PAPEL ANTI-INFLAMATÓRIO DA ADIPONECTINA E DA
INTERLEUCINA-10 EM MODELOS CLÍNICO E
EXPERIMENTAL DE OBESIDADE
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina, para obtenção
do Título de doutor em Ciências.
São Paulo
PAPEL ANTI-INFLAMATÓRIO DA ADIPONECTINA E DA
INTERLEUCINA-10 EM MODELOS CLÍNICO E
EXPERIMENTAL DE OBESIDADE
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina, para obtenção
do Título de doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Cláudia Maria da Penha Oller do Nascimento
Co-orientadores: Profa. Dra. Lila Missae Oyama
Profa. Dra. Ana Raimunda Dâmaso
São Paulo
Lira, Fabio Santos de
Papel anti-inflamatório da adiponectina e da interleucina-10 em
modelos clínico e experimental de obesidade.
/ Fabio Santos de Lira.
-- São Paulo, 2011.
xii, 88f.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista
de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Nutrição.
Título em inglês: Role anti-inflammatory of adiponectin and
interleukin-10 in obesity model clinical and experimental.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
Campus São Paulo
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
“Para os amigos Tudo, para os inimigos a Lei.”
Dedicatória
À minha mãe Jaci, meu pai Lira, minhas irmãs Andréia e
Luciana e meu irmão Cristiano, por tudo o que fizeram por mim.
À minha esposa Sabrina, pela compreensão e amor.
Ao meu pequeno Bruno Kenji, razão do meu viver.
Aos meus sobrinhos Pedro Augusto, Felipe Gabriel e Letícia, por
alegrar nossas vidas.
À meu sogro Akio, minha sogra Fumiko e minha cunhada Silvia,
AGRADECIMENTOS
A Professora Dra. Cláudia Maria Oller do Nascimento, pela paciência, amizade, mais que isso, por ter acreditado no meu potencial.
A Professora Dra. Lila Missae Oyama, pelos ensinamentos e amizade.
A Professora Dra Marília Seelaender, que sempre me apoiou, tendo enorme contribuição sobre minha formação acadêmica, serei eternamento grato.
A Professora Dra Ana Damaso e todo seu grupo, pelo carinhoso acolhimento. Sou muito grato pela oportunidade.
Aos Professores Marco Túlio de Mello e Ronaldo Vagner Thomatilei dos Santos, pela oportunidade de realizar meu pós-doutorado no CEPE, sou muito grato.
A Emília Ribeiro, minha eterna madrinha, obrigada por tudo.
Aos meus amigos do Laboratório de Fisiologia da Nutrição, a “velha guarda” José Cesar (Zeca), Gustavo Pimentel (Gú), Claudio Alexandre (Claudião), Karina Barros, Ricardo Eguchi (Ric), Vinícius Martins (Vini), João Felipe Mota, Cristiane Oliveira, Daniela Martins, Valter Tadeu e a “nova geração” Rachel De Laquila (Rachelzinha), Gabriel Honorato, Mayara Moreno (Demoninho).
As queridas, Ana Lúcia, Carmozinha e Fabiola, sou muito feliz por ter conhecido todas vocês.
Aos amigos, Alex Shimura Yamashita, Nelo Eidy Zanchi, Daniel Venancio (Cabeça), Wilton Darlens dos Santos, Eivor Martins Junior, Gabriela Chamusca, Valéria Panissa, Pedro Lorena Bezerra, Leandro Ribeiro Marques, Cássio Couto Moraes, Rodrigo Fermino, Mario Filho.
Aos amigos do Laboratório de Lípides da USP, Renata Silvério (Tchutchuca), Robson (Bibi), Daniela Caetano (Dani), Luiz Carnevali (Gringo), Felipe Donatto, Michele Joana, Rodrigo Xavier, Miguel Luiz Batista Jr.
Aos Professores: Erico Chagas Caperuto, Marco Carlos Uchida, Luciana Pisani, Marcela Meneguello Coutinho, Emer Suavinho Ferro, Alison Colquhoun, Antonio Hebert Lancha Junior. Ao Prof. GG (in
memorinam).
Ao pessoal do Laboratório das Profa Dra Eliane Beraldi Ribeiro, Vera Lúcia Flor Silveira, Ana Lydia.
SUMÁRIO
Dedicatória vi
Agradecimentos vii
Sumário viii
Listas ix-xi
Resumo xii
1 INTRODUÇÃO 1-2
2 REVISÃO DE LITERATURA 3
2.1 Obesidade 3-4
2.2 Tecido adiposo e processo inflamatório 4-10
2.3 Adipocinas anti-inflamatórias 10-15
3 Objetivos 16
3.1 Objetivo Geral 17
4. MATERIAIS E MÉTODOS 18
4.1 Estudo clínico: 18-23
4.2 Estudo Experimental 23-26
5. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS E DISCUSSÃO 27
5.1 Manuscrito 1 28-36
5.2 Manuscrito 2 37-55
5.3 Manuscrito 3 56-77
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 78
Lista de Figuras
Figura 1. Percentual da mudança do biótipo da população adolescente no Brasil.
Figura 2. Recrutamento de macrófagos para tecido adiposo. “Início do ciclo vicioso”.
Figura 3. Visão esquemática do possível mecanismo relacionado à Microbiota intestinal e à obesidade.
Figura 4. Ciclo Vicioso da manutenção da inflamação na obesidade.
Figura 5. Ação anti-inflamatória da IL-10.
Figura 6. Ação celular da resposta anti-inflamatória da adiponectina.
Lista de Abreviaturas e Símbolos
AdipoR1 Receptor de Adiponectina 1
AdipoR2 Receptor de Adiponectina 2
AG Ácido Graxo
AMPK Adenosina Monofosfato Quinase
ATGL Lipase do Triacilglicerol do Adiposo
CREBP Proteína Ligada ao Elemento Responsivo ao Carboidrato
DM2 Diabetes Mellitus 2
FAIJ Fator Adiposo induzido pelo Jejum
gp130 Glicoproteína 130
LHS Lipase Hormônio Sensível
IkB inibidor do NF-κB
Ikkβ inibidor Quinase do NFkB sub-unidade beta
IL-10 Interleucina 10
IL-10R Receptor de IL-10
IL-1ra Receptor Antagonista de IL-1
IL-1β Interleucina 1β
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
IMC Índice de Massa Corporal
IRAK Receptor da IL-1 associada à Kinase
IRS-1 Substrato do Receptor de Insulina 1
JAK Janus Quinase
LPS Lipopolissacarídeos
MCP-1 Proteína Quimioatraente de Monócito 1
mRNA Ácido Ribonucléico mensageiro
MYD88 Myeloid differentiation primary response gene (88)
NF-κB Fator de transcrição Nuclear kappa B
NK Matadoras Natural
PPER Elemento Responsivo ao PPAR
PPAR Receptor Ativado de Proliferador de Peroxissomo
RTNFI Receptor do Fator de Necrose Tumoral-α tipo I
RTNFII Receptor do Fator de Necrose Tumoral-α tipo II
SOCS-3 Sinal de Supressão de Citocina 3
SREBP Proteína Ligada ao Elemento Responsivo ao Esterol
STAT Transdutor de Sinal e Ativador Transcripcional
TACE Enzima Convertora de TNF-α
TLR-2 Toll Like Receptor 2
TLR-4 Toll Like Receptor 4
TNF Fator de Necrose Tumoral
TRADD Domínio de proteína de Morte, associado ao receptor de TNF-α tipo 1
TRAF1 Fator associado ao receptor do TNF 1
TRAF2 Fator associado ao receptor do TNF 2
TRAF6 Fator associado ao receptor do TNF 6
RESUMO
Objetivo: Verificar os efeitos anti-inflamatórios da adiponectina e da interleucina 10 em modelos clínico e experimental de obesidade. O estudo foi dividido em duas etapas: clínico com adolescentes obesos submetidos à terapia de redução de peso interdisciplinar por 1 ano; e experimental in vitro,
com adipócitos 3T3-L1. No estudo clínico, foram sujeitos do estudo 18 adolescentes (7 meninos e 11
meninas, idade 15 1,7 anos, índice de massa corporal (IMC) acima do Percentil 95. Os adolescentes participaram do programa de terapia interdisciplinar por 1 ano. Parâmetros antropométricos e bioquímicos séricos foram analisados antes e após a terapia. Nesta etapa do projeto observamos que, a redução da gordura visceral, assim como das adipocinas pró-inflamatórias no soro foram acompanhadas pelo aumento da adiponectina e da interleucina 10. Outro fator analisado foi a concentração sérica de endotoxina e resistência à ação da insulina. Pudemos observar que a melhora do quadro da resistência à ação da insulina foi acompanhada pela redução da endotoxina sérica após a terapia interdisciplinar. A redução da endotoxina correlacionou-se com aumento da adiponectina sérica. Tais alterações sugeriram que essas adipocinas anti-inflamatórias (adiponectina e interleucina 10) podem estar envolvidas nos processos anti-inflamatórios induzidos pelo programa de terapia interdisciplinar, e com a melhora do quadro inflamatório destes adolescentes obesos.
No estudo in vitro, analisamos os mecanismos intracelulares da resposta inflamatória em células
adiposas 3T3-L1, estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS), na ausência ou presença da adiponectina e interleucina 10, isoladas e associadas, a fim de elucidar os efeitos anti-inflamatórios da adiponectina e interleucina 10. Para tanto, avaliamos a secreção de IL-6 e a cascata de sinalização dos Toll Like Receptors (TLR-2, TLR-4, MyD88 e TRAF6), assim como o Fator Nuclear kappa B e sua ligação com DNA. Observamos que, adipócitos 3T3-L1 tratados por 24h mostraram elevada concentração de IL-6 no meio de cultura, assim como, aumento da cascata de sinalização da via do NF-κB e da expressão protéica do IL-6R, TLR-4, MyD88, TRAF6. A adiponectina e IL-10 inibiram o aumento na concentração de IL-6, bem como a ligação do NF-κB com DNA. Tomados em conjunto, nossos resultados tanto clínico quanto experimental fornecem evidência de que a adiponectina e IL-10 têm importante papel na resposta anti-inflamatória, inibindo a via de sinalização do NF-κB e consequentemente reduzindo as adipocinas pró-inflamatórias. Corroboram com a ideia de que tais adipocinas podem ser excelentes estratégias para o tratamento do estado inflamatório na obesidade.
1. Introdução
A obesidade é um problema de saúde pública sendo considerada uma epidemia mundial (Gruen
et al, 2007). As expectativas são que a prevalência desta doença crescerá nos próximos anos, devido o
aumento do número de pessoas com estilo de vida sedentário e consumo alimentar inadequado. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a obesidade e o sobrepeso alcançarão a marca de 1,6 bilhões em adultos (idade maior que 15 anos) em 2015.
A obesidade atualmente é caracterizada por um quadro inflamatório crônico associado a aumento plasmático de: endotoxina (como lipopolissacarídeos), ácidos graxos saturados (Kueht et al,
2009; Kashyap et al, 2009) e citocinas pró-inflamatórias (Hukshorn et al, 2004) envolvidos no
desenvolvimento de morbidades como diabetes mellitus, hipertensão, dislipidemias e síndrome metabólica (Gruen et al, 2007).
O tecido adiposo é um importante órgão secretor de adipocinas pró e anti-inflamatórias. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina-6 (IL-6), importantes marcadores inflamatórios, estimulam a produção de diversas proteínas e citocinas pró-inflamatórias, em diferentes tipos celulares via ativação do fator nuclear κB (NF-κB), (Haas et al, 2008; Turnbull, Rivier, 1999). Da mesma forma
que as endotoxinas (lipopolissacarideos - LPS) e os ácidos graxos saturados o fazem via ativação de TLR-4. Diversos estudos apontam que a adição de LPS no meio de cultura de adipócitos 3T3-L1, ativa o NF-κB, elevando a expressão gênica de adipocinas pró-inflamatórias, e que esta resposta é favorecida pelos TLR-2 e TLR-4 (Lin et al, 2000; Ajuwon, Spurlock, 2005; Suganami et al, 2007).
Vários relatos da literatura referem que o TNF-α e a IL-6 prejudicam a cascata de sinalização de insulina aumentando a resistência à ação desse hormônio em diversos tecidos, como no músculo esquelético, tecido adiposo e fígado (Hotamisligil et al, 1994; Feinstein et al, 1993; Del Aguila et al,
1999). Adicionalmente, a IL-6 tem efeitos pró-inflamatórios, como aumento da produção de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos, aumento da maturação e atividade de linfócitos B, macrófagos, monócitos e células NK, além de aumentar a expressão de IL-1 e TNF-α nestas células.
A concentração de IL-6 no tecido adiposo é, aproximadamente, 50 vezes maior do que sua concentração plasmática (Sopasakis et al, 2004) e este tecido contribui com aproximadamente 30% da
IL-6 presente no sangue (Mohamed-Ali et al, 1997).
Juge-Aubry et al (2005) demonstraram que o tecido adiposo é uma fonte importante de IL-10, e
sua secreção apresenta-se aumentada em indivíduos obesos quando comparados com eutróficos. Estudos têm demonstrado que a IL-10 tem sua produção aumentada no tecido adiposo em processos inflamatórios, câncer e exercício agudo (Coppack, 2001; Lira et al, 2009a; Rosa et al, 2009b), como
retroalimentação negativa ao excesso de adipocinas pró-inflamatórias, como por exemplo, o TNF- (Daftarian et al, 1996; Lira et al, 2009b).
A adiponectina, outra adipocina anti-inflamatória, tem efeito sistêmico, e sua concentração plasmática está inversamente relacionada com a massa de tecido adiposo e ao IMC (Gil-Campos et al,
2004). Esta adipocina aumenta a sensibilidade à insulina, no músculo esquelético e no tecido adiposo (Lara-Castro et al, 2007; Gil Campos et al, 2004); tem efeitos anti-inflamatórios sobre as células do
sistema imunológico (Wulster-Radcliffe, 2004), e reduz a formação de placa de ateroma. Portanto, a diminuição da concentração de adiponectina no plasma, pode estar associada com aumento do quadro inflamatório, com a diminuição na sensibilidade à insulina e problemas cardiovasculares, frequentemente observados em obesos (Schober et al, 2007).
Tomados em conjunto, esses estudos sugerem um papel de suma importância da IL-10 e da adiponectina em doenças inflamatórias crônicas, principalmente devido ao seu efeito modulador da síntese e secreção do TNF- e IL-6, desta forma, essas adipocinas vem ganhando um papel de destaque como possibilidade terapêutica em indivíduos obesos que apresentam o quadro inflamatório crônico.
Frente a essas informações da literatura, levantamos a hipótese de que a redução das adipocinas anti-inflamatórias, IL-10 e adiponectina, que ocorre em indivíduos obesos, teria papel relevante no desencadear do processo inflamatório no tecido adiposo destes indivíduos.
Para verificar esta hipótese analisamos o perfil de citocinas e endotoxina em adolescentes obesos antes e após terapia interdisciplinar para o tratamento da obesidade e correlacionamos as citocinas pró-inflamatórias com a concentração plasmática de adiponectina e IL-10. O tratamento interdisciplinar utilizado no presente estudo vem sendo eficiente na redução da prevalência da síndrome metabólica, da esteatose hepática não alcoólica, da compulsão alimentar, contribuindo para a melhoria na qualidade de vida destes adolescentes obesos (Caranti et al, 2007; De Piano et al, 2007;
Carnier et al, 2008; Caranti et al, 2008).
Adicionalmente, realizamos estudo invitro em adipócitos 3T3-L1 com objetivo de investigar os
2. Revisão de Literatura
2.1 Obesidade
A obesidade representa grave problema de saúde pública, que afeta tanto países desenvolvidos quanto em desenvolvimento (OMS, 2010). Estudos epidemiológicos indicam que aproximadamente 65% da população dos Estados Unidos apresentam excesso de peso, sendo que 35% desses indivíduos são classificados como sobrepeso (β5 ≤ IMC ≤ γ0 kg/m2) e γ0% são considerados obesos (IMC ≥ γ0
kg/m2) (Hedley
et al, 2004).
Segundo a Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009 realizada pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística o aumento de peso em adolescentes de 10 a 19 anos foi contínuo nos últimos 34 anos (IBGE, 2010). Neste período, a prevalência de excesso de peso (IMC ≥ β5 kg/m2) na
população adolescente brasileira passou de 3,7% para 21,7% no sexo masculino e 7,6% para 19% para o sexo feminino. Já os casos de obesidade (IMC ≥ γ0 kg/m2), entre adolescentes, passaram de 0,4%
para 5,9% no sexo masculino, e de 0,7% para 4,0% no sexo feminino (IBGE, 2010) (Figura 1).
Quadro este extremamente preocupante, pois, estima-se que indivíduos obesos apresentam aumento de 50 a 100% do risco de mortalidade, fato explicado pela associação entre excesso de peso e gordura abdominal com doenças crônicas não transmissíveis, como hipertensão arterial, dislipidemia, diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e certos tipos de câncer. O excesso de peso e a obesidade resultam da
interação de diversos fatores, como genéticos, metabólicos, comportamentais e ambientais (Ryan, Kushner, 2010).
No Brasil, vários estudos de base populacional têm mostrado que fatores sócio-demográficos e comportamentais estão associados ao aumento do peso corporal. Entretanto, ainda existem poucos estudos acerca do papel desses determinantes na distribuição da gordura corporal. Em geral, os riscos de desenvolver obesidade abdominal aumentam com a idade e diminuem com a maior escolaridade. Adicionalmente, observa-se associação entre obesidade abdominal e menopausa (Ronque et al, 2005;
Campos et al, 2006), tornando-se primordial o desenvolvimento de terapias, tanto relacionadas a
mudança de comportamento, como farmacológicas, em especial na adolescência visando reduzir o impacto do envelhecimento no desenvolvimento de obesidade e doenças a ela associadas.
A obesidade é uma condição heterogênea com relação à distribuição regional da adiposidade: obesidade visceral refere-se à acumulação de gordura nos depósitos omental e mesentérico, enquanto a obesidade periférica geralmente refere-se ao aumento de gordura nos depósitos subcutâneos e está menos relacionada com o desenvolvimento de comorbidades (Cao et al, 2008). As diferenças
funcionais entre os adipócitos viscerais e subcutâneos, tanto no que concerne aos aspectos metabólicos como secretórios, podem estar relacionadas com sua localização anatômica (Pond, 1996; Hocking et
O tecido adiposo visceral possui macrófagos residentes, os quais produzem várias moléculas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-6 e menores quantidades de moléculas anti-inflamatórias, tais como adiponectina e interleucina-10 (Dandona et al, 1998; Trayhurn, Wood, 2005). Este perfil
pró-inflamatório está associado à resistência à ação da insulina e desempenha papel importante na patogênese da disfunção endotelial e aterosclerose subsequente (Hamdy et al, 2006).
Este estado pró-inflamatório descrito em indivíduos obesos está principalmente relacionado com o acúmulo de gordura visceral e não da gordura subcutânea, sendo importante para a verificação do risco de desenvolvimento de doenças, a análise destes depósitos, o que torna o IMC um índice pouco acurado na pesquisa clínica.
Thorne et al (2002), relataram que a remoção de tecido adiposo visceral por omentectomia
(retirada do tecido adiposo omental) resultou na diminuição nas concentrações de glicose e de insulina em 11 homens e 14 mulheres (IMC >35kg/m2), em contraste, a remoção de tecido adiposo subcutâneo,
por método de lipoaspiração nem sempre resultaram em melhorias no metabolismo da glicose ou de lipídios (Klein et al, 2004).
2.2 Tecido adiposo e processo inflamatório
produzida e liberada pelo tecido adiposo, este tecido passou também a ser considerado um “órgão endócrino” (Pelleymounter et al, 1995).
Essa descoberta foi de suma importância, dando início aos estudos sobre a atividade secretora do tecido adiposo. Atualmente, sabemos que o tecido adiposo secreta peptídeos bioativos, chamados de “adipocinas”, que agem de maneira autócrina, parácrina e endócrina, participando da regulação da ingestão alimentar e do balanço energético, atuando no sistema imunológico, na sensibilidade à insulina, na angiogênese, na regulação da pressão arterial e do metabolismo lipídico (Trayhurn, Beattie, 2001).
O aumento na concentração plasmática do TNF-α e IL-6 estão envolvidos no desenvolvimento da resistência à insulina encontrada na obesidade (Ronti et al, 2006). Inversamente, a adiponectina,
que tem propriedades antidiabéticas e antiaterogênicas, apresenta sua concentração plasmática reduzida (Bueno et al, 2008).
A denominação de TNF-α foi derivada da ação deste peptídeo sobre células tumorais, provocando a necrose desse tipo celular. Esta citocina foi primeiramente descrita em 1975 e denominada de caquexina. Devido à potente ação contra as células tumorais, posteriormente passou a ser conhecida como TNF-α (Vercammen et al, 1998).
Potente citocina pró-inflamatória produzida em diversos tipos celulares, o TNF-α age de maneira autócrina, parácrina e induz, no tecido adiposo e em outras células, a expressão de várias citocinas inflamatórias, como IL-6, IL-1, IL-8, proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1), dentre outras e reduz a expressão e secreção de adiponectina (Peeraully et al, 2004).
A ação fisiológica do TNF-α depende de sua ligação aos seus receptores. Foram até hoje descritos dois tipos de receptores, o tipo I (TNF-RI, p55) e o tipo II (TNF-RII, p75) (Bazzoni, Beutler, 1996). Esses receptores que são proteínas transmembrana, possuem a porção extracelular dos dois tipos de receptores para TNF-α, exibindo arquitetura bem similar, mas os domínios intracelulares são bem diferentes (Lewis et al, 1991).
A ativação de ambos os receptores pelo TNF-α aumenta a atividade do NF-κB, no entanto, por vias diferentes. O TNF-RII ativa esse fator nuclear via transdução de sinal pela ação das enzimas TRAF1 e TRAF2 (Fator associado ao receptor do TNF 1 e 2), enquanto o TNF-RI age recrutando a
enzima TRADD (Domínio de proteína de Morte, associado ao receptor de TNF-α tipo 1) induzindo
uma via de transdução de sinalização diferente (Darnay, Aggarwal, 1997).
Outra adipocina que se encontra elevada em indivíduos obesos é a IL-6. A IL-6 é uma glicoproteína produzida por uma grande variedade de tipos celulares (Turnbull, Rivier, 1999). A primeira ação descrita foi o estímulo do crescimento e diferenciação dos linfócitos B (Curfs et al,
1997).
Hoje, sabe-se que a IL-6 é capaz de produzir as mais diversas ações em diferentes tecidos. Seu aumento no plasma é capaz de elevar a resposta de fase aguda a estímulos agressores (Turnbull, Rivier, 1999); alterar a homeostase energética (Fischer, 2006); induzir a liberação do hormônio adrenocorticotrófico, febre, anorexia e fadiga (Robson, 2003).
A IL-6 age via um receptor complexo que contém pelo menos uma subunidade da proteína transdutora de sinal gp130. Liga-se ao seu receptor na célula alvo e o complexo IL-6-receptor associa-se a proteína transmembrana gp130, permitindo a transdução de sinal (Taga, Kishimoto 1997; Derouet
et al, 2004). Desta forma, como todas as células até hoje estudadas que expressam a proteína gp130
em seus domínios transmembrana, pode-se inferir que a IL-6 atue em todas ou na maioria das células do organismo (Althoff et al, 2000; Althoff et al, 2001).
Atualmente sabe-se que indivíduos obesos apresentam um quadro inflamatório crônico de baixo grau, que é caracterizada pelo aumento sistêmico da proteína C reativa e citocinas pró-inflamatórias (Petersen, Pedersen, 2005). Este processo inflamatório tem origem em diversas modificações, tanto diretamente no tecido adiposo como sistêmicas.
Alterações no tamanho dos adipócitos e do depósito do tecido adiposo causam mudanças físicas na área circundante e na atividade parácrina do adipócito. Por exemplo, no início da hipertrofia dos adipócitos, estes começam, paulatinamente, a elevar a secreção de TNF-α, o que estimula a produção da MCP-1 pelos preadipócitos e pelas células endoteliais. A MCP-1 é uma quimiocina que recruta macrófagos para o tecido adiposo. Durante este processo ocorre modificação na secreção de outras adipocinas, tais como: elevação na leptina e redução na adiponectina. Este quadro favorece o processo inflamatório, pois, a leptina também estimula a migração de macrófagos para o tecido adiposo, e a redução de adiponectina promove a adesão de macrófagos nas células endoteliais.
Outros fatores como danos físicos no endotélio e hipóxia, causados por mudanças do tamanho exarcebado das células adiposas, e danos oxidativos resultantes de um ambiente cada vez mais lipolítico, também desencadeiam um ambiente propício para a infiltração de macrófagos, semelhante ao observado na aterosclerose.
Todas estas modificações no tecido adiposo levam a um ciclo vicioso de recrutamento de macrófagos, aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias e comprometimento da função dos adipócitos, como descrito na revisão de Wellen, Hotamisligil (2003).
Lipopolissacarídeo, também conhecido como endotoxina, é um potente indutor de inflamação, provocando elevada produção de TNF-α, IL-6, e reduzindo a produção de adiponectina. Em circunstâncias normais, apenas pequenas quantidades de endotoxina são translocadas do lúmen intestinal para a circulação sistêmica, e essa pequena parcela que consegue atravessar é absorvida rapidamente, e removida por monócitos, células de Kupffer no fígado. No entanto, novas evidências indicam que em doenças crônicas, tais como a obesidade, ocorre elevação na produção e estravazamento de endotoxina para a corrente sanguínea, podendo desencadear um estado de resistência à insulina na obesidade (Cani et al, 2007; Creely et al, 2007), conforme exemplificado na
Figura 3.
Creely et al (2007), demonstraram aumento nas concentrações circulantes de endotoxina em
mulheres portadoras de diabetes mellitus do tipo 2. Neste mesmo trabalho, os autores verificaram que o LPS elevou expressão protéica de TLR-2 e a secreção de IL-6 e TNF-α por adipócitos isolados do tecido adiposo subcutâneo.
O LPS e ácidos saturados agem sobre receptores da família Toll Like Receptor, em particular o
De acordo com estudos recentes, a expressão gênica do TLR-2 e TLR-4 está aumentada no tecido adiposo de camundongos tornados obesos e diabéticos do tipo 2, pela ingestão de dieta hiperlipídica. Os autores sugerem que, em parte, o aumento dos TLRs seria responsável pela ativação da resposta inflamatória no tecido adiposo, pois utilizando camundongos trangênicos que expressam pouco TLR-4, quando tratados com dieta hiperlipídica, não apresentaram este quadro inflamatório e a ativação do NF-κB neste tecido foi reduzida (Tsukumo et al, 2007).
A transmissão do sinal mediado pela ligação do LPS com o TLR-4 constitui um fenômeno altamente complexo e variado, mediado através de reações envolvendo fosforilação e ubiquitinação de proteínas alvo. Por exemplo, ocorre ativação da proteína MyD88, que por sua vez ativa o complexo IRAK (Receptor da IL-1 associada à Kinase)-TRAF 6 (Fator associado ao receptor do TNF 6), esta
última pertence à classe das ubiquitina ligases (E3 ligases) e parece ser essencial para o desacoplamento do NF-κB da sua proteína inibidora (Iκ-B). O NF-κB, uma vez liberado, migra para o núcleo ligando-se ao DNA, iniciando a amplificação gênica das proteínas relacionadas à inflamação (Takeda, Akira, 2004).
O tecido adiposo expressa esse receptor, que pode ser ativado tanto por LPS, como por ácidos graxos livres (Shi et al, 2006). A ativação desse receptor nos adipócitos aumenta a expressão e
liberação de citocinas via ativação do NF-κB (Schaeffler et al, 2009). A elevação persistente de ácidos
graxos livres no plasma, como ocorre muitas vezes no indivíduo obeso, pode aumentar a secreção de citocinas via TLR-4 (Francaux, 2009), (Figura 4).
2.3 Adipocinas anti-inflamatórias
Como dito anteriormente, é bem estabelecido o aumento na produção de adipocinas pró-inflamatórias no tecido adiposo de indivíduos obesos e, a participação destas adipocinas na indução de resistência à insulina e outras comorbidades associadas à obesidade. Pesquisadores da área têm desenvolvido estudos utilizando diferentes estratégias na tentativa de estabelecer protocolos para minimizar e/ou restaurar tais alterações (Peraldi et al, 1997; Polak et al, 2006).
Em 1991, Fiorentino e colegas observaram que um fator produzido por células T ativadas foi capaz de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias. Este fator foi nomeado de interleucina 10 (IL-10).
Estudos têm demonstrado que a IL-10 tem sua produção aumentada no tecido adiposo em processos inflamatórios (Coppack, 2001; Esposito et al, 2003; Lira et al, 2009), e sugerem que a IL-10
atuaria como um mecanismo de retroalimentação negativa ao excesso de adipocinas pró-inflamatórias,
como por exemplo, o TNF- (Daftarian et al, 1996; Lira et al, 2009b).
Juge-Aubry et al (2005) demonstraram que o tecido adiposo é uma fonte importante de IL-10,
A IL-10 atua, em uma variedade de tipos celulares, inibindo a produção de várias citocinas pró-inflamatórias, tais como: TNF- , IL-1 e IL-6, e estimulando a sua própria produção (Moore et al,
1993). Estes efeitos são desencadeados quando a IL-10, liga-se ao seu receptor (IL-10R), ativa a via JAK-STAT, especificamente a JAK1 e STAT3 em macrófagos (Riley et al, 1999), e essa ativação é
mediada pela SOCS3, reduzindo a atividade quinase do IKK e, portanto, a ativação do NF-κB (Murray, 2007), (Figura 5).
Esta adipocina, também, inibe a geração de espécies reativas do oxigênio e aumenta a
liberação dos receptores solúveis do TNF (TNFRs), os quais podem antagonizar os efeitos do TNF- (Ferrari, 1995; Nozaki et al, 1998).
Estudo recente mostrou que a sensibilidade à insulina no músculo esquelético foi maior em camundongos que super-expressavam IL-10 no músculo esquelético, quando comparados com camundongos controle, após tratamento com dieta rica em gordura (Hong et al, 2009).
Atualmente, utiliza-se a relação IL-10/TNF-α como marcador do estado inflamatório, pois se considera essa razão mais importante na avaliação do quadro inflamatório do que a concentração isolada de cada uma dessas citocinas. Redução nessa razão é correlacionada com pior prognóstico e diminuição na expectativa de vida de pessoas que possuem diferentes morbidades (Kaur et al, 2006;
Leonidou et al, 2007). Além disso, essa razão é um importante marcador de esteatose hepática,
Além da IL-10, outra adipocina envolvida na resposta anti-inflamatória em adipócitos, capaz de amenizar os efeitos deletérios induzidos pelas adipocinas pró-inflamatórias, é a adiponectina (Yamaguchi et al, 2005) .
A adiponectina é o produto da transcrição do gene apM1, sendo a mais abundante proteína secretada pelo tecido adiposo em humanos (Maeda et al, 1996, Arita et al, 1999). A regulação
transcricional do gene da adiponectina envolve um conjunto de fatores de transcrição. Os promotores da adiponectina contêm sítios de ligação da proteína ligada ao elemento responsivo ao esterol (Proteína Ligada ao Elemento Responsivo ao Esterol: SREBP), receptor ativado de proliferador de
peroxissomo (PPAR), e da proteína ligada ao elemento responsivo ao carboidrato (Proteína Ligada ao Elemento Responsivo ao Carboidrato: CREBP) (Seo et al, 2004). Pode apresentar-se na forma longa
ou globular, no entanto, quase toda adiponectina parece existir na forma longa no plasma. Fruebis et al
(2001), relataram entretanto que uma pequena quantidade de adiponectina globular foi detectada em plasma humano.
músculo esquelético humano. A T-caderina, embora seja um receptor truncado que não tem o domínio intracelular necessário para a transdução de sinal, pode participar da cascata de sinalização intracelular, competindo com AdipoR1 e AdipoR2 (Brochu-Gaudreau et al, 2010). A ação da resposta
anti-inflamatória da adiponectina está exemplificada na Figura 6.
Esta adipocina aumenta a sensibilidade à insulina e tem efeitos anti-inflamatórios e antiaterogênicas (Diez, Iglesias 2003). Diminuição das concentrações de adiponectina sérica tem sido observada em indivíduos com resistência à insulina, obesidade, diabetes tipo 2 e doença cardíaca (Diez e Iglesias 2003, Hotta et al, 2000). As concentrações séricas de adiponectina são inversamente
correlacionadas com o índice de adiposidade central, pressão arterial, glicemia de jejum, resistência à insulina e concentrações séricas de insulina (Yamamoto et al, 2002). Tem sido demonstrado que
adiponectina reduz a produção hepática de glicose e a concentração de triacilglicerol no músculo esquelético, assim melhorando a sensibilidade à insulina (Prins, 2002).
Salmenniemi et al (2005), verificaram que hipoadiponectinemia está relacionada com diversas
características da síndrome metabólica (aumento da glicemia de jejum, triacilglicerol, obesidade abdominal e diminuição do HDL-colesterol) e alta concentração de citocinas inflamatórias (IL-6, IL-1, e Proteína C-reativa).
Estudando os mecanismos envolvidos na resposta anti-inflamatória da adiponectina em macrófagos, o grupo da Profa Laura Nagy da Universidade de Ohio (EUA) verificou que a adiponectina, primeiramente, ativa a via inflamatória, aumentando de maneira significativa a concentração do TNF-α via ativação do NF-κB. A seguir, observou que o aumento exacerbado do TNF-α estimulou a produção da IL-10, predominando desta maneira a resposta anti-inflamatória. Estes resultados sugerem, portanto, que a ação anti-inflamatória da adiponectina possa ser dependente da IL-10. Corroborando com está inferência, o mesmo grupo verificou que a adição da adiponectina, em cultura de macrófagos, estimulados com LPS, não inibiu o aumento de TNF-α na presença de anticorpo bloqueando a ação da IL-10 (Park et al, 2007).
Diversos estudos apontam que a adição de LPS no meio de cultura de adipócitos 3T3-L1 ativa o NF-κB, elevando a expressão gênica de adipocinas pró-inflamatórias, e que esta resposta é favorecida pelos TLR-2 e TLR-4 (Lin et al, 2000; Ajuwon, Spurlock, 2005; Suganami et al, 2007).
Ajuwon e Spurlock (2005) demonstram que células 3T3-L1 estimuladas com LPS, quando incubadas com adiponectina, diminuíram a ativação do NF-κB, reduzindo a produção de adipocinas proinflamatórias, paralelamente, os autores observaram aumento do fator transcricional PPAR- , conhecido como desencadeador de resposta anti-inflamatória. Tal fator, também, pode estar envolvido nos efeitos anti-inflamatórios causados pela adiponectina.
A obesidade é uma doença multifatorial, e deve ser tratada por longo prazo. O tratamento da obesidade pode ser feito com intervenções em diferentes aspectos, incluindo diminuição na ingestão calórica e aumento do gasto energético imposto pelo exercício físico. O tratamento de longo prazo com dietas restritivas e capaz de diminuir as citocinas pró-inflamatórias no sangue, assim como a hiperleptinemia, reduzindo os riscos das morbidades associadas, como hipertensão, diabetes, dislipidemias e doenças cardiovasculares (Hukshorn et al, 2004). No entanto, os estudos mostram que
as intervenções isoladas, embora muitas vezes eficientes à primeira vista, não são muito efetivas após período prolongado, quando os indivíduos não mudam efetivamente o estilo de vida (Lawlor, Chatuverdi, 2006). Desta feita, a literatura nos leva a crer que as intervenções interdisciplinares para o tratamento da obesidade que contenham orientação médica, nutricional, programa de exercício físico e acompanhamento psicológico parecem ser mais indicadas para tratar a obesidade, pois visam à mudança do estilo de vida de forma ampla, aumentando a aderência e a permanencia nos novos hábitos (Curioni, Lourenço, 2005; Snethen et al, 2006).
O tratamento interdisciplinar para o tratamento de adolescentes obesos, sob a direção da Profa Dra Ana Dâmaso, que vem sendo desenvolvido na UNIFESP, tem se mostrado eficiente na redução da prevalência da síndrome metabólica, da esteatose hepática não alcoólica e, da compulsão alimentar contribuindo para a melhoria na qualidade de vida desses adolescentes (Caranti et al, 2007; Carnier et
Frente aos efeitos benéficos observados por este tratamento interdisciplinar e os relatados sobre a importância da IL-10 e da adiponectina em doenças inflamatórias crônicas, principalmente
3.
OBJETIVOS
Neste estudo nos propusemos responder as seguintes questões:
Os efeitos benéficos da terapia interdisciplinar para o tratamento da obesidade estão correlacionados com a elevação das adipocinas anti-inflamatórias (adiponectina e IL-10)?
Os efeitos benéficos da terapia interdisciplinar para o tratamento da obesidade estão correlacionados com a redução das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6), endotoxina e dos depósitos de gordura corporal?
Os efeitos anti-inflamatórios da adiponectina e da IL-10 em adipócitos 3T3-L1 são
dissociados ou interdependentes?
A ação anti-inflamatória, individual ou conjunta, da adiponectina e IL-10 em adipócitos
3.1 Objetivos específicos
1) Analisar o perfil de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6) e anti-inflamatórias
(adiponectina e IL-10), e correlacionar com os depósitos de gordura subcutânea e
visceral, antes e após um ano de terapia interdisciplinar em adolescentes obesos.
2) Avaliar a concentração de endotoxina, e correlacionar perfil de citocinas pro e
anti-inflamatórias, e resistência à ação da insulina, antes e após um ano de terapia
interdisciplinar em adolescentes obesos.
3) Quantificar a produção de IL-6 no meio de cultura, e a expressão protéica das seguintes
proteínas: IL-6R, TLR-2, TLR-4, MYD88 e TRAF6 em células 3T3-L1, na presença de
IL-10, adiponectina e IL-10 mais adiponectina, após estímulo de 24h com LPS.
4) Determinar a interação do fator transcripcional NF-κB: (subunidades NF-κB p50 e
NF-κB p65) com DNA. Avaliar parâmetros na presença de IL-10, adiponectina e IL-10
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Modelo Clínico
População
Para o desenvolvimento desta pesquisa, foram recrutados ciquenta e quatro (54) adolescentes (de
ambos os gêneros) obesos do programa de intervenção interdisciplinar do GEO/CEPE UNIFESP,
iniciado em 2004, conforme exemplificado abaixo na Figura 7.
Trinta e nove (39) adolescentes completaram até o final à Intervenção Interdisciplinar. Para o
presente estudo, foram selecionados dezoito (18) adolescentes, os quais exibiram perda de massa
Critérios de inclusão
Adolescentes com idade entre 13 a 19 anos, pós-púberes, com o IMC acima do Percentil 95
proposto pelas curvas do “Centers for Disease Control and Prevention” (CDC) (2000), estágio puberal
V segundo os critérios de Tanner (Tanner et al, 1976), além da assinatura do termo de consentimento
pelos familiares dos participantes do estudo.
Critérios de não inclusão
Como critérios de não inclusão foram selecionados os seguintes itens: limitações
músculo-esqueléticas que impeçam a intervenção, doença genética, hormonal ou metabólica, uso crônico de
álcool, usuário de drogas e outras causas de esteatose como hepatite viral B e C, hepatite auto-imune e
doenças metabólicas como hemocromatose.
Este estudo foi realizado de acordo com os princípios da declaração de Helsinki e foi previamente
aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina
sob o número (#0135/04). Os voluntários foram incluídos no estudo após consentimento assinado.
Descrição da Intervenção Interdisciplinar para o tratamento da obesidade
Após os exames diagnósticos, os adolescentes obesos foram submetidos à Intervenção
Interdisciplinar para o tratamento da obesidade, de acordo com o modelo preconizado pelo Grupo de
Estudo da Obesidade (GEO), desenvolvido no Centro de Estudos em Psicobiologia e Exercício
(CEPE), do Departamento de Psicobiologia da UNIFESP/EPM e Programa de Pós Graduação em
Nutrição.
O Protocolo baseia-se em intervenção Interdisciplinar em longo prazo (1 ano), incluindo a triagem,
os exames e o desenvolvimento da pesquisa. Para isto, todos os voluntários tiveram acompanhamento
nutricional e psicológico semanais; clínico (consultas mensais com o endocrinologista); treinamento
Protocolo de Exercício
Durante 48 semanas de intervenção Interdisciplinar os adolescentes obesos foram submetidos ao
programa de exercícios combinados três vezes por semana, consistindo em 30 minutos de exercícios
aeróbios por sessão de treinamento (bicicleta ergométrica e esteira ergométrica) e treinamento de força
adotando os seguintes exercícios: elevação lateral, supino sentado, puxador costas, remada baixa,
abdominais, hiperextensão lombar, leg press, flexão de joelhos, flexão de panturrilha e rosca direta.
Todos os sujeitos foram familiarizados com o protocolo de treinamento, durante 2 semanas, antes de
iniciarem o programa. Os exercícios aeróbios foram realizados na intensidade do esforço referente ao
limiar ventilatório 1, determinado por análise direta de gases. O treinamento de força foi orientado
seguindo os princípios para controle da carga e do volume do treinamento propostos por Kraemer et al
(2006). A periodização do treinamento de força utilizou o modelo não linear (ondulatório) proposto
por Kraemer et al (1997), desta forma, o protocolo consistiu na alteração semanal da carga, dividido
em semana de cargas altas (5 a 7-repetições máximas, RM) e semana de cargas moderadas (10 a
12-RM). Os sujeitos realizaram 18 séries por sessão, distribuídas em 3 séries para cada exercício. O
intervalo entre as séries dependeu da carga adotada na sessão de treinamento, tendo intervalos de 2
minutos para as semanas com cargas altas e intervalos de 1 minuto para as semanas com cargas
moderadas. Os voluntários realizaram o protocolo de treinamento de força após os 30 minutos de
exercício aeróbio.
Avaliação e Intervenção Nutricional
Uma vez por semana os adolescentes receberam aulas de educação nutricional em pequenos
grupos, abrangendo temas como pirâmide alimentar, dietas da moda, rotulagem nutricional, diferentes
tipos de gordura, alimentação de fast food, aprendendo a montar um lanche saudável entre outros.
Ressalta-se que também foram oferecidas consultas nutricionais individuais.
A avaliação alimentar foi realizada no início, e ao término da intervenção por meio do registro
alimentar de três dias não consecutivos, incluindo dois dias da semana e um do final de semana. A
As porções foram relatadas em termos de medida caseira por referência de um Atlas de porções
alimentares. Os dados alimentares obtidos foram analisados por meio do software Nutwin (UNIFESP,
2002).
Avaliação e Intervenção Psicológica
Para o atendimento psicológico os adolescentes foram divididos em pequenos grupos. A
intervenção psicológica consistiu em dinâmicas, aulas e sessões terapêuticas uma vez por semana,
compreendendo temas como auto-estima, imagem corporal, depressão, ansiedade, transtornos
alimentares, questões familiares, entre outros. Ressalta-se que a intervenção psicológica também
consiste em consultas individuais, conforme a anuência do paciente.
Análises sanguíneas
Parâmetros Bioquímicos:
As análises sanguíneas foram realizadas através de punção periférica da veia do antebraço, após
jejum noturno de 12 horas.
Para dosagem das adipocinas (Adiponectina, IL-6, IL-10 e TNF-α; R&D System, Inc.,
Minneapolis, USA), endotoxina (LONZA Cologne GmbH, Suiça) e insulina (Millipore, 290 Concord
Road, Billerica, MA 01821) foi utilizado o método enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA)
de captura. Este ensaio foi realizado em amostras de soro, proveniente da situação basal e após 1 ano
de terapia interdisciplinar. Placas com 96 poços foram sensibilizadas com 100 µL de anticorpo
monoclonal anti-humano (Adiponectina, IL-6, IL-10, TNF-α, insulina e endotoxina) (anticorpo de
captura) e incubadas por 2h em temperatura ambiente. Após este período, os poços foram lavados por
3 vezes com tampão para lavagem (0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,2 – 7,4). Posteriormente, a placa
foi bloqueada para evitar ligações inespecíficas com 300 µL de solução de bloqueio (1% BSA em
PBS, pH 7,2 – 7,4, 0,2 µm filtrado) e incubada por 1 hora em temperatura ambiente. Findo este prazo,
Após o bloqueio, foram adicionados 100 µL por poço das amostras e dos padrões diluídos
previamente em reagente de diluição (1% BSA em PBS, pH 7,2 – 7,4, 0,2 µm filtrado), e cobertos
com fita adesiva . Em dois poços foram colocados somente o reagente de diluição para caracterização
do branco. A placa foi incubada por 2 horas em temperatura ambiente. Após este período, os poços
foram lavados por 3 vezes com tampão de lavagem (0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,2 – 7,4).
Após as lavagens, adicionou 100 µL do anticorpo de detecção (Anticorpo anti-Humano
Adiponectina, IL-6, IL-10, TNF-α, insulina e endotoxina Biotinilado) diluídos previamente em
reagente de diluição (1% BSA em PBS, pH 7,2 – 7,4, 0,2 µm filtrado) na concentração estabelecida,
cobertos com fita adesiva e incubado por 2 horas em temperatura ambiente. Os poços foram
novamente lavados como descrito acima. Posteriormente, adicionou-se 100 µL de Streptoavidina-HRP
(1:250) por poço, que foram cobertos com papel laminado e incubados por 30 minutos, à temperatura
ambiente. Findo este prazo, os poços foram novamente lavados como descrito acima. Posteriormente,
a solução de substrato (mistura dos reagentes de cores A - H2O2 e B - Tetrametilbenzidina) foi
adicionada na diluição de 1:1 por poço, seguido de incubação por 30 minutos à temperatura ambiente,
evitando-se contato direto da placa com a luz. A reação foi interrompida com 50 µL de H2SO4 30%
por poço sob agitação lenta. A leitura foi feita em leitor de ELISA (Power Wave, Bio-tek),
utilizando-se filtro de 450 nm.
Para dosagem da glicemia de jejum, foi utilizado Kit Glicose PAP Liquiform (Labtest Diagnostica
S.A), por método colorimétrico, sendo a mistura da amostra com reagente incubado por 15 minutos
em temperatura a 37°C. O princípio da reação foi: A glicose oxidase (GOD) catalisa a oxidação da
glicose de acordo com a seguinte reação:
Glicose + O2 + H2O GOD Ácido Glucônico + H2O2
O peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação catalisadora da
peroxidase, através de uma reação oxidativa de acoplamento formando uma antipirilquininimina
vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose da amostra. A leitura foi
Análise estatística do modelo clínico
A distribuição dos dados foi checada pelo teste de variança de Bartlett, e os dados expressos em
média ± desvio padrão. Os valores outliers estatísticos foram identificados utilizando um teste de
Grubbs (GraphPad Software, San Diego, CA) e subseqüente removidos. Todos os dados que
permaneceram foram analisados pelo programa GraphPad Prism (version 5.00). As diferenças entre as
situações para todos os parametros foram analisadas pelo teste “t de student”. O teste de Pearson foi
aplicado para verificar possiveis correlações entre as variaveis. O nível de significância fixado foi de
p<0,05.
4.2 Modelo Experimental
Cultura de células - Adipócitos 3T3-L1
As células 3T3-L1 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e congeladas
em nitrogênio líquido até o dia de uso quando foram então descongeladas à temperatura ambiente. As
células foram mantidas em meio de crescimento contendo os seguintes constituintes: meio Dulbecco´s
Eagle modificado (DMEM) com 25mM de glicose, 1,0mM de piruvato, 4,02 de mM
L-alanyl-glutamina e 10% de soro fetal bovino (Sigma) e cultivadas a 37°C em atmosfera umidificada com 5%
CO2 / 95% ar. O meio de cultura foi trocado a cada quatro dias no máximo até a confluência das
células quando então foi feita a diferenciação destas células utilizando-se, por quatro dias, meio de
diferenciação contendo 0,25µM de dexametasona, 0,5mM de 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, 5µg/mL
de insulina (Sigma), penicilina e estreptomicina (1mL para cada 100mL de meio). Após os quatro dias
com o meio de diferenciação, as células foram cultivadas por dez dias em meio de alimentação
contendo DMEM modificado e 5µg/mL insulina.
No décimo dia da diferenciação os adipócitos foram mantidos por 24 horas em meio contendo
0,5% de soro fetal bovino. Após este período os adipócitos foram tratados com meio de incubação
livre de soro fetal bovino acrescido de LPS (100ng/mL), LPS associado à Adiponectina (50 ng/mL),
de incubação e as células foram coletados após 24h após os tratamentos, para análise precisa da
resposta anti-inflamatória.
As doses foram padronizadas em nosso laboratório, e escolhemos a melhor dose frente ao
estímulo inflamatório com LPS. As seguintes doses foram testadas: Adiponectina (10, 50 e
100ng/mL), e IL-10 (5, 10 e 20ng/mL).
Experimentos e coleta de amostras das células
Para determinação da concentração de IL-6 no meio de cultura, o sobrenadante foi coletado e
estocado a –80ºC para posterior análise da adipocina com kit de ELISA comercial (R&D System®).
Western blotting - IL-6R, TLR-2, TLR-4, MyD88 e TRAF6.
As células foram colocadas em 0,5 ml de tampão específico para extratos totais, o tampão de
extração para extrato total foi composto por: Trizma base 100 mM pH 7.5, EDTA 10 mM, SDS 10%,
fluoreto de sódio 100 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, ortovanadato de sódio 10 mM. O tampão foi
preparado no dia do experimento e aquecido em banho maria fervente.
As células 3T3-L1 foram rapidamente homogeneizadas com tampão específico usando-se uma
seringa e agulha de calibre 23 gauge. O homogenato foi em seguida fervido por 10 minutos e
centrifugado por 40 minutos a 12000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi mantido em gelo e o teor de
proteínas totais determinado pelo método de Bradford (1976).
As amostras foram adicionadas, na proporção de 4:1, do tampão de Laemmli (azul de
bromofenol 0,01%, fosfato de sódio 50mM, glicerol 25%, SDS 1%) contendo 200mM de DTT. O
volume de 100 g de proteína foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a
10% e submetido à eletroforese. Após separação eletroforética, as amostras foram transferidas para
então bloqueada por 2 horas em 15 ml de solução bloqueadora, composta de solução basal (Trizma
base 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 50 l/ml) contendo 5% de leite desnaturado. Em seguida, foi
feita a incubação com o anticorpo primário específico, overnight em temperatura ambiente, com o
anticorpo dissolvido em solução basal e BSA 1%. A seguir, a membrana foi incubada por uma hora
com anticorpo secundário associado a peroxidase. O anticorpo secundário constituiu-se sempre de
uma anti-imunoglobulina dirigida contra o animal produtor de anticorpo primário. Após algumas
lavagens com solução basal, a membrana foi revelada por quimioluminescência após adição do
reagente de revelação (ECL da Amersham) e então a membrana foi exposta a filme de raio X. As
bandas de interesse foram identificadas pelo seu padrão de migração eletroforética, por comparação
com padrões de Mr conhecidos e quantificadas por densitometria, utilizando-se o programa Scion
Image.
Ensaio da interação NF-κB-DNA por imunoensaio.
Extração das proteínas nucleares: As células adiposas 3T3-L1 foram coletadas em 0,5 mL de
tampão de extração nuclear. As proteínas nucleares foram extraídas em duas etapas, de acordo com as
instruções do fabricante Panomics (Santa clara, CA). Após esta etapa, a suspensão foi rapidamente
centrifugada para precipitação dos núcleos. Em seguida, o sedimento foi ressuspenso em 60 µL de
tampão C (Hepes 20mM; MgCL2 1,5mM; DTT 0,5mM; PMSF 0,2mM; NaCL 420mM; glicerol 25%)
e incubados durante 20 minutos em gelo. Após este intervalo, as amostras foram centrifugadas (14.000
rpm) e a quantidade de proteína total determinada pelo método de BSA.
Ativação do NF B(p50 e 65): Amostras provenientes da extração das proteínas nucleares
(5-10 µg/proteína por poço) foram plaqueadas em placas com 96 poços contendo sítios de ligação
específicos para moléculas ativadas NF Bp50 (EK 1110, Panomics, Inc.) e 65 (EK1120, Panomics,
Inc.) (oligonucleotídeos biotinilados). Esses oligonucleotídeos foram então imobilizados através da
adição de streptavidin coated. Desta forma, NF Bp50 e 65 ligados ao oligonucleotídeo foram
conjugado com peroxidase (horseradish), o que provera sensibilidade colorimétrica. Os níveis dos
complexos DNA – proteínas formadas foram quantificados por espectrofotometria a 450 nm.
Análise estatística do modelo experimental
A análise estatística foi realizada para todos os valores mensurados no estudo. A análise
comparativa dos dados quantitativos foi apresentada utilizando o ANOVA de um caminho, seguido de
post-teste de Tukey. Quando necessário utilizamos o teste “t de student“ não pareado. Para todas as
5. Resultados
Os resultados desta tese estão apresentados na forma de 3 trabalhos científicos:
Visceral fat decreased by long-term interdisciplinary lifestyle therapy correlated positively with interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha and negatively with adiponectin levels in obese adolescents. Lira FS, Rosa JC, Dos Santos RV, Venancio DP, Carnier J, Sanches PD, do Nascimento CM, de Piano A, Tock L, Tufik S, de Mello MT, Dâmaso AR, Oyama LM. Metabolism. 2011 Mar;60(3):359-65. Epub 2010 Mar 31.
Decreases endotoxin levels and improves insulin resistance in obese adolescents after long-term interdisciplinary therapy. Lira FS, Rosa JC, Pimentel GD, Santos RV, Carnier J, Sanches PD, do Nascimento CM, de Piano A, Tock L, Tufik S, de Mello MT, Oyama LM, Dâmaso AR. (submetido).
5.1 Manuscrito 1
and education use, including for instruction at the authors institution and sharing with colleagues.
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In most cases authors are permitted to post their version of the article (e.g. in Word or Tex form) to their personal website or institutional repository. Authors requiring further information
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Visceral fat decreased by long-term interdisciplinary lifestyle therapy
correlated positively with interleukin-6 and tumor necrosis factor
–
α
and
negatively with adiponectin levels in obese adolescents
Fábio Santos Lira
a,⁎, Jose Cesar Rosa
a, Ronaldo Vagner dos Santos
b, Daniel Paulino Venancio
c,
June Carnier
a, Priscila de Lima Sanches
a, Claudia Maria Oller do Nascimento
a,d, Aline de Piano
a,
Lian Tock
a, Sergio Tufik
c, Marco Túlio de Mello
a,c, Ana R. Dâmaso
a,b,⁎, Lila Missae Oyama
a,b,⁎a
Postgraduate Program of Nutrition, Federal University of São Paulo–UNIFESP, São Paulo/SP 04020-060, Brazil b
Department of Biosciences, Federal University of São Paulo–UNIFESP, São Paulo/SP 04020-060, Brazil c
Department of Psychobiology, Federal University of São Paulo–UNIFESP, São Paulo/SP 04020-060, Brazil d
Department of Physiology, Federal University of São Paulo–UNIFESP, São Paulo/SP 04020-060, Brazil Received 25 November 2009; accepted 16 February 2010
Abstract
The purpose of this study was to assess the level of cytokine expression in correlation with visceral and subcutaneous fat in obese adolescents admitted to long-term interdisciplinary weight loss therapy. The study was a longitudinal clinical intervention of interdisciplinary therapy. Adolescents (18, aged 15-19 years) with body mass indexes greater than the 95th percentile were admitted and evaluated at baseline and again after 1 year of interdisciplinary therapy. Visceral and subcutaneous fat was analyzed by ultrasonography. Blood samples were collected to analyze tumor necrosis factor–α(TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), and adiponectin concentrations that were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The most important finding in the present investigation is that the long-term interdisciplinary lifestyle therapy decreased visceral fat. Positive correlations between IL-6 levels and visceral fat (r= 0.42,Pb.02) and TNF-α levels and visceral fat (r= 0.40, Pb.05) were observed. Negative correlations between TNF-α levels and subcutaneous fat (r=
−0.46,Pb.01) and adiponectin levels and subcutaneous fat (r=−0.43,Pb.03) were also observed. In addition, we found a positive correlation between TNF-αlevels and the visceral to subcutaneous fat ratio (r= 0.42,Pb.02) and a negative correlation between adiponectin level and the visceral to subcutaneous fat ratio (r=−0.69,P b.001). Despite the limitation of sample size, our results indicate that the observed massive weight loss (mainly visceral fat) was highly correlated with a decreased inflammatory state, suggesting that the interdisciplinary therapy was effective in decreasing inflammatory markers.
© 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
1. Introduction
Obesity is a heterogeneous condition with respect to the regional distribution of fat: visceral obesity refers to fat accumulation within omental and mesenteric fat depots, whereasperipheral obesitygenerally refers to subcutaneous fat accumulation [1]. The functional differences between
visceral and subcutaneous adipocytes may be related to their anatomical location. Visceral adipose tissue and its adipose tissue resident macrophages produce many proinflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor–α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6), and less adiponectin and interleukin-10 (IL-10) [2-4]. These cytokine changes induce insulin resistance and play a major role in the pathogenesis of endothelial dysfunction and subsequent atherosclerosis [5]. Such differences are also reflected in the contrasting roles that visceral and subcutaneous adipose tissues play in the pathogenesis of obesity-related cardiometabolic problems in both lean and obese individuals[6]. Thorne et al[7]reported that the removal of visceral adipose tissue by omentectomy resulted in decreased glucose and insulin levels in humans,
Available online at www.sciencedirect.com
Metabolism Clinical and Experimental 60 (2011) 359–365
www.metabolismjournal.com
⁎Corresponding authors. Rua Marselhesa no. 535, Vila Clementino, São Paulo/SP 04020-060, Brazil. Tel.: +55 11 5572 0177; fax: +55 11 55720177.
E-mail addresses:fabioslira@gmail.com(F.S. Lira),
ana.damaso@unifesp.br(A.R. Dâmaso),lmoyama@gmail.com
(L.M. Oyama).
whereas the removal of subcutaneous adipose tissue by liposuction did not always result in improvements in glucose metabolism or lipid levels[8,9].
Different strategies are adopted with the intention of restoring the inflammatory state in obese subjects. Several studies have shown that diet-induced weight loss significantly decreases the levels of markers of inflammation, such as TNF-α, IL-6, and C-reactive protein [10,11]. On the other hand, sustained aerobic exercise is recommended both for the prevention and treatment of several chronic diseases[12-14]. Moreover, endurance training seems to induce an increase in the secretion of anti-inflammatory cytokines by adipose tissue[15]. Recently, our group has shown that long-term interdis-ciplinary lifestyle therapy is effective in controlling the psychologic aspects, nonalcoholic fatty liver disease, body composition, bone mineral density, and hormonal alterations [16-21] commonly observed in obese patients. However, despite these promising results, few studies have addressed the effects of long-term multidisciplinary intervention on pro- and anti-inflammatory cytokine levels.
Thus, the aim of this study was to assess the effect of long-term multidisciplinary intervention on visceral and sub-cutaneous fat loss and cytokine levels in obese adolescents.
2. Material and methods
2.1. Population
Adolescents were invited to participate in 1-year-long multidisciplinary therapy to promote changes in their sedentary lifestyle and nutritional habits. The basic require-ments for participation were motivation and high attendance at the therapy sessions.
Fifty-four adolescents were invited to participate in a 1-year-long Interdisciplinary Obesity Program of the Federal University of São Paulo-Paulista Medical School to promote changes in their sedentary lifestyle and nutritional habits. The basic requirements for participation were motivation and high attendance at the therapy sessions. Thirty-nine adoles-cents continued until the end of the therapy. For the present study, 18 obese adolescents who lost more than 5% fat mass (range sample: 5.4% at 22.50% fat mass) were selected.
These adolescents were evaluated at baseline and after long-term (1 year) weight loss intervention. This study was carried out in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki and was formally approved by the Institutional Ethical Committee (#0135/04). Informed con-sent was obtained from all subjects and/or their parents, and agreement of the adolescents and their families to participate was voluntary.
The ages of the 18 participants ranged from 15 to 19 years (16.6 ± 1.67 years), and the average body mass index (BMI) was 37.03 ± 3.78 kg/m2 (7 boys and 11 girls). All participants met the inclusion criteria of postpubertal stage V based on the Tanner stages[22]and of obesity (BMIN95th percentile) according to the Centers for Disease Control and
Prevention reference growth charts (2004). Noninclusion criteria included identifiable genetic, metabolic, or endocrine disease or previous drug utilization[23].
2.2. Study protocol and medical screening
Subjects were medically screened, their pubertal stage was assessed, and their anthropometric measures were recorded (ie, height, weight, BMI, and body composition). The endocrinologist completed a clinical interview including questions to determine eligibility based on inclusion and exclusion criteria. Blood samples were collected and analyzed, and an ultrasound (US) was performed. The procedures were scheduled for the same time of day for all subjects to remove any influence of diurnal variations. Thereafter, obese adolescents started the interdisciplinary weight loss program (described in a later section).
2.3. Anthropometric measurements and body composition
Subjects were weighed on a Filizola scale (São Paulo-SP, Brazil) while wearing light clothing and no shoes, and weight was recorded to the nearest 0.1 kg. Height was measured using a wall-mounted stadiometer (Sanny, São Paulo-SP, Brazil; model ES 2030) to the nearest 0.5 cm. Body mass index was calculated as body weight divided by height squared. Body composition was estimated by plethysmography using the BOD POD body composition system (version 1.69; Life Measurement Instruments, Concord, CA). This is the most advanced technique for assessing body composition available today. The patented air displacement plethysmography used by the BOD POD and PEA POD is similar in principle to hydrostatic (or “underwater”) weighing. The obvious difference is that air is more convenient and comfortable than water, such that air displacement plethysmography provides a much simpler and safer testing environment, better reliability, and significantly improved repeatability and accuracy[24].
2.4. Serum analysis
Blood samples were collected in the outpatient clinic at around 8:00AMafter an overnight fast. Cytokine (TNF-α,
IL-6, and IL-10) and adiponectin concentrations were measured using commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kits from eBioscience (San Diego, CA) and R&D Systems (Minneapolis, MN) according to the manufacturer's manual.
2.5. Visceral and subcutaneous adiposity measurements
All abdominal ultrasonographic procedures and the measurements of visceral and subcutaneous fat tissue were performed by the same physician, who was blinded to the subjects' assignment group. This physician was a specialist in imaging diagnostics using a 3.5-MHz multifrequency transducer (broadband), which reduces the risk of misclas-sification. The intraexamination coefficient of variation for US was 0.8%.
