PONTI FÍ CI A UNI VERSI DADE CATÓLI CA DO RI O GRANDE DO SUL FACULDADE DE BI OCI ÊNCI AS
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM BI OLOGI A CELULAR E MOLECULAR
ELI SA CRI STI NA DE TONI
M I CROSSATÉLI TES ( GGAA) n N O PROMOTOR DO GEN E N R0 B1 EM PACI EN TES AFETADOS E N ÃO AFETADOS PELO SARCOMA DE EW I N G
Orientadora: CLARI CE SAMPAI O ALHO
PONTI FÍ CI A UNI VERSI DADE CATÓLI CA DO RI O GRANDE DO SUL FACULDADE DE BI OCI ÊNCI AS
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM BI OLOGI A CELULAR E MOLECULAR
M I CROSSATÉLI TES ( GGAA) n N O PROMOTOR DO GEN E N R0 B1 EM PACI EN TES AFETADOS E N ÃO AFETADOS PELO SARCOMA DE EW I N G
Dissertação apresent ada com o requisito para a obtenção do grau de Mestre pelo Program a de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Biociências da Pont ifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Pós- gra duando: ELI SA CRI STI NA DE TONI Orient a dora: Dra. CLARI CE SAMPAI O ALHO
Dedico est e t rabalho aos m eus am ados pais, Ant onio Telm o e
Solange e a m inha irm ã Ana Rosa por sem pre acredit arem no
m eu pot encial e serem m eus m aiores exem plos de dedicação,
AGRADECI MEN TOS
À m inha querida orientadora Dra. Clarice Sam paio Alho, por t er confiado em m im , pela m aravilhosa convivência ao longo do desenvolvim ento deste trabalho, pelas infinit as conversas e conselhos.
Aos m eus am igos e am igas do Laboratório de Genética Hum ana e Molecular em
especial, Déborah Soares Bispo Santos Silva, Fernanda Sawitzki, Juliane Bentes Picanço, Aline Ponzoni e Piet ra Graebin pela com panhia, carinho, am izade e convivência j unto a vocês nestes longos t em pos de Mestrado.
SUMÁRI O
RESUMO 6
ABSTRACT 7
CAPÍ TULO 1 - APRESEN TAÇÃO DO TEMA 8
1. Sarcom a de Ewing 8
2. Causas m oleculares 9 3. Tipo de herança e predisposição ao sarcom a de Ewing 1 1
4. Gene EWS 1 2
5. Gene NR0B1 1 3
6. ETS e EWS/ FLI 1 no sarcom a de Ewing 1 5
7. Obj et ivos 1 6
8. Bibliografia 1 6
CAPÍ TULO 2 - ARTI GO CI EN TÍ FI CO 2 0
CAPÍ TULO 3 – CON SI DERAÇÕES FI N AI S 2 8
RESUMO
O sarcom a de Ewing é um t um or altam ente agressivo que afeta ossos e tecidos m oles. Ele acom ete principalm ent e crianças e adult os j ovens. Em torno de 88% a 95% dos casos verifica- se a ocorrência de um a translocação entre o gene EWS ( lócus 22q12) e dois m em bros da fam ília do fator de transcrição ETS: o FLI 1 ( 11q24) ou o ERG (21q22). A t ranslocação m ais frequente envolve os genes EWS e FLI 1. Esta translocação leva à form ação do fator de transcrição quim érico aberrant e EWS/ FLI 1. O fator EWS/ FLI 1 regula o prom otor do gene NR0B1 através de um a ligação direta a sequências de m icrossatélites GGAA. Nosso obj etivo foi ident ificar e descrever a est rut ura m olecular de m otivos GGAA no prom otor de NR0B1 em pacientes com Sarcom a de Ewing não relacionados e não afetados da população sul brasileira. Foram ident ificados 21 alelos diferent es em 224 indivíduos est udados. Todos os alelos t iveram , pelo m enos, de 4 a 5 m ot ivos consecutivos GGAA. O alelo 24.2, correspondente a sequência ( GGAA)7A(GGAA)7A( GGAA)10, foi o m ais freqüent e em nossa população, est ando present e em
ABSTRACT
Ewing´ s sarcom a is a highly aggressive t um or of bone and soft t issues. I t affect s m ainly children and young adults. I n about 88% t o 95% t here is t he occurrence of a translocation bet ween t he EWS gene (22q12 locus) and t wo m em bers of ETS t ranscription factors fam ily: FLI 1 (11q24 locus) or ERG (21q22) . The m ost com m on t ranslocat ion involves gene EWS and FLI 1. This t ranslocation leads to the form ation of EWS/ FLI 1chim eric aberrant t ranscript ion factor. The EWS/ FLI 1 regulat es t he NR0B1 gene prom oter through a direct binding t o GGAA m icrosat ellit es sequences. Our obj ect ive was t o ident ify and describe t he m olecular st ruct ure of GGAA m otifs in NR0B1 prom oter in unrelat ed Ewing's Sarcom a patient s and healt hy subj ects from South Brazilian populat ion. Were identified 21 different alleles in t he 224 subj ect s. All alleles had at least 4 t o 5 consecutive GGAA m ot ifs. The 24.2, corresponding t o ( GGAA)7A(GGAA)7A( GGAA)10 sequence, was t he m ost frequent in our populat ion, being present
in 50.4% of subj ect s. Allele 24.2 could be associat ed t o Ewing's sarcom a developm ent since it was significant ly m ore frequent am ong patients. Differences in t he global configurat ion of
CAPÍ TULO 1 - APRESEN TAÇÃO DO TEMA
I N TRODUÇÃO
1 - Sarcom a de Ew ing
A fam ília de Tum ores de Ewing com preende um espect ro de neoplasias de células neuroectodérm icas prim it ivas que acom etem prim ariam ente o tecido ósseo e tecidos m oles ( Ferm an S. Fam ília de Tum ores de Ewing: sarcom a de Ewing e Tum ores Neuroect odérm icos
Prim it ivos Periféricos; Askin. Disponível em : ht t p: / / www.inca.gov.br/ cont eudo_view.asp?id= 345. Acesso em : j ulho de 2010) . O sarcom a de
Ewing ósseo corresponde a 87% dos tum ores classificados dent ro dessa fam ília, seguido do sarcom a extra- ósseo ( 8% ) e do tum or neuroectodérm ico prim it ivo periférico (5% ) ( Horowit z et
al., 1997).
O sarcom a de Ewing foi prim eiram ente descrit o por Jam es Ewing em 1921 com o um endoteliom a difuso de osso e, atualm ente, é considerado altam ente m aligno e m etast ático ( Randall et al., 2010) . É o segundo tum or ósseo m ais com um de ocorrência em crianças, adolescentes e j ovens adult os, represent ando de 10–15% de t odos os t um ores ósseos prim ários ( Huvos, 1991; Burchill, 2003) .
Este sarcom a pode afetar qualquer osso, m as os locais m ais com uns são as extrem idades inferiores (45% ) , seguido pela pélvis ( 20% ) , extrem idades superiores (13% ), esquelet o axial e costelas (13% ) , e face (2% ) (Grier, 1997; Burchill, 2003) . O fêm ur é o osso m ais frequentem ente afetado, no entanto, qualquer região óssea pode ser acom etida (Burchill, 2003) . É um sarcom a ligado à etnia, tendo um a dist ribuição desigual, com 96% dos casos ocorrendo em caucasianos, 1,8% em africanos e 2,2% em out ras raças ( Parkin et al., 1993).
A incidência do sarcom a de Ewing é m enor que 1 em um m ilhão nas populações do Lest e e Sudeste Asiát ico, países Africanos e em Afro-Am ericanos. Taxas interm ediárias de 1- 2 em um m ilhão são encont radas em Cuba, Porto Rico e em populações hispânicas dos Estados Unidos. Nos países ocident ais, a incidência na população caucasiana é de cerca de 2- 3 em um m ilhão ( Tortaj ada et al., 2005).
2 - Causas m olecula res
Em t orno de 88% a 95% dos casos verifica- se a ocorrência de um a translocação ent re o gene EWS (lócus 22q12) e dois m em bros da fam ília do fat or de transcrição ETS: o FLI 1 ( 11q24) ou o ERG ( 21q22) ( Zucm an- Rossi et al., 1997; Rerin, 2000). A translocação m ais frequênte envolve os genes EWS e FLI 1, a qual ocorre em aproxim adam ent e 85% dos casos, seguidas pela translocação do EWS com o gene ERG, a qual ocorre em cerca de 5-10% dos casos ( Figura 1) (Delattre et al., 1992; Sorensen et al., 1993; Zucm an et al., 1993; Ozaki et
al., 2002).
Figura 1 : Tabela retirada do artigo de Burchill ( 2003) que m ost ra as diferentes translocações crom ossôm icas envolvendo o gene EWS.
A fusão ent re os genes m em bros das fam ílias EWS e ETS, decorrente da translocação, é um event o oncogenét ico chave que ocorre nos tum ores Ewing. O resultado é a form ação de um fat or de t ranscrição quim érico aberrante a partir da ligação do am inoácido term inal do EWS, que se apresent a com o um fator ativador da transcrição, com a região carboxi-term inal de FLI 1 ou ERG (Delattre et al., 1992; Guillon et al., 2009) . Esse fat or de transcrição aberrante regula genes envolvidos no fenót ipo t um origênico do sarcom a de Ewing e apresenta um a atividade transcricional aum entada quando com parado ao norm al FLI 1 ( Burchill, 2003; Gangwal et al., 2008) .
form a m ais com um , designada 'Tipo 1', consiste nos prim eiros 7 exons do EWS unidos com exons 6-9 do gene FLI 1, que ocorrem em aproxim adam ent e 60% dos casos ( Figura 2). Dessa form a, Ginsberg et al. ( 1999) invest igaram se dois produtos de fusão dos genes alternativos, EWS/ FLI 1 e EWS/ ERG, definiriam diferent es característ icas clínicas. Ent ret ant o, de acordo com os resultados obtidos, nenhum a diferença clínica significativam ente diferente foi observada entre os dois grupos.
Figura 2: Representação da form a m ais com um dos locais de quebra e fusão dos genes EWS e FLI 1 (gravura reproduzida da publicada por Burchill, 2003) .
Figura 3: Variant es de anorm alidades crom ossôm icas encontradas em pacientes portadores de sarcom a de Ewing ( Burchill, 2003).
3 - Tipo de herança e predisposiçã o ao sarcom a de Ew ing
Apesar de algum as causas m oleculares já terem sido descritas em relação ao sarcom a de Ewing, pouco ou quase nada se sabe sobre o tipo de herança dessa doença. Este tipo de câncer já foi descrit o ent re irm ãos, porém esse fat o é bast ant e raro e essa doença parece não fazer parte das síndrom es de câncer fam ilial ( Hutter et al., 1964; Zam ora et al., 1986; Burchill, 2003). De acordo com Randall et al. ( 2010) , casos de pacient es afet ados pelo sarcom a de Ewing são reportados, na m aioria das vezes, com o sendo isolados, no ent ant o existem t rês cit ações de ocorrências publicadas em relação à irm ãos serem port adores de Ewing e, int eressant em ent e, t odos envolvendo indivíduos do sexo fem inino. O fat o de existirem irm ãos, portadores do sarcom a de Ewing pode im plicar um a leve, m as sugestiva contribuição da genética herdada para o risco de desenvolver a doença ( Randall et al., 2010) .
ser consideradas no m om ento de se atribuir as probabilidades de ocorrência do sarcom a de Ewing.
Zucm an- Rossi et al. ( 1997) investigaram a especificidade étnica do sarcom a de Ewing analisando possíveis variações int er- ét nicas da região de quebra do gene EWS, e encontraram um a rara deleção de repet ições Alu raça- específica no intron 6, que ocorreu exclusivam ente em negros. De acordo com este trabalho, o int ron 6 no gene EWS apresenta um a grande densidade de elem entos Alu ( 65% ) , m as em indivíduos de origem africana o tam anho deste int ron dim inui em cerca de 50% com o resultado de um a recom binação hom óloga entre duas sequências Alu ( Zucm an-Rossi et al., 1997; Ozaki et al., 2002). A variabilidade das repet ições Alu pode est ar envolvida na est abilização e na estrut uração dos crom ossom os.
Este resultado poderia sugerir que a presença do alelo m ut ant e m ais recent e ( m ut ação derivada ocorrida apenas entre indivíduos da população negra africana) pode explicar a proteção genética dos negros africanos ao sarcom a de Ewing. Na avaliação analítica se deve levar em conta que no trabalho de Zucm an-Rossi et al. foram est udados m ais indivíduos negros africanos que brancos europeus, e que a m utação derivada ( m ais recente) se apresentou em som ente 8% dos indivíduos oriundos da população negra. Dessa form a, apenas um pequeno núm ero de indivíduos est aria protegido, não sendo essa a única ou verdadeira razão para explicar a discrepância ét nica da incidência do sarcom a de Ewing.
Outra análise revela que a m aioria das translocações observadas nos portadores de sarcom a de Ewing ocorre no intron 7 do gene EWS, e não no intron 6, onde estão as inserções Alu, não explicando com plet am ente, port ant o, o papel da variabilidade Alu na diferença racial observada para prevalência do tum or. Sendo assim , outros elem entos genéticos deverão poder explicar a incidência desproporcional do sarcom a de Ewing em relação à etnia ( Zucm an- Rossi
et al., 1997; Kovar, 1998).
4 - Gene EW S
Esse gene tem com o sím bolo oficial EWSR1 ( Ewing sarcom a breakpoint region 1 - Hom o
sapiens) e est á localizado no crom ossom o 22 na banda cit ogenét ica 12.2 (GeneI D 2130) ( EWS
Hom o sapiens. Disponível em :
em m últiplas variantes t ranscritas (Figura 4) ( EWSR1. Disponível em : http: / / www.ncbi.nlm .nih.gov/ gene/ 2130. Acesso em : m aio de 2010).
Figura 4: Representação do gene EWS e suas variant es t ranscrit as ( A) e do seu cont ext o genôm ico ( B) ( EWSR1. Disponível em : http: / / www.ncbi.nlm .nih.gov/ gene/ 2130. Acesso em : m arço de 2012) .
5 - Gene NR0 B1
Figura 5: Representação do gene NR0B1 e suas variant es t ranscrit as ( A) e do seu cont ext o genôm ico (B) (NR0B1. Disponível em : ht t p: / / www.ncbi.nlm .nih.gov/ gene/ 190. Acesso em : m arço de 2012) .
6 - ETS e EW S/ FLI 1 no sarcom a de Ew ing
As prot eínas ETS são ext rem am ent e im portantes no desenvolvim ent o de t um ores hum anos ( Num m et al., 1983; De Taisne et al., 1984). Muit os m em bros da fam ília dos ETS se ligam a sequências de DNA cont endo m otivos principais GGAA ( ou GGAT em alguns casos) . Sequências que flanqueiam o núcleo GGAA contribuem com a afinidade e especificidade das int erações ( Set h & Wat son, 2005; Sharrocks, 2001; Szym czyna & Arrowsm it h, 2000) .
O tum or de Ewing foi o prim eiro tum or no qual se dem onstrou que os m em bros da fam ília ETS estavam envolvidos em translocações crom ossom ais, sendo assim , serviu de paradigm a para cânceres guiados por ETS ( Guillon, 2009) . Com o j á m encionado, na m aioria dos casos do sarcom a de Ewing, essa translocação ocorre entre os crom ossom os 11 e 22, levando a form ação do fator de transcrição quim érico aberrant e EWS/ FLI 1 ( Delat t re et al., 1992; Guillon et al., 2009) . Vários procedim ent os experim entais têm dem onstrado que os fat ores ETS se ligam a sequências ricas em purinas com núcleo GGAA/ T ( Mao et al., 1994; Ray- Gallet et al., 1995; Shore & Sharrocks, 1995; Szym czyna & Arrowsm ith, 2000), de form a que, at ualm ent e, é am plam ente aceit o que o potencial oncogênico do EWS/ FLI 1 é, no m ínim o, parcialm ent e m ediado pela m odulação da expressão de alvos transcricionais ( Janknecht , 2005) .
O EWS/ FLI 1 desem penha um papel crítico no estabelecim ento e na m anutenção do fenótipo tum origênico nas células portadoras do sarcom a de Ewing ( Kinsey et al., 2006; Sm it h, el al., 2006; Ouchida et al., 1995; Owen & Lessnick, 2006; Prieur et al., 2004) . Segundo Guillon et. al. (2009) , o EWS/ FLI 1 usa os m icrossat élit es que cont ém a sequência GGAA para regular alguns de seus genes alvo, incluindo seu alvo oncogenético chave, o gene NR0B1. De fato, o EWS/ FLI 1 regula o prom ot or do gene NR0B1 através de um a ligação direta com a sequência de m icrossat élit es GGAA ( Garcia- Aragoncillo et al. 2008; Gangwall et al. 2008). De form a interessante, a correlação foi observada entre o núm ero de blocos de repetição GGAA e o nível de expressão do NR0B1, reforçando a hipótese de que vários m onôm eros de EWS/ FLI 1 podem estar cooperando com um a região rica em GGAA ( Garcia- Aragoncillo et al. 2008).
De acordo com Guillon et al. (2009) , a ligação in v ivo do EWS/ FLI 1 às sequências repetidas de GGAA dem onstra um a preferência de ligação por regiões de nove ou m ais repet ições, e t ais result ados apontam à grande contribuição dos elem entos m icrossat élit es GGAA a regulação dos genes alvo pelo EWS/ FLI 1. Não obstante, recentes est udos dem onst ram um novo papel para os m icrossatélites no câncer hum ano e sugerem um m ecanism o exclusivo para a regulação dos fatores de transcrição ETS de genes alvo ( Gangwall et al. 2008, Guillon
7 - Obj et ivos
O obj et ivo deste est udo foi analisar as sequências de m icrosat élit es ( GGAA)n present es no prom ot or do gene NR0B1 em indivíduos afetados e não- afet ados pelo sarcom a de Ewing. Especificam ent e, foram as int enções:
1. I dent ificar o núm ero de repet ições m icrossat élit es ( GGAA)n present es na sequência do prom otor do gene NR0B1 em indivíduos afetados pelo sarcom a de Ewing em indivíduos não-afet ados pelo sarcom a de Ewing pert encent es à população do Rio Grande do Sul. 2. Criar a escada alélica de repetições m icrossatélit es ( GGAA) n presentes na sequência do
prom otor do gene NR0B1 na população estudada.
3. Com parar as frequências alélicas entre o grupo de indivíduos afet ados pelo sarcom a de Ewing e o grupo de indivíduos não- afetados não aparentados.
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CAPÍ TULO 2 - ARTI GO CI EN TÍ FI CO
( Manuscrito subm et ido ao periódico “ HUMAN PATHOLOGY” )
MAN USCRI PT TI TLE: GGAA MI CROSATELLI TES I N NR0B1 PROMOTER: ALLELE ( GGAA)7A(GGAA)7A( GGAA)10 ASSOCI ATED WI TH EWI NG'S SARCOMA
AUTHORS, AFFI LI ATI ON S AN D ADDRESSES:
Elisa C. De Toni: Laboratory of Molecular and Hum an Genetics, Faculty of Biosciences, PUCRS, 90619- 900, Porto Alegre, RS, Brazil.
Deborah S. B. S. Silva : Laboratory of Molecular and Hum an Genetics, Faculty of Biosciences, PUCRS, 90619- 900, Porto Alegre, RS, Brazil.
Ferna nda R. Saw it zki: Laborat ory of Molecular and Hum an Genet ics, Facult y of Biosciences, PUCRS, 90619- 900, Porto Alegre, RS, Brazil.
Piet ra Graebin: Laboratory of Molecular and Hum an Genet ics, Facult y of Biosciences, PUCRS, 90619-900, Port o Alegre, RS, Brazil.
Ana Lucia Abuj am ra: Cancer Research Laborat ory, Universit y Hospit al Research Cent er ( CPE-HCPA) , Federal University of Rio Grande do Sul, 90035-003, Port o Alegre, RS, Brazil; National I nstitute for Translational Medicine, 90035- 003, Port o Alegre, RS, Brazil; Children’s Cancer I nstit ut e and Pediat ric Oncology Unit , Federal University of Rio Grande do Sul, 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil; Medical Sciences Program , School of Medicine, Federal Universit y of Rio Grande do Sul.
Juliane B. Pica nço: Laboratory of Molecular and Hum an Genet ics, Facult y of Biosciences, PUCRS, 90619- 900, Porto Alegre, RS, Brazil.
Caroline B. de Fa ria s: Cancer Research Laborat ory, Universit y Hospit al Research Cent er ( CPE-HCPA) , Federal University of Rio Grande do Sul, 90035-003, Port o Alegre, RS, Brazil; Nat ional I nst it ut e for Translat ional Medicine, 90035- 003, Port o Alegre, RS, Brazil; Children’s Cancer I nstit ut e and Pediat ric Oncology Unit , Federal University of Rio Grande do Sul, 90035-003, Port o Alegre, RS, Brazil.
Ra fael Roesler: Laboratory of Molecular Neuropharm acology, Depart m ent of Pharm acology, I nstit ute for Basic Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Sul, 90050-170, Porto Alegre, RS, Brazil; Cancer Research Laborat ory, Universit yHospit al Research Cent er ( CPE-HCPA) , Federal University of Rio Grande do Sul, 90035- 003, Port o Alegre, RS, Brazil; Nat ional I nst it ut e for Translat ional Medicine, 90035- 003, Porto Alegre, RS, Brazil.
Algem ir L. Brunet t o: Cancer Research Laboratory, University Hospital Research Center (CPE-HCPA) , Federal University of Rio Grande do Sul, 90035- 003, Port o Alegre, RS, Brazil; Nat ional I nstit ute for Translational Medicine, 90035-003, Port o Alegre, RS, Brazil; Children’s Cancer I nst it ut e and Pediat ric Oncology Unit , Federal Universit y of Rio Grande do Sul, 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil.
GGAA MI CROSATELLI TES I N NR0 B1 PROM OTER: ALLELE ( GGAA)7A( GGAA)7A( GGAA)1 0 ASSOCI ATED W I TH EW I N G'S SARCOM A
ABSTRACT
Ewing´ s sarcom a is a very aggressive tum or of bone and soft t issues t hat occurs m ainly during childhood and early adult hood is caused by a recurrent chrom osom al translocation that encodes EWS/ FLI oncoprotein. EWS/ FLI binds t o GGAA m icrosatellites, located in t he prom oter of NR0B1 gene. Our obj ect ive was t o ident ify and describe t he m olecular st ruct ure of GGAA m ot ifs in NR0B1 prom ot er in unrelat ed Ewing's Sarcom a patients and healthy subjects from Sout h Brazilian populat ion. A t ot al of 21 different alleles were ident ified in t he 224 subject s. All alleles had at least 4 to 5 consecutive GGAA m otifs. The 24.2 NR0B1 prom oter allele [ (GGAA)7A( GGAA)7A(GGAA)10 sequence] was t he m ost frequent in our populat ion being
present in 50.4% of subject s. Allele 24.2 could be associated t o Ewing's sarcom a developm ent since it was significant ly m ore frequent am ong pat ient s. Differences in t he global configurat ion of NR0B1 prom oter GGAA m icrosatellites ( size, sequence, am ount and position of GGAA repeat s and single 'A' base insert ions) could result in differences in Ewing's sarcom a susceptibility. All these results will provide insight s for t he underst anding of t um origenesis.
KEYW ORDS: Ewing´ s sarcom a, NR0B1, GGAA m icrosatellites, allele 24.2
I N TRODUCTI ON
To develop new t herapeut ic approaches t o a highly m alignant disease as Ewing's Sarcom a is im portant and necessary t o understand the m olecular structure and the em ergent propert ies that regulat e the prom ot er of the gene NR0B11. This very aggressive soft t issues and bone t um or that occurs m ainly during childhood and early adult hood and is caused by a recurrent chrom osom al t ranslocat ion that encodes EWS/ ETS oncoproteins1,2,3. Ewing's sarcom a
EWS/ FLI , t he m ost im portant EWS/ ETS fusion, regulates a portion of t arget genes, including t he crit ical oncogenic t arget NR0BI, via GGAA m icrosatellit es in their prom oter4,5. Because EWS/ FLI is also key oncoprotein in various hum an cancers, Ewing's sarcom a serves as a paradigm for ETS-driven cancers4,6.
The prom oter of NR0B1 cont ains GGAA-m icrosat ellit es, consist ing of m ult iple copies of GGAA core m otif, with occasional insertions4,1. These GGAA-m icrosat ellit es were ident ified as
EWS/ ETS response elem ent s in Ewing's sarcom a being necessary and sufficient for EWS/ FLI -m ediated regulat ion of NR0B14.
EWS/ FLI protein binds in GGAA sequences and m echanist ic studies dem onstrated that t he abilit y of EWS/ FLI t o bind DNA and m odulat e gene expression t hrough t hese repet it ive elem ent s depended on t he st ruct ure of GGAA m ot ifs1,4. I t was shown t hat it is not sim ply t he
ability to funct ion as an EWS/ FLI response elem ent s, but rat her t he num ber of consecut ive ( in tandem ) GGAA repeats t hat is im port ant7. Experim ental analysis of DNA probes and prom ot er
fragm ents with variable num ber of repeats indicat ed t hat at least 4 t o 5 consecut ive GGAA m ot ifs are required for DNA binding and gene activation and that the efficiency of t hese processes increased wit h increasing num bers of repeat s4. Additionally, it was dem onstrated
that the num ber of consecutive GGAA repeats as well as the position of the single 'A' base insertions will influence the binding of EWS/ FLI oncoprotein to DNA1.
Here our obj ect ive was t o ident ify and describe t he m olecular st ruct ure of GGAA m ot ifs in NR0B1 prom oter in unrelated Ewing's Sarcom a pat ient s and healt hy subj ects from Sout h Brazilian populat ion.
MATERI ALS AN D METHODS
The Ewing’s sarcom a pat ients (14 fem ale; 10 m ale; 1 to 21 years old) were diagnosed in t he Pediat ric Oncology Departm ent , Port o Alegre Clinic Hospit al (HCPA), Rio Grande do Sul, Brazil. All t he 24 clinic diagnoses were confirm ed by m edical im aging and biopsies st udies. The control group consist ed of 200 people without Ewing’s sarcom a, geographically m atched to the pat ient s. This st udy was approved by t he Research Et hics Com m it tee of each inst it ut ion. All subject s included in t his st udy gave inform ed consent .
Leukocyte DNA was am plified in a final volum e of 25µl reaction cont aining 1-10ng of DNA, 12.5µL of Mast er Mix Mult iplex PCR Kit ( QI AGEN Gm bH, Hilden, Germ any) , 10 pm ol/ µL of upst ream and downst ream prim ers and 5.0µL of Q Solution (QI AGEN Gm bH, Hilden, Germ any). PCR was perform ed on a Verit i Therm al Cycler ( Applied Biosyst em s; Life Technologies, Fost er, CA, USA) using predenaturat ion of 38 cycles of 94° C- 60s, 57° C- 90s and 72° C- 30s, and a final ext ension. The prim ers used t o am plify t he t argeted regions ( design using the Prim er3 algorithm ; http: / / frodo.wi.m it .edu/ prim er3) were 5'
-TCTTATGCTGAGAATTCCAGGTC- 3' and 5'- AAGAAGAGGGAGGATGGGA- 3'. Sequencing reactions were perform ed in ABI 3730xl DNA Analyzer (96 capillary t ype). Sequencing reactions were perform ed int he DNA Engine Tet rad 2 Pelt ier Therm al Cycler ( BI O-RAD) using t he ABI BigDye®
Term inat or v3.1 Cycle Sequencing Kit ( Applied Biosystem s, Life Technologies, Foster, CA, USA) , following t he prot ocols supplied by t he m anufact urer. The sequencing had bet ter result s for forward single strand DNA, which was used for t he proceeding analysis. I n all sequences involved in t his st udy we clearly discerned t he forward prim er followed by a beginning box, GGAA repeat s, ending box and finishing wit h prim er reverse (see m odel on Figure 1). All subject s invest igated in t his st udy had t he sam e prim ers, beginning box and ending box sequences.
were able to identify the arrangem ent of GGAA m otifs on NR0B1 prom oter. A total of 21 different alleles were ident ified in t he 224 subject s, which were classified according t o t he am ount and position of GGAA repeat s and single 'A' base insert ions ( Table 1) . The Table shows that all alleles had at least 4 t o 5 consecut ive GGAA m ot ifs. Using Chi Square Test we com pared patients ( n= 24) with controls (n= 200) concerning NR0B1 prom oter allele frequencies and t ot al GGAA m ot ifs, t ot al of 'A' insert ions, greater num ber of consecut ive GGAA m ot ifs, and t ot al allele base pairs, but no significant differences were found ( Figure 2) . There was no significant difference between pat ient s and cont rols even when we t est ed for t he presence of alleles st art ing by ( GGAA)5A (p= 0.1124; Chi Square Test ) . The 24.2 NR0B1
prom oter allele [ (GGAA)7A( GGAA)7A(GGAA)10 sequence] was the m ost frequent in our
populat ion, being present in 50.4% of all subject s ( see Figure 2- A) . I nterest ingly, we detected that 24.2 NR0B1 prom oter allele rate was significantly higher in Ewing's sarcom a patients; t his allele is present in 70.8% and 48.0% of patient s and cont rols, respect ively (p= 0.0345; Chi Square Test).
Different num bers of consecut ive GGAA repeats on t he lengt h of NR0B1 prom oter allow different configurat ions of EWS/ FLI binding. I n t his work we invest igat ed 224 subject s from South Brazil and report ed 21 different NR0B1 prom oter alleles by sequencing. We not iced an increasing expansion of GGAA m otifs interposed by single 'A' bases in each 3 to 15 consecut ive GGAA repeats extending by a length of 66 to 395bp of the NR0B1 prom oter. Not only patient s, but also controls had at least 4 t o 5 consecutive GGAA m ot ifs, which are required for EWS/ FLI binding. I n addition, we reported here that 24.2 NR0B1 prom oter allele could be associated to Ewing's sarcom a developm ent since it was significant ly m ore frequent am ong patients. Because t he 24.2 NR0B1 prom ot er allele has a part icular struct ure, we are able t o em phasize that the differences in the global configurat ion of NR0B1 prom oter GGAA m icrosatellites (size, sequence, am ount and position of GGAA repeat s and single 'A' base insertions) could result in differences in Ewing's sarcom a suscept ibilit y. Opportunely, should be interest ing to analyze allele rat es according Ewing's sarcom a m edical evolut ion. All these result s will provide insight s for t he understanding of tum origenesis.
REFEREN CES
1. Gangwal K, Close D, Enriquez CA, et al: Em ergent propert ies of EWS/ FLI regulat ion via GGAA m icrosat ellit es in Ewing´ s sarcom a. Genes & Cancer 2: 177- 187, 2010.
2. Guillon N, Tirode F, Boeva V, et al: The oncogenic EWS- FLI 1 prot ein binds in vivo GGAA m icrosat telit e sequences wit h pot ent ial t ranscript ional act ivat ion funct ion. PNAS 29: 10149-10154, 2009.
3. Sorensen PH, Liu XF, Delat t re O, et al: Reverse t ranscript ase PCR am plificat ion of
4. Gangwal K, Sankar S, Hollenhorst PC, et al: Microsatellites as EWS/ FLI response elem ent s in Ewing´ s sarcom a. Proc Nat l Acad Sci U S A 105: 10149- 10154, 2008.
5. Jedlicka P: Ewing sarcom a, an enigm at ic m alignancy of likely progenit or cell origin, driven by t ranscript ion fact or oncogenic fusions. I nt J Clin Exp Phatol 3: 338- 347, 2010. 6. Delat t re O, Zucm an J, Plougast el B, et al: Gene fusion with an ETS DNA- binding dom ain
caused by chrom osom e translocation in hum an tum ors. Nat ure 359: 162- 165, 1992. 7. Gangwal K, Lessnick SL: Microsatellites are EWS/ FLI response elem ents: genom ic
Figure 1 . Standard NR0B1 prom ot er allele with 25 GGAA repeats and two single insertions of 'A' base to show the reference patterns used t o know the other alleles; I n black up: forward prim er; I n whit e up: beginning box; I n gray: GGAA repeat s allele; I n whit e down: ending box; I n black down: reverse prim er.
tcttatgctg agaattccag gtc
ctggaga agaagaaaaa gagaaagaaa
gagagagaga gaaggagtga gagagggagg gagggaggga gggagggagg
aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaagga aggaaggaag gaaggaagga
aggaaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa
aagaaacagc aaaaaaagaa a
gagggagga tggga
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aggaaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa
Table 1 . Different alleles by GGAA m otifs in NR0B1 prom oter.
Allele
Nam e* Total of GGAA
m ot ifs
Total of 'A' insert ions
Great er num ber of consecut ive GGAA m ot ifs
Total of base
pairs* * NR0B1
prom ot er allele sequences bet ween beginning and ending boxes
16.2 16 1 11 66 (GGAA)5A(GGAA)11
17.2 17 1 12 70 (GGAA)5A(GGAA)12
18.2 18 1 13 74 (GGAA)5A(GGAA)13
19.2 19 1 14 78 (GGAA)5A(GGAA)14
20.2 20 1 15 80 (GGAA)5A(GGAA)15
21.2 21 2 8 86 (GGAA)7A(GGAA)6A(GGAA)8
23.2 23 2 9 94 (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)9
24.2 24 2 10 98 (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)10
25.2 25 2 11 102 (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)11
26.2- A 26 2 12 106 (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)12
26.2- B 26 2 11 106 (GGAA)7A(GGAA)8A(GGAA)11
26.2- C 26 2 11 106 (GGAA)8A(GGAA)7A(GGAA)11
27.2- A 27 2 13 110 (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)13
27.2- B 27 2 12 110 (GGAA)8A(GGAA)7A(GGAA)12
28.2 28 2 14 114 (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)14
38.3 38 3 13 ( x2) 155 (GGAA)5A(GGAA)13A(GGAA)7A(GGAA)13
57.6 57 6 12 234 (GGAA)5A(GGAA)10A(GGAA)8A(GGAA)4A(GGAA)12A(GGAA)9A(GGAA)9
59.6 59 6 14 242 (GGAA)5A(GGAA)10A(GGAA)8A(GGAA)4A(GGAA)14A(GGAA)9A(GGAA)9
60.5 60 5 15 245 (GGAA)5A(GGAA)10A(GGAA)11A(GGAA)15A(GGAA)9A(GGAA)10
75.8 75 8 13 308 (GGAA)5A(GGAA)11A(GGAA)8A(GGAA)4A(GGAA)13A(GGAA)4A(GGAA)12A(GGAA)9A(GGAA)9
96.11 96 11 13 395 (GGAA)5A(GGAA)11A(GGAA)6A(GGAA)11A(GGAA)11A(GGAA)5A(GGAA)8A(GGAA)3A(GGAA)10A(GGAA)10A(GGAA)5A(GGAA)9A(GGAA)13
* The NR0B1 prom oter alleles were nam ed using the num ber of GGAA m otifs followed by the num ber of single "A" insertions (see the second and t hird colum ns in t his t able); Let t ers -A, - B, and - C were used t o discrim inat e t he alleles when t he "A" insert ions were in different posit ions. * * The num ber of base pairs was calculat ed considering t he first nucleot ide aft er t he beginning box unt il t he last nucleot ide before t he ending box (see m odel in Figure 1) .
Figure 2 . Com parison between patients (n= 24; gray) wit h controls ( n= 200; black) concerning NR0B1 prom oter allele data: A- allele frequencies, B- total of 'A' insertions, C- total of base pairs (up) and t ot al of GGAA m ot ifs (down), D- great er num ber of consecut ive GGAA m ot ifs.
0 2 4 6 8 10 12 14
16.117.118.119.120.121.223.224.225.2 26.2 -A 26.2 -B 26.2 -C 27.2 -A 27.2 -B
28.238.357.659.660.575.896.1 1 0 2 4 6 8 10 12 14
16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 28 38 57 59 60 75 96
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
8 9 10 11 12 13 14 15
0 1 2 3 4
2 3 5 6 8 11
40 80 100 40 80 / / / / / / 40 80 / /
102 106 110 114 155 234 242 245 308 395 66 70 74 78 80 86 94 98
F re q u e n c y ( % ) F re q u e n c y ( % ) F re q u e n c y ( % ) F re q u e n c y ( % )
N R0 B1 prom ot er a lleles
Tot al of GGAA m ot ifs Tot al of base pairs
Tot al of A insert ions
Grea t er num ber of consecut ive GGAA m ot ifs
A
B
CAPÍ TULO 3 - CON SI DERAÇÕES FI N AI S
At ravés dest e est udo foi possível ident ificar e descrever a est rut ura m olecular de m ot ivos de repet ição ( GGAA) n na região prom otora do gene NR0B1 em pacient es com sarcom a de Ewing não relacionados e indivíduos saudáveis da população do Rio Grande do Sul, Brasil. Com o present e est udo foi possível identificar um t ot al de 21 alelos diferent es em 224 indivíduos estudados. Est es alelos foram classificados de acordo com a quant idade e posição de m ot ivos de repet ição GGAA e inserções de base única 'A' ( adenina). O teste est atístico qui-quadrado não revelou resultados significativos quando analisadas as frequências alélicas do prom ot or do gene NR0B1, ent re os pacient es ( n= 24) e os controles (n= 200) . O alelo 24.2, correspondente a sequência (GGAA)7A ( GGAA)7A ( GGAA)10, foi o m ais frequent e t ant o na
população dos pacientes quanto na população dos controles, estando presente em 50,4% de todos os indivíduos. Além disso, foi possível observar que a t axa do alelo 24,2 foi significat ivam ent e m aior em pacient es com sarcom a de Ewing ( 70,8% ) do que nos controles ( 48,0% ). At ravés destes dados foi possível concluir que o alelo 24.2 pode est ar associado ao desenvolvim ento do sarcom a de Ewing. Levando-se em conta que a proteína quim érica aberrante EWS / FLI apresenta variabilidade de ligação ao DNA que depende da est rut ura dos m ot ivos de repetição GGAA ( tam anho, sequência, quantidade e posição das repetições) além do local das inserções de base única ‘A’, podem os afirm ar que estas configurações estruturais podem result ar em diferent e suscept ibilidade ao sarcom a de Ewing. Oportunam ente, será interessante analisar as taxas de alelos de acordo com a evolução m édica do sarcom a de Ewing.
O ent endim ent o de m ecanism os oncogenét icos que envolvem m em bros da fam ília ETS pode levar a novas perspect ivas de diagnóstico, prognóstico e abordagens terapêuticas. O present e t rabalho vem j ust am ent e corroboar com essas perspect ivas. No ent ant o, para que se possa identificar a susceptibilidade de um indivíduo à doenças com plexas, com o o sarcom a de Ewing, se faz necessária a realização de abordagens envolvendo não só o gene NR0B1 m as tam bém outras estruturas genicas com o, por exem plo, segm ent os polim órficos e m ut ados nos genes EWS e FLI. Um a análise conj unta da herança de cada paciente poderia increm entar result ados e conclusões que venham , em breve, im pulsinar a ciência e facilitar o diagnóstico e/ ou o prognóstico aos pacient es com sarcom a de Ewing.
sarcom a de Ewing. Considerando que a literatura experim ent al t em report ado que m ut ações no NR0B1 podem levar ao desenvolvim ento de hipoplasia, é possível sust entar a possibilidade de que determ inadas estrut uras nesse gene possam influenciar o risco de um indivíduo. Apesar destes result ados, acredit a- se est ar longe a obt enção de um a resposta concreta sobre quais os reais fatores que desencadeiam a susceptibilidade ao sarcom a. Há ainda m uito que se descobrir sobre o câncer de com o o organism o hum ano responde aos diferentes fatores int rínsecos e ext rínsecos, e por que algum as pessoas tendem a t er o m esm o desfecho clínico, m esm o não sendo encontrada associação estatíst ica com os principais sinalizadores do câncer. Trabalhar com esta variante polim órfica do gene NR0B1 foi um em penho a m ais na busca de desvendar part e do pequeno efeit o que a herança genét ica pode t er sobre a t um origênesis.
Com base nos obj et ivos dest e t raba lho, as conclusões foram que:
1- O núm ero de repet ições m icrossat élit es ( GGAA)n present es na sequência do prom otor do gene NR0B1 em indivíduos afetados pelo sarcom a de Ewing e em indivíduos não-afetados pertencent es à população do Rio Grande do Sul foi de 3 a 15 consecut ivas e 16 a 96, considerando as inserções de base 'A'.
2- A escada alélica de repet ições m icrossatélites (GGAA)n presentes na sequência do prom otor do gene NR0B1 na população estudada m ostrou variar de 66 a 395 pares de bases, com 21 t ipos diferent es de alelos.
