ß-defensina 2 no leite materno mostra uma ampla atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas.

www.jped.com.br

ARTIGO

ORIGINAL

␤

-defensin-2

in

breast

milk

displays

a

broad

antimicrobial

activity

against

pathogenic

bacteria

夽

,

夽夽

Joanna

Baricelli

_,

_Miguel

_A.

_Rocafull

_,

_Desiree

_Vázquez

_,

Betsi

Bastidas

_,

_Estalina

_{Báez-Ramirez}

_e

_Luz

_E.

_Thomas

a_{LaboratóriodeFisiologiaMolecular,CentrodeBiofísicaeBioquímica,InstitutoVenezolanodeInvestigacionesCientíficas(IVIC),}

Caracas,Venezuela

b_{BancodeLeiteHumano,HospitalUniversitáriodeCaracas,Caracas,Venezuela} c_{LaboratórioDelgadoLaunois,ClínicaLugo,Maracay,Venezuela}

Recebidoem7demarçode2014;aceitoem14demaiode2014

KEYWORDS

Antimicrobialcationic peptides;

hBD2; Lactancy; Defensins;

Anti-infectiveagents; Breastmilk

Abstract

Objective: Todescribetheantimicrobialactivityof␤-defensin-2 producedinthemammary glandandsecretedinhumanbreastmilk.

Methods: Thepeptide productionwas performed by DNA cloning. ␤-defensin-2 levels were quantifiedin61 colostrumsamples and39 maturemilksamples fromhealthydonors, byan indirect enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA). Usinghalo inhibition assay,this study assessedactivityagainstsevenclinicalisolatesfromdiarrhealfecesofchildrenbetween0and 2yearsofage.The activityof␤-defensin-2against threeopportunistic pathogensthatcan causenosocomialinfectionswasdeterminedbymicrodilutiontest.

Results: The peptidelevels were higher incolostrum (n=61) thanin mature milk samples (n=39),asfollows:medianandrange,8.52(2.6-16.3)␮g/mlversus0.97(0.22-3.78),p<0.0001; Mann-Whitney test. The recombinant peptide obtained showed high antimicrobial activity against a broad range of pathogenic bacteria. Its antibacterial activity was demonstrated in a disk containing between 1---4␮g, which produced inhibition zones ranging from 18 to 30mmagainstthreeisolatesofSalmonellaspp.andfourofE.coli.␤-defensin-2showed mini-muminhibitoryconcentrations (MICs)of0.25␮g/mLand0.5␮g/mLfor S.marcescenandP. aeruginosa,respectively, whileahigher MIC (4␮g/mL)was obtainedagainst anisolatedof multidrug-resistantstrainofA.baumannii.

Conclusions: Totheauthors’knowledge,thisstudyisthefirsttoreport␤-defensin-2levelsin LatinAmericanwomen.Theproductionandtheactivityof␤-defensin-2inbreastmilkprove itsimportanceasadefensemoleculeforintestinalhealthinpediatricpatients.

©2014SociedadeBrasileiradePediatria.PublishedbyElsevierEditoraLtda.Allrightsreserved.

DOIserefereaoartigo:http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2014.05.006

夽 _{Comocitaresteartigo:BaricelliJ,RocafullMA,VázquezD,BastidasB,Báez-RamirezE,ThomasLE.}

␤-defensin-2inbreastmilkdisplays abroadantimicrobialactivityagainstpathogenicbacteria.JPediatr(RioJ).2015;91:36---43.

夽夽_{EsteartigorecebeubolsadoInstitutoVenezolanodeInvestigacionesCientíficas(IVIC),Caracas,Venezuela.} ∗_{Autorparacorrespondência.}

E-mails:lthomas@ivic.gob.ve,luzthomas1@gmail.com(L.E.Thomas).

PALAVRAS-CHAVE

Peptídeoscatiônicos antimicrobianos; hBD2;

Lactac¸ão; Defensinas; Agentes

anti-infecciosos; Leitematerno

␤-defensina2noleitematernomostraumaamplaatividadeantimicrobianacontra bactériaspatogênicas

Resumo

Objetivo: Descrever aatividadeantimicrobiana dadefensina-beta2naglândulamamáriae secretadanoleitematernohumano.

Métodos: Aproduc¸ãodepeptídeosfoirealizadaporclonagemdeDNA.Osníveisde defensina--beta 2foramquantificadosem 61 amostras decolostroe39 de leitemaduro dedoadoras saudáveispelotesteELISAindireto.Porumensaiodehalodeinibic¸ão,avaliamosaatividade contraseteisoladosclínicosdiarreicosdecrianc¸asentre0e2anos.Aatividadedadefensina 2contratrêspatógenosoportunistasquepodemcausarinfecc¸õesnosocomiaisfoideterminada pelotestedemicrodiluic¸ão.

Resultados: Osníveisdepeptídeosestavamsignificativamentemaioresnasamostrasdecolostro (n=61)quedeleitemaduro(n=39),comosegue:8,52(2,6-16,3␮g/mL)medianaefaixaem comparac¸ãoa0,97(0,22-3,78),p<0,0001;testedeMann-Whitney.Opeptídeorecombinante foiobtidodaaltaatividadeantimicrobianademonstradacontraumaamplagamadebactérias patogênicas. Sua atividadeantibacteriana foi demonstradaem um discocontendo entre 1-4␮g,queproduziuzonasdeinibic¸ãoentre18e30mmcontratrêsisoladosdeSalmonellaspp. equatrodeE.coli.Adefensina-beta2demonstrouconcentrac¸õesinibitóriasmínimas(CIMs) de0,25␮g/mLe0,5␮g/mLparaS.marcescenandP.aeruginosa,aopassoqueumaCIMmaior (4␮g/mL)foiobtidacontraumisoladodecepamultirresistentedeA.baumannii.

Conclusões: Atéondesabemos,esteestudoéoprimeiroarelatarníveisdedefensinaem mulhe-resdaAméricaLatina.Aproduc¸ãoeaatividadedadefensina2noleitematernocomprovamsua importânciacomoumamoléculadedefesaparaasaúdeintestinalempacientespediátricos. ©2014SociedadeBrasileiradePediatria.PublicadoporElsevierEditoraLtda.Todososdireitos reservados.

Introduc

¸ão

A Organizac¸ão Mundial de Saúde relata que 6,6 milhões decrianc¸as com menosdecincoanos deidade morreram em 2012. Ademais, 44% dessas mortesocorreram durante o período neonatal.Do final do períodoneonatal aos pri-meiroscincoanosdevida,asprincipaiscausasdeóbitosão pneumonia,diarreiae malária.Adesnutric¸ãoé ofatorde contribuic¸ão de base em aproximadamente 45% de todos osóbitosinfantis, tornandoascrianc¸as maisvulneráveis a doenc¸as graves.1 _{Maisdametade dessasmortes}

prematu-rasdecrianc¸asdeve-seacondic¸õesquepodemserevitadas outratadascomacessoaintervenc¸õessimpleseacessíveis; umadelaséaamamentac¸ão.

Apenasdurantealactac¸ão,ossereshumanosenfrentamo grandedesafiodesobrevivênciapormeiodoleitematerno. Este estáassociado à protec¸ão contradoenc¸asdiarreicas, infecc¸ões do trato respiratório e enterocolite necrosante (ECN).2---5_{Aprotec¸ãocontrainfecc¸ãoemneonatos}

amamen-tadospareceocorrerpormeiodediversosfatoresdedefesa adquiridos e inatos complementares encontrados no leite materno,inclusiveoligossacarídeoseseusglicoconjugados,6

enospeptídeosantimicrobianos(PAMs).7,8

DentreosPAMs, afamíliadasdefensinasconstitui uma importante parte darespostaimuneinatana secrec¸ão de fluidos. Uma comprovac¸ão cada vez mais forte sugere a importância dasdefensinasna respostaimune. Resultados em estudos recentes sobre asatividades homeostáticas e de combate a doenc¸as das defensinas humanas apontam parasuaprincipalrelevânciaemváriasdoenc¸aspediátricas.

Por exemplo, as concentrac¸ões elevadas de defensina--beta2(hBD2)refletindofortesrespostasimunesintestinais foramassociadasacursosmoderadosdeECN.9_Contudo,os

neonatos com ECN grave não apresentaram aumento nas concentrac¸ões fecais de hBD2 antes e durante a doenc¸a. Esses estudos sugerem que uma deficiência específica na ativac¸ão da imunidade inata em neonatos com extremo baixopesoaonascer(EBPN),emvezdeumabarreira epi-telial intestinal prejudicada, leva a um curso mais grave de ECN.9 _{No contexto, a ingestão de hBD2 a partir do}

leitematernoganhaimportância.Notavelmente,osníveis dehBD2 nointestino correspondem a defensinas noleite materno7,8,10_{esecrec¸õesdascélulasepiteliaisintestinais.As}

últimassãoinduzidasporanticorposcatalíticospresentesno leitematerno,agindopormeiodedoisreceptoresativados porproteasespresentesnamembranaplasmática.11

Asconcentrac¸õesdecomponentestotaiseespecíficosdo leitematernohumanoviriamentreasmães,duranteodia, deacordocomaidadegestacionaldoneonatoedurantea lactac¸ão.10,12 _{Apresenc¸adehBD2intactotambémfoi}

rela-tadanasfezesdosneonatos,oquemostraqueahBD2tende aresistiraosprocessosdigestivosdotratogastrointestinal.13

Defato, foi proposto que a quantificac¸ão das defensinas nasfezespodeserumbiomarcadorefetivodasaúdeede doenc¸as intestinais na populac¸ão pediátrica.14 _A

resistên-ciadaHBD2à digestão aumentaria suadisponibilidade, o quepossibilitariaaprotec¸ãodetodaasuperfíciemucosado tratogastrointestinal.

venezuelanas.Segundo,caracterizamosaatividade antimi-crobiana da hBD2 em comparac¸ão a bactérias associadas a enterocolite em neonatos e a bactérias gram-negativas associadasainfecc¸õesnosocomiais.

Materiais

e

métodos

Materiais

Okitdeclonagem® _TOPO®_{TAparasequenciamentoeokit}

deexpressãodirecionalpETTOPO®_{foramadquiridosda}

Invi-trogen(InvitrogenCorp.,Carlsbad,Califórnia,EUA).Todos osoutrosreagentesforamdegraureagenteanalítico.

Coletaepreparac¸ãodoleitematerno

Foiobtidooconsentimentoporescritodetodasasdoadoras envolvidasneste estudo antesdacoleta e processamento dasamostras.Nenhumadasdoadorasnoestudoapresentou histórico de doenc¸as reumatológicas,respiratórias, cardi-ovasculares ou gastrointestinais. Os critérios de inclusão foramlactantessaudáveisquederamàluzatermo.Os cri-tériosdeexclusãoforammãesquetiverampartoscesáreos, quereceberam tratamento com antibiótico,com suspeita deinfecc¸ão, oucom históricode doenc¸as autoimunes. As amostrasdoprimeiro aosextodiasapóso nascimentosão caracterizadas como colostro, ao passo que as amostras coletadas depois do 10◦

dia de nascimento são caracte-rizadasleite maduro. Obtivemos 61 amostras de colostro e39deleitemaduro.Todasasamostrasforamcoletadas uti-lizandoumprotocolopadronizadoaprovadopeloComitêde Bioética do Hospital Universitário da Universidad Central deVenezuela(UCV).Asamostrasforamcoletadasdemães saudáveis (18-30 anos de idade) incluídas no servic¸o de bancodeleitedo HospitalUniversitário. Antes dacoleta, osmamilosforamlimposcomcotoneteeáguaestéril.

As amostrasforamcoletadasdedos seiose centrifuga-dasa4◦ _{C(1.000×gpor15minutos)paraqueasmesmas}

tivessem um aglomerado de células na parte inferior e umacamada degordura napartesuperior. Osorodeleite sobrenadantenomeiofoialiquotadoecongeladoa---80◦_C.

Quandoprontoparauso,foidescongeladoa4◦

C.

Culturasdecélulas

CélulasSKBR3cultivadas(linhagemcelularde adenocarci-nomademamahumano,HTB-30cat.n◦_{11965-092American}

TypeCultureCollection(ATCC),Manassas,EUA).

Cepasdebactérias

Isoladosclínicos:AbactériaAcinetobacterbaumannii(cepa multirresistente isolada de pacientes com infecc¸ão noso-comial do Hospital Universitário de Caracas --- ICV) foi gentilmentedoadapeloDr.G.Alonso(InstitutodeBiologia Experimental---UCV).Foitestadoumtotaldesete enteropa-tógenosdeamostrasdiarreicasdascrianc¸as,sendotrêsdo gênero Salmonella: Salmonella paratyphi,Salmonella ari-zona,Salmonellasp.equatroisoladosdiferentesdeE.coli. Todos foram identificados com ensaios bacteriológicos

padrão,utilizandoosistemaVitek®_{32(BioMérieuxInc.,}

Mis-souri,EUA)eocartãoGNI(BioMérieuxInc.,Missouri,EUA). AcepaPseudomonasaeruginosaATCC276532 foi cordi-almentecedidapeloDr.TakiffdoLaboratóriodeGenética Molecular---IVIC.AbactériaEscherichiacoliATCC25922foi obtidadocentroATCC.

Animais

Galinhasmarronsdecincomesesdeidadeforamcompradas deumfazendeirolocal.

Reac¸ãoemcadeiadapolimerasecomtranscric¸ão

reserva(RT-PCR)

As células SKBR3 foram cultivadas para confluência de 80%. As células foram então tratadas por quatro horas comlipopolissacarídeo(LPS)(1␮g/mL),conformedescrito anteriormente.11_{ORNAfoiextraídodascélulasSKBR3}

utili-zandooreagenteTrizol®_{(Invitrogen,Carlsbad,CA,EUA),de}

acordocomasinstruc¸õesdofabricante.ODNAcdadefensina 2foiamplificadopelareac¸ãoRTPCRutilizandoiniciadores antissensohBD2,conformeanteriormenterelatado.11_A

clo-nagemdirecionaldoprodutodaPCRfoiatingidautilizando iniciadoresdesignadoscomlocaisderestric¸ãoespecíficos.

hBD2S:CCCGGGCATGAGGGTCTTGTATCTCCTCTTC hBD2R:GAATTCGGAGCCCTTTCTGAATCCGCA;(255bp) Osprodutos dePCR resultantes foram purificados,e o gene completo hBD2da codificac¸ão das células SKBR3 foi clonadonovetor100pET(kitdeexpressãoeclonagem dire-cionaispETTOPOChampion,Invitrogen,Califórnia,EUA).As proteínasdefusãoforamexpressasemumsistemadeE.coli

(CepaBL21DE3),deacordocomasinstruc¸õesdofabricante. A proteínadefusão recombinante foi utilizadaem ambos ostestesdeatividadeantimicrobiana.Tambémfoiutilizada paraproduziranticorposdasgemasdeovosdasgalinhas.

Produc¸ãoepurificac¸ãodeanticorposdasgemasde

ovosparahBD2recombinante

O antígenode 100␮g(hBD2 recombinante) foi diluídoem soluc¸ãotampãofosfatosalino(PBS)eemulsionadacomigual volumedeadjuvanteincompletodeFreund.Asuspensãofoi injetada por via subcutânea nasaves. As aves receberam injec¸õesadicionaisdaproteína7,21,31e42diasdepois. AimunoglobulinaY(IgY)foipurificadaapartirdeovos indi-viduaisutilizandoumkitdePurificac¸ãodeIgY deFrangos (Catn◦_{44918,PierceBiotechnology,Illinois,EUA),seguindo}

asinstruc¸õesdofabricante.Antesdaimunizac¸ão, purifica-mosaIgYparaobterIgYpré-imuneparaserutilizadacomo controlenegativonapadronizac¸ãodotesteELISA.

Quantificac¸ãodehBD2pelotesteELISAindireto

(Cat n◦ _{300-51A e 300-49, Peprotech México, Cidade do}

México,México).Ospadrõeseamostrasforamdiluídosem tampão de revestimento de carbonato e as placas foram

bloqueadas por 4 horas em 200mL de tampão de

blo-queio. A ␤-defensina 2 anti-humana de galinhas com IgY policlonalfoidiluídaemtampãodebloqueio1:1000e acres-cidade(100␮l).Duas horasdepois,aanti-imunoglobulina secundáriadecoelhosconjugadacomperoxidase(diluic¸ão 1:5000) em tampão de bloqueio foi acrescidade (100␮l) e incubada por 1 hora e 50 minutos. A reac¸ão colorimé-trica foi feita conforme descrito anteriormente.11 _Como

controle, as amostrasem cada placa foram tratadas com IgYpré-imunesousemanticorposprimáriosparadeterminar qualquerligac¸ãonãoespecífica.Aconcentrac¸ãode defen-sina das amostras foi calculada pela interpolac¸ão de três curvas padrão construídas por meiode duas diluic¸ões de sériedenossahBD2recombinante.Adiluic¸ãoidealda amos-trafoiestabelecidaportitulac¸ãoevariouentreosdoadores. Nossostestescontrolemostraramqueosanticorpos policlo-naisutilizadosparaas␤-defensinas2foramseletivos.Assim, aIgYanti␤-defensina2nãoreagiucom␤-defensina1.

Testesdeatividadeantimicrobiana

AscepastestadasforamcultivadasemmeioLuria-Bertano (LB) líquido para um OD600 ∼1.0. As suspensões

resultan-tesforamdiluídasaumaconcentrac¸ãode∼104_deunidades

de formac¸ão de colônias (CFU) por mL. A alíquota de LB de 100 l foi distribuída em placas de 96 poc¸os.15 _A

ati-vidade antibacteriana dahBD2 foi avaliada com peptídeo diluídoemsérieparaobterconcentrac¸õesde8;4;2;1;0,5; 0,25e0,125␮g/mL.UmcontroledecrescimentosemhBD2 e umcontrolede esterilidadeseminóculotambémforam incluídos em cada cepa. As placasforam incubadasa 35◦ Ceasmedic¸õesdeturbideza600nmutilizandoumleitor demicroplacaspormultidetecc¸ãoSynergyHT(SynergyHT, Bio-TekInstruments,Vermont,EUA).Em umúnico experi-mento,cadaconcentrac¸ãodehBD2foitestadatrês vezes. Cadamicro-organismofoianalisadonomínimoemtrês expe-rimentos independentes. A análise estatística e ascurvas derespostaàdose foramobtidasutilizandoosoftwareK4 fornecido pelaSynergy HT(Bio-TekInstruments,Vermont, EUA). As concentrac¸ões inibitórias mínimas (CIMs) foram determinadasa partirdascurvas dosperfisdeinibic¸ãodo crescimentocomumaabsorbânciadeOD600nm,e represen-tamamenorconcentrac¸ãodahBD2queinibiuocrescimento bacterianoem90%na24a_{horadecultura.}

Susceptibilidadeaantimicrobianosportestesde

difusãoemdisco

A susceptibilidade in vitro de isolados clínicos a

defen-sina pode ser aproximadamente determinada por testes

dedifusãoemdisco.16 _{Foiutilizadacanamicinacomo}

con-trole interno. Osdiscos foram preparados utilizando uma soluc¸ãodeantibiótico reservaacrescentandoumasoluc¸ão antimicrobianaemcadadiscodepapel.Utilizamosfolhasde papel-filtrodaBioRad(Catn◦_{:170-3956,BioRad,Califórnia,} EUA).Elesforampreparadosumahoraantesdaaplicac¸ão nasplacas, seguido de30 minutosdeabsorc¸ão.Os discos

preparadosnãoforamarmazenados,tendosidosecosantes daaplicac¸ão.

Após24horasdeincubac¸ão,aszonasdeinibic¸ãoforam medidas.O diâmetrodas áreas de inibic¸ão pôdeser con-vertido às categorias de susceptível, intermediário ou resistente (S, I ou R), de acordo com as tabelas padrão. A interpretac¸ão, pontos de interrupc¸ão e esquema de categorizac¸ãoforamfeitosdeacordocomasrecomendac¸ões doInstitutodePadronizac¸ãoClínicaeLaboratorial(Clinical andLaboratoryStandardInstitute---CLSI).

Análiseestatística

A apresentac¸ão gráfica e a análise estatística dos dados foramfeitasutilizandoosoftwareGraphPadPrism(versão 4.0)(GraphPadSoftwareInc.,Califórnia,EUA).Foiutilizado otesteUdeMann-Whitneyparacomparac¸ãoentreos gru-pos.Arelevânciaestatísticafoiestabelecidaemp<0,05.

Resultados

ExpressãodopeptídeorecombinantedehBD2

O peptídeo recombinante de hBD2 foi produzido a

par-tir do DNAc da célula epitelial mamária com base na

conhecida sequência de nucleotídeos da hBD2 (também

conhecidacomoDEFB4A),esuaidentidadefoiestabelecida pelosequenciamentodoDNA.Essepeptídeorecombinante foiutilizado paraproduzir IgYpoliclonal.Essesanticorpos foram utilizados no ELISA indireto para a detecc¸ão e a quantificac¸ãoda␤-defensinahumananasamostrasdeleite humano.

Quantificac¸ãodehBD2nasamostrasdeleite

humano

Umtotalde100mãesvenezuelanassaudáveisfoirecrutado para este estudo. Os níveis de peptídeo estavam signi-ficativamente maiores no colostro: 8,52 (2,6-16,3␮g/mL)

mediana e faixa, que nas amostras de leite materno

0,97 (0,22-3.78), p<0,0001; teste de Mann-Whitney. A quantificac¸ãodehBD2nasamostrasdeleitehumano apre-sentou variabilidade interindividual, bem como em cada estágiodalactac¸ão(fig.1).

Testesdeatividadeantimicrobiana

Opeptídeorecombinantefoianalisadoparaverificac¸ãoda atividade dos antienteropatógenos. Os resultados desses experimentossãomostradosnatabela1efigura2.

DeacordocomoCLSI,ocontroledaCanamicinaemuma concentrac¸ão de30␮gnodiscodeveproduzir umhalode inibic¸ãode18-25mmemcomparac¸ãoàE.coliATCC25922.17

Tabela 1 Concentrac¸ões inibitórias mínimas depeptídeo defensina-beta 2humano contrasete cepas clínicas isoladas de SalmonellaeE.coli

Agenteantimicrobiano Conteúdodo discoem␮g

Cepadebactérias Diâmetrodazonadeinibic¸ãoemmm

Resistente Intermediário Susceptível

Canamicina 30 EscherichiacoliATCC

25922

ENSAIOCONTROLE

13 14-17 18

20±0,5

hBD2 1 Escherichiacolisp

ISOLADO1

10±0,5

hBD2 4 16±0,4

hBD2 8 19±0,4

Canamicina 30 22±0,3

hBD2 1 Escherichiacolisp

ISOLADO2

20±0,3

hBD2 4 23±0,4

hBD2 8 27±0,5

Canamicina 30 29±0,6

hBD2 1 Escherichiacolisp

ISOLADO3

22±0,3

hBD2 4 24±0,5

hBD2 8 26±0,3

Canamicina 30 27±0,3

hBD2 1 Escherichiacolisp

ISOLADO4

15±0,3

hBD2 4 18±0,5

hBD2 8 22±0,4

Canamicina 30 30±0,6

hBD2 1 Salmonellaparatyphi

ISOLADO5

22±0,3

hBD2 4 25±0,3

hBD2 8 29±0,6

Canamicina 30 16±0,3

hBD2 1 Salmonellasp

ISOLADO6

17±0,5

hBD2 4 22±0,5

hBD2 8 26±0,4

Canamicina 30 28±0,3

hBD2 1 Salmonellaarizona

ISOLADO7

18±0,3

hBD2 4 19±0,3

hBD2 8 21±0,4

Canamicina 30 33±0,4

Alémdisso,ahBD2mostrouatividadeantimicrobianaem relac¸ãoatrês cepasrepresentativasdeespécies bacteria-nasenvolvidasem infecc¸ões nosocomiais. ObtivemosCIMs de0,25␮g/mL e 0,5␮g/mL para S. marcescen e P. aeru-ginosa.ObtivemosumaMICrelativamentemaior(4␮g/mL) emcomparac¸ãoaumisoladoclínicodeumacepa multirre-sistente(MDR)deA.baumannii.

Discussão

Os atrasos no desenvolvimento do sistema imunológico

em neonatos são compensados pela glândula mamária,

fornecendo assim a protec¸ão necessária. A lactac¸ão for-nece não apenas nutric¸ão, mas também protec¸ão vital

contra patógenos ambientais. Mesmo com variabilidade

interindividualemníveisdediferentesfatoresdeprotec¸ão relacionados ao leite, a amamentac¸ão fornece protec¸ão contraenterocolitenecrosante,4_{infecc¸ãogastrointestinal}3

e infecc¸ões respiratórias2 _{no recém-nascido. Este artigo}

abordou a produc¸ão dehBD2 em doadoras de leite vene-zuelanas e explorou o possível efeito de protec¸ão da hBD2 contra isolados enteropatógenos obtidos das fezes diarreicasdascrianc¸as.

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

hBD-2 (

µ

g/ml)

Colostro Leite maduro

Figura 1 Níveisde defensina encontradosnas amostras de

leitematernodas100doadoras.Aslinhashorizontaisindicama medianadeconcentrac¸ãodedefensinanasamostrasdecolostro eleite maduro.Osníveis depeptídeosestavam significativa-mente maioresnocolostro, 8,52(2,6-16,3␮g/mL)mediana e faixa,quenoleitemaduro,0,97(0,22-3,78).Foiusadooteste deMann-Whitneyparacompararosgrupos,comp<0,0001.

colostro, os intervalos de concentrac¸ão de hBD2 foram 0,31-19,12 ng/mL, em comparac¸ão a52,65-182,29 pg/mL encontradosnoleitemaduro. DeacordocomWangetal., também encontramos maiores níveis dehBD2 nocolostro que noleitemaduro; contudo,ambosos grupos de amos-trasdasmulheresvenezuelanasmostrarammaioresníveisde

hBD2queogrupochinês.18_{Asdiferenc¸asentreosníveisde}

expressãodehBD2 entreambos osresultadosdos estudos sãosurpreendentes.Ambososrelatospossuemigualnúmero dedoadoras,portanto,essasdiferenc¸aspodemser atribuí-das à etnia dos grupos envolvidos. Um artigo recentede Burchetal.destacouquearac¸a/etniapareceter influên-ciasobreoníveldefatoresimunológicosnoleitematerno,19

enossosresultadosparecemcomprovaressesachados.Até ondesabemos,nossoestudoconstituioprimeiro relatoda caracterizac¸ão dos níveis de defensina no leite materno em mulheres daAmérica Latina, e esses achados ajudam a reforc¸ar a recomendac¸ão de amamentac¸ão exclusiva, visandoprotegerasaúdedecrianc¸asemrisco.Foram encon-tradasdefensinasemumaconcentrac¸ãode1-10mg/mLem grânulosdeneutrófilos20,21_{econcentrac¸ãode20-100mg/mL}

noepitéliodalíngua desuínos.22 _{Acredita-sequemenores}

concentrac¸ões(0,1-1mg/mL)de␤-defensinaspodem indu-zirquimiotaxia,23,24_{enossosresultadosmostramumafaixa}

semelhantedeconcentrac¸ão.

De acordo com nossos resultados, Castellote et al.25

relataramqueaconcentrac¸ãodefatoresimunológicosnas amostras de colostro é maior no leite de transac¸ão ou maduro.Elessugeremqueoíndice elevadodefatores ati-vosemneonatosprematurosesuascorrelac¸õesinversasao pesoaonascerpodemindicarquesuaconcentrac¸ãonoleite émoduladapelasnecessidadesdoneonato.Osmecanismos responsáveispelasdiferenc¸asnacomposic¸ãodoleiteentre osestágiosdelactac¸ãoaindanãoforamestabelecidos.

Foirelatadaaatividadebactericidainvitrodas defensi-nashumanas2emcomparac¸ãoaenteropatógenosecepas nosocomiais.26 _{Defato,cadadefensina-beta caracterizada}

atéomomentotemacapacidadedematarouinibirinvitro

8

1 4

0,25 0,125 0 0,5 2

1,2

1

0,8

0,6 0,4

0,2

0

–0,2 0 8 16 24 32

Tempo (h)

CIM 0,25 μg/ml 1 CIM 0,5 μg/ml

0,8

0,6

0,4

0,2

0

–0,2 0 12 24 36

Tempo (h)

8

1 4

0,25 0,125 0 0,5 2

D0 600nm

8

1 4

0,25 0,125 0 0,5 2

Tempo (h)

0 12 24 36

CIM 4 μg/ml

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 –0,2

D0 600nm

P. aeruginosa S. marcesens

A. baumannii

C

B

A

D0 600nm

Figura2 EfeitodahBD2sobreocrescimentobacteriano.DensidadeópticaemdiferentesmomentosdecrescimentoemLBdetrês

diversas bactérias. Essa atividade varia, principalmente, comconcentrac¸õesdesaleproteínasdoplasmanoteste.21

Assim,a comparac¸ão diretadaCIMpodenãoser determi-nante.Contudo,énotávelqueaconcentrac¸ãonaqualessa defensinamostraatividadeantimicrobianaéamesmaque noleitematerno;fatoquenãoapenasnosimpressiona,mas tambémindicasuafunc¸ãofisiológica.

Opapeldessepeptídeonafisiologiaintestinaldo recém--nascidotemsido antimicrobiano.Adiarreia bacteriana é umadasprincipaiscausasdeinfecc¸ãonainfância.Portanto, é importante determinar a atividade da hBD2 em isola-dos de casosclínicos diarreicos. Neste estudo, utilizamos quatrodiferentes isolados de E.coli e três de Salmonella spp.Emtodososcasos,encontramosatividadeinibitóriado crescimento,emcomparac¸ãoaosparâmetrosdereferência dacanamicina(comcepadereferênciadosisoladosE.coli

ATCC25922).Kapeletal.13_{descreveramníveisfecais}

eleva-dosdehBD2empacientespediátricoscomcoliteulcerativa (CU)e doenc¸adeCrohn(DC), emcomparac¸ãoa controles saudáveis. Eles encontraram umaumento de três a qua-trovezes nos níveis fecais dehBD2 em crianc¸as com DC, diferentementedoaumento>10nosníveisfecaisdehBD2 paraCU.Notavelmente,Barreraetal.11 _{relataram que as}

célulasepiteliais do intestino aumentaram a secrec¸ão de hBD2apóstratamento comanticorposcatalíticos com ati-vidadedeproteasepurificada doleitematerno.Portanto, deveser considerado que o índice de hBD2 nas amostras fecaiscorrespondeàsomadaproduc¸ãodepeptídeos intes-tinais mais a ingestão direta por meiodo leite materno. Ademais, Hiratsuka et al.27 _{indicaram reduc¸ão da}

ativi-dadedasdefensinas-betanafibrosecística,sugerindoque asdefensinas-beta podem desempenhar um papel impor-tantenoprocessopatológicodeinfecc¸ão crônicadotrato respiratório.Além desuaatividadeantimicrobiana, foram relatadasoutrasatividadesdahBD2.Osachadosde Gambi-chleretal.28_{mostrarampadrõesdeexpressãoalteradosda}

hBD2nocarcinomabasocelularnãoulcerado,sugerindoque ahBD2tambémdesempenhaumpapelnapatogênesedesse câncer depele não melanoma. Recentemente, Li etal.29

indicaramque a terapia genéticacom hBD2 podemediar a imunidadeantitumoral e os efeitos antitumorais locais. Adicionalmente,ahBD2apresentouatividadequimiotática paramonócitos,macrófagos,neutrófilosecélulas dendríti-casimaturas.15

Por fim, determinamos a atividade antimicrobiana da hBD2 recombinante em três bactérias gram-negativas (S.

marcescen, P. aeruginosa, A. baumannii) que podem ser

patógenosoportunistasemsereshumanos,afetandopessoas comsistemaimunológico comprometido.Um fator impor-tanteemsuaproeminênciacomopatógenoséaresistência intrínsecaaantibióticosedesinfetantesquepossuem,que os tornam importantes indivíduos no campo de infecc¸ão nosocomial.AhBD2recombinante apresentoucrescimento inibidoem todasasbactérias testadas. Asusceptibilidade daHBD2mostradapelacepadaMDRA.Baumanniiestáde acordocomorelatadoporRoutsiasetal.26 _{Elessugeriram}

que,alémdemutac¸õesqueconferem resistênciaa deter-minadosantibióticos,essasbactériassofremmutac¸õesque afetamagerac¸ãodeenergianecessáriaparaamanutenc¸ão da integridade de suas membranas ou afetam a própria estruturadasmembranas,levandoaumamaior susceptibi-lidadeàhBD2.Aac¸ãolíticadosPAMsocorrepormeiodeum

eventovinculante,comoqualospeptídeospositivamente carregados interagemcom asmembranas plasmáticas ani-ônicasdosmicro-organismosalvo.Sabe-sequeaatividade antimicrobianadahBD2edeoutrosPAMséaltamente sensí-velàpresenc¸adecatiõesbivalentes,soroemacromoléculas aniônicas, como os glicosaminoglicanos. Contudo, vários desses PAMs ainda conseguem conferir protec¸ão nessas doenc¸as. Nesse sentido, outras propriedades imunomodu-ladoras, como migrac¸ão celular, sobrevida,proliferac¸ão e induc¸ãodemediadoresimunológicos,provavelmentepodem ter mais relevância em seus mecanismos de combate a doenc¸as.30

O uso inadequado de antibióticos levou à transferên-cia horizontal de genes entre micróbios e estimulou seu potencialevolutivodedesenvolverresistênciacontra anti-microbianosconvencionais.Emconsequência,aresistência bacterianaaosantibióticoséumproblemacrescenteno tra-tamentomédicomodernodedoenc¸asinfecciosas,conforme mostrado pelo crescente número de pacientes imuno-comprometidos com infecc¸ões nosocomiais. Para superar temporariamenteoproblemadaresistência,sãonecessárias novas abordagens terapêuticas. Como os peptídeos anti-microbianossão produtosdaevoluc¸ão de longoprazo por natureza, o estudo dessa família pode nos fornecer uma soluc¸ãoviável.

Em suma, a amostra de populac¸ão de mulheres neste estudoapresentouníveiselevadosdedefensina2noleite, sugerindo que a rac¸a/etnia pode influenciar o nível de fatoresimunológicos noleitematerno.Osníveis elevados depeptídeoencontradosnocolostrosugerema importân-cia desse fator imunológico inato nos primeiros dias de vida. O peptídeo hBD2 mostrou atividade antimicrobiana em relac¸ãoaváriasbactérias,inclusive patógenoscomuns que causamdiarreia em neonatos egram-negativos, rele-vantesem infecc¸õesnosocomiais. Aatividadeeo elevado índicedahBD2noleitematernoenfatizamasuperioridade daamamentac¸ãonanutric¸ãodeneonatos.

Conflitos

de

Interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

EsteartigorecebeubolsadoInstitutoVenezolanode Inves-tigaciones Científicas (IVIC). Este estudo fez parte da dissertac¸ão demestradode JoannaBaricelli noCentro de EstudosAvanc¸ados(CEA-IVIC).

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