CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
EVELLYN CÂMARA GRILO
AVALIAÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO MATERNA COM
PALMITATO DE RETINILA SOBRE OS NÍVEIS DE RETINOL E
ALFA-TOCOFEROL NO LEITE HUMANO
EVELLYN CÂMARA GRILO
AVALIAÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO MATERNA COM
PALMITATO DE RETINILA SOBRE OS NÍVEIS DE RETINOL E
ALFA-TOCOFEROL NO LEITE HUMANO
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Roberto Dimenstein
Coorientadora: Heryka Myrna Maia Ramalho
NATAL
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, pelas pessoas especiais que colocou em meu caminho e por renovar minhas esperanças diante das dificuldades;
Ao meu amado pai, José Américo, pelo exemplo de caráter e ética. Agradeço pelo amor, zelo e apoio de sempre, inclusive por ter me acompanhado em todas as
visitas domiciliares deste trabalho;
A minha amada mãe, Ana Maria, por todo amor, dedicação e cuidado demonstrados diariamente por palavras e gestos;
A minha amada irmã, Andressa, pela grande amizade e cumplicidade que nos une e por me incentivar a crescer pessoal e profissionalmente;
Aos meus avós, tios e primos, por todo amor, afeto, apoio e compreensão;
À amiga Mayara Santa Rosa, pela preciosa amizade, confiança e por compartilhar comigo momentos de incertezas e alegrias, sendo presença constante em minha
vida;
À amiga Larissa Martins, exemplo de fé e determinação, pelo zelo, por incentivar minhas escolhas e estar comigo em todos os momentos;
À amiga Júlia Freitas, pela inestimável amizade, cumplicidade e por ser tão especial para mim;
Aos meus queridos amigos-irmãos do grupo de oração Santo Agostinho, da Comunidade Católica Shalom, pelo amor, carinho, incentivo e especialmente pelas
orações;
Às amigas pela fé Ana Cláudia, Rojeane, Jossiane, Naiara e Fabiana, pelo cuidado, amizade, acolhida e apoio incondicional;
Aos meus queridos amigos de graduação. Em especial à Mayara, Júlia, Caroline Carvalho, Priscila Nunes, Miriam, Priscila Fabíola, Samara e Priscila Farias, pelo
Ao professor Roberto Dimenstein, pela confiança, paciência e generosidade. Agradeço o grande incentivo, as oportunidades e por despertar em mim o gosto pela
pesquisa científica ao longo de seis anos;
À professora Heryka Myrna, minha coorientadora, pelas valiosas correções deste trabalho e pelo incentivo;
Aos membros das bancas de qualificação e defesa desta dissertação, por toda a disponibilidade e pelas relevantes contribuições;
À professora Karla Danielly Rodrigues, pela amizade, incentivo, generosidade e por me auxiliar na tomada de decisões importantes durante a realização deste trabalho;
À Cristiane Gurgel e Larissa Lira pela cooperação no planejamento das coletas das amostras e apoio nas análises bioquímicas;
Às queridas alunas de Iniciação Científica que deram uma contribuição inestimável para a realização das coletas e análises bioquímicas deste trabalho e que foram verdadeiros anjos em minha vida. Agradeço pelo grande apoio e amizade durante
todo esse período;
Às amigas do Laboratório de Alimentos e Bioquímica da Nutrição pelo incentivo e pela torcida para que este trabalho tivesse êxito.
Aos amigos de turma do mestrado, pela generosidade e auxílio durante as disciplinas e pelos vários momentos de alegria e descontração vividos. Agradeço por
terem tornado esse período mais leve e especial;
Às lactantes, motivo maior para a realização do meu projeto, que voluntariamente se prontificaram a participar neste momento tão delicado de suas vidas;
“A vida se contrai e se expande proporcionalmente à coragem do
indivíduo.”
RESUMO
As vitaminas A e E são nutrientes que possuem natureza lipofílica e atuam em vários processos biológicos importantes, como a imunidade, reprodução, crescimento e desenvolvimento. Estas vitaminas são essenciais na fase inicial da vida e devem ser transferidas adequadamente da mãe para o filho durante a gestação e a lactação. A suplementação materna com vitamina A é uma das estratégias de controle de sua deficiência no grupo materno-infantil, entretanto, estudos com animais evidenciaram que a suplementação com altas doses de vitamina A reduziu os níveis de alfa-tocoferol (vitamina E) no soro e no leite. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da suplementação materna com vitamina A sobre a concentração de retinol e alfa-tocoferol nos leites colostro e maduro de lactantes. Puérperas a termo e saudáveis foram aleatoriamente distribuídas nos grupos controle (n = 44) e suplementado (n = 44). Amostras de sangue e leite colostro foram coletadas no pós-parto imediato e uma amostra de leite maduro foi coletada após 30 dias. O grupo suplementado recebeu uma suplementação com palmitato de retinila (200.000 UI), imediatamente após a primeira coleta de colostro. O retinol e o alfa-tocoferol das amostras biológicas foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Valores séricos abaixo de 20 µg/dL para a vitamina A e 516 µg/dL para a vitamina E foram indicativos de deficiência. As concentrações de retinol e alfa-tocoferol no soro das lactantes foram 46,4 ± 15,9 µg/ dL e 1.023,6 ± 380,4 µg/ dL, respectivamente, sendo consideradas adequadas. No grupo suplementado, verificou-se um aumento significativo dos níveis de retinol no leite colostro, 24 horas após intervenção (p<0,001), entretanto, não foi observada diferença estatística entre a concentração de retinol no leite maduro dos grupos avaliados (p>0,05). Além disso, após a suplementação materna com vitamina A, houve uma redução significativa na concentração de alfa-tocoferol no leite colostro (p<0,05), que correspondeu a um declínio de 16,4% dos níveis de vitamina E. Por outro lado, a administração do suplemento não influenciou os níveis de alfa-tocoferol no leite maduro (p>0,05). Diante disso, conclui-se que a suplementação materna com altas doses de vitamina A aumentou os níveis desse micronutriente no leite colostro, porém, reduziu a biodisponibilidade do alfa-tocoferol, o que pode trazer prejuízos à saúde do neonato, que possui reservas limitadas de vitamina E ao nascimento.
ABSTRACT
Vitamins A and E are lipophilic nutrients that act in many important biological processes, such as immunity, reproduction, growth, and development. These vitamins are essential during the initial phase of life and should be properly transferred from mother to child during pregnancy and lactation. Maternal supplementation with vitamin A is one of the strategies for controlling its deficiency in the mother-child dyad, but studies with animals showed that supplementation with high doses of vitamin A reduces the levels of alpha-tocopherol (vitamin E) in the mother’s serum and milk. Hence, the objective of this study was to assess the influence of maternal supplementation with vitamin A on the concentration of retinol and alpha-tocopherol in colostrum and mature milk. Healthy puerperal women with term deliveries were randomly distributed into a control group (n=44) and a supplemented group (n=44). Blood and colostrum samples were collected immediately after delivery, and mature blood samples were collected 30 days later. The supplemented group received 200,000 IU of retinyl palmitate immediately after the first colostrum collection. The retinol and alpha-tocopherol levels in the biological samples were determined by high-performance liquid chromatography (HPLC). Serum vitamin A levels below 20 µg/dL and serum vitamin E levels below 516 µg/dL indicated deficiency. The retinol and alpha-tocopherol levels in the maternal serum were considered adequate at 46.4 ± 15.9 µg/ dL and 1,023.6 ± 380.4 µg/ dL, respectively. The colostrum retinol levels of the supplemented group increased significantly 24 hours after the intervention (p<0.001). However, the retinol levels in the mature milk of both groups did not differ (p>0.05). Moreover, after maternal supplementation with vitamin A, colostrum alpha-tocopherol level decreased by 16.4%, a significant reduction (p<0.05). However, vitamin A supplementation did not affect the alpha-tocopherol level of mature milk (p>0.05). In conclusion, maternal supplementation with high doses of vitamin A increased the colostrum level of this nutrient but reduced the bioavailability of alpha-tocopherol, which may harm the newborn’s health since newborns have limited vitamin E reserves.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% Porcentagem
µg Micrograma
µL Microlitro
µmol Micromol
ANOVA Análise de Variância ApoA-I Apoliproteína A-I
ARAT Acil-CoA retinol aciltransferase CEHC carboxietil-hidroxicromano
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cm Centímetro
CRBP Proteína ligadora de retinol celular
dL Decilitro
DVA Deficiência de vitamina A
g Grama
HDL Lipoproteína de alta densidade HIV Human immunodeficiency virus
IDL Lipoproteína de densidade intermediária IMC Índice de Massa Corporal
Kg Quilograma
L Litro
LDL Lipoproteína de baixa densidade LPL Lipase lipoprotéica
LRAT Lecitina retinol aciltransferase
m2 Metros quadrados
mg Miligrama
mL Mililitro
n Número amostral
nm Nanômetro
o C Graus Celsius
p Nível de significância
PNDS Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da Mulher
QMr Quilomícron remanescente RBP Proteína ligadora de retinol
RN Rio Grande do Norte
RNAm Ácido ribonucleico mensageiro SR-B1 Receptor da classe B, tipo 1 TTR Transtirretina
UI Unidade Internacional
VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...16
1.1. VITAMINA E...16
1.1.1. Estrutura química, funções e fontes alimentares...16
1.1.2. Metabolismo e biodisponibilidade...19
1.1.3. Vitamina E e lactação...22
1.1.4. Deficiência de vitamina E e estratégias de combate...23
1.2. VITAMINA A...25
1.2.1. Estrutura química, funções e fontes alimentares...25
1.2.2. Metabolismo e biodisponibilidade...27
1.2.3. Vitamina A e lactação...29
1.2.4. Deficiência de vitamina A e estratégias de combate...31
1.3. RELAÇÃO ENTRE AS VITAMINAS A E E...34
2. OBJETIVOS...37
2.1. OBJETIVO GERAL...37
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...37
3. MATERIAL E MÉTODOS...38
3.1. CASUÍSTICA...38
3.2. COLETA DE DADOS...39
3.3. COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO...39
3.4. EXTRAÇÃO DE RETINOL E ALFA-TOCOFEROL NO SORO E LEITE MATERNOS...40
3.4.1. Extração de retinol e alfa-tocoferol no soro materno...40
3.4.2. Extração de retinol no leite materno...41
3.4.3. Extração de alfa-tocoferol no leite materno...42
3.5. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA...43
3.5.1. Linearidade, exatidão e precisão do método...43
3.6. VALORES DE REFERÊNCIA...45
3.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA...45
4. RESULTADOS...47
5. DISCUSSÃO...52
1. INTRODUÇÃO
1.1. VITAMINA E
1.1.1. Estrutura química, funções e fontes alimentares
Vitamina E é o termo genérico utilizado para designar oito moléculas que exibem atividade de alfa-tocoferol (TRABER, 2012). Essas moléculas são compostas por um anel cromanol e uma cadeia lateral formada por carbonos e hidrogênios. Esses compostos são classificados em tocoferóis (α-, , - e -tocoferol) ou tocotrienóis (α-, -, - e -tocotrienol), de acordo com a estrutura química da cadeia lateral. Os tocotrienóis diferem dos tocoferóis pela presença de três duplas ligações na cadeia lateral. Os prefixos α-, , - e - indica a posição e o número de grupos metil no anel cromanol (Figura 1) (GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010; TRABER,
Figura 1 - Estruturas químicas dos tocotrienóis e tocoferóis encontrados na natureza.
(A) Os tocotrienóis são constituídos por um anel cromanol e uma cadeia lateral insaturada com três
duplas ligações. O α-, -, - e -tocotrienol diferem de acordo com o número e a posição do grupo metil do anel cromanol. (B) Os tocoferóis são constituídos por um anel cromanol e uma cadeia lateral
saturada. O α-, -, - e -tocoferol diferem de acordo com o número e a posição do grupo metil do anel cromanol. Fonte: Adaptado de LU et al., 2015.
Figura 2 - Estrutura química do RRR-alfa-tocoferol, com ênfase na configuração R nas posições β’, 4’ e 8’ da cadeia.
Na estrutura química do alfa-tocoferol, há três centros quirais, nas posições β’, 4’ e 8’ da cadeia
lateral saturada, que estão enfatizados nesta figura, com possibilidade de duas configurações químicas (R ou S). A forma natural do alfa-tocoferol assume a configuração R- nos três centros quirais, sendo denominado RRR-alfa-tocoferol. Fonte: DERSJANT-LI; PEISKER, 2010.
As formas naturais dos isômeros da vitamina E são sintetizadas por plantas e os óleos vegetais são as principais fontes desta vitamina, sendo o α- e o -tocoferóis os compostos mais abundantes (BIANCHINNI-PONTUSCHKA; PENTEADO, 2003). Os óleos de girassol, de cártamo e de gérmen de trigo são especialmente ricos em alfa-tocoferol (CARETTO et al., 2010). Além dos óleos, nozes e sementes comestíveis, cereais, espinafre, brócolis são considerados fontes alimentares de vitamina E (FREITAS; NAVES, 2010; TRABER, 2012). A vitamina E também está difundida em alguns alimentos de origem animal, como ovos, fígado e produtos lácteos (BIANCHINNI-PONTUSCHKA; PENTEADO, 2003).
A vitamina E funciona como um antioxidante não-enzimático e o alfa-tocoferol é considerado o maior antioxidante capaz de interromper reações de oxidação em cadeia envolvendo radicais livres. O alfa-tocoferol atua diretamente na remoção de radicais peroxil, conferindo proteção aos ácidos graxos poli-insaturados das membranas celulares e lipoproteínas (MOCCHEGIANI et al., 2014).
Além disso, esta vitamina possui propriedades anti-inflamatórias, antiplaquetárias e atua também na prevenção do câncer e como protetor dos sistemas neurológico e ósseo (GURALP, 2014).
Foram propostas funções não-antioxidantes da vitamina E. À nível pós-traducional, o alfa-tocoferol modula proteínas, como a proteína quinase, lipoxigenase e fosfolipase A2. Já à nível transcricional, esse composto é capaz de modular a transcrição de genes envolvidos na sinalização celular e regulação do ciclo celular. O alfa-tocoferol também possui a função de inibir a proliferação celular e a adesão de monócitos (AZZI et al., 2004; ZINGG; AZZI, 2004).
1.1.2. Metabolismo e biodisponibilidade
A vitamina E é inicialmente liberada da matriz alimentar, incorporada em micelas mistas e absorvidas pelas células epiteliais do intestino delgado. As micelas mistas são constituídas de sais e fosfolipídios da bile, do suco pancreático e de produtos lipídicos da digestão (ácidos graxos livres e monoacilgliceróis) provenientes da ação das lipases sobre os triacilgliceróis da dieta (YANG; MCCLEMENTS, 2013). A biodisponibilidade da vitamina E em humanos é regulada por muitos fatores e geralmente é avaliada por meio dos níveis plasmáticos de alfa-tocoferol. A eficiência da absorção da vitamina E é amplamente variável (entre 10 e 79%) e é afetada por fatores dietéticos, como a forma química da vitamina E, a matriz alimentar, a quantidade de vitamina E, de lipídeos e de fibras, entre outros, bem como por fatores genéticos (BOREL; PREVERAUD; DESMARCHELIER, 2013).
A captação celular da vitamina E foi inicialmente descrita como um processo passivo. Entretanto, estudos com fígado e cérebro evidenciaram o envolvimento do SR-BI (scavenger receptor class B type I) nesse processo. O SR-BI é altamente expresso nos enterócitos e a absorção intestinal de vitamina E é, em parte, mediada por esse receptor. Sugere-se que as variações interindividuais na expressão do SR-BI podem explicar a alta variabilidade na eficiência da absorção de vitamina E (REBOUL et al., 2006).
concentram um importante pool intracelular de vitamina E que é destinada à formação de quilomícrons, que são lipoproteínas cuja liberação ocorre no sistema linfático (RIGOTTI, 2007).
Os quilomícrons (QM) são catabolizados rapidamente na circulação pela lipase lipoprotéica (lipoprotein lipase - LPL), dando origem aos quilomícrons remanescentes (QMr) contendo vitamina E, que são endocitados pelo fígado através de um processo mediado por receptor. No fígado, o alfa-tocoferol é seletivamente incorporado e secretado através de lipoproteínas plasmáticas, como a VLDL. Assim, a discriminação entre os isômeros da vitamina E ocorre no fígado pela proteína transportadora de alfa-tocoferol (α-TTP) e não durante a absorção intestinal (Figura 3) (KONO; ARAI, 2015).
Em humanos, a α-TTP (alpha-tocopherol-transfer protein) é uma proteína intracelular específica que se liga ao alfa-tocoferol com afinidade superior em relação aos demais isômeros da vitamina E. Ela é expressa principalmente no fígado, mas também está presente no cérebro e na placenta (Figura 3) (GAGNÉ et al., β009). Embora a α-TTP seja essencial à transferência de alfa-tocoferol às VLDLs nascentes, outras proteínas de ligação também estão envolvidas no transporte intracelular de vitamina E em diversos tecidos, como a proteína TAP ( tocopherol-associated protein), que foi identificada em tecidos bovinos e humanos. Esta proteína pertence a uma família de proteínas que se ligam a compostos hidrofóbicos que compartilham o mesmo motivo proteico de ligação ao cis-retinal (REBOUL; BOREL, 2011).
As VLDLs são catabolizadas pela LPL, assim, transferem o alfa-tocoferol a tecidos adjacentes e a partículas de lipoproteína de alta densidade (high-density lipoprotein - HDL). Cerca de 50 a 60% das partículas remanescentes de VLDL (ou
Intermediate-density lipoprotein - IDL) são absorvidos pelo fígado, enquanto o
Figura 3 - Absorção, transporte e excreção da vitamina E.
Vit E = vitamina E; α-TOH = alfa-tocoferol; α-TTP = proteína de transporte intracelular de alfa-tocoferol; LPL = lipase lipoprotéica; VLDL = lipoproteína de muito baixa densidade; LDL = lipoproteína de baixa densidade; IDL = lipoproteína de densidade intermediária; HDL = lipoproteína de alta densidade; CEHC = carboxietil-hidroxicromano. Fonte: CLEMENTE, 2013. Adaptado de GAGNÉ et al., 2009.
O alfa-tocoferol pode se acumular em tecidos como o fígado, músculos e tecido adiposo, constituindo cerca de 90% de sua quantidade total no corpo. Os adipócitos contém a maior proporção dessa vitamina, entretanto, sua mobilização é muito lenta (DEBIER; LARONDELLE, 2005).
Os isômeros da vitamina E são metabolizados de forma semelhante a xenobióticos, uma vez que inicialmente são ω-oxidados pelo citocromo P450, em seguida, passam por diversas etapas de -oxidação e são conjugados, sendo excretados por meio da urina ou da bile (TRABER, 2007). Os CEHCs [(2’ -carboxyethyl)-6-hydroxychroman] são os metabólitos da vitamina E e a urina constitui uma importante via de sua excreção, especialmente em condições de suplementação com doses excessivas de vitamina E (SCHULTZ et al., 1997).
CEHC na circulação fetal, sugerindo um aumento do metabolismo da vitamina E pelo fígado materno ou fetal (DIDENCO et al., 2011).
1.1.3. Vitamina E e lactação
A vitamina E é essencial nos diferentes estágios da gestação, especialmente durante a implantação e desenvolvimento da placenta. Durante o período gestacional, os níveis plasmáticos de alfa-tocoferol aumentam na mãe, porém, em gestações com complicações fetais ou maternas, estes níveis são reduzidos. Recém-nascidos tem níveis plasmáticos de alfa-tocoferol significativamente menores que suas mães. Assim, sugere-se que a transferência placentária dessa vitamina para a circulação fetal não ocorre de forma eficiente (GAGNÉ et al., 2009).
Devido a essa transferência placentária limitada, a vitamina E deve ser fornecida ao recém-nascido em quantidades adequadas através do leite materno, a fim de evitar quadros de deficiência vitamínica e melhorar o sistema imunológico (DEBIER et al., 2005).
Em mamíferos, em geral, a composição do leite sofre modificações de acordo com a fase de lactação (leite colostro, de transição e maduro). Com a progressão da lactação, ocorre um rápido declínio dos níveis de carotenóides, vitamina A e alfa-tocoferol no leite materno, bem como de hormônios e fatores de crescimento. Por outro lado, a quantidade de lipídeos totais, principalmente de triacilgliceróis, aumenta substancialmente (SCHWEIGERT et al., 2004).
Lima et al. (2014), em sua revisão, também verificaram essa tendência à redução da concentração de alfa-tocoferol no leite materno com o curso da lactação, sendo o leite colostro mais rico nessa vitamina. Essa redução da concentração de alfa-tocoferol no leite maduro pode ser explicada pelo aumento do volume dos glóbulos de gordura com a progressão da lactação, o que implica numa redução relativa dos componentes da membrana desses glóbulos, entre eles, o alfa-tocoferol (BOERSMA et al. 1991).
Uma relação não-linear entre as concentrações plasmáticas de alfa-tocoferol e a quantidade secretada no leite foi evidenciada em vacas, o que sugere que essa transferência não ocorre por difusão passiva simples (JENSEN et al., 1999). Em estudo realizado em vacas, Schweigert (1990) sugere que a transferência de vitamina E para o colostro ocorre por meio do sistema de transporte específico para LDL nas células secretoras e que sua alta concentração no colostro está relacionada com o aumento de receptores de LDL na glândula mamária no período pós-parto.
Evidências in vivo também consideram o papel da LPL na captação tecidual de vitamina E. De acordo com estudo realizado em ratas, alterações no conteúdo de alfa-tocoferol na glândula mamária têm sido diretamente correlacionadas com a atividade da LPL nesse tecido durante a gestação e a lactação (MARTÍNEZ; BARBAS; HERRERA, 2002).
Em um estudo realizado em mulheres lactantes, foi verificado que a razão molar entre o gama-tocoferol e o alfa-tocoferol foi significativamente menor no leite em comparação aos níveis plasmáticos das lactantes avaliadas. Diante disso, os autores sugerem que o alfa-tocoferol seja transferido preferencialmente do plasma para a glândula mamária (AZEREDO; TRUGO, 2008).
Assim como na transferência placentária, existe uma seletividade da glândula mamária na captação da forma RRR-alfa-tocoferol em detrimento da vitamina E sintética. Diante disso, a existência de um mecanismo semelhante ao que envolve a α-TTP em outros tecidos não pode ser excluída. A presença do receptor SR-BI na glândula mamária também deve ser investigada, uma vez que o mesmo pode estar envolvido na captação de alfa-tocoferol da HDL (DEBIER; LARONDELLE, 2005).
1.1.4. Deficiência de vitamina E e estratégias de combate
Uma elevada ingestão de alfa-tocoferol na dieta habitual está associada à redução do risco de desordens como aterosclerose, câncer, catarata e isquemia. Especialmente em recém-nascidos, a vitamina E previne o dano oxidativo causado pelo ambiente hiperoxêmico. Além disso, recém-nascidos prematuros são mais suscetíveis à deficiência de vitamina E (ANTONAKOU et al., 2011).
para esta deficiência pela limitada ingestão de alimentos fontes de vitamina E e pela maior prevalência de doenças, como a malária e a infecção por HIV, que aceleram a depleção desta vitamina. Além desses fatores, o risco para desenvolver a deficiência de vitamina E é maior em crianças, idosos, obesos e homens (DROR; ALLEN, 2011).
A deficiência primária de vitamina E é observada em casos de ataxia com deficiência isolada de vitamina E, que é causada por mutações hereditárias no gene que codifica a α-TTP. Esta doença se caracteriza pela ataxia espinocerebelar progressiva e por baixos níveis de vitamina E no plasma. Os sinais clínicos incluem disartria, perda da propriocepção e da acuidade visual, falta de coordenação das mãos e arreflexia. Já a deficiência secundária de vitamina E é causada por desordens que afetam vias metabólicas que não são específicas para o processamento da vitamina E, como síndromes de má absorção intestinal. Além disso, a ataxia cerebelar é uma das principais manifestações clínicas da deficiência secundária de vitamina E (ULATOWSKI; MANOR, 2013).
A acantocitose é uma alteração morfológica da membrana do eritrócito que também está associada com a deficiência de vitamina E e resulta em hemólise de eritrócitos e anemia. É provável que a neuropatia periférica e a anemia observadas em pacientes com deficiência em vitamina E sejam causadas pelo excesso de danos oxidativos aos axônios de grande calibre e à membrana dos eritrócitos, respectivamente (DROR; ALLEN, 2011).
Evidencias apontam que a ingestão adequada de vitamina E é fundamental para a saúde muscular. Em diversos modelos animais, o consumo de dietas extremamente deficientes em alfa-tocoferol resultaram em necrose de miócitos e distrofia muscular letal. Em humanos, a deficiência de vitamina E é associada com fraqueza muscular, níveis elevados de creatina quinase e miopatia (HOWARD; MCNEIL; MCNEIL, 2011).
As concentrações de vitamina E nos tecidos fetais aumentam no final da gestação em decorrência do aumento do tecido adiposo, que armazena cerca de 90% dessa vitamina. Nos recém-nascidos prematuros, esses tecidos são escassos e suas reservas de vitamina E são limitadas, apresentando maior suscetibilidade à deficiência de vitamina E em comparação aos nascidos a termo (WEY, 2008).
abaixo de 500 µg/dL, indicando elevada deficiência de vitamina E nesse grupo (KOSITAMONGKOL et al., 2011). Os recém-nascidos prematuros com deficiência de vitamina E apresentam sintomas clínicos, tais como: anemia hemolítica, fibroplasia retrolental, hemorragia intraventricular e displasia broncopulmonar (ANTONAKOU et al., 2011).
Suplementos contendo alfa-tocoferol melhoram o quadro de deficiência em vitamina E ou previnem os sintomas, caso sejam administrados ainda na infância (NIKI; TRABER, 2012). Doses de vitamina E acima de 1.000 mg por dia têm sido prescritas para crianças com deficiência de vitamina E e são recomendadas por prevenir a progressão das disfunções neurológicas e, em alguns casos, esse suplemento é capaz de revertê-las (TRABER, 2014).
Um estudo realizado com gestantes verificou que 98% apresentaram deficiência de vitamina E. Essa alta porcentagem foi relacionada à inadequada ingestão de alfa-tocoferol e à baixa condição socioeconômica dessas mulheres (LOHIA et al., 2009). Por outro lado, Schulpis et al. (2004) observou que 8% das puérperas a termo apresentaram níveis deficientes de alfa-tocoferol.
A suplementação de gestantes e lactantes com vitamina E parece melhorar os níveis vitamínicos no leite materno e plasma do recém-nascido (DEBIER et al., 2005). Como relatado anteriormente em estudos locais, a porcentagem de deficiência de vitamina E no grupo materno-infantil é considerada relevante, porém, não há estratégias específicas para sua prevenção.
1.2. VITAMINA A
1.2.1. Estrutura química, funções e fontes alimentares
que regula a transcrição de mais de 500 genes (LI et al., 2014; SOLOMONS, 2012). A forma química da vitamina A depende da função desempenhada e da localização do composto no organismo (GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010).
Figura 4 - Estrutura química de compostos com atividade biológica de vitamina A. Fonte: LIMA, 2015.
A vitamina A é essencial para a sobrevivência humana, da embriogênese à idade adulta e desempenha um papel fundamental na visão, imunidade e reprodução (TANOURY; PISKUNOV; ROCHETTE-EGLY, 2013).
Esta vitamina também possui ações que auxiliam no tratamento de algumas condições patológicas. A capacidade da vitamina A e seus isômeros de promover a diferenciação terminal, inibir a proliferação e promover a apoptose está envolvida com sua ação antiproliferativa. Altas doses de retinóides demonstraram atividade antineoplásica in vitro (SOLOMONS, 2012).
Durante a gravidez e a lactação, a vitamina A tem um importante papel no desenvolvimento saudável do feto e do recém-nascido e sua deficiência leva a um conjunto de malformações congênitas e ao retardo do crescimento neonatal (STROBEL; TINZ; BIESALSKI, 2007; TANOURY; PISKUNOV; ROCHETTE-EGLY, 2013).
por meio da dieta, seja pela vitamina A pré-formada ou provitamina A (HARRISON, 2012).
A vitamina A pré-formada é consumida principalmente na forma de ésteres de retinil, que são facilmente hidrolisados para liberar o retinol e estão presentes em alimentos de origem animal, como fígado, rim, peixe, produtos lácteos e ovos (WEBER; GRUNE, 2012).
Carotenóides são pigmentos orgânicos e classificam-se em carotenos e xantofilas. Carotenóides pró-vitamina A, como o -caroteno, são parcialmente convertidos a retinol pelas enzimas oxigenase e redutase para serem absorvido no intestino (GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010; HARRISON, 2012). Esses carotenóides provitamina A são importantes fontes dietéticas de vitamina A para a maioria da população e estão presentes principalmente em folhosos verdes, vegetais de cor amarela e frutas de coloração laranja (WEBER; GRUNE, 2012).
1.2.2. Metabolismo e biodisponibilidade
No intestino humano, cerca de 50% dos carotenóides provitamina A são convertidos em retinol e o restante é absorvido intacto, embora a eficiência da conversão tenha uma grande variação entre indivíduos (HARRISON, 2012).
As formas livres das vitaminas lipossolúveis e carotenóides são absorvidas pela mucosa intestinal, enquanto as formas esterificadas são inicialmente hidrolisadas. A hidrólise dos ésteres de retinil pode iniciar no estômago pela ação da lipase gástrica, entretanto, esse processo ocorre essencialmente no duodeno. No intestino, a vitamina A, os carotenoides e os lipídeos da dieta são incorporados em micelas mistas, que contém fosfolipídios, colesterol, produtos da digestão lipídica e sais biliares. Os ésteres de retinil sofrem a ação da lipase pancreática e de enzimas presentes na mucosa intestinal. Alguns estudos apontam que alguns ésteres são absorvidos intactos pelas células intestinais e hidrolisados no espaço intracelular (REBOUL, 2013).
difusão passiva, quando o retinol está em concentração farmacológica. Assim, existe a hipótese de que os mecanismos de difusão passiva e facilitada para absorção de retinol podem ocorrer no enterócito (GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010; HARRISON, 2012).
Após sua absorção, o retinol é resterificado a ésteres de retinil nos enterócitos (LI et al., 2014). A principal enzima responsável pela formação de ésteres de retinil é a lecitina: retinol aciltransferase (lecithin: retinol acyltransferase - LRAT), que catalisa a reação de transesterificação, que consiste na transferência de um ácido graxo de cadeia longa para o retinol, formando um éster de retinil. A literatura sugere a existência de outra enzima com função semelhante à LRAT, a acil-CoA: retinol aciltransferase (acyl-CoA: retinol acyltransferase - ARAT) (O’BYRNE; BδANER, 2013).
Os ésteres de retinil são incorporados aos quilomícrons, que são secretados no sistema linfático em direção à circulação sanguínea. Após o consumo de uma refeição rica em vitamina A, a circulação pós-prandial pode conter de 5 a 10 µM (1.432 a 2.865 µg) de ésteres de retinil, com concentrações diretamente proporcionais a quantidade de vitamina A consumida. Estudos em roedores estabeleceram que aproximadamente 66 a 75% dos ésteres de retinil dos quilomícrons são absorvidos pelo fígado, enquanto a porcentagem de 25 a 33% são fornecidos aos tecidos periféricos (LI et al., 2014).
Na circulação geral, a enzima lipase lipoprotéica (LPL) degrada parcialmente os quilomícrons, transferindo ésteres de retinil para os tecidos periféricos. Os quilomícrons remanescentes chegam ao fígado e são rapidamente absorvidos no espaço de Disse, onde diversas proteínas são envolvidas na sua captura, internalização e remodelamento. No fígado, o retinol pode ser armazenado nas células estreladas (células de Ito) ou lançado na corrente sanguínea para suprir as necessidades do organismo (DEBIER; LARONDELLE, 2005; SCHREIBER et al., 2012).
(Transthyretin - TTR), formando o complexo retinol-RBP-TTR, que é dissociado quando o retinol é liberado aos tecidos-alvo (WOLF, 2007).
O fígado também secreta algumas moléculas de ésteres de retinil ligadas à lipoproteína de muito baixa densidade (Verylow-densitylipoprotein - VLDL) na circulação. Após o metabolismo dessas lipoproteínas, alguns ésteres de retinil se encontram em lipoproteínas de baixa densidade (Low-density lipoprotein - LDL). Os ésteres de retinil contidos nesses tipos de lipoproteínas podem ser absorvidos pelos tecidos periféricos (LI et al., 2014).
Embora o intestino e o fígado sejam os principais sítios de esterificação do retinol no corpo, outros tecidos são capazes de esterificar e armazenar reservas de ésteres de retinil, incluindo o olho, o pulmão, o tecido adiposo, os testículos, a pele, o baço e o tecido mamário (O’BYRNE; BδANER, β01γ).
.
1.2.3. Vitamina A e lactação
Baydas et al. (2002) verificaram que os níveis de vitamina A no soro materno foram superiores àqueles encontrados no cordão umbilical. Além disso, foi encontrada uma correlação positiva entre esses valores. Concentrações mais baixas de vitamina A em recém-nascidos podem ser induzidas pela ineficiente transferência placentária desta vitamina.
Recém-nascidos são dependentes da vitamina A do leite materno para construção de seus estoques hepáticos, que serão muito importantes para sua sobrevivência após o desmame. Assim, o aleitamento materno é o grande fator de proteção contra a deficiência de vitamina A até os dois anos de idade (MARTINS et al., 2007; FUJITA et al., 2011).
Figura 5 - Modelo esquemático da transferência de ésteres de retinil à glândula mamária e ao leite materno.
VA = vitamina A; QM = quilomícrons; RE = ésteres de retinil; TG = triacilgliceróis; LPL = lipase lipoprotéica; RBP = proteína ligadora de retinol. Fonte: BEZERRA, 2008. Adaptado de ROSS; PASATIEMPO; GREEN, 2004.
A lipase lipoprotéica (LPL) apresenta uma importante função na transferência de vitamina A dos quilomícrons para o tecido mamário (ROSS; PASATIEMPO; GREEN, 2004). Sugere-se que a absorção de vitamina A dos quilomícrons pela glândula mamária é limitada e a saturação da lipase lipoprotéica está envolvida nessa questão (VALENTINE; TANUMIHARDJO, 2005).
O sangue contém cerca de 95% da vitamina A ligada a RBP. Por outro lado, o leite materno é caracterizado por conter de 95 a 100% da vitamina A na forma de ésteres de retinil, sendo os mais importantes o estearato de retinil, o palmitato de retinil e o oleato de retinil (DEBIER; LARONDELLE, 2005). A enzima LRAT é a principal responsável pela síntese da maioria dos ésteres de retinol incorporados ao leite de ratas (O’BYRNE et al., β010).
metabolismo (PIANTEDOSI et al., 2005). A CRBP-I, CRBP-II e a CRBP-III são importantes para o processo de esterificação. Especificamente, a CRBP-III é necessária para a incorporação de ésteres de retinil no leite (BLOMHOFF; BLOMHOFF, 2006).
Uma pesquisa realizada com mulheres suplementadas com vitamina A, no pós-parto, avaliou o retinol no leite colostro, antes e após a refeição. Os mecanismos pelos quais a vitamina A é incorporada à glândula mamária e ao leite materno não estão completamente elucidados em humanos. Entretanto, os autores sugeriram que a transferência de vitamina A para o leite ocorre via RBP em estado de jejum e tem a contribuição dos quilomícrons no período pós-prandial, assim como foi comprovado em estudos com animais (BLANER et al., 1994; GREEN et al., 2001; ROSS; PASATIEMPO; GREEN, 2004; O’BYRNE et al., β010; GRILO et al., 2015).
Evidencias apontam que a concentração de retinol no leite materno responde à ingestão materna de nutrientes e à suplementação com vitamina A e é mais afetada pela ingestão de vitamina A do que o retinol sérico, por este ser regulado homeostaticamente pelo fígado (AZEREDO; TRUGO, 2008).
Os níveis de vitamina A no leite materno variam de acordo com as reservas e a ingestão maternas desse micronutriente, por isso, essa concentração tem sido utilizada como um indicador para avaliar a estado nutricional em vitamina A de mulheres lactantes e seus bebês, bem como o monitoramento do impacto de programas de intervenção relacionadas à vitamina A (STOLTZFUS; UNDERWOOD, 1995; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1996; SCHWEIGERT et al., 2011).
1.2.4. Deficiência de vitamina A e estratégias de combate
A deficiência de vitamina A (DVA) é considerada um problema de saúde pública, especialmente em países em desenvolvimento. Esse problema é avaliado de acordo com a prevalência de DVA na população, por meio de indicadores clínicos e bioquímicos específicos, que classificam o estado nutricional em vitamina A (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
regiões da África e Sudoeste da Ásia (ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD, 2011).
A forma clínica da DVA inclui manifestações oculares e cutâneas evidentes, além do agravamento do quadro infeccioso na infância e aumento de taxas de mortalidade por infecções nesse grupo. Entre as manifestações dessa deficiência, a xeroftalmia é o sinal característico da DVA clínica (SOLOMONS, 2012).
Por outro lado, a deficiência subclínica se caracteriza pela ausência de sinais e sintomas clínicos, entretanto, há a depleção dos níveis de retinol, das reservas hepáticas e aparecem problemas funcionais em decorrência da deficiência. Estima-se que a proporção entre as formas clínica e subclínica é de 1 para 10 casos. Apesar dos progressos alcançados a fim de reduzir a deficiência clínica de vitamina A, o estado nutricional marginal ainda é prevalente e de difícil diagnóstico (ROSTAMI; FARSAR; SHIVA, 2007; TANUMIHARDJO, 2011).
As principais manifestações da deficiência de vitamina A ocorrem quando as reservas de retinol do fígado sofrem depleção, seja por ingestão dietética insuficiente, seja pelo aumento do requerimento fisiológico, ou ambos (FUJITA et al., 2011). A deficiência de vitamina A também pode ser atribuída a alterações no metabolismo associado a doenças hepáticas, desnutrição ou má absorção (SAKER et al., 2015).
Os principais fatores de risco para esta deficiência incluem a idade, sendo as crianças mais susceptíveis, desmame precoce para bebês, gestação e lactação para mulheres e baixa ingestão dietética de vitamina A (FUJITA et al., 2011).
As consequências da deficiência de vitamina A sãs mais facilmente observadas em células que se dividem rapidamente e os efeitos sistêmicos e oculares da deficiência de vitamina A são observados, geralmente, quando o quadro é mais agudo (WEST JR, 2005; SAKER et al., 2015).
Devido à transferência placentária limitada, os recém-nascidos possuem reservas de vitamina A reduzidas e são dependentes do leite materno para suprir suas necessidades fisiológicas e constituir suas reservas hepáticas (DEBIER et al., 2005; FUJITA et al., 2011).
O aleitamento materno exclusivo é capaz de atender ao requerimento em vitamina A do lactente se o leite possuir concentração de retinol e volume adequados. A deficiência de vitamina A no leite pode resultar na manutenção de baixas reservas hepáticas no infante, aumentando sua suscetibilidade a infecções respiratórias graves, pneumonia e diarreia (SOUZA et al., 2015).
Quando a ingestão materna de vitaminas é insuficiente, a quantidade fornecida ao recém-nascido por meio do colostro pode ser deficiente. Assim, a suplementação materna de vitaminas lipossolúveis, nos períodos pré- e pós-parto, pode ser necessária para garantir uma concentração adequada no plasma e no colostro (DEBIER et al., 2005).
As principais estratégias de controle da deficiência de vitamina A são: o incentivo à diversificação da dieta e ao consumo de alimentos fontes de vitamina A por meio de programas de educação nutricional, a suplementação e a fortificação de alimentos (AKHTAR et al., 2013).
A estratégia mais amplamente praticada de controle da deficiência de vitamina A é a suplementação periódica de crianças de 6 a 11 meses com uma dose de 100.000 UI de vitamina A e de crianças de 12 meses a 5 anos, com uma dose de 200.000 UI. Muitos países de alto risco para a DVA também adotaram a política de suplementação materna com uma dose de 200.000 UI de vitamina A, dentro de 6 semanas após o parto, a fim de enriquecer o leite materno com esta vitamina (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
Desde 2005, o Ministério da Saúde desenvolve o Programa Nacional de Suplementação de vitamina A, visando reduzir e erradicar a deficiência nutricional de vitamina A em crianças de 6 a 59 meses de idade e mulheres no pós-parto imediato, residentes em regiões consideradas de risco. Em relação às mulheres no pós-parto imediato, recomenda-se a suplementação com a megadose de 200.000 UI de vitamina A, a ser administrada na maternidade antes da alta hospitalar (BRASIL, 2013).
1.3. RELAÇÃO ENTRE AS VITAMINAS A E E
As vitaminas A e E são nutrientes que possuem natureza lipofílica e atuam em vários processos biológicos importantes. Estas vitaminas são extremamente importantes durante os estágios iniciais da vida e devem ser transferidas adequadamente da mãe para o filho durante a gestação e lactação (DEBIER; LARONDELLE, 2005).
Estudos conduzidos com animais verificaram que a suplementação com altas doses de vitamina A provocaram uma redução dos níveis séricos de alfa-tocoferol (BLAKELY et al., 1990; SCHELLING et al., 1995; NONNECKE et al., 1999; AMETAJ et al., 2000).
Em um estudo desenvolvido com bezerros suplementados, foi observado que os animais que receberam doses mais altas de vitamina A dietética apresentaram menores concentrações de alfa-tocoferol associado a lipoproteínas. Os autores do estudo concluíram que a vitamina A modulou negativamente a quantidade de RRR-alfa-tocoferol na circulação (AMETAJ et al., 2000).
De forma semelhante, um estudo com vacas no período de lactação verificou que quanto maior a dose administrada de vitamina A menores são os níveis plasmáticos de alfa-tocoferol. Após a administração de 675.000 UI de vitamina A por dia, houve uma redução significativa de 19% e 17% nos níveis de alfa-tocoferol no plasma e no leite das vacas, respectivamente. Esse estudo sugeriu que a ingestão de altas doses de vitamina A reduz a biodisponibilidade da vitamina E no organismo (SCHELLING et al., 1995).
Os autores justificam essa proposição pelo potencial aumento dos níveis de ácido retinóico, um metabólito da vitamina A, em decorrência da ingestão de altas doses dessa vitamina. O ácido retinóico atua regulando negativamente o receptor SR-BI, que está envolvido na absorção de vitamina E pelo enterócito, e promovendo a oxidação do alfa-tocoferol durante a absorção. Assim, esse processo absortivo é prejudicado, levando à redução dos níveis de alfa-tocoferol no soro (BOREL; PREVERAUD; DESMARCHELIER, 2013).
Ratos com deficiência em vitamina A foram suplementados com uma dose única de ácido retinóico, 20 horas antes da coleta dos tecidos avaliados. Foi verificado um declínio de cerca de 40% dos níveis hepáticos do RNAm da Apoliproteína A-I (ApoA-I) (ZOLFAGHARI; ROSS, 1994). Em humanos, a HDL, cujo principal constituinte protéico é a apolipoproteína A-I (ApoA-I), é capaz de transferir vitamina E para as demais lipoproteínas circulantes que distribuem o alfa-tocoferol para os tecidos periféricos (TRABER, 2012; MAZER et al., 2013). Diante disso, sugere-se que altos níveis de ácido retinóico podem reduzir o transporte de alfa-tocoferol da HDL para outras lipoproteínas e consequentemente, para tecidos periféricos, como o tecido mamário.
Lira et al. (2013) avaliaram o soro e o colostro de mulheres lactantes, em condições basais, e verificaram que há uma correlação negativa entre o retinol sérico materno e o alfa-tocoferol do colostro, sugerindo que a biodisponibilidade da vitamina E pode estar comprometida em humanos, sob condições de suplementação com vitamina A.
Um estudo conduzido em uma maternidade pública evidenciou um aumento dos níveis de alfa-tocoferol no leite colostro de puérperas, 24 horas após a suplementação com vitamina A (200.000 UI). Todavia, a cápsula administrada também continha 49,4 mg de all-rac-alfa-tocoferol. Os autores sugeriram que a composição do suplemento pode ter influenciado a investigação acerca do efeito de altas doses de vitamina A sobre os níveis vitamina E no leite materno (GARCIA et al., 2010).
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da suplementação materna com palmitato de retinila sobre a concentração de retinol e alfa-tocoferol no leite materno de mulheres atendidas em maternidades públicas de Natal/RN.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar as lactantes incluídas no estudo com base em variáveis maternas, obstétricas e do neonato;
Identificar as concentrações séricas basais de retinol e alfa-tocoferol das lactantes;
Identificar as concentrações de retinol e alfa-tocoferol nos leites colostro e maduro;
Avaliar o efeito da suplementação materna com vitamina A (200.000 UI) sobre os níveis de retinol nos leites colostro e maduro;
Avaliar o efeito da suplementação materna com vitamina A (200.000 UI) sobre os níveis de alfa-tocoferol nos leites colostro e maduro;
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. CASUÍSTICA
A coleta das amostras foi conduzida na Maternidade Escola Januário Cicco e na Unidade Mista das Quintas, localizadas no município de Natal-RN, durante o período de dezembro de 2013 a dezembro de 2014. Este estudo foi do tipo longitudinal e obteve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CAAE: 19513113.9.0000.5537) (Anexo). Além disso, foi obtido o registro no ReBEC (Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos), sob o n° RBR – 4v7j2d.
As puérperas internadas nas maternidades citadas foram submetidas aos critérios de triagem definidos para este estudo. A amostragem foi obtida de acordo com os seguintes critérios de exclusão: parto prematuro; existência de complicações maternas, dentre elas a presença de doenças (diabetes, hipertensão, neoplasias, doenças hepáticas, infecciosas e do trato gastrintestinal, cardiopatias, sífilis, HIV positivo, dentre outras); existência de má-formação fetal; conceptos múltiplos; suplementação materna com vitamina A ou E durante a gestação ou no pós-parto.
Foi estimado um tamanho amostral mínimo de 28 participantes, no total. O cálculo foi realizado utilizando o pacote estatístico G*Power V.3.1.9 (FAUL et al., 2007), considerando a aplicação do teste ANOVA, conforme a proposta do estudo, e os seguintes parâmetros: valor alfa igual a 5%, poder esperado em 80% e valor da medida de efeito igual a 0,25.
O grupo avaliado foi composto por 88 lactantes voluntárias que foram esclarecidas quanto aos objetivos da pesquisa e autorizaram sua participação no estudo mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A).
3.2. COLETA DE DADOS
Os dados obstétricos, maternos e do neonato foram obtidos através do prontuário, cartão de acompanhamento do pré-natal e questionário aplicados pelos pesquisadores (Apêndice B). As puérperas com idade entre 10 e 19 anos foram classificadas como adolescentes e acima de 19 anos, como adultas (BRASIL, 2010). Os recém-nascidos foram classificados de acordo com o peso ao nascer: em baixo peso (inferior a 2.500g), com peso adequado (entre 2.500g e 4.000g) e com macrossomia (acima de 4.000g) (STRUTZ; RICHARDSON; HUSSEY, 2012).
O estado nutricional pré-gestacional foi determinado a partir do Índice de Massa Corporal (IMC), calculado pela razão do peso corpóreo habitual (em Kg) antes da gestação sobre o valor da estatura (em metros) elevado ao quadrado. De acordo com as recomendações preconizadas pelo Instituo de Medicina, foram feitas as seguintes classificações do peso materno pré-gestacional: IMC inferior a 18,5 Kg/m2 foi indicativo de baixo peso, IMC entre 18,5 e 24,9 Kg/m2 indicou peso adequado ou eutrofia, IMC entre 25,0 e 29,9 Kg/m2 foi indicativo de sobrepeso e IMC
superior a 30 Kg/m2 indicou obesidade (INSTITUTE OF MEDICINE, 2009).
O ganho de peso gestacional foi calculado por meio da diferença entre o peso aferido no momento pré-parto e o peso pré-gestacional. A avaliação do ganho de peso foi feita de acordo com as seguintes recomendações do Instituto de Medicina: mulheres com baixo peso antes da gestação deveriam ganhar um total de 12,5 a 18,0 Kg, mulheres com peso adequado pré-gestacional deveriam ganhar de 11,5 a 16,0 Kg, mulheres que estavam com sobrepeso antes da gestação deveriam ganhar de 7,0 a 11,5 Kg e as mulheres com obesidade pré-gestacional deveriam ganhar de 5 a 9 Kg (INSTITUTE OF MEDICINE, 2009).
3.3. COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
primeira coleta, ocorreu a segunda coleta de 2 mL de leite colostro (leite 24 horas) durante a internação da lactante na maternidade.
No trigésimo dia após a primeira coleta de leite colostro, foi realizada a coleta de 4 mL de leite maduro (leite 30 dias) pela própria mãe, em condição de jejum de oito a doze horas. A coleta das amostras de leite maduro foi feita por ordenha manual de uma única mama, no início e no final da mamada.
Durante a manhã em que foi realizada a ordenha do leite maduro, a pesquisadora responsável por este projeto fez visitas domiciliares às mães e transportou as amostras de leite maduro, sob refrigeração, ao Laboratório de Alimentos e Bioquímica da Nutrição (LABAN), localizado na UFRN. Durante essas visitas domiciliares, as mulheres alocadas no grupo controle receberam uma dose única da suplementação de vitamina A. Dentre as 88 mulheres recrutadas, 57 permaneceram até o final deste estudo, sendo 27 mulheres no grupo controle e 30 no grupo suplementado.
As amostras biológicas foram coletadas em tubos de polipropileno protegidos da luz e previamente higienizados, e foram imediatamente transportadas, sob refrigeração, ao LABAN, localizado na UFRN. As alíquotas de sangue foram centrifugadas (500 giros) por 10 minutos para separação e remoção do soro. As amostras de soro e leite maternos foram armazenadas a -20ºC, por um tempo médio de 04 dias, para posterior extração e análise bioquímica do retinol e alfa-tocoferol.
3.4. EXTRAÇÃO DE RETINOL E ALFA-TOCOFEROL NO SORO E LEITE MATERNOS
3.4.1. Extração de retinol e alfa-tocoferol no soro materno
O retinol e o alfa-tocoferol presentes nas amostras de soro foram extraídos de acordo com adaptação do método utilizado por Ortega et al. (1998). Para 1 mL de soro, foi adicionado 1 mL de etanol a 95% (Merck®) e 2 mL de hexano (Merck®). As
mL, para evaporação em banho-maria a 37°C. No momento da análise, o extrato foi diluído em 500 μδ de etanol absoluto (Vetec®) e β0 μδ foram injetados no aparelho de CLAE.
3.4.2. Extração de retinol no leite materno
Figura 6 - Esquema da extração de retinol em amostras de leite materno. Fonte: Elaborado pelo autor.
Para extração de retinol no leite maduro, foi utilizado o método de Giuliano et al. (1992) adaptado, como detalhado acima, alterando-se o volume do leite materno extraído (1 mL), do etanol a 95% (Merck®) (1 mL) e do hidróxido de potássio a 50% v/v (1 mL) adicionados. No momento da análise, o extrato seco foi diluído em β50 μδ de etanol absoluto.
3.4.3. Extração de alfa-tocoferol no leite materno
por 1 minuto e centrifugadas (500 giros) durante 10 minutos, em seguida, o extrato hexânico foi transferido para outro tubo. Essa etapa foi realizada duas vezes, totalizando 4 mL do extrato, do qual foi retirada uma alíquota de 3 mL para evaporação a 37°C. No momento da análise, o extrato seco foi diluído em 500 μδ de diclorometano grau CLAE (Merck®) e β0 μδ foram aplicados no aparelho de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
A extração de alfa-tocoferol no leite maduro utiliza o mesmo método supracitado, modificando-se apenas o volume de leite materno extraído (1 mL) e o volume de etanol a 95% (Merck®) adicionado (1 mL). Além disso, no momento da análise, o extrato seco foi diluído em β50 μδ de diclorometano grau CδAE (Merck®).
3.5. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
As concentrações de alfa-tocoferol e retinol nas amostras biológicas foram determinadas em cromatógrafo da marca Shimadzu. O equipamento é constituído de bomba LC-10 AD Shimadzu, acoplado a um Detector SPD-10A Shimadzu UV-VIS, Coluna Perkin Elmer CLODS (M) 4,6 x 250 mm e integrador Chromatopac C-R6A Shimadzu. A fase móvel utilizada para as análises bioquímicas foi metanol (grau para cromatografia) a 100%, em sistema isocrático com fluxo de 1,0 mL/ min e os comprimentos de onda adotados foram 292 nm e 325 nm para o alfa-tocoferol e retinol, respectivamente.
A identificação e a quantificação do alfa-tocoferol e retinol nas amostras foram realizadas por meio da comparação ao tempo e à área dos padrões de alfa-tocoferol e de retinol (Sigma®). As concentrações dos padrões utilizados foram confirmadas pelos coeficientes de extinção específico em etanol absoluto para alfa-tocoferol e retinol ( 1%, 1 cm = 75,8 a 292 nm e 1%, 1 cm = 1.780 a 325 nm, respectivamente) (NIERENBERG; NANN, 1992; MILNE; BOTNEN, 1986).
3.5.1. Linearidade, exatidão e precisão do método
(concentração versus área do pico). As curvas de calibração foram obtidas por meio de análises de soluções padrão de retinol e de alfa-tocoferol com diferentes concentrações. As curvas de calibração foram consideradas lineares, uma vez que os valores dos coeficientes de linearidade (R2) foram 1,0 e 0,9998 para o retinol e o alfa-tocoferol, respectivamente (Figura 7).
Figura 7 - Curva de calibração dos padrões de retinol (A) e alfa-tocoferol (B) com equação da reta (y) e coeficiente de regressão linear (R2).
Fonte: Elaborado pelo autor.
recuperação de retinol no leite, foram utilizadas 6 alíquotas do pool de leite colostro e acetato de retinol como padrão interno, obtendo-se uma porcentagem de recuperação de 98,0%. O mesmo procedimento foi realizado para o soro e a taxa de recuperação obtida foi de 96,0%. Para o teste de recuperação do alfa-tocoferol no leite, foram utilizadas 6 alíquotas do pool de leite colostro e o padrão interno foi o acetato de alfa-tocoferol, obtendo-se uma recuperação de 98,8%. Este teste de recuperação também foi feito para o alfa-tocoferol no soro materno e a taxa de recuperação foi de 100,0%.
A precisão do método foi verificada por meio do teste de repetitividade, com utilização de 6 alíquotas de uma mesma amostra (leite ou soro). Esse teste consistiu na extração do retinol e do alfa-tocoferol dessas alíquotas e determinação em CLAE em 3 dias alternados. O coeficiente de variação foi inferior a 4% para as amostras de soro e de leite materno.
3.6. VALORES DE REFERÊNCIA
Concentrações de retinol no soro materno inferiores a β0 µg/dδ (0,70 μmol/δ) são indicativas de deficiência de vitamina A e valores de retinol entre 20 e 30 µg/dL (0,70 e 1,05 μmol/δ) indicam baixos níveis séricos (WEST JR, β00β). Concentrações de alfa-tocoferol sérico materno inferiores a 516 µg/dδ (ou 1β μmol/δ) indicam deficiência de vitamina E (INSTITUTE OF MEDICINE, 2000).
3.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
4. RESULTADOS
As características maternas, obstétricas e do recém-nascido referentes à população estudada foram apresentadas na Tabela 1. A maior proporção do grupo é composta por mulheres adultas (65%), que tiveram parto normal (67%) e que possuíam de 0 a 8 anos de estudo (51%). A maioria das mães foi considerada eutrófica quanto ao estado nutricional pré-gestacional (59%). Já em relação ao ganho de peso gestacional, foi observada uma predominância do ganho insuficiente (40%). Os recém-nascidos tiveram peso médio ao nascer de 3.291 ± 506 gramas e 86% possuíam peso adequado. As características das puérperas e dos seus recém-nascidos foram semelhantes entre os grupos estudados (p>0,05).
Tabela 1 - Caracterização da população avaliada com base em variáveis maternas, obstétricas e do recém-nascido.
Características
Grupo controle
(n = 44)
Grupo suplementado
(n = 44)
p* Grupo total
(n = 88)
Idade materna 23 ± 7 24 ± 7 24 ± 7
Adolescente [n (%)] 15 (34) 16 (36) 0,82 31 (35)
Adulta [n (%)] 29 (66) 28 (64) 57 (65)
Escolaridade (anos de estudo)
0 a 8 anos [n (%)] 23 (52) 22 (50) 45 (51)
9 a 11 anos [n (%)] 19 (43) 20 (45) 0,89 39 (44)
>11 anos [n (%)] 2 (5) 2 (5) 4 (5)
Renda familiar (salários)
<1 salário mínimo [n (%)] 19 (46) 15 (35) 34 (40)
1 a 3 salários mínimos [n (%)] 17 (42) 23 (53) 0,52 40 (48)
>3 salários mínimos [n (%)] 5 (12) 5 (12) 10 (12)
Tipo de parto
Normal [n (%)] 30 (68) 29 (66)
0,82 59 (67)
Estado nutricional pré-gestacional
Baixo peso [n (%)] 0 (0) 1 (2) 1 (1)
Eutrofia [n (%)] 23 (52) 29 (66)
0,31 52 (59)
Sobrepeso [n (%)] 11 (25) 9 (21) 20 (23)
Obesidade [n (%)] 10 (23) 5 (11) 15 (17)
Ganho de peso gestacional (Kg) 9,7 ± 8,0 12,1 ± 6,0 10,9 ± 7,1
Insuficiente [n (%)] 21 (48) 14 (32) 35 (40)
Adequado [n (%)] 11 (25) 15 (34) 0,31 26 (29)
Excessivo [n (%)] 12 (27) 15 (34) 27 (31)
Peso ao nascer (g) 3.281 ± 564 3.300 ± 446 3.291 ± 506
Baixo [n (%)] 3 (7) 2 (5) 5 (6)
Adequado [n (%)] 38 (86) 38 (86) 0,84 76 (86)
Macrossomia [n (%)] 3 (7) 4 (9) 7 (8)
*Teste qui-quadrado. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
Em condições basais, as concentrações médias de retinol no soro materno foram 44,8 ± 16,4 µg/ dL e 48,3 ± 15,4 µg/ dL nos grupos controle e suplementado, respectivamente. Não houve diferença significativa entre esses valores (p>0,05), evidenciando a homogeneidade dos grupos antes da intervenção. No grupo total, essa concentração foi 46,4 ± 15,9 µg/ dL, indicando que a população estudada possui níveis séricos adequados em vitamina A. Análises individuais das concentrações de retinol sérico indicaram que 6,2% das mulheres do grupo total apresentaram deficiência de vitamina A.
O efeito da suplementação materna com vitamina A sobre a concentração de retinol nos leites colostro e maduro foi evidenciado na figura 8. No grupo suplementado, houve um aumento significativo de 131% nos níveis de retinol no leite colostro, 24 horas após a suplementação materna com palmitato de retinila (p<0,001), o que não ocorreu no grupo controle (p>0,05). Entretanto, não houve diferença estatística entre a concentração de retinol no leite maduro do grupo controle em comparação ao grupo suplementado (p>0,05).
avaliados (p<0,001), sendo a redução percentual semelhante entre os grupos: 52,8% para o grupo controle e 48,6% para o grupo suplementado (Figura 8).
Figura 8 - Efeito da suplementação materna com vitamina A sobre a concentração de retinol no leite materno das lactantes avaliadas.
Letras diferentes indicam diferença significativa entre as concentrações médias de retinol no leite materno. As diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05 (Teste de ANOVA, com post hoc de Tukey).
O impacto da suplementação materna com vitamina A sobre a concentração de alfa-tocoferol nos leites colostro e maduro foi evidenciado na figura 9. Após a suplementação com vitamina A, a concentração de alfa-tocoferol no leite colostro reduziu significativamente 24 horas após a intervenção (p<0,05), sendo a redução percentual de 16,4%. Por outro lado, a intervenção não influenciou os níveis de alfa-tocoferol no leite maduro (p>0,05).
A análise em função do período de lactação evidenciou uma redução significativa na concentração de alfa-tocoferol no leite maduro de ambos os grupos avaliados (p<0,001), havendo um decréscimo de 79,2% para o grupo controle e de 80,2% para o grupo suplementado (figura 9).
Figura 9 - Efeito da suplementação materna com vitamina A sobre a concentração de alfa-tocoferol no leite materno das lactantes avaliadas.
5. DISCUSSÃO
Durante a gestação, a deficiência de micronutrientes pode trazer consequências adversas para saúde das gestantes e para o desenvolvimento fetal. No período de lactação, as deficiências nutricionais da nutriz podem contribuir para a manutenção de baixas reservas de nutrientes nos lactentes, aumentando as chances de desenvolvimento de carências nutricionais nos primeiros anos de vida, período em que há maior prevalência de agravos à saúde infantil (SILVA et al., 2007).
No grupo de puérperas avaliado, a concentração de retinol sérica foi considerada adequada e está em concordância com os valores obtidos no Brasil (48,6 µg/ dL; 50,6 µg/ dL) (SAUNDERS et al., 2005; GARCIA et al., 2010) e na Alemanha (49,1 µg/ dL) (SCHULZ et al., 2007), entretanto, são superiores ao resultado obtido na África (17,4 µg/ dL) (SEMBA et al., 2000). Além disso, os níveis basais de retinol nos leites colostro e maduro das puérperas avaliadas são semelhantes àqueles de estudos realizados na Alemanha (110,3 µg/ dL) e no Brasil (53,4 µg/ dL), respectivamente (SCHULZ et al., 2007; SOUZA et al., 2015).
Alguns países de alto risco para a deficiência de vitamina A, como o Brasil, adotaram a política de suplementação materna com uma dose de 200.000 UI de vitamina A, dentro de 6 semanas após o parto, a fim de enriquecer o leite materno com esta vitamina (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Nosso estudo verificou que essa estratégia de suplementação aumentou significativamente os níveis de retinol no leite colostro, 24 horas após a intervenção. Achados semelhantes acerca do efeito da suplementação sobre o retinol do colostro foram relatados na literatura (RICE et al., 2000; BAHL et al., 2002; RIBEIRO et al., 2009; GARCIA et al., 2010).
Com relação à concentração de alfa-tocoferol sérico obtida neste estudo, esta foi considerada adequada e é semelhante ao valor encontrado em Cuba, China e Brasil (1.028,0 µg/ dL; 1.106,9 µg/ dL; 1.137,0 µg/ dL) (RODRÍGUEZ et al., 2002; WANG et al., 2009; LIRA et al., 2013) e inferior àquele obtido nos Estados Unidos (1.438,5 µg/ dL) (DIDENCO et al., 2011).
Uma vez que os recém-nascidos exibem uma maior sensibilidade ao dano oxidativo e a transferência placentária de vitamina E é limitada, este micronutriente deve ser fornecido aos recém-nascidos em quantidades adequadas por meio do leite materno (DEBIER; LARONDELLE, 2005; DEBIER et al., 2005). A concentração de alfa-tocoferol no leite colostro é semelhante aos valores encontrados em puérperas cubanas e brasileiras (1.180,0 µg/ dL; 1.206,0 µg/ dL; 1.147,6 µg/ dL) (MACIAS; SCHWEIGERT, 2001; GARCIA et al., 2010; GRILO et al., 2013) e inferior à encontrada em mulheres espanholas (2.455,0 µg/ dL) (QUILES et al., 2006). Além disso, os níveis de alfa-tocoferol no leite maduro são próximos àqueles obtidos em Cuba e no Canadá (270,0 µg/ dL; 232,0 µg/ dL) (MACIAS; SCHWEIGERT, 2001; TIJERINA-SÁENZ; INNIS; KITTS, 2009).
A suplementação com altas doses de vitamina A reduziu a concentração sérica de alfa-tocoferol em estudos realizados com mamíferos (BLAKELY et al., 1990; SCHELLING et al., 1995; NONNECKE et al., 1999; AMETAJ et al., 2000). Estes estudos concluíram que a ingestão de altas doses de vitamina A afeta negativamente a biodisponibilidade da vitamina E no organismo.
Em condições basais, Lira et al. (2013) avaliaram o soro e o colostro de parturientes e sugeriram que a biodisponibilidade da vitamina E pode estar comprometida em condições de suplementação com vitamina A. O único estudo que investigou essa problemática em humanos, em condições de suplementação com vitamina A, foi realizado por Garcia et al. (2010), no Nordeste do Brasil.
Em nosso estudo, quando avaliado o efeito da suplementação materna com vitamina A, verificou-se que os níveis de alfa-tocoferol no leite colostro diminuíram significativamente, 24 horas após a intervenção. Essa redução correspondeu a 16,4%, sendo semelhante à redução percentual de 17% nos níveis de alfa-tocoferol do leite de vacas, após a suplementação com altas doses de vitamina A (675.000 UI) (SCHELLING et al., 1995).
