DESMIELINIZAÇÃO TÓXICA DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
I. A Ç Ã O D E U M A D R O G A I N T E R C A L A N T E G L I O T Ó X I C A N A M E D U L A E S P I N H A L D E R A T O S W I S T A R
DOMINGUITA LÜHERS GRAÇA *
R E S U M O — P e q u e n o s v o l u m e s de b r o m e t o de e t í d i o f o r a m i n j e t a d o s nas colunas dorsais da m e d u l a l o m b a r de ratos W i s t a r . F o i assim i n d u z i d o p r o c e s s o d e s m i e l i n i z a n t e q u e v a r i o u em n a t u r e z a e v e l o c i d a d e de r e p a r a ç ã o de a c o r d o c o m a d o s e e m p r e g a d a . A s lesões p r o d u z i d a s f o r a m classificadas em três t i p o s ( I , r á p i d a s ; I I , l e n t a s ; I I I , i n t e r m e d i á r i a s ) , d e a c o r d o com as características h i s t o l ó g i c a s e a extensão d a r e m i e l i n i z a ç ã o . E m a l g u m a s lesões ou em áreas d e n t r o da m e s m a lesão, os restos d e m i e l i n a e de células g l i a i s e r a m r a p i d a m e n t e processados p o r m a c r ó f a g o s e os a x ô n i o s r a p i d a m e n t e r e m i e l i n i z a d o s p o r células d e Schwann, enquanto em outras lesões de duração similar, o u em á r e a s d e n t r o d a m e s m a lesão, a m i e l i n a se t r a n s f o r m a v a em emaranhados de m e m b r a n a s que p e r s i s t i a m a o r e d o r do a x ô n i o p o r l o n g o s p e r í o d o s de t e m p o . N a s lesões que continham tais m e m b r a n a s d e r i v a d a s da mielina, os m a c r ó -f a g o s eram escassos e a r e m i e l i n i z a ç ã o , -f e i t a p e l a s células d e Schwann, era d e m o r a d a e trabalhosa. Concluiu-se que a r e s o l u ç ã o lenta de a l g u m a s lesões r e s u l t a r a do lapso transcor-r i d o enttranscor-re a i n t o x i c a ç ã o e o d e s a p a transcor-r e c i m e n t o das células transcor-relacionadas à m i e l i n a , s i g n i f i c a n d o que as respostas celulares à d e s m i e l i n i z a ç ã o t i v e r a m l u g a r em á r e a l i v r e d e células g l i a i s . E s t a não p o d i a sustentar, p o r t a n t o , a m o v i m e n t a ç ã o c e l u l a r necessária p a r a a r e m o ç ã o dos restos de m i e l i n a e a p o s t e r i o r r e m i e l i n i z a ç ã o . E s t a i n v e s t i g a ç ã o i n d i c a que o d e s e n v o l v i -m e n t o e o desfecho d a d e s -m i e l i n i z a ç ã o p o d e -m ser a l t e r a d o s pelos e v e n t o s celulares q u e aco-m- acom-panham a d e g e n e r a ç ã o dos o l i g o d e n d r ó c i t o s .
Toxic demyelination of the central nervous system: I. Effects of an intercalating gliotoxic chemical in the spinal cord of W i s t a r rats.
S U M M A R Y — Small v o l u m e s of ethidium b r o m i d e w e r e i n j e c t e d i n t o the dorsal columns of the spinal c o r d of W i s t a r rats. I t w a s induced a d e m y e l i n a t i n g process, v a r i a b l e in nature and speed of r e p a i r a c c o r d i n g to t h e dose used. T h e induced lesions w e r e classified i n t o three g r o u p s ( t y p e I or fast l e s i o n s ; t y p e I I o r s l o w l e s i o n s ; t y p e I I I o r i n t e r m e d i a t e l e s i o n s ) a c c o r d i n g to the h i s t o l o g i c a l appearance and e x t e n s i o n o f r e m y e l i n a t i o n . I n some lesions or in areas w i t h i n the same lesion, m y e l i n and g l i a l c e l l d e b r i s w e r e r a p i d l y processed b y m a c r o p h a g e s and the naked a x o n s soon r e m y e l i n a t e d b y S c h w a n n c e l l s . I n o t h e r lesions of s i m i l a r duration, o r areas w i t h i n the lesions, m y e l i n u n d e r w e n t t r a n s f o r m a t i o n i n t o mazes of membranes w h i c h p e r s i s t e d around the axons f o r l o n g p e r i o d s of t i m e . I n the lesions w h i c h contained such m y e l i n _ d e r i v e d m e m b r a n e s , m a c r o p h a g e s w e r e scant and r e m y e l i n a t i o n b y Schwann cells w a s s l o w and arduous. I t m a y be c o n c l u d e d t h a t the s l o w r e s o l u t i o n of s o m e lesions resulted f r o m the t i m e elapsed b e t w e e n i n t o x i c a t i o n and disappearance of m y e l i n _ r e l a t e d cells. T h a t t i m e d i f f e r e n c e d e t e r m i n e d that the c e l l u l a r responses to d e m y e l i n a t i o n t o o k place in an area d e v o i d of g l i a l c e l l s and t h e r e f o r e w i t h o u t a s u p p o r t f o r t h e c e l l u l a r m i g r a t i o n n e e d e d f o r the r e m o v a l of m y e l i n d e b r i s and e v e n t u a l r e m y e l i n a t i o n . T h i s i n v e s t i g a t i o n indicates that t h e d e v e l o p m e n t and o u t c o m e o f d e m y e l i n a t i o n m a y b e a l t e r e d b y t h e cellular e v e n t s that occur d u r i n g o l i g o d e n d r o c y t e d e g e n e r a t i o n .
D e p a r t a m e n t o de P a t o l o g i a , U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d e S a n t a M a r i a : * D M V , P h D , P r o -fessor A d j u n t o .
Á r e a s de desmielinização podem ser induzidas na medula espinhal de animais por injeção de pequenos volumes de d r o g a s g l i o t ó x i c a s na substância branca 1,2,10. Os
axônios desprovidos de suas bainhas são remielinizados por oligodentrócitos ou células de Schwann, dependendo do grau de destruição dos astrócitos 3,8 e da espécie animal
u s a d a1 2
. O corante intercalante brometo de etídio ( B E ) , extensivamente usado como tripanocida nos países africanos? é atualmente utilizado para destruir seletivamente a neuróglia da substância branca e induzir áreas de desmielinização no sistema nervoso central de mamíferos 4,n,i2,i5,i6.
N o presente estudo é examinado o efeito de injeções intramedulares de B E no rato. O s resultados mostram que o tempo, o tipo e a extensão da remielinização são influenciados pelos eventos locais o c o r r i d o s após a injeção do tóxico. T a i s resultados também apontam para os efeitos do meio em que j a z o axônio desmielinizado, na deter-minação do processo de reparação.
M A T E R I A L E M É T O D O
Oitenta e quatro ratos W i s t a r adultos, de ambos os sexos, receberam injeções intra-medulares de B E dissolvido em salina normal. F o r a m usadas duas concentrações: 0,5 m g / m l e 1,0 m g / m l e três volumes: 0,5, 0,8 e 1,0^1. N o v e ratos receberam injeções de 1,0^1 de salina normal. P a r a a injeção, os ratos eram anestesiados com Halotano e era feita laminectomia na primeira vértebra lombar. A s injeções eram realizadas na substância branca dorsal com micropipeta de vidro colada na a g u l h a de seringa Hamilton em micromanipulador (8). Os animais foram sacrificados em vários tempos entre 24h e 9 meses após a injeção, por perfusão intra-aórtica, sob anestesia geral, com glutaraldeído a 4% em tampão fosfato. A medula pré-fixada era removida e a área d a lesão identificada e cortada em secções transversais de 1 mm de espessura. Os fragmentos eram pós-fixados em tetróxido de ósmio e incluídos em Resina T a a b . D e cada bloco, secções de um mícron de espessura foram cortadas e coradas pelo azul de toluidina para exame em microscópio óptico. Áreas selecionadas foram
eviden-o
ciadas e cortadas com espessura de 700 A , coradas com sais de chumbo e uranila e examinadas em microscópio eletrônico de transmissão Hitachi H S - 8 .
R E S U L T A D O S
A resposta do tecido quanto à natureza da patologia mostrou marcante variação rela-cionada à concentração de B E utilizada. Três tipos de lesão se desenvolveram: rápidas, lentas e intermediárias — tipos I , I I e I I I , respectivamente ( T a b e l a 1). O tipo I I , ou lesão lenta, estava associado com doses baixas de B E . A concentração alta de B E induziu lesões rápidas ou intermediárias ( F i g . 1).
O B E induziu alterações degenerativas em todas as células da medula espinhal, com exceção das células endoteliais. A s células mais afetadas foram as da neuróglia, das quais a que mais rapidamente degenerou foi o astrócito. A s bainhas de mielina mostravam vacuoli-zação e vesiculação e as células da glia mostravam tumefação das mitocôndrias, desarranjo da cromatina nuclear e alterações do citoesqueleto ( F i g . 2). A s mudanças observadas no retículo endoplasmático dos oligodendrócitos durante a mielinização do tronco cerebral de ratos lactentes expostos ao B E (11) não foram detectadas neste estudo. A s alterações
dege-Tipo
Características
histológicas Remielinização
Velocidade de desenvolvimento
I alta celularidade nítida fagocitose
extensa e uniformemente distribuída
rápida
I I baixa celularidade, pouca atividade fagocitária
escassa, somente em áreas subpiais
lenta
I I I celularidade média, atividade fagocitária inconstante
variável, ao redor de vasos sangüíneos e sob a pia
intermediária
Tabela 1 ratos.
— Tipos de lesão induzidas classificadas de acordo com
por brometo de estídio (BE) a extensão da remielinização.
266 Arq Neurò-Psiquiat (São Paulo) Jf7(3) 1989
nerativas evoluiram até o 13' dia. Nias lesões rápidas, a mielina e as células degeneradas eran removidas por abundantes macrófagos ativados, de modo que aos 7 dias após a injeção de B I muitos axônios tinham perdido suas bainhas. N a s lesões lentas, a presença d e macrófago! era escassa e neles se acumulavam grandes quantidades de membranas derivadas da mielini ( M D M ) ( F i g . 3). N a s lesões intermediárias ( T i p o I I I ) , eventos dos dois tipos ocorriam simul taneamente. A partir do 13? dia era visualizada a reparação do tecido pelas células d< Schwann, sob a pia e ao redor dos vasos sangüíneos, locais a partir dos quais migravarr ordenadamente entre os axônios desmielinizados. Os oligodendrócitos remielinizavam fibras adjacentes ao tecido normal.
C O M E N T Á R I O S
O fato mais notável nas lesões induzidas pelo B E na medula espinhal do rato foi a v a r i a ç ã o na natureza do processo de d e g r a d a ç ã o das bainhas de mielina e a dife-rença na velocidade em que as lesões se repararam. A desmielinização primária é nor-malmente caracterizada pela ativação macrofágica e o rápido processamento das bainhas de mielina 13. Nessas circunstâncias, a remielinização por oligodentrócitos e células de Schwann é rápida, tão l o g o o estímulo desmielinizante seja removido 5. O acúmulo de mielina vesiculada ( l e s õ e s lentas) ocorreu em áreas com poucos macró-f a g o s ativados, indicando que ela macró-forma e persiste quando a d e g r a d a ç ã o tem lugar na ausência ou sem a adequada indução de resposta macrofágica normal após a morte dos o l i g o d e n d r ó c i t o s1 2
. A maioria dessas lesões lentas ocorreu quando a menor dose do B E foi injetada.
A s alterações celulares e teciduais são induzidas pela ação intercalante do BE 14 e pela reação inflamatoria não específica no local da i n j e ç ã o6
. P o r t a n t o , quando se considera o efeito da injeção de B E na medula espinhal, é importante considerar os efeitos não específicos induzidos pelo tóxico, os quais poderiam influenciar o desen-volvimento da lesão. Assim, as lesões induzidas por dose alta podem ser rápidas não só por o c o r r e r pronta desmielinização, mas por haver estimulação não específica para a entrada de m a c r ó f a g o s na área N a ausência de tal estimulação, a entrada dos macró-f a g o s pode ser retardada, ocorrendo acúmulo de mielina vesiculada, o qual protrai a reparação do tecido.
Agradecimentos — A excelente assistência técnica de I r e n e L L o y d e Robert Patterson (University of C a m b r i d g e ) e de I a r a E t h u r F l o r e s (Universidade Federal de Santa M a r i a ) é calorosamente reconhecida.
R E F E R Ê N C I A S
1. B l a k e m o r e W F — R e m y e l i n a t i o n b y S c h w a n n cells of a x o n s d e m y e l i n a t e d b y intraspinal injections of 6-aminonicotinamide in t h e rat. J N e u r o c y t o l 4 :745, 1975.
2. B l a k e m o r e W F — I n v a s i o n of Schwann cells i n t o t h e spinal c o r d of t h e r a t f o l l o w i n g local injections of l y s o l e c i t h i n . N e u r o p a t h A p p l N e u r o b i o l 2 : 21, 1976.
3. B l a k e m o r e W F — R e m y e l i n a t i o n in t h e c e n t r a l nervous s y s t e m . I n B e h a m P O , C l i f f o r d R o s e F ( e d s ) : P r o g r e s s i n N e u r o l o g i c a l R e s e a r c h . P i t m a n , Bath, 1979, p g 12.
4. B l a k e m o r e W F — E t h i d i u m b r o m i d e induced d e m y e l i n a t i o n in t h e spinal cord of the cat. N e u r o p a t h A p p l N e u r o b i o l 8 : 365, 1982.
5. B l a k e m o r e W F — D e m y e l i n a t i o n a n d r e m y e l i n a t i o n in t h e central nervous s y s t e m . I n S w a s h M , K e n n a r d C ( e d s ) : S c i e n t i f i c Basis o f Clinical N e u r o l o g y . C h u r c h i l l _ L i v i n g s t o n e , H o n g K o n g , 1985, p g 589.
6. B r a n d e r G C , P u g h D M — V e t e r i n a r y A p p l i e d P h a r m a c o l o g y and T h e r a p e u t i c s E d 2. B a i l - ¬ l i e r e T i n d a l l , N e w Y o r k , 1971, p g 456.
7. G i l b e r t R J , N e w t o n B A — E t h i d i u m b r o m i d e : p h a r m a c o k i n e t i c s a n d efficacy against t r y p a n o s o m e infections in r a b b i t s and c a l v e s . P a r a s i t o l 85 : 127, 1982.
8. G r a ç a D L — I n v e s t i g a t i o n into ethidium b r o m i d e induced d e m y e l i n a t i o n in t h e central nervous s y s t e m . T e s e de P h D , U n i v e r s i t y of C a m b r i d g e , U K . C a m b r i d g e , 1986. 9. G r a ç a D L — I n v e s t i g a ç ã o s o b r e a d e s m i e l i n i z a ç ã o i n d u z i d a p e l o b r o m e t o d e e t i d i o no
sistema n e r v o s o central. R e v P a u l M e d 105 : 238, 1987.
10. Graça D L — M i e l i n i z a ç ã o , d e s m i e l i n i z a ç ã o e r e m i e l i n i z a ç ã o n o s i s t e m a n e r v o s o central. A r q N e u r o - P s i q u i a t ( S ã o P a u l o ) 46 : 292, 1988.
11. G r a ç a D L , B l a k e m o r e W F — T h e f o r m a t i o n o f i n t r a c y t o p l a s m i c scrolls f o l l o w i n g local injections of ethidium b r o m i d e . N e u r o p a t h A p p l N e u r o b i o l 11 : 73, 1985.
12. Graça D L , B l a k e m o r e W F — D e l a y e d r e m y e l i n a t i o n in r a t spinal cord f o l l o w i n g ethidium b r o m i d e injection. N e u r o p a t h A p p l N e u r o b i o l 12 : 593, 1986.
13. L a m p e r t P W — F i n e s t r u c t u r e o f t h e d e m y e l i n a t i n g process. I n H a l l p i k e J F , A d a m s C W M , T o u r t e l l o t t e W W ( e d s ) : M u l t i p l e S c l e r o s i s : P a t h o l o g y , D i a g n o s i s and M a n a g e m e n t . Chapman and H a l l , L o n d o n , 1983, p g 29.
14. W a r i n g M J — C o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n e t h i d i u m b r o m i d e and nucleic acids. J M o l e c B i o l 13 : 269, 1965.
15. Y a j i m a K , Suzuki K — U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s i n o l i g o d e n d r o g l i a and m y e l i n sheaths induced b y ethidium b r o m i d e . N e u r o p a t h o l A p p l N e u r o b i o l 5 : 49, 1979.
