg/mL;

Q = quantidade da substância ativa liberada em μg/cm2; sen î = seno do ângulo de incidência;

senȓ = seno do ângulo de refração;

Σ = somatória;

γ = taxa de cisalhamento;

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t = tempo;

tA = tempo da estabilidade acelerada;

tP = tempo da estabilidade preliminar;

t0 = tempo experimental;

tr = tempo de relaxamento da tensão;

∆G = variação da energia livre de Gibbs;

∆H = variação de entalpia;

∆S = variação de entropia;

dv = velocidade de deslocamento;

η = viscosidade;

V = volume;

Unidades

Hz = hertz;

cm = centímetro;

cm2 _{= centímetro quadrado;}

μg = micrograma;

mg = miligrama

M = molar;

m = metro;

m2 = metro quadrado; mL = mililitros;

N = newton;

nm = nanômetros;

Pa = Pascal.

Grandezas

N = dureza;

N.s = bioadesão; N.s = compressão; 1s-1 = taxa de cisalhamento;

N/m = tensão superficial ou interfacial; Pa = tensão de cisalhamento;

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Classificação dos testes, de acordo com a finalidade. ... 49 Tabela 2 – Ensaios necessários para a validação do método analítico segundo a finalidade. 49 Tabela 3 – Composição percentual (% p/p) e caracterização física visual das formulações líquido-cristalinas selecionadas do diagrama 1 para estudo nos TEP. ... 65

Tabela 4 – Composição percentual (% p/p) e caracterização física visual das formulações líquido-cristalinas selecionadas do diagrama 2 para estudo nos TEP. ... 65

Tabela 5 – Composição percentual (% p/p) e caracterização física visual das formulações emulsionadas I e J selecionadas do diagrama 2 para determinação da atividade antioxidante in vitro e estudo da liberação in vitro, respectivamente. ... 66

Tabela 6 – Composição percentual (% p/p) e caracterização física visual das formulações líquido-cristalinas K e L selecionadas do diagrama 2 para ensaio de bioadesão in vitro. ... 66

Tabela 7 – Concentração percentual (% p/p) dos polímeros empregados para o preparo dos géis avaliados no ensaio de bioadesão in vitro. ... 67

Tabela 8 – Concentrações utilizadas das soluções de palmitato de retinol (material referência) em 2-propanol para a construção da curva analítica do método espectrofotométrico, na região do UV, no comprimento de onda de máxima absorção (em nanômetros). ... 72

Tabela 9 – Concentrações utilizadas das soluções de palmitato de retinol (matéria prima) para a construção do intervalo linear do método espectrofotométrico, na região do UV, no comprimento de onda de máxima absorção (em nanômetros). ... 73

Tabela 10 – Preparo das amostras para determinação da atividade antioxidante in vitro do palmitato de retinol ou do ácido retinóico, por espectrofotometria, no comprimento de onda de 517 nm. ... 77

Tabela 11 – Preparo das amostras para verificação da especificidade da reação de redução do radical livre DPPH. ... 78

Tabela 12 – Preparo das amostras para determinação da atividade antioxidante in vitro das formulações G e I contendo ou não 1% de palmitato de retinol, por espectrofotometria, no comprimento de onda de 517 nm. ... 79

Tabela 13 – Composição dos meios receptores. ... 80 Tabela 14 – Resultados da determinação do potencial hidrogeniônico (pH) das formulações A, B, C e D (diagrama 1), no TEP, nos tempos t1P e t2P. ... 104

(15)

Tabela 16 – Resultados da determinação da condutividade eletrolítica das formulações A, B, C e D (diagrama 1), no TEP, nos tempos t1P e t2P. ... 105

Tabela 17 – Resultados da determinação da condutividade eletrolítica das formulações E, F, G e H (diagrama 2), no TEP, nos tempos t1P e t2P. ... 107

Tabela 18 – Resultados da determinação do índice de refração das formulações A, B, C e D (diagrama1), no TEP, nos tempos t1P e t2P. ... 109

Tabela 19 – Resultados da determinação do índice de refração das formulações E, F, G e H (diagrama2), no TEP, nos tempos t1P e t2P. ... 110

Tabela 20 – Resultados do índice de consistência e do índice de escoamento obtidos pelo modelo matemático da lei da potência e classificação do comportamento de escoamento das formulações A, B, C e D, nos TEP. ... 112

Tabela 21 – Média da triplicata da viscosidade aparente (Pa.s) obtida a partir da curva de viscosidade das formulações A, B, C e D, do diagrama 1. ... 112

Tabela 22 – Média da triplicata de cada área de histerese calculada a partir da curva de escoamento das formulações A, B, C e D, do diagrama 1. ... 114

Tabela 23 – Resultados do índice de consistência e do índice de escoamento obtidos pelo modelo matemático da lei da potência e classificação do comportamento de escoamento das formulações E, F, G e H, nos TEP. ... 116

Tabela 24 – Média da triplicata da viscosidade aparente obtida a partir da curva de viscosidade das formulações E, F, G e H, do diagrama 2. ... 116

Tabela 25 – Média da triplicata de cada área de histerese calculada a partir da curva de escoamento das formulações E, F e G, do diagrama 2. ... 117

Tabela 26 – Valores de absorbância do palmitato de retinol (material referência) em soluções de pentano e 2-propanol para a construção da curva analítica pelo método espectrofotométrico, na região do UV, em 327 nm. ... 121

Tabela 27 – Valores de absorbância do PR (matéria-referência) em solução de pentano e 2-propanol, obtidos por espectrofotometria, no comprimento de onda de 327nm, para obtenção do intervalo linear do método analítico. ... 123

Tabela 28 – Valores de absorbância do palmitato de retinol (padrão secundário) em soluções de pentano e 2-propanol para a construção da curva analítica pelo método espectrofotométrico, na região do UV, em 327 nm. ... 124

Tabela 29 – Valores de absorbância do palmitato de retinol (padrão secundário) em soluções de pentano e 2-propanol medidas pelo analista 1 para determinar a repetibilidade do método analítico por espectrofotometria, na região do UV, em 327 nm. ... 126

(16)

Tabela 31 – Preparo das soluções de PR (padrão secundário) para o teste de recuperação do método espectrofotométrico, na região do UV, em 327 nm. ... 127

Tabela 32 – Valores de absorbância obtidos pelo analista 1 na quantificação do PR (padrão secundário) adicionado à matriz (formulação G) para determinar o fator de recuperação do método analítico, na região do UV, em 327 nm. ... 127

Tabela 33 – Valores de absorbância obtidos pelo analista 2 na quantificação do PR (padrão secundário) adicionado à matriz (formulação G) para determinar o fator de recuperação do método analítico, na região do UV, em 327 nm. ... 128

Tabela 34 – Resultados da determinação do potencial hidrogeniônico (pH) da formulação GPR, em tempos pré-estabelecidos, durante 135 dias de TEA. ... 133

Tabela 35 – Resultados da determinação da condutividade eletrolítica (μS/cm) da

formulação GPR, em tempos pré-estabelecidos, durante 135 dias de TEA. ... 133

Tabela 36 – Resultados da determinação do índice de refração da GPR, em tempos

pré-estabelecidos, durante 135 dias de TEA. ... 134

Tabela 37 – Resultados do índice de consistência e do índice de escoamento obtidos pelo modelo matemático da lei da potência e classificação do comportamento de escoamento da GPR, armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, nos TEA. ... 136

Tabela 38 – Resultados do índice de consistência e do índice de escoamento obtidos pelo modelo matemático da lei da potência e classificação do comportamento de escoamento

da formulação GPR, armazenada à 40,0 ± 2,0ºC, nos TEA. ... 136

Tabela 39 – Resultados do índice de consistência e do índice de escoamento obtidos pelo modelo matemático da lei da potência e classificação do comportamento de escoamento da formulação GPR, armazenada à 5,0 ± 2,0ºC, nos TEA. ... 136

Tabela 40 – Média da triplicata da viscosidade aparente obtida a partir da curva de viscosidade da formulação GPR, em diferentes temperaturas de armazenamento. ... 137

Tabela 41 – Determinação do módulo elástico e do módulo viscoso da formulação GPR,

em períodos de tempo pré-determinados no TEA, em diferentes temperaturas de armazenamento. ... 138

Tabela 42 – Valores de absorbância em comprimento de onda de 327 nm, obtidos na quantificação analítica do PR a partir de sua matriz, em períodos de tempo pré-determinados, durante os TEA (25,0 ± 2,0ºC). ... 141

Tabela 43 – Valores de absorbância em comprimento de onda de 327 nm, obtidos na quantificação analítica do PR a partir de sua matriz, em períodos de tempo pré-determinados, durante os TEA (40,0 ± 2,0ºC). ... 141

(17)

Tabela 45 – Concentração (μg/mL) do PR em períodos de tempo pré-determinados, nas condições de armazenamento na temperatura ambiente (25,0 ± 2,0ºC), na estufa (45,0 ± 2,0ºC) e na geladeira (05,0 ± 2,0ºC). ... 142

Tabela 46 – Relação entre os valores da média das absorbâncias no comprimento de onda de 300, 350 e 370 nm pelo valor da média de absorbância no comprimento de onda de 326nm, no TEA (25,0 ± 2,0ºC). ... 143

Tabela 49 – Média dos valores de absorbância (λ = 517 nm) obtidos pela reação de

redução do radical DPPH• pelo PR. ... 145

Tabela 50 – Média dos valores de absorbância (λ = 517 nm) obtidos pela reação de redução do radical DPPH• pelo AR. ... 145

Tabela 51 – Atividade antioxidante in vitro das formulações G e I, contendo, ou não, 1% de palmitato de retinol, em períodos de tempo pré-estabelecidos, durante 30 dias de avaliação. ... 147

Tabela 52 – Fator de recuperação (Fr) do palmitato de retinol solubilizado nas soluções receptoras testadas. ... 151

Tabela 53 – Quantidade de PR liberado (μg/cm2_{) e a correspondente porcentagem de}

liberação, a partir da formulação GPR, em função do tempo (h), λ = 327 nm. ... 152

Tabela 54 – Quantidade de PR liberado (μg/cm2) e a correspondente porcentagem de liberação a partir da formulação JPR, em função do tempo (h), λ = 327 nm. ... 152

Tabela 55 – Determinação da ordem de reação da liberação in vitro do PR a partir das formulações GPR e JPR (diagrama 2) utilizando o parâmetro de coeficiente de correlação

linear (R2). ... 154 Tabela 56 – Constante da velocidade k de liberação do PR a partir das formulações envolvidas no estudo. ... 155

Tabela 57 – Trabalho de bioadesão in vitro (N.s) e da força máxima (N) necessária para o destaque do substrato biológico das amostras analisadas. ... 157

Tabela 58 – Viscosidade complexa (Pa.s) das amostras analisadas. ... 163 Tabela 59 – Estudo do comportamento reológico das amostras avaliadas por determinação

(18)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Representação esquemática dos tipos de rugas faciais mais comuns. ... 32

Figura 2 – Representação esquemática da capacidade de penetração na pele (estrato córneo, epiderme e derme) das radiações do espectro eletromagnético, na região do ultravioleta, em diferentes comprimentos de onda, em nanômetros. ... 33

Figura 3 – Fórmula estrutural dos retinóides. ... 36

Figura 4 – Representação esquemática da estrutura química de compostos anfifílicos. ... 38

Figura 5 – Representação esquemática das micelas, dependendo da natureza do solvente: (a) micelas esféricas; (b) micelas reversas. ... 39

Figura 6 – Representação esquemática de sistemas nanoestruturados formados por agregados de moléculas anfifílicas. ... 40

Figura 7 – Demonstração do escoamento de um fluido entre duas placas paralelas com o líquido preenchendo a distância dy entre as placas. ... 43

Figura 8 – Curvas de escoamento representativas dos diferentes comportamentos reológicos: (A) = fluido newtoniano; (B) = fluido binghamiano ou plástico ideal; (C) = pseudoplástico; (D) = dilatante; (E) = pseudoplástico com limite de escoamento. ... 46

Figura 9 – Curvas de fluxo para fluidos com comportamento dependente do tempo. ... 47

Figura 10 – Representação esquemática de um diagrama ternário de fases. ... 48

Figura 11 – Reação química de redução do radical DPPH•_{pela substância antioxidante. ...} ₅₄

Figura 12 – Esquema da célula de difusão do equipamento Microette Plus - Hanson Research®_{, empregada nos estudos de liberação in vitro. ... 55}

Figura 13 – Representação esquemática que traduz a curva de liberação in vitro de substâncias ativas que obedecem à cinética de ordem zero. ... 56

Figura 14 – Representação esquemática que traduz a curva de liberação in vitro de substâncias ativas que obedecem à cinética de primeira ordem. ... 57

Figura 15 – Representação esquemática que traduz a curva de liberação in vitro de substâncias ativas que obedecem a cinética de pseudoprimeira ordem (lei de Higuchi). ... 57

Figura 16 – (a) Procedimento de dissecação da pele proveniente da orelha de suínos; (b) Procedimento de dermatomização; (c) Remoção de pele dermatomizada na espessura de 500 μm. ... 83

(19)

Figura 18 – (a) Texturômetro Stable Micro Systems TA-XT2i, com controle da temperatura em 32 ± 1,0o_{C; (}_b_{) Sonda com o substrato biológico (pele dermatomizada de suínos) entrando}

em contato com a amostra a ser analisada. ... 85

Figura 19 – Gráfico característico da análise de bioadesão: (1) Área ou trabalho de adesão; (2) Força máxima necessária para o destaque do substrato biológico da amostra analisada. ... 86

Figura 20 – Diagrama ternário de fases (1) pontual do sistema constituído por Procetyl AWS®

(tensoativo), silicone DC 5330®_{(fase oleosa) e água:} _{= sistema líquido transparente;} ₌

sistema viscoso transparente; = sistema semitransparente; = sistema viscoso opaco; = separação de fases. ... 89

Figura 21 – Diagrama ternário de fases (1) das regiões de transição do sistema constituído por Procetyl AWS®_{(tensoativo), silicone DC 5330}®_{(fase oleosa) e água:}_SLT_{= sistema líquido}

transparente; SVT = sistema viscoso transparente; SVO = sistema viscoso opaco; SST = sistema semitransparente; SF = separação de fases. ... 90 Figura 22 – Diagrama ternário de fases (2) pontual do sistema constituído por Procetyl AWS® (tensoativo), silicone DC 5329®_{(fase oleosa) e água: sistema líquido transparente;}

sistema viscoso transparente; sistema líquido opaco; sistema viscoso opaco. ... 90

Figura 23 – Diagrama ternário de fases (2) das regiões de transição do sistema constituído por Procetyl AWS® (tensoativo), silicone DC 5329® (fase oleosa) e água: SLT = sistema líquido transparente; SVT = sistema viscoso transparente; SLO = sistema líquido opaco; SVO = sistema viscoso opaco. ... 91

Figura 24 – Diagrama ternário de fases (2) constituído por Procetyl AWS®_{(tensoativo),}

silicone DC 5329®_{+ PR (fase oleosa) e água: sistema líquido transparente; sistema}

viscoso transparente; sistema líquido opaco; sistema viscoso opaco. ... 93

Figura 25 – Diagrama ternário de fases (2) das regiões de transição do sistema constituído por Procetyl AWS®_{(tensoativo), silicone DC 5329}®_{+ PR (fase oleosa) e água:}_SLT_{= sistema}

líquido transparente; SVT = sistema viscoso transparente; SLO = sistema líquido opaco; SVO = sistema viscoso opaco. ... 94

Figura 26 – Fórmula estrutural do palmitato de retinol. ... 94 Figura 27 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação A armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP: (a) no t1P, após 24 horas (b) no t2P, após 15 dias. ... ₉₆

Figura 28 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação B armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP: (a) no t1P, após 24 horas (b) no t2P, após 15 dias. ... 97

Figura 29 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação C armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP: (a) no t1P, após 24 horas (b) no t2P, após 15 dias. ... 97

Figura 30 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação D armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP: (a) no t1P, após 24 horas e (b) no t2P, após 15 dias. ... 97

Figura 31 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação E armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP, após 24 horas (t1P): (a) cristal líquido de fase lamelar; (b)

(20)

Figura 32 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação E, após 15 dias (t2P) no TEP, armazenada nas seguintes condições: (a) ambiente - 25,0 ± 2,0ºC; (b)

ciclo estufa /geladeira; (c) estufa - 40,0 ± 2,0ºC; (d) geladeira - 05,0 ± 2,0ºC. ... 99 Figura 33 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação F, armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP, após 24 horas (t1P): (a) cristal líquido de fase lamelar; (b)

cristal líquido de fase hexagonal. ... 99

Figura 34 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação F, após 15 dias (t2P) no TEP, armazenada nas seguintes condições: (a) ambiente - 25,0 ± 2,0ºC; (b) ciclo

estufa /geladeira; (c) estufa - 40,0 ± 2,0ºC; (d) geladeira - 05,0 ± 2,0ºC. ... 99 Figura 35 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação G, armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP, após 24 horas (t1P): (a) cristal líquido de fase lamelar; (b)

cristal líquido de fase hexagonal. ... 100

Figura 36 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação G, após 15 dias (t2P) no TEP, armazenada nas seguintes condições: (a) ambiente - 25,0 ± 2,0ºC; (b)

ciclo estufa /geladeira; (c) estufa - 40,0 ± 2,0ºC; (d) geladeira - 05,0 ± 2,0ºC. ... 100 Figura 37 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação H, armazenada à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP, após 24 horas (t1P). ... 100

Figura 38 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação H, após 15 dias (t2P) no TEP, armazenada nas seguintes condições: (a) ambiente - 25,0 ± 2,0ºC; (b)

ciclo estufa /geladeira; (c) estufa - 40,0 ± 2,0ºC; (d) geladeira - 05,0 ± 2,0ºC. ... 101 Figura 39 – Visualização macroscópica do aspecto, após 24 horas de manipulação das formulações A, B, C e D conduzidas ao teste de centrifugação à 3000rpm, por 30 minutos. ... 103

Figura 40 – Visualização macroscópica do aspecto, após 24 horas de manipulação das formulações E, F, G e H conduzidas ao teste de centrifugação à 3000rpm, por 30 minutos. ... 103

Figura 41 – Condutividade eletrolítica das formulações A, B, C e D (diagrama 1) em função da porcentagem de fase aquosa, no TEP, após 24 horas (t1P) e 15 dias (t2P). ... 106

Figura 42 - Condutividade eletrolítica das formulações E, F, G e H (diagrama 2) em função da porcentagem de fase aquosa, no TEP, após 24 horas (t1P) e 15 dias (t2P). ... 107

Figura 43 – Índice de refração das formulações A, B, C e D (diagrama 1), no TEP, após 24 horas (t1P) e 15 dias (t2P). ... 109

Figura 44 - Índice de refração das formulações E, F, G e H (diagrama 2), no TEP, após 24 horas (t1P) e 15 dias (t2P). ... 110

Figura 45 – Reograma da curva de escoamento das formulações A, B, C e D (diagrama 1), armazenadas à 25,0 ± 2,0ºC, no TEP, após: 24 horas (t1P) e 15 dias (t2P). ... ₁₁₁

Figura 46 – Reogramas da curva de escoamento das formulações E, F, G e H, no TEP, após 24 horas à 25,0 ± 2,0 ºC ( ) e após 15 dias, armazenadas na seguintes condições: 5,0 ± 2,0 ºC ( ), .25,0 ± 2,0 ºC ( ); ciclo 40,0/5,0 ± 2,0 ºC ( ) e 40,0 ± 2,0 ºC ( )... 115

(21)

Figura 48 – Espectro de varredura dos excipientes da matriz analítica sem a substância de interesse para determinar a seletividade do método analítico espectrofotométrico, na região do UV, em 327 nm. ... 120

Figura 49 – Curva analítica do palmitato de retinol (material referência), no intervalo de 10 UI /mL a 15 UI/mL, no comprimento de onda de 327 nm. ... 122

Figura 50 – Intervalo linear do método analítico na faixa de concentrações entre 0,3125 UI/mL a 17,5 UI/mL, no comprimento de onda de 327 nm. ... 123

Figura 51 – Curva analítica do palmitato de retinol (matéria prima), no intervalo de 5,0 μg/mL a 17,5 μg/mL, no comprimento de onda de 327 nm. ... 125 Figura 52 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação GPR, após

24 horas de manipulação mantida à temperatura ambiente (25,0 ± 2,0ºC). ... 129

Figura 53 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação GPR, após

7 dias do TEA, armazenada nas seguintes condições: (a) ambiente (25,0 ± 2,0ºC), (b) estufa (40,0 ± 2,0ºC) e (c) geladeira (5,0 ± 2,0ºC). ... 130 Figura 54 – Fotomicrografia em microscópio de luz polarizada (10x) da formulação GPR, após

150 dias do TEA, armazenada nas seguintes condições: (a) ambiente (25,0 ± 2,0ºC), (b) estufa (40,0 ± 2,0ºC) e (c) geladeira (5,0 ± 2,0ºC). ... 132 Figura 60 – Reograma da curva de escoamento da formulação GPR, após 7, 15, 30, 60 e 90

dias, armazenada à: 5,0 ± 2,0 ºC ( ), 25,0 ± 2,0 ºC ( ) e 40,0 ± 2,0 ºC ( ) ... 135

Figura 61 - Reograma das curvas de fluência e relaxação da formulação GPR, armazenada à 5,0

± 2,0 ºC, nos tempos: (1) 7 dias; (2) 15 dias; (3) 30 dias; (4) 60 dias; (5) 90 dias. ... 139

Figura 62 - Reograma das curvas de fluência e relaxação da formulação GPR, armazenada à

(22)

Figura 63 - Reograma das curvas de fluência e relaxação da formulação GPR, armazenada à

40,0 ± 2,0 ºC, nos tempos: (1) 7 dias; (2) 15 dias; (3) 30 dias; (4) 60 dias; (5) 90 dias. ... ₁₄₀

Figura 64 – Porcentagem de degradação do PR presente na formulação GPR em função do

tempo, nas diferentes condições de armazenamento. ... 142

Figura 65 – Determinação da porcentagem de inibição do radical DPPH•_{reduzido em função}

da concentração (mg/mL) dos princípios ativos testados. ... 146

Figura 66 – Atividade antioxidante (%) da formulação GPR (quadrados fechados) e G

(quadrados abertos), durante 30 dias de estudo, nos seguintes tempos: 48h (preto); 7 dias (vermelho); 15 dias (verde); 21 dias (azul); e, 30 dias (rosa). ... 148

Figura 67 – Atividade antioxidante (%) da formulação IPR (quadrados fechados) e I (quadrados

abertos), durante 30 dias de estudo, nos seguintes tempos: 48h (preto); 7 dias (vermelho); 15 dias (verde); 21 dias (azul); e, 30 dias (rosa). ... 148 Figura 68 – Atividade antioxidante in vitro das seguintes amostras: ( ) formulação GPR;

( ) PR adicionado à formulação GPR; ( ) formulação IPR; ( ) PR adicionado à

formulação IPR. ... 150

Figura 69 – Perfil de liberação in vitro das formulações GPR (à esquerda) e JPR (à direita), de

acordo com o modelo matemático de cinética de ordem zero. ... 153

acordo com o modelo matemático de cinética de primeira ordem. ... 153

acordo com o modelo matemático de cinética de pseudoprimeira ordem. ... 154

Figura 72 – Comparação dos valores do trabalho de bioadesão in vitro (N.s) medidos em analisador de textura para as amostras dos géis poliméricos. ... 158

Figura 73 – Comparação dos valores da força máxima (N) necessária para o destaque entre a sonda do analisador de textura e as amostras dos géis poliméricos. ... 158

Figura 74 – Comparação dos valores do trabalho de bioadesão in vitro (N.s) medidos em analisador de textura entre as formulação GPR e os géis poliméricos na concentração de

1,5%. ... 160 Figura 75 – Comparação dos valores do trabalho de bioadesão in vitro (N.s) medidos em analisador de textura entre as formulações e o gel de C940 2%. ... 161

Figura 76 – Comparação dos valores da força máxima (N) necessária para o destaque entre a sonda do analisador de textura e as amostras analisadas. ... ₁₆₂

Figura 77 – Evolução temporal de G’ para as amostras analisadas dos géis poliméricos:

(23)

SUMÁRIO

Resumo ... viii

Abstract ... ix

Lista de Abreviaturas ... x

Lista de Símbolos, Unidades e Grandezas ... xii

Lista de Tabelas ... xiv

Lista de Figuras ... xviii

Sumário ... xxiii

I. – INTRODUÇÃO ... 26

II. – REVISÃO DA LITERATURA ... 31 2.1. – Processo do Envelhecimento Cutâneo ... 31 2.2. – Palmitato de Retinol (PR) ... 35 2.3. – Sistemas Nanoestruturados: Cristais Líquidos ... 38

2.3.1. – Microscopia de Luz Polarizada

2.3.2. – Viscosidade e Comportamento Reológico 2.3.3. – Diagrama de Fases

... ... ...

42 42 47 2.4. – Validação de Metodologia Analítica ... 48 2.4.1. – Especificidade e Seletividade ... 50 2.4.2. – Linearidade e Faixa Linear de Trabalho ... 50 2.4.3. – Limite de Quantificação ... 50 2.4.4. – Limite de Detecção ... 51 2.4.5. - Precisão ... 51 2.4.6. – Exatidão e Recuperação ... 52 2.4.7. - Robustez ... 52 2.5. – Estudo da Atividade Antioxidante in vitro ... 53 2.6. – Estudo de Liberação in vitro ... 54 2.7. – Estudo de Bioadesão in vitro ... 57

III. – OBJETIVOS ... 61

3.1. – Objetivo Geral ... 61 3.2. – Objetivos Específicos ... 61 IV. – MATERIAIS E MÉTODOS

... 63

4.1. – Materiais ... 63

4.1.1. – Substâncias e Reagentes ... 63

4.2. – Métodos ... 64

4.2.1. – Desenvolvimento dos Sistemas Líquido-Cristalinos:

(24)

4.2.2. – Teste de Estabilidade Preliminar (TEP) das formulações líquido-cristalinas selecionadas (A à H) sem palmitato de retinol

... 67

4.2.3. – Validação do Método Analítico para Quantificação

do palmitato de retinol acrescido à Formulação GPR ... 69

4.2.4. – Teste de Estabilidade Acelerada (TEA) da formulação líquido-cristalina GPR acrescida de 1%

de palmitato de retinol ... 75

4.2.5. – Determinação da Atividade Antioxidante in vitro do palmitato de retinol pelo método de redução do

radical DPPH ... 76

4.2.6. – Estudo de Liberação in vitro do palmitato de retinol ... 79 4.2.7. – Estudo da Bioadesão in vitro de formulações líquido

cristalinas e géis poliméricos ... 82

V. – RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 88 5.1. – Desenvolvimento dos Sistemas Líquido-Cristalinos:

Construção do Diagrama de Fases Ternário ... 88 5.2. – Teste de Estabilidade Preliminar (TEP) das

formulações líquido-cristalinas selecionadas sem

palmitato de retinol ... 95

5.3. – Validação do Método Analítico empregado para quantificação do palmitato de retinol acrescido à

formulação líquido-cristalina GPR ... 118

5.4. – Teste de Estabilidade Acelerada (TEA) da formulação líquido-cristalina GPR acrescida de 1% de palmitato de

retinol ... 128

5.5. – Determinação da Atividade Antioxidante in vitro do

palmitato de retinol ... 144

5.6. – Estudo de Liberação in vitro do palmitato de retinol ... 150 5.7. – Estudo da Bioadesão in vitro ... 156

VI. – CONCLUSÕES ... 169

(25)

(26)

I. – INTRODUÇÃO

A consolidação de produtos cosméticos desenvolvidos para uma visão com propostas terapêuticas multifuncionais possibilitou o desenvolvimento de um novo segmento na cosmetologia denominado de Cosmética Dermatológica (KLIGMAN, 2002).

O atual momento de valorização da qualidade de vida e do bem estar pessoal, principalmente pela preocupação com a aparência e a saúde da pele, vêm contribuindo para o desenvolvimento de produtos dermocosméticos embasados em atributos funcionais mensuráveis dentro deste novo segmento que aproxima as fronteiras entre a cosmética e a dermatologia (MAGDASSI, 1997; DRAELOS, 2001; DRAELOS, 2009)

O tratamento tópico antienvelhecimento constitui-se, sem dúvida, na área de maior interesse e evolução no mercado de produtos para cuidados com a pele (FOX, 1995).

À luz da compreensão científica etiopatológica atual, as hipóteses modernas mais aceitas baseiam o processo de envelhecimento cutâneo em dois tipos. O primeiro tipo diz respeito ao envelhecimento intrínseco, o qual é determinado, principalmente, por fatores genéticos (TAGAMI, 2008) e está relacionado com a ocorrência de algumas alterações típicas, como secura e afinamento da pele, formação de colágeno menos flexível, menor retenção de água no estrato córneo e diminuição do número e da capacidade elástica das fibras de elastina devido à deterioração progressiva da pele na sua estrutura e em suas funções, com o decorrer do tempo (ROENIGK, 1995).

Em paralelo à formação dita endógena, existem vários fatores exógenos que originam precocemente as alterações degenerativas cutâneas, destacando-se as radiações ultravioletas (UV) provenientes da exposição solar excessiva, as quais expõem a pele a uma situação que aumenta a formação de radicais livres (SAIJA et al., 1998; KOHEN & GATI, 2000; TZAPHLIDOU, 2004). Por este fato, o envelhecimento extrínseco é mais comumente denominado de fotoenvelhecimento (FUTORYAN & GILCHREST, 1994).

(27)

átomo em sua vizinhança, a fim de recuperar a valência mais estável e, em decorrência, a estabilidade (ARUOMA, 1998; OLIVEIRA, 2002; OLIVEIRA et al., 2004b).

Bioquimicamente, as alterações celulares quantitativa e qualitativas na epiderme (em queratinócitos, células de Langerhans e melanócitos), nas proteínas da matriz extracelular dérmica e no ácido desoxirribonucléico (DNA) (HALLIWELL et al., 1995; BERGENDI et al., 1999) geradas pela formação dos radicais livres comprovam que o estresse oxidativo é uma das causas do fotoenvelhecimento. Em indivíduos idosos ou em pessoas com estresse oxidativo crônico originado pelos efeitos deletérios da exposição solar excessiva, o sistema antioxidante endógeno torna-se menos eficiente ou está saturado e surge, portanto, a necessidade do uso de antioxidantes tópicos para capturar as espécies reativas de oxigênio remanescentes (SORG et al., 2006).

Dentre os antioxidantes tópicos disponíveis, o trabalho dos pesquisadores Tsuchiya et al. (1992), Tesoriere et al. (1997), Sorg; Tran; Saurat (2001) & Sorg; Kuenzli; Kaya (2005) mostram a capacidade dos retinóides (família da qual faz parte a vitamina A, seus derivados naturais e análogos sintéticos) exercerem atividade sequestradora de radicais livres in vitro, contribuindo para a resolução de problemas associados ao envelhecimento cutâneo.

Nos tratamentos dermatológicos mais modernos que buscam retardar e, até mesmo atenuar os efeitos do envelhecimento cutâneo, o palmitato de retinol é um análogo sintético do ácido retinóico que vem sendo preferivelmente empregado por causa de sua baixa atividade irritante comparada ao seu precursor (PAPAGEORGIOU et al., 2007). Além de diminuir os riscos toxicológicos, a aplicação tópica de produtos contendo palmitato de retinol para o tratamento do fotoenvelhecimento torna-se interessante, pois este derivado sofre clivagem enzimática de sua ligação éster, pelas enzimas estearases da pele, convertendo-se no metabólito ativo que possui poderosa atividade antioxidante, o ácido all-trans-retinóico (BOLLAG, 1983; TANG & RUSSELL, 1991; SORG et al., 2006).

Adicionalmente, os retinóides também se tornaram compostos de referência na dermato-cosmetologia devido à capacidade de estimulação mitótica e metabólica que estes compostos possuem, pela modulação da expressão de genes envolvidos na proliferação e diferenciação celular, o que, em conseqüência, proporcionam modificações histológicas na derme e na epiderme (GUDAS et al., 1994; KANG, 2005).

(28)

Porém, a literatura recente tem apontando que o uso terapêutico do palmitato de retinol ainda é limitado devido à instabilidade química que o mesmo apresenta frente à umidade, oxigênio, ácidos, metais e exposição à luz (FARMACOPÉIA EUROPÉIA, 2005). Em seus estudos, Papageorgiou & colaboradores (2007) demonstram que o palmitato de retinol é um composto antioxidante que apresenta baixa fotoestabilidade em formulações cosméticas.

Nos estudos de estabilidade do palmitato de retinol encapsulado em nanopartículas lipídicas sólidas constituídas por Precirol ATO 5, Pluronic F68 e quelato de sódio, Carafa e colaboradores (2008) descobriram que o sistema apresentava alta eficiência de encapsulamento da substância ativa, mas não foi capaz de protegê-la da fotodegradação pois o palmitato de retinol distribui-se, preferencialmente, na superfície das partículas, tornando-se parcialmente exposto à fase externa aquosa.

O estudo de Carlotti & seu grupo de pesquisa (2004) demonstrou que o palmitato de retinol adicionado aos sistemas encapsulados, tais como, nanocápsulas Lipotec®, microcápsulas Tagravit®_{A-1, lipossomas de fosfatidilcolina e lipossomas Lipotec}®_{protegeram o éster da}

vitamina A das reações de hidrólise e de oxidação, ao longo do tempo; enquanto que a substância ativa adicionada em géis de hidroetilcelulose, em pH 4,0 e 8,0, apresentou menor estabilidade. Os resultados do grupo de pesquisa mencionado demonstrou que as nanocápsulas e os lipossomas também melhoraram a fotoestabilidade do palmitato de retinol.

Mehta & colaboradores (2009) apontam que as pesquisas realizadas nos últimos anos demonstram que o desenvolvimento de sistemas micro e nanoestruturados têm sido muito relevantes em estabelecer alternativas terapêuticas mais eficientes no que diz respeito à estabilidade de armazenamento, liberação lenta do princípio ativo veiculado e aumento da permeação das substâncias ativas através da pele. Exemplos deste tipo de sistema já investigados são nanoesferas (SHIM et al., 2004), nanocápsulas (MILÃO et al., 2003; MIYAZAKI et al., 2003), nanoemulsões (CALVO et al., 1996; MÜLLER-GOYMANN, 2004), nanopartículas lipídicas sólidas (JENNING; SCHÄFER-KORTING; GOHLA, 2000; MEHNERT & MÄDER, 2001), microemulsões (MEHTA et al., 2009), fases líquido-cristalinas (MUZZALUPO et al., 2009), lipossomas (VERMA et al., 2003; TORCHILIN, 2005) e niossomas (SHAHIWALA & MISRA, 2002).

(29)

solubilização e encapsulamento de substâncias hidrofílicas e lipofílicas, melhora da biodisponibilidade, uma ampla gama de propriedades reológicas e imensa similaridade com a pele (biocompatíveis), além de poderem contribuir com a hidratação cutânea da pele fotoenvelhecida por retenção de água no estrato córneo (JAHN et al., 2002; SCHAFFAZICK et al., 2003; WILLIAMS & BARRY 2004; MUZZALUPO et al., 2009).

Em seu artigo, Snelders (1997) fez um levantamento histórico comentando que, em 1888, o químico austríaco Friedrich Reinitzer notou que o composto sólido benzoato de colesterila se transformava em um líquido turvo em 145,5ºC e acima de 178,5ºC formava um líquido claro. No ano seguinte, o professor alemão de física Otto Lehmann, que já vinha realizando estudos sistemáticos sobre este tipo de comportamento, descreveu pela primeira vez os cristais líquidos, definindo-os como sendo um estado intermediário na transformação térmica a partir do estado sólido para o líquido (SNELDERS, 1997). Na década de 1920, os cientistas George Friedel e Daniel Vorländer realizaram pesquisas fundamentais que contribuíram para a expansão dos conhecimentos conquistados até o momento, porém, o interesse para as aplicações dos cristais líquidos só ocorreu durante a descoberta de sua capacidade de mudança de estados através de propriedades eletroópticas, realizada por George H. Heilmeie (TYLE, 1989).

(30)

(31)

II. – REVISÃO DA LITERATURA

2.1. – Processo de Envelhecimento Cutâneo

A pele é o maior órgão do corpo humano, sendo considerado altamente diferenciado por conter aproximadamente 1,0 x 1011 células de origens epiteliais, mesenquimais e neurais. Ocupa uma área média de 2 m2, correspondendo à cerca de 10 a 15% do peso corporal e recebe cerca de um terço do total de suprimento sanguíneo do organismo (WANG et al., 2003; LEONARDI, 2004).

O processo de envelhecimento da pele é um fenômeno biológico muito complexo. Embora seja difícil definir precisamente a natureza bioquímica exata deste processo (BUCHLI, 2002), as hipóteses mais modernas baseiam o envelhecimento cutâneo em duas teorias: a teoria do envelhecimento intrínseco e a do extrínseco (TZAPHLIDOU, 2004; TAGAMI, 2008).

O envelhecimento intrínseco é determinado por fatores genéticos e encontra-se diretamente relacionado com a diminuição dos níveis de hormônios esteróides (estrógeno, testosterona, dehidroepiandrosterona e seus ésteres sulfato) e outros hormônios de homeostase do organismo (melatonina, insulina, cortisol, tiroxina), com o aumento da sinalização celular via citocina de fibroblastos senescentes e como resultado de danos endógenos cumulativos devido à contínua formação de espécies reativas de oxigênio pelo metabolismo celular oxidativo. Enquanto que no envelhecimento extrínseco os danos celulares aleatórios, resultantes de mutações induzidas por radicais livres durante os processos metabólicos, são intensificados por fatores ambientais, como: poluição do ar, tabagismo, abuso de álcool, má nutrição e exposição ao sol, sendo que este último fator contribui em até 80% para o envelhecimento prematuro da pele (PUIZINA-IVIĆ, 2008; TAGAMI, 2008).

Tanto no envelhecimento intrínseco como no extrínseco, as principais alterações da pele são caracterizadas por formação de rugas (PUIZINA-IVIĆ, 2008). A atrofia e o afrouxamento

(32)

Dependendo da idade e de fatores ambientais, as rugas apresentam uma profundidade que varia de 100µm até alguns milímetros. Segundo Peyrefitte, Martini & Chivot (1998), existem cinco tipos de rugas de expressão que são as mais comuns, conforme representadas na Figura 1:

1. As rugas da testa, as primeiras rugas a surgirem, são horizontais e perpendiculares ao músculo frontal, o qual se contrai formando a ruga.

2. O aprofundamento dos sulcos nasogenianos (rugas da asa do nariz aos cantos da boca) é devido à ação dos músculos elevadores do lábio superior e dos zigomáticos.

3. A contração do músculo orbicular das pálpebras provoca rugas radiais no ângulo externo dos olhos.

4. As rugas em torno da boca são causadas pelas contrações do músculo orbicular dos lábios.

5. As rugas horizontais e verticais da raiz do nariz se desenvolvem sob a ação dos músculos piramidal para as horizontais e superciliar para as verticais.

Figura 1 – Representação esquemática dos tipos de rugas faciais mais comuns (adaptado de PEYREFITTE; MARTINI; CHIVOT, 1998, p.419).

A correlação entre radicais livres e fotoenvelhecimento é incontestável, pelo simples fato de que a radiação solar, através dos seus raios ultravioletas (UV) A e B, gera espécies tóxicas de O2 que produzem uma série de danos na pele. Os efeitos biológicos resultantes de reações

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O espectro eletromagnético solar que atinge a superfície terrestre compreende as radiações UV, que se subdividem em: radiações ultravioleta C (UVC, 200-290nm), ultravioleta B (UVB, 290-320nm) e ultravioleta A (UVA, 320-400nm, sendo que a radiação UVA divide-se em UVA I ou longo, 340-400nm e UVA II ou curto, 320-340nm), a radiação visível (400-800nm) e infravermelha (acima de (400-800nm), como esquematizado na Figura 2 (OLIVEIRA et al., 2004b).

Figura 2 – Representação esquemática da capacidade de penetração na pele (estrato córneo, epiderme e derme) das radiações do espectro eletromagnético, na região do ultravioleta, em diferentes comprimentos de onda, em nanômetros (adaptado de SCOTTI et al., 2007).

Apenas 5% dos raios UV atingem a Terra, mas são os maiores responsáveis pelos efeitos nocivos nos indivíduos, Desse montante das radiações ultravioletas capazes de atingirem a superfície terrestre, 95% são do tipo UVA e destes, aproximadamente 80%, a pele não consegue desviar, penetrando até a derme (LENAERS et al., 2007).

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epidérmico e as células de Langerhans, suprimindo, assim, a resposta imunológica da pele. As radiações UVC são altamente eritematógenas e prejudiciais ao tecido vivo, com efeitos carcinogênicos e mutagênicos, mas são absorvidas, em sua maioria, pela camada de ozônio que recobre a Terra (OLIVEIRA et al., 2004b; LENAERS et al., 2007).

O dano ao DNA gerado pelas espécies reativas de oxigênio formadas pela exposição direta da radiação UV sobre a epiderme e a derme subjacente acarreta o fotoenvelhecimento por meio da sinalização molecular célula-célula, produzindo proteínas mensageiras (citocinas) que se ligam à superfície das células-alvo na derme e na epiderme (queratinócitos e fibroblastos) e provocam respostas ao estresse produzido. As citocinas geradas em resposta ao estresse levam à altos níveis de metaloproteínase-1 da matriz (MMP-1) na derme, também conhecida por colagenase-1, o que leva à degradação do colágeno na matriz extracelular da derme e conseqüentemente ao enrugamento devido à perda do tônus da pele pela desorganização das fibras de colágeno no tecido conectivo dérmico (GOLDSTEIN, 2008).

A lesão ao DNA nos queratinócitos da epiderme, induzida pela radiação UV, também ativa caminhos imunossupressores que inibem o sistema imunológico cutâneo impedindo-o de reagir contra desafios ambientais e tumores. O fator alfa de necrose tumoral (TNF-α) das

citocinas imunosupressoras e a interleucina-10 (IL-10) têm sido observados entre o repertório de respostas celulares que se segue à irradiação UV (GOLDSTEIN, 2008).

O fotodano ao DNA, produzido por transferência de carga de um cromóforo endógeno excitado ou por reação com espécies reativas de oxigênio, oxidam a guanina para 8-oxo-guanina no DNA nuclear e mitocondrial. Embora a radiação UVA tenha maior capacidade de penetrar as camadas da pele, a penetração da radiação UVB traz maiores danos ao DNA porque o espectro de emissão dos seus fótons é o mesmo espectro de absorção do DNA das células, podendo causar reações de degradação nas bases de pirimidina: timina e citosina (FERGUSON & DOVER, 2006; LENAERS et al., 2007).

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os danos em fitas transcritas de DNA detectados pela RNA polimerase (BUCHLI, 2002; LENAERS et al., 2007).

Porém, ainda que a pele tenha um eficiente sistema de defesa antioxidante, em indivíduos idosos ou em pessoas com estresse oxidativo crônico originado pelos efeitos deletérios da exposição solar excessiva, as espécies reativas de oxigênio podem afetar constituintes celulares, tais como membranas, enzimas e DNA e surge, portanto, a necessidade do uso de antioxidantes tópicos para capturar as espécies reativas de oxigênio remanescentes (BAUMANN, 2002; SORG et al., 2006).

2.2. Palmitato de Retinol (PR)

Sendo o órgão mais exposto ao meio ambiente, a pele é especialmente vulnerável aos danos oxidativos causados pelos radicais livres. Atualmente, existem relevantes estudos clínicos que fornecem evidências científicas referentes aos benefícios alcançados na pele pela aplicação tópica de antioxidantes, razão pela qual a indústria dermocosmética tem desenvolvido formulações dermatológicas que os contenha (RAMOS & PÉREZ, 2010).

Os retinóides possuem a capacidade de capturarem o oxigênio singleto, um radical livre altamente reativo que pode ser mutagênico por induzir danos aos DNA. A propriedade antioxidante dos componentes desta família os torna responsáveis em evitarem a peroxidação lipídica, processo este que seria responsável por alterações dermo-epidérmicas específicas, manifestadas principalmente por elastose actínica e lesões de queratose senil (LUPO, 2001; MAIA CAMPOS, 2006).

Além do potencial antioxidante dos retinóides, a capacidade de estimulação mitótica e metabólica destes compostos os consagraram na dermato-cosmetologia no tratamento de problemas associados ao envelhecimento cutâneo, seja relacionado com mudanças associadas à idade, ou àquele decorrente do fotoenvelhecimento, por influenciarem na diferenciação dos queratinócitos, regularem a expressão de várias proteínas epidérmicas, aumentarem a espessura da epiderme e da camada granulosa, aumentarem a síntese de colágeno nas papilas dérmicas, diminuírem a resistência dos desmossomos e regularem a atividade dos melanócitos (JOUANDEAUD et al., 2004; LEONARDI, 2004; DARLENSKI; SURBER; FLUHR, 2010).

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da síntese de colágeno e aumento da degradação de colágeno e elastina na derme, malformação da camada de queratina e redução do estrato granular a uma única camada de células contendo grânulos de queratina (LEONARDI, 2004; FU et al., 2007). Através da determinação de marcadores celulares e histológicos, Varani & seu grupo de pesquisa (2000) demonstraram que a aplicação tópica de 1% de retinol, por sete dias, em quatro grupos de faixas etárias diferentes, resultou na redução dos níveis das metaloproteinases da matriz MMP1 e MMP9, aumentou o crescimento dos fibroblastos em cerca de três vezes e aumentou a expressão de colágeno dérmico.

O benefício da aplicação tópica dos retinóides também tem sido observado na pele fotoenvelhecida (FU et al., 2007). Em revisão da literatura, Tierney & Hanke (2010) identificaram que a aplicação de retinóides tópicos nos pacientes, em 41,67% dos estudos, produziram melhora em nível histológico na pele, incluindo alterações na espessura da epiderme e derme, compactação do estrato córneo, maior produção de colágeno tipo I e III e formação de dímeros de timina.

Os retinóides constituem uma família da qual faz parte a vitamina A, seus derivados naturais e análogos sintéticos (KANG, 2005), os quais são indicados topicamente para o tratamento de doenças de pele, especialmente com ação preventiva, para retardar ou evitar certas alterações degenerativas associadas ao processo de envelhecimento, como a pele seca e descamativa e a formação de rugas (LUPO, 2001; MAIA CAMPOS, 2006).

Na estrutura molecular de um retinóide natural é possível identificar três partes fundamentais, como ilustrado na Figura 3: um anel não aromático, uma cadeia poliisoprênica e um grupo funcional terminal polar com carbonos e oxigênio (VAHLQUIST, 1999; JOUANDEAUD et al., 2004).

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Os análogos sintéticos do ácido retinóico são classificados em três gerações, com base nas suas características estruturais. As moléculas da 1ª geração são o retinol e os compostos que dele podem derivar metabolicamente, como a tretinoína, isotretinoína, alitretinoína, retinaldeído e os ésteres de retinila. Da 2ª geração fazem parte os retinóides monoaromáticos (em que o anel

β-ionona é aromático), como, o etretinato e a acitretina. Na 3ª geração estão integrados os retinóides poliaromáticos como o tazaroteno e o adapaleno (DARLENSKI; SURBER; FLUHR, 2010).

A Farmacopéia Européia 5.0 (2005) descreve que as moléculas da 1ª geração variam estruturalmente de acordo com o grupo polar funcional presente no radical (R) terminal da molécula, podendo ser: R1: H = retinol, R2: OH = retinal, R3: COOH = ácido retinóico (isômero

ácido 11-trans-retinóico = tretinoína e isômero ácido 13-cis-retinóico = isotretinoína), R4:

CO-CH3 = retinol acetato, R5: CO-C2H5 = retinol propionato, R6: CO-C15H31 = retinol palmitato.

No trabalho de Benevenuto & colaboradores (2010) verificou-se por meio da análise histológica e histométrica que formulações contendo filtros UV suplementadas com palmitato de retinol melhoram o eritema e diminuíram o número de células fotodanificadas, além de manterem a espessura da epiderme viável na pele de camundongos sem pelo; ao passo que na formulação sem estabilizante ocorreu redução na espessura da epiderme viável devido à atrofia induzida pela radiação UV.

Buscando compreender se os efeitos protetores ao DNA das células, após a exposição da pele aos raios UVB, são receptores-dependentes ou ligados a outras propriedades da molécula, Sorg & colaboradores (2005) demonstram que os retinóides tópicos (retinol, retinaldeído e palmitato de retinol) diminuíram significativamente (≈50%) o número de células apoptóticas e a formação de dímeros de timina na epiderme de ratos expostos aos raios UVB, de modo similar ao ácido retinóico. Com isso, conclui-se que a proteção aos danos do DNA ocorre por mecanismo independente da ativação de receptores nucleares de retinóides.