UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
Orientadora: Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild Co-Orientadora: Profª. Drª. Adriana Augusto de Rezende
ii
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
NATAL-RN 2010
iii
CATALOGAÇÃO NA FONTE F383a
Ferreira, Diana Quitéria Cabral.
Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas / Diana Quitéria Cabral Ferreira. – Natal, 2010.
67f.
Orientadora: Profª Drª Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild.
Co-orientadora: Profª Drª Adriana Augusto de Rezende. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Aterosclerose – Dissertação. 2. Selênio – Dissertação. 3. Rosuvastatina – Dissertação. I. Schwarzschild, Lucia de Fátima Campos Pedrosa. II. Título.
iv
COLABORADORES
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF), Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental.
Profa. Drª. Dulcinéia Saes Parras Abdalla
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF), Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas
Profa. Ms. Karine Cavalcanti Maurício de Sena
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Centro de Ciências da Saúde (CCS), Departamento de Nutrição.
Drª. Maria Sanali Moura de Oliveira Paiva
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), Departamento de Medicina Clínica.
Paula Cristina Silveira Dias
v
FINANCIAMENTOS E BOLSAS CONCEDIDAS
- Edital Universal CNPq: N° do processo – 475781/2008-0
vi
Diana Quitéria Cabral Ferreira
Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas
Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora
Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild Orientadora/Presidente
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental. Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP).
Profª. Drª. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Centro de Ciências da Saúde (CCS). Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
vii
Aos meus queridos pais, Ezilda Barros e João Ferreira, que são para mim um exemplo de amor, dedicação, respeito e companheirismo.
A minha irmã, Daiane Ferreira, pelo apoio incondicional.
viii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela bênção que ele me concede a cada dia, pela minha família e por ter ao meu lado pessoas maravilhosas.
A meus pais, João e Ezilda, por sempre me apoiarem nessa longa, árdua e prazerosa caminhada que é a pós-graduação.
A minha irmã, Daiane, e meu cunhado Daniel, por representarem pra mim mais que pessoas queridas, são exemplos de superação e dedicação.
Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras de ânimo nos momentos que mais precisei.
A professora Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild pelo exemplo profissional que representa em minha vida, pelas oportunidades concedidas desde a graduação, como
aluna de iniciação científica até hoje com o mestrado.
A professora Adriana Augusto de Rezende, pelo apoio, principalmente pela abertura do Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL), confiando e acreditando no trabalho.
A professora Karine Cavalcanti Maurício de Sena, pela confiança e por ser para mim um exemplo de dedicação e amor à profissão.
A mestranda Paula C. S. Dias, pelo apoio nos momentos mais difíceis dessa trajetória.
A professora Silvia Maria Franciscato Cozzolino pela abertura concedida em seu laboratório, pelo total apoio à nossa pesquisa e por ter aceitado colaborar e enriquecer
nosso trabalho.
A professora Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas pela colaboração, desde o momento da qualificação, até a disponibilidade de estar na minha banca de apresentação do
ix
As alunas bolsistas, Heliane, Renata, Carol e Patricia, pela dedicação e empenho a cada dia de coleta e análise dos dados.
Aos amigos do Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), principalmente nas pessoas de Marcela, Freie, Felipe, Gustavo, Clélio, pela ajuda inestimável para desenvolvimento desse
trabalho, bem como pelos momentos de descontração fora do laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Nutrição Experimental da FCF-USP, nas pessoas de Alexandre, Kaluce, Graziela, Suzana e Janaína, pela ajuda nas análises e também na estadia em São Paulo, terra até então desconhecida para mim, mas que me encanto e onde pude fazer
verdadeiros amigos.
x
RESUMO
FERREIRA, D. Q. C. Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas. 2010. 67f. [Dissertação] Natal (RN): Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal – RN, 2010.
Este trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do uso da rosuvastatina em pacientes com aterosclerose, em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como observar possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes. A amostra foi constituída de 27 pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença arterial coronariana submetidos à angioplastia, atendidos no Natal Hospital Center, Natal, RN. Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina durante 4 meses. Variáveis antropométricas, como Índice de Massa Corporal (IMC) e Circunferência Abdominal (CA), foram medidas antes e após o tratamento, bem como o perfil lipídico, glicemia e enzimas hepáticas (AST e ALT). A dieta dos pacientes também foi analisada utilizando o Recordatório alimentar de 24 horas. Foram analisadas as concentrações do selênio no plasma e nos eritrócitos, e também a atividade da enzima Glutationa Peroxidase e a expressão gênica por PCR em Tempo Real das selenoproteínas GPx1, SelP1 e SelN1. Os pacientes apresentaram idade média de 61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. Após os quatro meses de tratamento observou-se redução significativa da CA e, de acordo com o IMC, a maior parte estava com sobrepeso. A ingestão dos macronutrientes, colesterol, ácidos graxos polinsaturados, monoinsaturados e saturados foi adequada, porém a de energia e fibras estava abaixo das recomendações. Com relação a ingestão de selênio foi observada uma alta prevalência de inadequação. Como esperado, após o tratamento com a rosuvastatina, houve redução significativa do colesterol total e LDL, bem como da glicemia, o que não foi observado para o HDL. As concentrações de selênio no plasma e eritrócitos não apresentaram alterações, se mantendo dentro dos pontos de corte estabelecidos. Foi observado um aumento significante na atividade enzimática da GPx e na expressão de mRNA do GPX1 e SEPN1, mas não para o gene SEPP1. Dessa forma, foi verificado que o tratamento com a rosuvastatina não diminuiu a expressão das selenoproteínas. Mais estudos são necessários para esclarecer os efeitos da rosuvastatina sobre a expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose.
xi
ABSTRACT
FERREIRA, D. Q. C. Assessment of nutritional status of selenium and gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis treated with statins. 2010. 67f. [Dissertation] Faculty of Pharmaceutical, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal – RN, 2010.
The aim of this study was to determine the effects of the use of rosuvastatin in patients with atherosclerosis, in relation to blood parameters of selenium and selenoproteins, and also observe possible changes in gene expression of selenoproteins in these patients. The sample consisted of 27 adult and elderly patients with a clinical diagnosis of coronary artery disease undergoing angioplasty, treated at Natal Hospital Center hospital, Natal, RN. Patients were treated with rosuvastatin 10 mg/day during four months. Anthropometric variables such as body mass index (BMI) and Waist circumference (WC) were measured before and after treatment, as well as lipid profile, blood glucose and liver enzymes (AST and ALT). The diet of the patients was also analyzed using 24-hour diet recall. We analyzed the concentrations of selenium in plasma and erythrocytes, and also the activity of Glutathione Peroxidase and gene expression by Real Time PCR of selenoproteins GPx1, SelP1 and SelN1. Patients had mean age of 61.0 ± 9.4 years, 59.3% were men and 40.7% were women. After four months of treatment there was significant reduction of CA and, according to BMI, most were overweight. The intake of macronutrients, cholesterol, polyunsaturated fatty acids, monounsaturated and saturated was adequate, but the energy and fiber intake was below the recommendations. Regarding the selenium intake was observed a high prevalence of inadequacy. As expected, after treatment with rosuvastatin, a significant reduction in total cholesterol, LDL and glucose, which was not observed for HDL. Selenium concentrations in plasma and erythrocytes showed no changes, keeping within the established cutoffs. We observed a significant increase in GPx enzyme activity and mRNA expression of GPX1 and SEPN1, but not for gene SEPP1. Thus, it was found that treatment with rosuvastatin did not reduce the expression of selenoproteins. More studies are needed to clarify the effects of rosuvastatin on gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS Ácido Acetil Salicílico ALT Alanina Aminotransferase AST Aspartato Aminotransferase CA Circunferência Abdominal CT Colesterol total
cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar DM Diabetes mellitus
DNA Ácido Desoxirribonucléico (Deoxyribonucleic Acid)
DP Desvio Padrão
DRIs Ingestão Dietética de Referência (Dietary References Intakes) EAR Necessidade média estimada (Estimated Average Requirements) EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
GAPDH Gliceraldeído trifosfato desidrogenase GPx Glutationa Peroxidase
GPX1 Gene da Glutationa Peroxidase 1
HDL Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein) HMG-CoA redutase 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima A redutase HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes
IMC Índice de Massa Corporal
LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein) NHC Natal Hospital Center
PCR Reação de Polimerase em Cadeia pH Potencial Hidrogeniônico
RDA Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance) RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
RT-PCR Reação de Polimerase em Cadeia por transcriptase reversa
Se Selênio
SelP Selenoproteína P
SEPP1 Gene da Selenoproteína P 1 SelN Selenoproteína N
xiii
SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética
TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica TG Triacilgliceróis
TM Temperatura de Melting
UL Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels) UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das estatinas... 5
FIGURA 2 – Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 13
FIGURA 3 - Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 15
FIGURA 4 - Fluxograma das atividades do estudo com pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
FIGURA 5 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital Center...
FIGURA 6 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital Center...
16
27
27
FIGURA 7 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes e colesterol, atendidos no Natal Hospital Center... 29
FIGURA 8 - Distribuição da ingestão de Se, bruta (A) e ajustado (B) dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.... 30
xv
FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas de mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center. ...
xvi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH... 23
TABELA 2 - Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 25
TABELA 3 - Dados antropométricas dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 26
TABELA 4 – Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
28
31
32
TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos no Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de referência para perfil lipídico e glicemia... 34
TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade enzimática da Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 35
xvii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo o IMC... 17
xviii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 2
1.1 Aterosclerose e Estatinas... 2
1.2 Selênio e Selenoproteínas... 6
2 JUSTIFICATIVA... 10
3 OBJETIVOS... 11
3.1 Objetivo Geral... 11
3.2 Objetivos Específicos... 11
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS... 11
4.1 Protocolo Experimental... 11
4.2 Parâmetros Antropométricos... 17
4.3 Análise da Dieta... 18
4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas... 19
4.5 Análise de Selênio... 20
4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase... 4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas... 21 22 4.8 Análise Estatística... 24
5 RESULTADOS... 6 DISCUSSÃO... 25 38 7 CONCLUSÕES... 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 44
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
Orientadora: Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild Co-Orientadora: Profª. Drª. Adriana Augusto de Rezende
ii
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
NATAL-RN 2010
iii
COLABORADORES
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF), Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental.
Profa. Drª. Dulcinéia Saes Parras Abdalla
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF), Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas
Profa. Ms. Karine Cavalcanti Maurício de Sena
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Centro de Ciências da Saúde (CCS), Departamento de Nutrição.
Drª. Maria Sanali Moura de Oliveira Paiva
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), Departamento de Medicina Clínica.
Paula Cristina Silveira Dias
iv
FINANCIAMENTOS E BOLSAS CONCEDIDAS
- Edital Universal CNPq: N° do processo – 475781/2008-0
v
Diana Quitéria Cabral Ferreira
Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas
Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora
Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild Orientadora/Presidente
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental. Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP).
Profª. Drª. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Centro de Ciências da Saúde (CCS). Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
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Aos meus queridos pais, Ezilda Barros e João Ferreira, que são para mim um exemplo de amor, dedicação, respeito e companheirismo.
A minha irmã, Daiane Ferreira, pelo apoio incondicional.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela bênção que ele me concede a cada dia, pela minha família e por ter ao meu lado pessoas maravilhosas.
A meus pais, João e Ezilda, por sempre me apoiarem nessa longa, árdua e prazerosa caminhada que é a pós-graduação.
A minha irmã, Daiane, e meu cunhado Daniel, por representarem pra mim mais que pessoas queridas, são exemplos de superação e dedicação.
Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras de ânimo nos momentos que mais precisei.
A professora Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild pelo exemplo profissional que representa em minha vida, pelas oportunidades concedidas desde a graduação, como
aluna de iniciação científica até hoje com o mestrado.
A professora Adriana Augusto de Rezende, pelo apoio, principalmente pela abertura do Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL), confiando e acreditando no trabalho.
A professora Karine Cavalcanti Maurício de Sena, pela confiança e por ser para mim um exemplo de dedicação e amor à profissão.
A mestranda Paula C. S. Dias, pelo apoio nos momentos mais difíceis dessa trajetória.
A professora Silvia Maria Franciscato Cozzolino pela abertura concedida em seu laboratório, pelo total apoio à nossa pesquisa e por ter aceitado colaborar e enriquecer
nosso trabalho.
A professora Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas pela colaboração, desde o momento da qualificação, até a disponibilidade de estar na minha banca de apresentação do
viii
As alunas bolsistas, Heliane, Renata, Carol e Patricia, pela dedicação e empenho a cada dia de coleta e análise dos dados.
Aos amigos do Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), principalmente nas pessoas de Marcela, Freie, Felipe, Gustavo, Clélio, pela ajuda inestimável para desenvolvimento desse
trabalho, bem como pelos momentos de descontração fora do laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Nutrição Experimental da FCF-USP, nas pessoas de Alexandre, Kaluce, Graziela, Suzana e Janaína, pela ajuda nas análises e também na estadia em São Paulo, terra até então desconhecida para mim, mas que me encanto e onde pude fazer
verdadeiros amigos.
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RESUMO
FERREIRA, D. Q. C. Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas. 2010. 67f. [Dissertação] Natal (RN): Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal – RN, 2010.
Este trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do uso da rosuvastatina em pacientes com aterosclerose, em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como observar possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes. A amostra foi constituída de 27 pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença arterial coronariana submetidos à angioplastia, atendidos no Natal Hospital Center, Natal, RN. Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina durante 4 meses. Variáveis antropométricas, como Índice de Massa Corporal (IMC) e Circunferência Abdominal (CA), foram medidas antes e após o tratamento, bem como o perfil lipídico, glicemia e enzimas hepáticas (AST e ALT). A dieta dos pacientes também foi analisada utilizando o Recordatório alimentar de 24 horas. Foram analisadas as concentrações do selênio no plasma e nos eritrócitos, e também a atividade da enzima Glutationa Peroxidase e a expressão gênica por PCR em Tempo Real das selenoproteínas GPx1, SelP1 e SelN1. Os pacientes apresentaram idade média de 61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. Após os quatro meses de tratamento observou-se redução significativa da CA e, de acordo com o IMC, a maior parte estava com sobrepeso. A ingestão dos macronutrientes, colesterol, ácidos graxos polinsaturados, monoinsaturados e saturados foi adequada, porém a de energia e fibras estava abaixo das recomendações. Com relação a ingestão de selênio foi observada uma alta prevalência de inadequação. Como esperado, após o tratamento com a rosuvastatina, houve redução significativa do colesterol total e LDL, bem como da glicemia, o que não foi observado para o HDL. As concentrações de selênio no plasma e eritrócitos não apresentaram alterações, se mantendo dentro dos pontos de corte estabelecidos. Foi observado um aumento significante na atividade enzimática da GPx e na expressão de mRNA do GPX1 e SEPN1, mas não para o gene SEPP1. Dessa forma, foi verificado que o tratamento com a rosuvastatina não diminuiu a expressão das selenoproteínas. Mais estudos são necessários para esclarecer os efeitos da rosuvastatina sobre a expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose.
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ABSTRACT
FERREIRA, D. Q. C. Assessment of nutritional status of selenium and gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis treated with statins. 2010. 67f. [Dissertation] Faculty of Pharmaceutical, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal – RN, 2010.
The aim of this study was to determine the effects of the use of rosuvastatin in patients with atherosclerosis, in relation to blood parameters of selenium and selenoproteins, and also observe possible changes in gene expression of selenoproteins in these patients. The sample consisted of 27 adult and elderly patients with a clinical diagnosis of coronary artery disease undergoing angioplasty, treated at Natal Hospital Center hospital, Natal, RN. Patients were treated with rosuvastatin 10 mg/day during four months. Anthropometric variables such as body mass index (BMI) and Waist circumference (WC) were measured before and after treatment, as well as lipid profile, blood glucose and liver enzymes (AST and ALT). The diet of the patients was also analyzed using 24-hour diet recall. We analyzed the concentrations of selenium in plasma and erythrocytes, and also the activity of Glutathione Peroxidase and gene expression by Real Time PCR of selenoproteins GPx1, SelP1 and SelN1. Patients had mean age of 61.0 ± 9.4 years, 59.3% were men and 40.7% were women. After four months of treatment there was significant reduction of CA and, according to BMI, most were overweight. The intake of macronutrients, cholesterol, polyunsaturated fatty acids, monounsaturated and saturated was adequate, but the energy and fiber intake was below the recommendations. Regarding the selenium intake was observed a high prevalence of inadequacy. As expected, after treatment with rosuvastatin, a significant reduction in total cholesterol, LDL and glucose, which was not observed for HDL. Selenium concentrations in plasma and erythrocytes showed no changes, keeping within the established cutoffs. We observed a significant increase in GPx enzyme activity and mRNA expression of GPX1 and SEPN1, but not for gene SEPP1. Thus, it was found that treatment with rosuvastatin did not reduce the expression of selenoproteins. More studies are needed to clarify the effects of rosuvastatin on gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS Ácido Acetil Salicílico ALT Alanina Aminotransferase AST Aspartato Aminotransferase CA Circunferência Abdominal CT Colesterol total
cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar DM Diabetes mellitus
DNA Ácido Desoxirribonucléico (Deoxyribonucleic Acid)
DP Desvio Padrão
DRIs Ingestão Dietética de Referência (Dietary References Intakes) EAR Necessidade média estimada (Estimated Average Requirements) EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
GAPDH Gliceraldeído trifosfato desidrogenase GPx Glutationa Peroxidase
GPX1 Gene da Glutationa Peroxidase 1
HDL Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein) HMG-CoA redutase 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima A redutase HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes
IMC Índice de Massa Corporal
LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein) NHC Natal Hospital Center
PCR Reação de Polimerase em Cadeia pH Potencial Hidrogeniônico
RDA Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance) RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
RT-PCR Reação de Polimerase em Cadeia por transcriptase reversa
Se Selênio
SelP Selenoproteína P
SEPP1 Gene da Selenoproteína P 1 SelN Selenoproteína N
xii
SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética
TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica TG Triacilgliceróis
TM Temperatura de Melting
UL Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels) UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das estatinas... 5
FIGURA 2 – Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 13
FIGURA 3 - Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 15
FIGURA 4 - Fluxograma das atividades do estudo com pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
FIGURA 5 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital Center...
FIGURA 6 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital Center...
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FIGURA 7 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes e colesterol, atendidos no Natal Hospital Center... 29
FIGURA 8 - Distribuição da ingestão de Se, bruta (A) e ajustado (B) dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.... 30
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FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas de mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center. ...
xv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH... 23
TABELA 2 - Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 25
TABELA 3 - Dados antropométricas dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 26
TABELA 4 – Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...
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32
TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos no Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de referência para perfil lipídico e glicemia... 34
TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade enzimática da Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center... 35
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LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo o IMC... 17
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 2 1.1 Aterosclerose e Estatinas... 2 1.2 Selênio e Selenoproteínas... 6 2 JUSTIFICATIVA... 10 3 OBJETIVOS... 11 3.1 Objetivo Geral... 11 3.2 Objetivos Específicos... 11 4 CASUÍSTICA E MÉTODOS... 11 4.1 Protocolo Experimental... 11 4.2 Parâmetros Antropométricos... 17 4.3 Análise da Dieta... 18 4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas... 19 4.5 Análise de Selênio... 20 4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase... 4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas...
21 22 4.8 Análise Estatística... 24 5 RESULTADOS... 6 DISCUSSÃO...
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1. Introdução
1.1 Aterosclerose e Estatinas
A aterosclerose é uma doença inflamatória, progressiva e caracterizada pelo acúmulo de lípides e componente fibroso em grandes artérias. O processo crônico da aterosclerose envolve o endotélio arterial culminando com complicações aterotrombóticas, podendo ser causado por uma resposta inflamatória e estresse oxidativo desencadeados por partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) oxidada devido a presença de radicais livres (PAI et al., 2004; STEPHENS; KHANOLKAR; BAIN, 2009).
Atualmente a doença arterial coronariana (DAC) e o acidente vascular cerebral (AVC), principais manifestações clínicas da aterosclerose, constituem as maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental (NISSEN et al., 2006). Projeções da Organização Mundial da Saúde para 2020 indicam que estas doenças continuarão aumentando em países do leste europeu e em nações em desenvolvimento, consolidando a perspectiva de maior causa de morte no mundo (WHO, 2004). No Brasil, as doenças cardiovasculares representam a principal causa de morte nos indivíduos acima de 40 anos (BRASIL, 2006), além do mais, seu tratamento representa um grande ônus financeiro (RIBEIRO et al., 2005).
A doença aterosclerótica se manifesta em nível das artérias coronárias como angina de peito e infarto do miocárdio; nas artérias carótidas e cerebrais como acidente vascular cerebral; nas artérias dos membros inferiores como a claudicação intermitente, caracterizada como dor com a marcha que alivia com o repouso; e como lesões cutâneas, levando ao risco de amputação nos casos mais graves se não tratado (PALINSKI; NAPOLI, 2002).
Dentre os fatores de risco para doenças cardiovasculares estão a idade, hipercolesterolemia, diabetes mellitus, tabagismo, hipertensão arterial sistêmica, hipertrigliceridemia, obesidade e história familiar de cardiopatia isquêmica; além da qualidade da dieta e estilo de vida (RODRÍGUEZ-MORÁN et al., 2008; SARAÇ et al., 2007; SBC, 2007; STEPHENS et al., 2004).
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associada com a HDL (SHOJI et al., 2009). As concentrações elevadas do colesterol total e LDL, diminuição da HDL e aumento nos teores de triacilgliceróis, também predispõem à doença coronariana. (SEMAN et al., 1999; ROMALDINI et al., 2004). Apesar disso, alguns mecanismo fisiopatológicos de desenvolvimento das DCV ainda permanecem parcialmente elucidados. Atualmente, vem aumentando o interesse no desenvolvimento de marcadores alternativos, como os marcadores plasmáticos de estresse oxidativo, que podem ter um papel importante na predição de risco cardiovascular (STEPHENS; KHANOLKAR; BAIN, 2009).
A utilização do oxigênio nos sistema biológico leva a formação de espécies reativas de
oxigênio (ERO’s), que podem causar danos à biomoléculas (DNA, lipídeos e proteínas). O estresse oxidativo é descrito como um desequilíbrio entre agentes pró-oxidantes e componentes antioxidantes, o que pode ser conseqüência de uma inadequada ingestão de nutrientes (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). Os desequilíbrios da peroxidação lipídica das estruturas celulares nas doenças cardiovasculares ocorrem devido ao aumento na produção de radicais livres e deficiência nos mecanismos de defesa antioxidantes (STEPHENS; KHANOLKAR; BAIN, 2009; SOLIMAN, 2008).
A oxidação da LDL na parede arterial pode levar a formação de aldeídos altamente reativos, principalmente malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal, que reagem com proteínas da matriz extracelular na parede arterial. A ativação da resposta imune contra componentes da matriz extracelular na placa aterosclerótica pode ser considerada fundamental no desenvolvimento da aterosclerose e suas complicações, pois promove a instabilidade da capa fibrosa da lesão aterosclerótica. Os macrófagos e os linfócitos produzem citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral-alfa (FNT-α), interferon-gama (IFN-γ), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) que mantêm o estímulo quimiotático para as células do sistema imune e inibem a síntese de colágeno pelas células musculares lisas (ORTIZ-MUÑOZ et al., 2009; DUNÉR et al., 2009).
Segundo Artwohl et al. (2009), as altas concentrações de ácidos graxos saturados circulantes, oriundos da dieta, induz à apoptose de células musculares lisas do sistema vascular, contribuindo para a progressão prematura da aterosclerose, ou mesmo para a instabilidade da placa aterosclerótica. Por outro lado, existe o efeito protetor de alguns tipos de gorduras, como é o caso dos ácidos graxos monoinsaturados e polinsaturados, que contribuem para a prevenção do aparecimento de trombos e arritmias cardíacas (CALDER, 2008; ERKKILA et al., 2008).
Os nutrientes antioxidantes, a exemplo das vitaminas E e C, os carotenóides e alguns
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ação oxidativa sobre as membranas (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). A vitamina E atua de forma protetora na doença cardiovascular, devido aos mecanismos de inibição da oxidação da LDL e na diminuição da adesão de monócitos e plaquetas ao endotélio (JIALAL; GRUND, 1992). A vitamina C, por sua vez, age transferindo elétrons para radicais de tocoferol em membranas ou lipídeos, evitando também a oxidação da LDL (KNEKT; RITZ; PEREIRA, 2004). O cobre e o zinco são minerais essenciais na defesa antioxidante do corpo, principalmente por serem incorporados na enzima CuZn superóxido dismutase (CuZn-SOD), enquanto o selênio participa da estrutura da enzima glutationa peroxidase (GPx) (KOSAR et al., 2006).
As células também possuem um sistema de defesa contra as ERO’s, representado pelas enzimas antioxidantes, que apresentam substratos específicos e diferentes estruturas e localização. Dentre as principais enzimas antioxidantes estão a superóxido dismutase (SOD), a catalase e a glutationa peroxidase (GPx) (NIKI et al., 2005).
No tratamento da aterosclerose preconiza-se uma abordagem multifatorial e simultânea em relação a todos os fatores de risco, priorizando-se inicialmente a mudança do estilo de vida, incluindo a terapia nutricional, a atividade física, a abstenção do tabagismo, associadas ou não ao tratamento farmacológico específico (SBC, 2007).
A angioplastia com balão tem recebido ultimamente maior atenção no tratamento do paciente com doença arterial oclusiva periférica, pelo fato de ser um procedimento relativamente de baixo risco, pouco invasivo e com possibilidade de repetição. O desenvolvimento dos sistemas de guias e cateteres representa um avanço importante na técnica da angioplastia transluminal percutânea, tornando o procedimento possível em situações anatômicas desfavoráveis, quer seja pela configuração da lesão ou do calibre do vaso afetado (OSTERNE et al, 1999; PEREIRA; GRUDTNER, 2003).
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As estatinas são os fármacos mais utilizados nas hiperlipidemias em nível de prevenção primária e secundária, com o propósito de diminuir as concentrações de lipoproteínas plasmáticas ricas em colesterol e reduzir os riscos de DAC. As formas comerciais mais usadas são: lovastatina (Mevacor®), pravastatina (Pravachol®), sinvastatina (Zocor®), fluvastatina (Lescol®), atorvastatina (Lipitor®) e rosuvastatina (Crestor®) (CAMPO; CARVALHO, 2007).
As estatinas atuando como inibidores da enzima HMG-CoA redutase, agem consequentemente impedindo a conversão da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) em ácido mevalônico e inibindo os primeiros passos da biossíntese de colesterol na via do Mevalonato (Figura 1). O próximo produto dessa cascata é o isopentenil pirofosfato (IPP), o qual serve de substrato para a isopentenil transferase Sec tRNA (selenocisteína tRNA), que está relacionada com a expressão gênica das selenoproteínas (CARLSON et al., 2004; MOOSMANN; BEHL, 2004a).
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IPP – Isopentenil pirofosfato.
FONTE: Adaptado de Moosmann e Behl (2004a).
FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das estatinas.
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Takarada et al. (2009) identificaram que o efeito protetor do tratamento com estatinas deve-se ao fato destes fármacos aumentarem a capa fibrosa sobre a placa aterosclerótica coronariana, o que produz uma baixa vulnerabilidade da placa e evita o infarto agudo do miocárdio.
Nissen et al. (2006) observaram que uma terapia de alta potência com estatina utilizando 40mg/dia de rosuvastatina, alcançou a redução da LDL e o aumento na concentração de HDL, resultando em regressão significativa da aterosclerose. Pacientes idosos que fizeram uso de rosuvastatina apresentaram redução no número de internações oriundas de complicações cardiovasculares; porém não houve redução sobre o número de mortes (KJEKSHUS et al., 2007).
1.2 Selênio e Selenoproteínas
O selênio (Se) como essencial para humanos tem sido pesquisado quanto à sua participação em compostos essenciais para homeostase corporal (REILLY, 2006), cuja demanda corporal aumenta, principalmente, devido seu papel importante no sistema antioxidante (HAMBIDGE, 2003). O selênio está envolvido em diversas atividades metabólicas, via selenoproteínas, que são essenciais para a proteção contra os danos oxidativos e na regulação do sistema imunológico, atuando na diminuição da resposta do NF-kB ao mecanismo de pró-inflamação da célula endotelial (ZHANG et al., 2002; SHRIMALI et al., 2008). Altas concentrações de selênio melhoram as funções das células do sistema imune inato e adaptativo (HOFFMANN et al., 2007).
O alimento mais rico em selênio é a castanha do Brasil, conhecida com castanha do
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Um estudo nacional avaliou o consumo diário médio de selênio em diferentes grupos etários e cidades do Brasil. O maior consumo ocorreu em crianças da cidade de Macapá (AP)
(107μg de Se/dia), seguido de adultos de Manaus (AM) (98μg de Se/dia) devido ao consumo
de castanha do Brasil. Crianças residentes em São Paulo (SP) apresentaram concentrações
médias diárias mais baixas (26,3μg de Se/dia) (MAIHARA et al., 2004).
A biodisponibilidade e a toxicidade do Se consumido dependem da sua forma química, sendo os compostos orgânicos mais biodisponíveis e menos tóxicos do que os inorgânicos, como selenito e selenato (TINGGI, 2003).
Para Finley (2006), a absorção de todas as formas de Se é relativamente alta (70 a 95%), mas pode variar dependendo da fonte e do indivíduo. O autor comparou a biodisponibilidade de Se em cereais, carnes, peixes e outros produtos e verificou que o Se foi mais biodisponível em alimentos de origem vegetal. Analisando alimentos consumidos no Brasil, Ferreira et al. (2002) verificaram que as frutas, legumes e tubérculos apresentaram baixos teores de Se, enquanto que valores superiores foram encontrados nos peixes (11 a 80
μg.100 g-1), fígado (44 μg.100 g-1), gema de ovo de galinha (23 a 55 μg.100 g-1) e no feijão
preto, cuja concentração de Se variou de 0,5 a 23,9 μg.100 g-1
A Ingestão Dietética de Referência (Dietary Reference Intakes - DRIs) engloba 4 valores de referência de ingestão de nutrientes e que devem ser utilizados para planejar e avaliar dietas para pessoas saudáveis. Na avaliação em grupo é utilizada a Necessidade média estimada (Estimated Average Requirements- EAR) que orresponde a um valor de ingestão diária de um nutriente que se estima que supra a necessidade de metade (50%) dos indivíduos saudáveis de um determinado grupo de mesmo gênero e estágio de vida. A EAR para o
mineral selênio é 45 μg/dia.
Na Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance - RDA) para o Se é de 55 μg/dia, para homens e mulheres adultos. A RDA é utilizada na avaliação individual e considera que 97% dos indivíduos têm suas necessidades supridas, ela é baseada na quantidade necessária de selênio para maximizar a atividade da enzima GPx, enquanto que o valor do Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels -UL) de 400
μg/dia foi fixado considerando o risco de selenose (NRC, 2000).
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2004), segundo este autor, doses de 100-200 μg de Se/dia inibiriam danos genéticos e o desenvolvimento de câncer em humanos. Entretanto, para Silvera e Rohan (2007) não há evidência consistente da associação entre baixas concentrações de Se e aumento no risco de alguns tipos de câncer. A deficiência de selênio pode levar a redução significativa na atividade das selenoproteínas, incluindo as enzimas GPx, DIOs e TRs (LU; HOLMGREN, 2009; RENKO et al., 2009).
Como análogo dos aminoácidos sulfurados, a forma orgânica de selênio está presente como um produto direto da incorporação de Se em proteínas em substituição ao enxofre (selenometionina e selenocisteína-Sec), mas pode também ser incorporado de maneira inespecífica em proteínas como selenometionina (KRYUKOV et al., 2003). Tais mecanismos diferem das metaloproteínas ou quelatos, nos quais ocorre simplesmente uma complexação com grupos funcionais das proteínas (SUZUKI, 2005).
Baixos níveis de selênio foram associados à ocorrência de aterosclerose (GONZÁLEZ et al., 2006). Em estudo de observação de aproximadamente mil homens, com idades entre 55 e 74 anos, baixos níveis de selênio sérico foram associados a DCV e AVC (VIRTAMO et al., 1985)
As selenoproteínas incorporam o selênio na estrutura do resíduo de selenocisteína, que é ionizado inteiramente em pH fisiológico e atua como um catalisador redox muito eficiente. Existem no mínimo 25 selenoproteínas identificadas; a selenoproteoma humana consiste de 17 famílias de selenoproteínas, formadas de vários genes, porém com funções biológicas semelhantes. Muitas dessas selenoproteínas são enzimas, porém algumas ainda não foram caracterizadas quanto as suas funções fisiológicas (KRYUKOV et al., 2003; PAPP; HOLMGREN; KHANNA, 2010). De acordo com Castellano et al. (2005) e Papp et al.(2007), apenas 12 selenoproteínas foram caracterizadas quanto as funções no organismo, dessas, cinco são GPx, três são deiodinases da iodotironina (DIOs), três são tioredoxina redutases (TRs) e uma selefosfatase sintetase 2 (SPS2). As demais selenoproteínas foram registradas de acordo com o seu tamanho (Sep 15 – selenoproteína com 15kDa) ou conforme a sequência do alfabeto: SelH, SelI, SelK, SelM, SelN, SelO, SelP/SepP, SelR, SelS, SelT, SelV e SelW.
As selenoproteínas com papel antioxidante possuem a capacidade de remover os
radicais livres, por exemplo, peróxidos de hidrogênio, hidroperóxidos e ERO’s, os quais, em
desequilíbrio, oxidam os lipídeos da membrana, causando danos a sua estrutura (peroxidação lipídica), o que pode resultar na aterosclerose (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
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alcoóis correspondentes, utilizando a glutationa reduzida como co-substrato (HAMANISHI et al., 2004).
Até o momento seis tipos de glutationas peroxidases foram descritas em humanos: GPx1 – citosólica, GPx2 – gastrointestinal, GPx3 – plasmática, GPx4 – fosfolipídeo hidroeroxidase, Gpx5 – epididimal e GPx6 – olfatória. A glutationa citosólica (GPx1) é expressa em vários tecidos, principalmente em eritrócitos, rins e fígado, e sua deficiência pode estar envolvida na disfunção endotelial e anormalidades cardíacas, sendo dessa forma considerada uma selenoproteína protetora dos vasos evitando o estresse oxidativo e posterior aterogênese. O gene que codifica a GPx1 (GPX1) localiza-se no cromossomo 3 (3p21.2) e possui dois exons (FORGIONE et al., 2002a; FORGIONE et al., 2002b).
Há ainda a GPx2 expressa principalmente no trato gastrointestinal, a GPx3 (extracelular) que é secretada por glicoproteínas e está presente principalmente no plasma, mas também é expressa em rins, coração, pulmões e placenta; enquanto a fosfolipídeo hidroperóxido GPx (GPx4) possui atuação específica na peroxidação dos fosfolipídeos (IMAI; NAKAGAWA, 2003), e pode estar envolvido no controle da morte celular por apoptose (NOMURA et al., 2001). A Gpx5 e GPx6 não possuem selenocisteína ou selênio, a GPx5 está expressa principalmente no epidídimo. A GPx6 ainda não está bem caracterizada quanto as funções e relações com doenças, porém sabe-se que participa da detoxificação do peróxido de hidrogênio e sua expressão está restrita ao tecido olfatório de embriões e adultos (KRYUKOV et al., 2003; REEVES; HOFFMANN, 2009).
A Selenoproteína P (SelP) possui dez átomos de selênio por molécula, tem ação antioxidante e é a principal selenoproteína presente no plasma. Essa selenoproteína, juntamente com a GPx3 extracelular, contêm mais de 90% do selênio plasmático, e serve como proteína de transporte e distribuição corporal ( ARTEEL; SIES, 2001; BURK; HILL; MOTLEY, 2003; HILL et al., 2003; BURK; HILL, 2009). O gene SEPP1 localiza-se no braço curto do cromossomo 5 (5p12) (REDERSTORFF; KROL; LESCURE, 2006).
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é de que a SelN esteja envolvida na maturação de outras proteínas relacionadas ao desenvolvimento do tecido muscular (MOGHADASZADEH; BEGGS, 2006; PAPP et al., 2007).
Considerando a importância da nteração fármaco-nutrientes em terapias medicamentosas crônicas, este estudo propõe-se a verificar os efeitos do uso da rosuvastatina no estado nutricional de selênio, em parâmetros enzimáticos e na expressão gênica de selenoproteínas.
2. Justificativa
A aterosclerose é uma doença de importância mundial, tendo em vista sua alta prevalência e complicações, que são responsáveis por elevados índices de morbi- mortalidade em todo o mundo. Sabe-se que é uma doença inflamatória crônica, com evolução lenta, cujas lesões iniciais podem começar na infância e evoluírem gradualmente por toda a vida, principalmente com a exposição a fatores de risco. No tratamento da aterosclerose, as estatinas são os principais fármacos de escolha, por inibirem a biossíntese do colesterol e apresentarem efeitos na função vasomotora do endotélio, inflamação e trombose. Alguns trabalhos apontam para o fato das estatinas interferirem na síntese das selenoproteínas, sugerindo que muitos dos efeitos colaterais das mesmas poderiam acontecer em decorrência deste fato, especialmente as miopatias.
O selênio é um importante agente antioxidante, sendo o único a exercer funções biológicas através da incorporação em proteínas (selenoproteínas) e no aminoácido cisteína. As selenoproteínas possuem diferentes funções no organismo, como ação antioxidante (por exemplo, GPx e SelP), maturação celular (SelN - miócitos), regulação hormonal (TRs), entre outras.
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3. Objetivos
Objetivo Geral
Verificar os efeitos do uso de estatinas (rosuvastatina) em pacientes com aterosclerose, em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como observar possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes.
Objetivos específicos
Caracterizar os pacientes quanto aos parâmetros antropométricos e bioquímicos, tais como o perfil lipídico, glicemia e enzimas hepáticas;
Determinar as concentrações de selênio plasmático e eritrocitário; Avaliar a atividade enzimática da Glutationa Peroxidase;
Estudar a expressão do mRNA das selenoproteínas: GPx 1, Selenoproteína P1 e, Selenoproteína N1 em leucócitos totais de sangue periférico;
Avaliar a dieta (ingestão de calorias, proteínas, lipídeos, carboidratos e selênio), e estabelecer correlações com os parâmetros de selênio, atividade da enzima Glutationa Peroxidase e expressão gênica das selenoproteínas.
4.Casuística e Métodos
4.1 Protocolo Experimental
Trata-se de um estudo longitudinal quase-experimental. A amostra foi composta por pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença arterial coronariana submetidos à angioplastia, atendidos no Serviço de Hemodinâmica do Natal Hospital Center (NHC), localizado em Natal, Rio Grande do Norte (RN), no período de junho de 2008 a janeiro de 2009.
Para o cálculo da amostra foi utilizado o método proposto por Zar (1999) com poder
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A pesquisa é um desdobramento do projeto ―Efeito da Suplementação com minerais
antioxidantes em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas‖. O referido projeto foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF/USP) sob o número CAAE 0009.0.294.018-06 e no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), sob n° de registro 026/06
– Adendo (Anexo A).
Todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE. Foram incluídos na pesquisa pacientes adultos e idosos de ambos os gêneros com diagnóstico de aterosclerose coronariana por angiografia, com estenose ≥ 60% em uma ou mais artérias, associado ao diagnóstico de angina estável. Foram considerados como critérios de não-inclusão a presença de complicações cardíacas graves ou outras doenças como as hematológicas, auto-imunes, hepatopatias, insuficiência renal, neoplasias, infecções associadas, pós-operatório, uso de antiácidos, antibióticos, suplementos vitamínico-minerais, etilismo e tabagismo.
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FIGURA 2 - Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
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FIGURA 3 – Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
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4.2 Parâmetros Antropométricos
4.2.1 Índice de Massa Corporal (IMC)
A avaliação antropométrica foi feita por meio do Índice de Massa Corpórea (IMC), que corresponde à razão do peso pela altura ao quadrado (Peso/Altura²), recomendado pela Organização Mundial de Saúde (World Health Organizations - WHO, 1998). Para mensuração do peso, foi utilizada balança digital Tanita®, modelo MEA-03140, com capacidade para 150 kg e precisão de 100 gramas, estando os indivíduos descalços e com o mínimo possível de roupa e adereços.
A estatura foi aferida em centímetros, com auxílio de estadiômetro (marca: WCS) medindo 216cm com plataforma. Os indivíduos foram medidos descalços em posição ortostática, com os olhos no plano Frankfört, com as costas e a parte posterior dos joelhos encostados à parede. O estado nutricional antropométrico dos pacientes foi diagnosticado conforme Quadro 1.
FONTE: WHO (1998).
QUADRO 1 – Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo o IMC.
4.2.2 Circunferência Abdominal (CA)
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FONTE: WHO (1998).
QUADRO 2 - Risco de complicações metabólicas relacionadas à obesidade, com base na Circunferência abdominal.
4.3 Análise da Dieta
Foi utilizado o método de Recordatório de 24 horas (R24h) para avaliar a ingestão dietética atual, que consiste no registro da informação sobre a ingestão alimentar (alimentos e bebidas) do dia anterior. Esse instrumento foi aplicado cinco vezes e em dias diferentes, incluindo um dia de final de semana, com o intuito de registrar o consumo habitual dos pacientes (Figura 4).
Para auxiliar na aplicação do R24h, foi utilizado um álbum fotográfico com uma compilação de imagens de utensílios, alimentos e preparações com diferentes medidas caseiras para melhor identificar as porções consumidas pelos pacientes (ZABOTTO; VIANA; GIL, 1996; ANDRADE; MORAIS, 2004). A definição dos tamanhos das porções foi baseada nas medidas fornecidas por Tomita e Cardoso (2000), Pinheiro et al. (2004) e Araújo e Guerra (2007). Os alimentos que não foram encontradas as medidas foram pesados em balança digital eletrônica, no Laboratório de Técnica Dietética do Departamento de Nutrição da UFRN.
A dieta foi avaliada quanto a energia, macronutrientes, colesterol e selênio utilizando-se o Software Virtual Nutri Plus® (PHILIPPI, 2008) e os resultados apresentados como a média dos cinco R24h. Os alimentos/preparações de interesse foram adicionados ao banco de dados, sendo o cálculo nutricional realizado com o auxílio de Tabelas de Composição de Alimentos (Tabela Brasileira de Composição de Alimentos – TACO, 2006 e United States Department of Agriculture – USDA, 2003).
A adequação da ingestão dietética foi baseada nas recomendações dietéticas da SBC (2007) para macronutrientes, fibras e colesterol (Anexo B), enquanto que para o Se, como não há recomendação específica para indivíduos com aterosclerose, foi utilizada a EAR (Estimate Average Requirement) (IOM, 2000).
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de variância (One-Way ANOVA) (SLATER; MARCHIONI; FISBERG, 2004). Em seguida os nutrientes foram ajustados pela energia, segundo Willett, Howe e Kushi (1997). A prevalência de ingestão inadequada de Se foi obtida utilizando-se o EAR como ponto de corte (IOM, 2000).
4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas
As análises bioquímicas foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas do HUOL, UFRN- RN. O soro dos pacientes foi separado com centrifugação a 3.500rpm durante 15 minutos a 4°C, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha). As análises foram realizadas por meio do aparelho Analisador Imunoquímico da marca Olympus®, modelo AU400e (Olympus America Inc., Melville, EUA), utilizando-se o kit do Laboratório Olympus®.
O perfil lipídico foi avaliado pela concentração no soro de colesterol total, lipotroteína de alta densidade (High Density Lipoprotein – HDL) e triacilgliceróis. Também foi determinada a concentração da lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein – LDL, que foi que foi calculada pela equação de Friedewald (SBC, 2007). Para identificação de dislipidemias foram utilizados os valores de referência preconizados pela Sociedade Brasileira de Cardiologia (2001).
Nas determinações das glicemias de jejum e Aspartato Aminotransferase (AST), também conhecida como Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGO) e Alanina Aminotransferase (ALT) ou Transaminase Glutâmica Pirúvica (TGP) foram considerados para avaliação os valores sugeridos pelo Laboratório Olympus® (Anexo C).
4.5 Análise de Selênio
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A amostra foi preparada a partir de 6,0mL de sangue total coletado em tubo com EDTA. O plasma foi separado após centrifugação a 3.500rpm, a 4°C, durante 15 minutos, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha). e armazenado à -80°C para posterior análise. Em seguida foram realizadas 3 lavagens com solução salina (NaCl) a 0,9% com rotação 10.000rpm a 4°C, durante 10 minutos, utilizando-se a centrífuga IEC MultiRF® (Thermo Electron Corporation, EUA). Os eritrócitos foram armazenados a -80°C até o momento da análise.
A análise do selênio foi realizada por espectrofotometria de absorção atômica (marca HITACHI, modelo Z-5000; Japão) com geração de hidretos acoplados à cela de quartzo, de acordo com a padronização de Gonzaga (2002). Na fase 1 do experimento foi acrescido 10mL de ácido nítrico 68% (PA Merck®) às amostras de 250μL de plasma ou eritrócito, em triplicata, e no branco, para digestão overnight. No dia seguinte, foi realizada a digestão das amostras em bloco digestor a uma temperatura de 150°C, até que as amostras obtivessem coloração clara. Após a digestão, as amostras foram acrescidas de 5mL de ácido clorídrico (HCl) 1,2N e, posteriormente, aquecidas até a redução do Se (VI) em Se (IV). Foi preparada uma solução de borohidreto de sódio (NaBH4), utilizada como reagente redutor no processo de determinação do selênio. A curva de calibração foi feita a partir de diluição de uma solução de trabalho com concentração conhecida. Os resultados das leituras em triplicatas foram
expressos em microgramas por litro (μg/L), considerando o coeficiente de variação inferior a
10% entre as triplicatas.
Para controle da exatidão e reprodutibilidade do método de análise de selênio no plasma e eritrócitos, utilizou-se o material de referência certificado Seronorm Trace Elements Serum®, preparados de acordo com as recomendações do fabricante o em água ultrapura e observando-se os valores da curva de calibração.
Foi determinada a concentração de hemoglobina no eritrócito com a finalidade de expressar os resultados em termos de massa de selênio e GPx / massa de hemoglobina. Essa análise foi realizada no Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), Centro de Ciências da Saúde, UFRN-RN.
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leituras realizadas por espectofotometria, utilizando um espectofotômetro UV visível (HITACHI, modelo U1100) em 540nm. Os resultados foram expressos em g/dL.
4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase
As análises foram feitas no Laboratorio Multidisciplina – LABMULT do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – PPgCF, no Centro de Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde, UFRN-RN. Para a análise da atividade da enzima Glutationa Peroxidase (GPx), as amostras foram preparadas a partir de 5mL de sangue total coletado em tubo com anticoagulante EDTA, com 3 lavagens com solução salina a 0,9%, rotação de 4.500rpm, a 4°C, durante 10 minutos, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha). Os eritrócitos foram armazenados à -80°C até o momento das análises, realizadas em um prazo máximo de 40 dias após a coleta.
A atividade enzimática da GPx foi mensurada em UV, Espectofotômetro (UV2100S; Shimadzu Co.®, Japão), utilizando-se o kit Ransel do Laboratório Randox (Laboratório Randox, São Francisco, EUA). Este método é baseado em Paglia e Valentine (1967), cujo princípio se baseia na medida da velocidade de oxidação da Glutationa reduzida (GSH) por hidroperóxido de cumeno catalisada pela Glutationa Peroxidase (GPx), presente no hemolisado (amostra do paciente), gerando água e Glutationa oxidase (GSSG). Na presença da Glutationa Redutase (GR) e nicotinamida-adenina dinucleotídio-fosfato (NADPH) a GSSG é imediatamente convertida na forma reduzida (GSH), sendo monitorada a 340 nm quando o NADPH é convertido a NADP+.
Os resultados das leituras foram expressos em unidades por grama de hemoglobina (U/g Hb). Os valores de referência para a Glutationa Peroxidase são: 27,5 – 73,6 U/g Hb (Kit Ransel, Laboratório Randox).
4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas
As análises da expressão do mRNA das selenoproteínas (GPX1, selenoproteína P1 e N1) foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular – LABIOMOL, do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – PPgCF, no Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRN – RN.
4.8.1 Extração do RNA total
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imediatamente após a coleta do sangue, através de metodologia descrita pelo fabricante. O material foi armazenado em freezer a -80C.
O RNA total extraído foi quantificado (A260nm) e teve seu grau de pureza (A260/A280) avaliado através de espectrofotometria no ultravioleta utilizando o espectrofotômetro Cirrus 80MB (FEMTO, São Paulo, Brasil) (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). A integridade do RNA das amostras foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1,0%, na presença de formaldeído a 2,2M e tampão MOPS [MOPS a 20mM (pH 7,0), acetato de sódio a 8mM e EDTA a 1mM (pH 8,0)] preparado com água tratada com Dietil-pirocarbonato (DEPC) (SAMBROOK e RUSSEL, 2001).
4.8.2 Análise da Expressão gênica pela PCR em Tempo Real
A síntese do cDNA, a partir do RNA total, foi realizada utilizando-se o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems®, de acordo com a metologia descrita pelo fabricante (Foster City, CA, EUA) em termociclador MyCiclerTM (Bio Rad®, Hercules, CA, EUA). O cDNA obtido foi armazenado a –20°C até a realização da PCR em tempo real.
