4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.2 Modelo Experimental
Cultura de células - Adipócitos 3T3-L1
As células 3T3-L1 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e congeladas em nitrogênio líquido até o dia de uso quando foram então descongeladas à temperatura ambiente. As células foram mantidas em meio de crescimento contendo os seguintes constituintes: meio Dulbecco´s Eagle modificado (DMEM) com 25mM de glicose, 1,0mM de piruvato, 4,02 de mM L-alanyl- glutamina e 10% de soro fetal bovino (Sigma) e cultivadas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% CO2 / 95% ar. O meio de cultura foi trocado a cada quatro dias no máximo até a confluência das
células quando então foi feita a diferenciação destas células utilizando-se, por quatro dias, meio de diferenciação contendo 0,25µM de dexametasona, 0,5mM de 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, 5µg/mL de insulina (Sigma), penicilina e estreptomicina (1mL para cada 100mL de meio). Após os quatro dias com o meio de diferenciação, as células foram cultivadas por dez dias em meio de alimentação contendo DMEM modificado e 5µg/mL insulina.
No décimo dia da diferenciação os adipócitos foram mantidos por 24 horas em meio contendo 0,5% de soro fetal bovino. Após este período os adipócitos foram tratados com meio de incubação livre de soro fetal bovino acrescido de LPS (100ng/mL), LPS associado à Adiponectina (50 ng/mL), LPS associado à IL-10 (5 ng/mL) ou LPS associado à Adiponectina mais IL-10 por 24 horas. O meio
de incubação e as células foram coletados após 24h após os tratamentos, para análise precisa da resposta anti-inflamatória.
As doses foram padronizadas em nosso laboratório, e escolhemos a melhor dose frente ao estímulo inflamatório com LPS. As seguintes doses foram testadas: Adiponectina (10, 50 e 100ng/mL), e IL-10 (5, 10 e 20ng/mL).
Experimentos e coleta de amostras das células
Para determinação da concentração de IL-6 no meio de cultura, o sobrenadante foi coletado e estocado a –80ºC para posterior análise da adipocina com kit de ELISA comercial (R&D System®).
Western blotting - IL-6R, TLR-2, TLR-4, MyD88 e TRAF6.
As células foram colocadas em 0,5 ml de tampão específico para extratos totais, o tampão de extração para extrato total foi composto por: Trizma base 100 mM pH 7.5, EDTA 10 mM, SDS 10%, fluoreto de sódio 100 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, ortovanadato de sódio 10 mM. O tampão foi preparado no dia do experimento e aquecido em banho maria fervente.
As células 3T3-L1 foram rapidamente homogeneizadas com tampão específico usando-se uma seringa e agulha de calibre 23 gauge. O homogenato foi em seguida fervido por 10 minutos e centrifugado por 40 minutos a 12000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi mantido em gelo e o teor de proteínas totais determinado pelo método de Bradford (1976).
As amostras foram adicionadas, na proporção de 4:1, do tampão de Laemmli (azul de bromofenol 0,01%, fosfato de sódio 50mM, glicerol 25%, SDS 1%) contendo 200mM de DTT. O volume de 100 g de proteína foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a 10% e submetido à eletroforese. Após separação eletroforética, as amostras foram transferidas para membrana de nitrocelulose por 2 horas à temperatura ambiente (ou overnight a 4 C) e a membrana foi
então bloqueada por 2 horas em 15 ml de solução bloqueadora, composta de solução basal (Trizma base 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 50 l/ml) contendo 5% de leite desnaturado. Em seguida, foi feita a incubação com o anticorpo primário específico, overnight em temperatura ambiente, com o anticorpo dissolvido em solução basal e BSA 1%. A seguir, a membrana foi incubada por uma hora com anticorpo secundário associado a peroxidase. O anticorpo secundário constituiu-se sempre de uma anti-imunoglobulina dirigida contra o animal produtor de anticorpo primário. Após algumas lavagens com solução basal, a membrana foi revelada por quimioluminescência após adição do reagente de revelação (ECL da Amersham) e então a membrana foi exposta a filme de raio X. As bandas de interesse foram identificadas pelo seu padrão de migração eletroforética, por comparação com padrões de Mr conhecidos e quantificadas por densitometria, utilizando-se o programa Scion Image.
Ensaio da interação NF-κB-DNA por imunoensaio.
Extração das proteínas nucleares: As células adiposas 3T3-L1 foram coletadas em 0,5 mL de tampão de extração nuclear. As proteínas nucleares foram extraídas em duas etapas, de acordo com as instruções do fabricante Panomics (Santa clara, CA). Após esta etapa, a suspensão foi rapidamente centrifugada para precipitação dos núcleos. Em seguida, o sedimento foi ressuspenso em 60 µL de tampão C (Hepes 20mM; MgCL2 1,5mM; DTT 0,5mM; PMSF 0,2mM; NaCL 420mM; glicerol 25%)
e incubados durante 20 minutos em gelo. Após este intervalo, as amostras foram centrifugadas (14.000
rpm) e a quantidade de proteína total determinada pelo método de BSA.
Ativação do NF B(p50 e 65): Amostras provenientes da extração das proteínas nucleares (5- 10 µg/proteína por poço) foram plaqueadas em placas com 96 poços contendo sítios de ligação específicos para moléculas ativadas NF Bp50 (EK 1110, Panomics, Inc.) e 65 (EK1120, Panomics, Inc.) (oligonucleotídeos biotinilados). Esses oligonucleotídeos foram então imobilizados através da adição de streptavidin coated. Desta forma, NF Bp50 e 65 ligados ao oligonucleotídeo foram detectados por anticorpo direto contra essas moléculas e após adição de anticorpo secundário
conjugado com peroxidase (horseradish), o que provera sensibilidade colorimétrica. Os níveis dos complexos DNA – proteínas formadas foram quantificados por espectrofotometria a 450 nm.
Análise estatística do modelo experimental
A análise estatística foi realizada para todos os valores mensurados no estudo. A análise comparativa dos dados quantitativos foi apresentada utilizando o ANOVA de um caminho, seguido de post-teste de Tukey. Quando necessário utilizamos o teste “t de student“ não pareado. Para todas as análises o valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significante.
5. Resultados
Os resultados desta tese estão apresentados na forma de 3 trabalhos científicos:
Visceral fat decreased by long-term interdisciplinary lifestyle therapy correlated positively with interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha and negatively with adiponectin levels in obese adolescents. Lira FS, Rosa JC, Dos Santos RV, Venancio DP, Carnier J, Sanches PD, do Nascimento
CM, de Piano A, Tock L, Tufik S, de Mello MT, Dâmaso AR, Oyama LM. Metabolism. 2011 Mar;60(3):359-65. Epub 2010 Mar 31.
Decreases endotoxin levels and improves insulin resistance in obese adolescents after long-term interdisciplinary therapy. Lira FS, Rosa JC, Pimentel GD, Santos RV, Carnier J, Sanches PD, do
Nascimento CM, de Piano A, Tock L, Tufik S, de Mello MT, Oyama LM, Dâmaso AR. (submetido).
Both adiponectin and interleukin-10 inhibit LPS-induced activation of the NF-κB pathway in 3T3-L1 adipocytes. Lira FS; Rosa JC; Pimentel GD; Seelaender M; Damaso AR, Oyama LM and
5.1 Manuscrito 1
Visceral fat decreased by long-term interdisciplinary lifestyle therapy correlated positively with interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha and negatively with adiponectin levels in obese adolescents. Lira FS, Rosa JC, Dos Santos RV, Venancio DP, Carnier J, Sanches PD, do Nascimento
CM, de Piano A, Tock L, Tufik S, de Mello MT, Dâmaso AR, Oyama LM. Metabolism. 2011 Mar;60(3):359-65. Epub 2010 Mar 31.
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