R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c in a T r o p ic a l 2 4 ( 4 ) : 2 0 9 - 2 1 6 , o u t - d e z , 1 9 9 1
A R T I G O S
E S T U D O D O C O M P O R T A M E N T O D E C E P A S D E
TRYPANOSOMA CRUZI
A P Ó S P A S S A G E M E M D IF E R E N T E SE S P É C IE S D E T R IA T O M ÍN E O S
Juracy B. Magalhães e Sonia G. Andrade
F o i e s tu d a d a a in flu ê n c ia d a p a s s a g e m e m d ife r e n te s e s p é c ie s d e tr ia to m ín e o s d e c e p a s d o T. cruzi b io lo g ic a m e n te d is tin ta s , m a n ti d a s e m c a m u n d o n g o s . C e p a s : P e r u a n a (T ip o I ), 1 2 S F (T ip o II), C o lo m b ia n a (T ip o 111). T r ia to m ín e o s : Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus e Triatom a infestans. N in fa s d o 4 o e s tá g io f o r a m a lim e n ta d a s e m c a m u n d o n g o s in fe c ta d o s c o m a s r e s p e c tiv a s c e p a s e o b ti d o s o s in ó c u lo s ( i c f t f o r m a s m e ta c íc li n a s ) p a r a in fe c ç ã o d e c a m u n d o n g o s d e 8 a 1 0 g . G r u p o s e x p e r im e n ta is p a r a c a d a c e p a : I - C o n tr o le s in o c u la d o s c o m f o r m a s s a n g u íc o la s ; 11,111 e T V - in o c u la d o s c o m m e ta c íc li c o s d e P. megistus, T. infestans o u
R. prolixus, r e s p e c tiv a m e n te . O s p e r fi s d e p a r a s ite m ia f o r a m m a n ti d o s p a r a c a d a c e p a , c o m p i q u e s m a is e le v a d o s n a s in fe c ç õ e s c o m m e ta c íc li c o s d o P. megistus e d o R. prolixus, p a r a a c e p a P e r u a n a , d o P. megistus p a r a a 1 2 S F e d o R. prolixus, p a r a a C o lo m b ia n a . O h is to tr o p is m o e o p a d r ã o d e le s õ e s f o r a m m a n ti d o s p a r a o s tr ê s tip o s d e c e p a s . O g r a u d e v ir u lê n c ia d a c e p a P e r u a n a f o i id ê n tic o e m to d o s o s g r u p o s e v a r io u p a r a a s c e p a s 1 2 S F e C o lo m b ia n a d e a c o r d o c o m a e s p é c ie d e tr ia to m ín e o u s a d a , c o m p r e d o m i n â n c ia d e f o r m a s d e lg a d a s , n o s in o c u la d o s c o m f o r m a s m e ta c íc lic o s o q u e f o i in te r p r e ta d o c o m o u m a f a s e a d a p ta tiv a d a s f o r m a s m e ta c íc lic o s a o h o s p e d e ir o v e r te b r a d o .
P a la v r a s - c h a v e s : Trypanosoma cruzi. T r ia to m ín e o s . C e p a s d o T. cruzi. C a r a c te r e s b io ló g ic o s . V e to r e s .
Em trab alh o a n te rio r10 tivem os a oportunidade de verificar que a passagem das
cepas Y e Peruana do
T. cruzi
em diferentes meiosde multiplicação (culturas acelulares, passagem em triato m ín eo s) ou a m anutenção em criopreservação, não alteravam o comportamento morfobiológico destas cepas, na infecção de camundongos, de acordo com critérios previamente estabelecidos1. No referido estudo, foi utilizado
exclusivamente o
R. prolixus
para avaliar o efeitoda passagem em triatomíneos sem que se tenham observado alterações do comportamento das mesmas. Também Garcia e cols6 verificaram que a passagem de uma cepa homogênea em triatomíneo não alterou os seus caracteres biológicos, bioquímicos e genéticos. Carvalheiro e Collares4,
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/Fundação Oswaldo Cruz, Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA.
Apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
E ndereço p a r a co rresp o n d ên cia: Dra. Sonia G. Andrade, R. Valdemar Falcão 121 Brotas, 41945 Salvador, BA. Recebido para publicação em 14/06/91.
fazendo uma passagem da cepa Y em
T. infestans
verificaram a manutenção da virulência da cepa com altos níveis parasitêmicos e alta mortalidade, assinalando en tretanto uma dim inuição do reticuloptropismo, o que não foi por nós observado
em relação ao
R. prolixus.
Outros autores, entretanto,comparando a infectividade de formas sanguícolas de diferentes cepas com a de formas metacíclicas dos triatomíneos encontraram maior infectividade nas primeiras, com maiores níveis parasitêmicos, bem como diferenças no viscerotropismo71114. Deste modo é de interesse verificar se as características de cepas de tipos biológicos padronizados (Tipos I, II e III) de acordo com Andrade1, são mantidas após passagens em diferentes espécies de triatomíneos. Tendo em vista as diferenças geográficas de distribuição das espécies de triatomíneos na América Central e do Sul15 e no Brasil915 e levando em conta as diferenças de suscetibilidade de diferentes espécies de triatomíneos5816, o papel do inseto vetor deveria ser melhor avaliado quanto à sua influência na
patogenicidade e virulência das cepas do
T. cruzi.
M a g a lh ã e s J B , A n d r a d e S G . E s tu d o d o c o m p o r ta m e n to d e c e p a s d o Trypanosoma cruzi a p ó s p a s s a g e m e m d i f e r e n t e s e s p é c ie s d e tr ia to m ín e o s . R e v is ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic in a T r o p ic a l 2 4 : 2 0 9 - 2 1 6 , o u t- d e z , 1 9 9 1
M ATERIAL E MÉTODOS
Camundongos suíços inoculados com 10^ formas sanguícolas do T r y p a n o s o m a c r u z i das cepas Peruana (Tipo I), 12 SF (Tipo II) ou Colombiana (Tipo III) foram utilizados para a alimentação (xenodiagnóstico) das seguintes espécies de triatomíneos: R h o d n i u s p r o l i x u s , P a n s t r o n g y l u s m e g i s t u s e T r i a t o m a i n f e s t a n s . Foram utilizadas ninfas do 4 o estágio fornecidas pelo Laboratório de Parasitologiado Centro de Pesquisas GonçaloMoniz. Os camundongos no 8 o dia de infecção pela cepa Peruana, no 12° dia de infecção pela cepa 12 SF e no 18 ° dia pela cepa Colombiana foram anestesiados e subm etidos ao xenodiagnóstico em grupos individualizados para cada espécie de triatomíneo utilizada. As ninfas foram mantidas por 45 dias sem posterior alimentação. Para obtenção de inóculos provenientes de cada espécie de triatomíneo, o conteúdo intestinal dos insetos foi extraído, suspenso emPBS pH 7.2 e após três lavagens por centrifugação a 1.000 g com salina tamponada, feita contagem das formas metacíclicas em câmara Neubauer. Os inóculos foram padronizados em 104 metacíclicos em 0,2 ml e inoculados em camundongos de 8 a 10g por via intraperitoneal. Para cada cepa do T . c r u z i , foram feitos 4 grupos experimentais: Grupo I - camundongos controles, infectados com formas sanguícolas provenientes de camundongos; Grupo II - camundongos infectados com metacíclicos obtidos do P . m e g i s t u s ; Grupo III - camundongos infectados com metacíclicos provenientes do T. in f e s t a n s ; Grupo IV - camundongos inoculados com formas de R . p r o l i x u s .
Na Tabela 1 constam os números de animais de cada grupo. Como controles, camundongos suiços de 8 a 10 g foram inoculados com formas sanguícolas obtidas de camundongos, após três lavagens em salina tamponada e inóculos idênticos (104), para as três cepas.
Os camundongos infectados, dos diversos grupos experimentais, foram acompanhados quanto à evolução deparasitemia, à morfologia dos parasitos no sangue periférico, aos índices de mortalidade e às lesões histopatológicas no curso da infecção. A parasitemia foi avaliada em 5 animais de cada grupo, no sangue periférico, entre lâmina elamínula em 50 campos microscópicos de X400 e expressa pela média aritmética do número de parasitos
encontrado. O estudo morfológico foi feito em esfiregaços de sangue periférico, corados pelo método de Giemsa, do 7 o ao 14° dias pós infecção através contagem percentual de formas largas e delgadas. A mortalidade foi avaliada pela percentagem de animais que morreram durante a infecção excluídos os sacrificados. Os dados de mortalidade nos diversos grupos constam da Tabela 1.
O estudo histopatológico foi feito em camundongos sacrificados no 7 o, 10°, 12°, 14° e 17° dias pós infecção com a cepa Peruana e no 7 o, 12°, 15°, 20°, 25° e 30° com as cepas 12 SF ou Colombiana. Os animais sacrificados após anestesia pelo éter, foram submetidos a autópsias completas e fragmentos dos diversos órgãos fixados em formol a 10%.
RESULTADOS
I. C a m u n d o n g o s in fe c ta d o s c o m a c e p a P e r u a n a .
a. E v o l u ç ã o d a p a r a s i t e m i a . N a Figura 1 estão expressos os níveis de parasitemia nos diversos grupos de infecção pela cepa Peruana. Em todos os grupos observou-se acentuada e precoce elevação da parasitemia, com piques elevados do 8o ao 14° dia, observando-se os níveis mais elevados nos infectados com formas do P . m e g i s t u s e do R . p r o l i x u s .
b. O s í n d i c e s d e m o r t a l i d a d e foram de 100 % do
M a g a l h ã e s J B , A n d r a d e S G . E s tu d o d o c o m p o r t a m e n to d e c e p a s d o Trypanosom a cruzi a p ó s p a s s a g e m e m d i f e r e n t e s e s p é c i e s d e t r i a t o m í n e o s . R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s i l e ir a d e M e d i c in a T r o p i c a l 2 4 : 2 0 9 - 2 1 6 , o u t- d e z , 1 9 9 1
14° ao 17° dia pós infecção, para todos os grupos experimentais (Tabela 1).
c.
O estudo morfológico
(Tabela 2) mostroupredominância de formas delgadas até o 14° dia nos animais infectados com formas sanguícolas e com
inóculo proveniente do
R. prolixus.
Nos inoculadoscom formas derivadas do
P. megistus
e doT.
infestans
as formas delgadas predominaram até o10° dia e no 14° predominavam as formas largas,
d.
Estudo histopatológico
- a infecção comTabela 1
-Dados Gerais - Infecção de camundongos com diferentes cepas do
T. cruzi(formas sanguícolas
e metacíclicas)
Cepas: Grupos*
experimentais
Peruana 12 SF Colombiana
N° Animais
Mortalidade
%
N° Animais
Mortalidade
%
N° Animais
Mortalidade %
I. Controles 20 100 20 69 20 7
II.
P. megistus
8 100 20 62 8 45III.
T. infestans
11 100 27 90 11 92IV.
R. prolixus
8 100 24 33,3 8 100* Origem do inóculo: 104 formas sanguícolas (I) e 104 metacíclicos (II, III, IV)
Tabela 2 - Cepa Peruana do
T. cruzi-Estudo morfológico. Percentagem deformas tripomastigotas largas
e delgadas no sangue periférico.
Grupos experimentais 7° dia 10° dia 14° dia
(origem inóculo)* L
%
D L%
D L D%
I. Camundongos
(controles) 14 56 35 65 25 76
II.
P. megistus
38 62 37 63 65 35III.
T. infestans
- - 23 77 59 41IV.
R. prolixus
6 94 23 77 43 57* I = Form as sanguícolas; II, III, IV = formas metacíclicas.
- n° insuficiente para.estudo; L = largas, D = delgadas
M a g a l h ã e s J B , A n d r a d e S G . E s tu d o d o c o m p o r t a m e n t o d e c e p a s d o T r y p a n o so m a c r u z i a p ó s p a s s a g e m e m d i f e r e n t e s e s p é c i e s d e tr i a t o m í n e o s . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 4 : 2 0 9 - 2 1 6 , o u t - d e z , 1 9 9 1
formas sanguícolas provenientes de camundongos determinou moderado macrofagotropismo a partir do 7° dia de infecção e discreto parasitismo de músculo esquelético e de miocárdio no 10° e 12° dias. Aos 17 dias observou-se acentuado parasitismo e intenso processo inflamatório em miocárdio e músculo esquelético. Nos camundongos infectados com inóculos provenientes das três espécies de triatomíneos, o parasitismo de macrófagos só foi visto a partir do 13° dia de infecção, em baixa intensidade. Aos 13 dias observou-se discreto parasistismo e discreto processo inflamatório em miocárdio e músculo esquelético que se intensificou entre 15° e 17° dias pós infecção.
n . C a m u n d o n g o s in fe c ta d o s c om a c ep a 12 SF .
a. E v o l u ç ã o d a p a r a s i t e m i a (Figura 2). No grupo controle inoculado com formas sanguícolas, observou-se rápida elevação da parasitemia a partir do 12° dia de infecção, ocorrendo piques elevados entre o 12° e o 20° dias. Nos grupos inoculados co m fo rm a s m e ta c íc lic a s de tria to m ín e o s observaram-se piques parasitêmicos entre o 18° e 24° dias. O nível mais elevado foi detectado nos infectados com inóculo do P . m e g i s t u s .
b. O s í n d i c e s d e m o r t a l i d a d e até o 20° dia de infecção estão expressos na Tabela 1, observando- se o índice mais elevado nos infectados com a cepa proveniente do T . i n f e s t a n s (90%) e o menos elevado com o inóculo do R . p r o l i x u s (33,3 %).
c. E s t u d o m o r f o l ó g i c o (Tabela 3) mostrou predominância de formas largas nos camundongos inoculados com formas sanguícolas e de formas delgadas nos inoculados com formas provenientes das três espécies de triatomíneos.
d. E s t u d o h i s t o p a t o l ó g i c o . Nos camundongos controles, infectados com formas sanguícolas da cepa 12 SF, observou-se aos 13 dias, moderado parasitismo de miocárdio, que se intensificou no 16° dia, tomando-se muito intenso no 24° dia de infecção, acompanhado do infiltrado inflamatório mononuclear de moderada intensidade. Também em músculo esquelético o parasitismo variou de discreto a moderado no 16 ° e 24 ° dias com moderada inflamação. Aos 16 dias as lesões determinadas pelo inóculo proveniente do P . m e g i s t u s foram semelhantes às dos controles inoculados com formas sanguícolas, enquanto com os inóculos do T. in f e s t a n s e do R . p r o l i x u s, o parasitismo era menor. Aos 24 dias de infecção observou-se parasitismo intenso de miocárdio, acompanhado de acentuado processo inflamatório em todos os grupos inoculados com formas provenientes de triatomíneos idênticos aos determinados por formas sanguícolas.
I I I . C a m u n d o n g o s i n f e c t a d o s c o m c e p a C o lo m b ia n a .
a. E v o l u ç ã o d a p a r a s i t e m i a . (Figura 3). Tanto nos camundongos infectados com formas sanguícolas como nos infectados com formas metacíclicas das três espécies de triatomíneos, os piques de parasitemia ocorreram entre o 2 4 ° e o 3 0 ° dias de infecção, com uma evolução mais precoce nos inoculados com formas sanguícolas e pique máximo nos infectados com formas do R . p r o l i x u s .
b. O s í n d i c e s d e m o r t a l i d a d e (Tabela 1) foram variáveis para os 4 grupos e mais elevados nos inoculados com formas do T . i n f e s t a n s (92%) e do R . p r o l i x u s (100%) até o 26° dia de infecção.
M a g a l h ã e s J B , A n d r a d e S G . E s tu d o d o c o m p o r ta m e n to d e c e p a s d o Trypanosoma cruzi a p ó s p a s s a g e m e m d if e r e n t e s e s p é c ie s d e tr ia to m ín e o s . R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s i l e ir a d e M e d ic in a T r o p ic a l 2 4 : 2 0 9 - 2 1 6 , o u t- d e z , 1 9 9 1
T a b e l a 3 - C e p a s 1 2 S F e C o l o m b i a n a d o T. cruzi - E s t u d o m o r f o l ó g i c o . P e r c e n t a g e m d e f o r m a s
t r i p o m a s t i g o t a s l a r g a s e d e l g a d a s d o T. cruzi n o s a n g u e p e r i f é r i c o .
Cepas: 12 SF Colombiana
G ru p o s * ^ ^ .
experim entais^^
(origem inóculo)
10° dia 14° dia 14° dia
L % D L % D L % D
I. Camundongos (controles)
53 47 56 44 58 42
II. P . m e g i s t u s - - 34 66 55 45
III. T . i n f e s t a n s 31 69 57 43 35 65
IV. R . p r o l i x u s 2 2 78 35 65 17 83
M a g a l h ã e s J B , A n d r a d e S G . E s tu d o d o c o m p o r t a m e n to d e c e p a s d o Trypanosom a cruzi a p ó s p a s s a g e m e m d i f e r e n t e s e s p é c i e s d e tr ia to m ín e o s . R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c in a T r o p i c a l 2 4 : 2 0 9 - 2 1 6 , o u t- d e z , 1 9 9 1
provenientes do
T. infestans
eR. prolixus
(Tabela 3).d.
Estudo histopatológico.
Nos controlesinfectados com formas sanguícolas da cepa Colombiana, observou-se presença de parasitos e moderado processo inflamatório em miocárdio e músculo esquelético a partir do 15° dia de infecção, o que se acentuou no 20°, 25° e 30° dias. O infiltrado inflamatório nesta fase era idêntico em miocárdio e músculo esquelético, variando de moderado a intenso e o parasitismo era de moderada intensidade. Aos 35 dias, observou-se intensa miocardite e miosite, com escassos parasitos. As lesões observadas com o inoculo obtido do T.
infestans
foram idênticas às observadas nos controlesinoculados com formas sanguícolas. Na infecção
com metacíclicos provenientes do
P. megistus
e doR. prolixus
as lesões e o parasitismo foram maisintensos.
DISCUSSÃO
A proposta do presente trabalho foi de
verificar se cepas do
T. cruzi
mantidas em laboratóriopor passagens sucessivas em camundongos teriam modificado o seu comportamento biológico após a passagem em diferentes espécies de triatomíneos. Recentemente, Perlowagora-Szumlewicz e cols12 mostraram nítidas diferenças na infectividade de
cepas do
T. cruzi
para diferentes espécies detriatomíneos, na dependência do tipo biológico e isoenzimático da cepa. Neste particular chamam a atenção estes autores, para alta infectividade da cepa São Felipe (Tipo II e zimodema 2) e a baixa infectividade da cepa Colombiana (Tipo III e zimodema 1). Deste modo, parece interessante investigar se a passagem em triatomíneos das cepas com características biológicas e isoenzimáticas definidas3 poderia determinar alterações na sua evolução, virulência e patogenicidade para o animal experimental, especificamente o camundongo. Os re su lta d o s ob tid o s no p resente trabalho demonstraram que as diversas cepas mantiveram os caracteres biológicos, avaliados de acordo com parâmetros já bem estabelecido1, mantendo os perfis de parasitemia, embora com um retardo na evolução, nas cepas 12 SF e Colombiana provenientes de triatomíneos, mantendo também o mesmo tropismo tissular e a mesma patogenicidade. O retardo na evolução da parasitemia correspondeu a um menor
grau de parasitismo nas fases iniciais de infecção, quando comparados aos controles infectados com formas sanguícolas. Foi observada entretanto, na evolução posterior, nítida elevação dos níveis parasitêmicos das diversas cepas provenientes de triatomíneos, por vezes atingindo níveis mais elevados do que os observados nos controles. Do mesmo modo, as lesões tissulares, que foram mais tardias, atingiram a mesma intensidade na fase final de observação na maioria dos grupos, podendo mesmo ser mais intensas, como foi observado com
a cepa Colombiana proveniente do
P. megistus
e doR. prolixus.
Vale assinalar que o comportamento decada espécie de triatomíneo não foi uniforme em relação aos três tipos de cepas no que diz respeito à virulência do inóculo obtido. Um exemplo disto é
o
R. prolixus,
cujo inóculo da cepa Colombianadeterminou o mais alto índice de mortalidade (100 % ) enquanto com a cepa 12 SF, o inóculo proveniente
do
R. prolixus
determinou o menor índice demortalidade para esta cepa (33,3%). Comparando a
virulência das diferentes cepas do
T. cruzi
apóspassagem nas três espécies de triatomíneos verificou- se que a cepa 12 SF é mais virulenta quando
proveniente do
P. megistus
e doT. infestans
e a cepaColombiana, do
P. megistus
e doR. prolixus.
Acepa Peruana mostrou virulência atenuada em todos os grupos, quando comparada com os padrões descritos anteriormente12. Isto foi atribuído ao baixo inóculo pois, como foi demonstrado em trabalho anterior10, com as cepas de Tipo I, houve nítida influência do inóculo quando se utilizaram inóculos de 104 ou 5 x 104. A cepa Peruana manteve a predominância de formas delgadas em todos os grupos. Entretanto observou-se que apósapassagem em triatomíneos, passaram a predominar as formas delgadas na infecção pela cepa 12 SF o mesmo acontecendo com a cepa Colombiana proveniente
do
R. prolixus
e doT. infestans.
O aparecimento deformas delgadas nas cepas passadas em triatomíneos, juntamente com retardo verificando na evolução da parasitemia e do parasitismo tissular poderiam representar uma fase adaptativa das formas provenientes do vetor no hospedeiro vertebrado.
SUMMARY
T o s tu d y t h e in jlu e n c e o f t h e in te r m e d ia te h o s t
M a g a l h ã e s J B , A n d r a d e S G . E s tu d o d o c o m p o r t a m e n to d e c e p a s d o Trypanosom a cruzi a p ó s p a s s a g e m e m d if e r e n t e s e s p é c i e s d e t r i a t o m í n e o s . R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s i l e ir a d e M e d i c in a T r o p i c a l 2 4 : 2 0 9 - 2 1 6 , o u t- d e z , 1 9 9 1
s ta g e o n th e c o u r s e o f m o u s e in fe c ti o n , Trypanosoma
cruzi b e lo n g in g t o t h e P e r u v ia n (T y p e I) , 1 2 S F (T y p e II) a n d C o lo m b ia n (T y p e 111) s tr a in s w e r e p a s s a g e d th r o u g h e ith e r Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus or
Triatoma infestans. T. cru zim e t a c y c l ic fo r m s (d o s e 10*) f r o m th e d if f e r e n t s tr a i n s w e r e o b ta in e d f r o m e a c h b u g a n d in o c u la te d in to 8 - 1 0 g m m ic e . C o m p a r is o n w a s m a d e in m ic e in o c u la te d w ith b lo o d fo r m s . P a r a s ita e m ia c u r v e s w e r e p l o t t e d in th e p e r i p h e r a l b lo o d f o r e a c h s tr a in , r e a c h in g m o r e e le v a te d p e a k s w ith P e r u v ia n s tr a in p a r a s i te s f r o m P. megistus a n d R, prolixus, 1 2 S F s tr a in f r o m P. megistus a n d C o lo m b ia n s tr a in f r o m R. prolixus.
T is s u e tr o p is m a n d h is to p a th o lo g ie a lp a tte r n s w e r e th o s e u s u a lly s e e n in m ic e in fe c te d w ith e a c h r e s p e c tiv e s tr a in ty p e . P e r u v ia n v ir u le n c e w a s th e s a m e f o r a ll g r o u p s . S le n d e r f o r m s p r e d o m i n a te a m o n g m ic e in o c u la te d w ith
m e ta c y c lic f o r m s o f C o lo m b ia n a n d 1 2 S F s tr a in s , p r o b a b l y a n a d a p ta ti v e p a r a s i t e c h a n g e r e l a t e d t o th e
in te r m e d ia te h o s t.
K e y -w o r d s : Trypanosoma cruzi. T r ia to m in a e .
T. cruzi s tr a in s . B io lo g ic a l c h a r a c te r s . V e c to r s .
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. ítalo Sherlock Chefe do Laboratório de Parasitologia do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/FIOCRUZ/UFBA, pelo constante apoio no fornecimento das espécies de triatomíneos utilizadas no presente trabalho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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