Rev ista da So ciedade Brasileira d e M edicina Tro pical 2 9 (6 ):5 7 9 - 5 8 3 , no v - dez , 1 9 9 6 .
IM UN O G EN ICIDA D E DA CEPA AVIRULENTA RV 194-2 D O
VÍRUS RÁ BICO EM CA M UNDONGOS
R u g im a r M a r c o v is t z , E d u a r d o C h a v e s L e a l, D e n is e C r is t in a S . d e M a t o s ,
H u m b e r t o P i n h e ir o d e A r a ú jo e H e n r i T s ia n g
O v írus rábico R V 194- 2, um a v ariante av irulenta da cepa CVS (C hallenge Vírus St andard), p ro d u z um a infecção inaparent e quando ino culado int racerebralm ent e em cam undo ngo s adultos. Sugerindo q ue a resposta im uno ló gica do ho spedeiro p erm it e a elim inação do v írus do sistema nerv o so central. P o r esta raz ão fo ram estudadas a indução de int erfero n e a resposta im une hum o ral em cam undo ngo s BA LB/ c ino culado s co m v írus R V 194- 2. D urant e a infecção , estes cam undo ngo s apres ent aram elev ado s nív eis d e int erfero n no plas m a e no céreb ro co m altos títulos d e antico rpo s neutraliz antes anti- rãbico s. A 2- 5A sintetase. um m arcado r da ação do s int erfero ns ,fo i t a m b é m a n a l i s a d a n o c é re b r o d e s t e s a n i m a i s . S u a a t i v i d a d e , a u m e n t o u , paralelam ent e, ã p ro d uçã o d e int erfero n, dem o ns t rando q ue este int erfero n é bio quím icam ent e ativ o. O v írus R V 1 9 4 - 2 tam bém induz iu, 4 5 dias apó s s ua ino culação , pro t eção ao s anim ais q uando desafiado s co m a cepa v irulenta CVS. Estes resultado s dem o nst ram q ue a cepa R V 1 9 4 - 2 p o s s ui um alto nív el im uno gênico .
P alav ras- chav es: Vírus rãbico . Int erfero n. Im uno genicidade.
Durante muito tem po , co m base em testes im uno ló gico s co nvencio nais, todas as cep as de vírus rábico eram consideradas antigênicamente semelhantes25. Contudo, d iferenças antigênicas entre as cep as de vírus fixo e as cep as de vírus de rua ou selvagem foram facilmente detectadas, u tiliz and o antico rp o s m o no clo nais co ntra a glico pro teína do vírus rábico 10 26.
O em prego destes anticorpo s m o no clo nais
antiglicoproteína possibilitou a seleção i n v i t r o,
de cep as avirulentas variantes do vírus fixo CVS48. Dentre estas cep as variantes avirulentas, uma d emonstrou ser incapaz de reagir co m dois antico rpo s m o no clo nais antiglicoproteína d o CVS (antico rp o s n- 248-8 e 194-2), send o então, d enominad a de RV194-2. Sua avirulência foi caracterizad a pela ausência de mortalidade de cam und o ngo s Suíços, quand o inoculad os p o r via intracerebral.
Dietzscho ld e co l8 estud and o a m o lécula da glico pro teína d o vírus RV194-2 o bservo u que a
D e p artam e n to d e Im u n o lo g ia, In stitu to O sw ald o C ru z , Fund ação O sw ald o C ruz, Rio d e Jan eiro, Brasil. Service Rage, Institut Pasteur, Paris, França.
F i n a n ci a d o p e l o C N Pq e C o m m i s s io n o f E u ro p e a n (co n trato n o.T S 2 1 90).
E nd e re ço p a ra co rres p o ndência: D ra. Rugim ar M arcovistz, Serviço d e C ontrole de Q ualidade, In stituto Butantan. Av. Brasil 1 5 0 0 , Butantan 0 5 5 0 3 - 9 0 0 , São Paulo, Brasil. R eceb id o p ara p ub licação em 0 1 / 0 9 / 9 5 .
simples substituição de um am ino ácid o na p o sição 333 (Arg —► Ile o u Gin) era essencial p ara a in te g rid ad e d e u m d e te rm in an te antigênico e respo nsável pela cap acid ad e do vírus de p ro d uzir infeção não letal em cam und o ng o s. Po sterio rm ente, Tu ffereau e c o l24 c o n firm aram q u e a su b s titu iç ã o d a arg inina, na p o siç ão 3 33, na m o léc u la da glicoproteína de variantes avirulentas derivadas dos vírus CVS e ERA, era fund am ental para a avirulência dessas cepas.
Vário s autores tem utilizado essas variantes, c o m o u m a f e r r a m e n ta n o e s tu d o d as c a ra c te rístic a s b io ló g ic a s e n v o lv id as na neurovirulência do vírus rábico718. Recentemente, Jackso n17 demonstrou que o s vírus CVS e sua variante avirulenta RV194-2 d issem inam -se igualmente no SNC de camundongos, entretanto, o CVS era capaz de infectar um núm ero maio r de neurô nio s do que o RV194-2.
Nosso trabalho teve co m o o bjetiv o estudar a im u n o g ê n ic id ad e d o v íru s R V 194-2 em cam und o ng o s BA LB/ c atrav és da ind u ção d e interferon, da pro d ução de antico rpo s n eu traliz an tes an ti-ráb ic o s e d a p ro te ç ão d estes animais co ntra a cep a parental virulenta (CVS) usada co m o desafio.
MATERIAIS E MÉTODOS
A n i m a i s . Utilizamos cam und o ngo s BALB/ c
(id ad e de 6 sem anas), fo rnecid o s p elo Bio tério Central da Fund ação O sw ald o Cruz.
M arco v ístz R, Leal EC, M ato s D CS, A raújo HP, Tsiang H. Im im o geniciclade da cepa av irulenta R V 1 9 4 - 2 do v írus rábico em cam undo ngo s . Revista da So ciedade Brasileira de M edicina Tro pical 2 9 :5 7 9 - 5 8 3 , no v - dez , 1 9 9 6 .
C é l u l a s . As linhagens de células empregadas
fo ram : L-929 (c élu las ep iteliais m urinas), BHK21 (baby ham ster kid ney) e CER (chick embryo -related ), cultivadas em m eio mínimo de Eagle (MEM) sup lem entad o co m 10% de so ro fetal bo v ino (SFB).
V í m s . Foram utilizadas duas cep as de vírus
rábico : a cep a de vírus fixo, CVS, adaptada em c am u n d o n g o s e em c é lu las BH K21 e sua variante, avirulenta RV194-2, adaptada em células BHK21. As amostras originais destas cep as foram fo rnecid as p elo Serviço de raiva do Instituto Pasteur de Paris, França.
A cep a de vírus da encefalo m io card ite murina (EMC) adaptada em células L929 foi fo rnecid a p ela Dra. Claire Kubelka (Dep t9 de Virologia, Instituto Osw aldo Caiz).
D o s a g e m d e a n t i c o r p o s a n t i - r ã b i c o s . Os
cam und o ngo s foram sangrad os através de p unção no p lexo retroorbital, as amostras de sangue foram co lo cad as em tubo s co ntend o heparina (100U/ ml) e o plasma separad o p o r centrifugação . O m éto d o de inibição do fo co de fluo rescência, em cultura de células BHK21, foi utilizado para a d o sagem de anticorpo s anti-rábicos23.
D iluiçõ es seriadas do plasma (1:2 a 1:1024) foram feitas em m icro placas de 96 orifícios. A c ad a 2 5 p 1 d as d ilu iç õ e s d o p lasm a f o i ad icio nad o igual volume de uma suspensão de vírus CVS (ad aptad o em células BHK21 e previamente titulado) e 80pl de diluente (MEM co m 5% de SFB). A pós incubação de 1 ho ra a 3ó°C, em am biente de C 02 (5% ), 50pl de uma susp ensão de células BHK21 (106cel/ ml) foram ad icio nad o s. Um vo lum e de lOjil da mistura plasma, vírus e células foi transferido para placa de Terasaki. A pós incubação a 36°C durante 24 horas, as células foram lavadas co m so lu ç ão salin a tam p o n ad a (PBS c o n ten d o Ca++ e Mg++) e fixad as em aceto na (80% ) durante 1/ 2 hora a 4°C. Em seguida, o conjugado an tin u c le o c ap síd e o ráb ic o (5p l/ o rifíc io ), marcado co m iso tio cianato de fluoresceína (FIT C ) ( D ig n o s tic P aste u r, Fra n ç a ) , fo i ad icio nad o e ap ó s incubação p o r 30 minutos a 37°C e as células foram lavadas duas vezes co m PBS. As p lacas secas foram examinad as ao m icro scó p io de fluo rescência.
Em paralelo , foi tam bém titulado um so ro de referência co ntend o 350 UI, fo rnecid o p e lo In s titu to N a c io n a l d e C o n tro le d e Qualid ad e em Saúde da Fund ação O sw ald o Cruz (INCQS-FIOCRUZ). Os títulos de anticorpos,
expresso s em unidades internacionais, foram determinados a partir do inverso das d iluiçõ es •de p lasm as c a p a z e s d e in ib ir 50% d a
rep licação virai nas células BHK.
E x t r a t o c e r e b r a l . C éreb ro s c o n g elad o s
fo ram m ac e rad o s e h o m o g e n e iz ad o s em 2 m l d e u m a so lu ç ão tam p ão h ip o tô n ic a, co ntend o lOmM de HEPES (pH 7,6), lOmM d e KC1, 2m M d e M g ( O A C ) 2 , 7m M d e 2-iâ-m ercap to etano l e apro tinina a 100 U/ ml. Estes ho m o genato s foram d eixad o s p o r 15 minutos a 4°C antes da ad ição de NP40 na co ncentração final de 0,5%. Cada suspensão foi, então, sonicada p o r 10 segundos e centrifugada a 1500g p o r 20 m in u to s13. O s ex trato s d o s c é re b ro s fo ram g u ard ad o s a -70°C p ara p o sterio r av aliação da ativid ad e da 2-5A sintetase.
A t i v i d a d e d e 2 - 5 A s i n t e t a s e . Os extratos de
cérebro ( 200pl) foram co lo cad o s para reagir co m 4001 de uma so lução tampão hipo tô nica, co ntend o 20mM de HEPES (pH 7,6), 50mM de K C 1, 25m M d e M g ( O A C ) 2 , 7m M d e 2-E-m ercap to etano l, 5mM de ATP, lOmM de fo stato de creatinina, 0, l 6mg/ ml de creatina kinase, 0,lm g/ m l de p o ly(I).p o ly(C) e 20ytl de 3H-ATP (0,lmCi/ ml) (A mershan, Inglaterra). A mistura fo i incubad a a 30°C p o r 90 m inuto s e em se g u id a p o r 5 m in u to s a 80/ 90°C . A s m o léculas de 2-5A resultantes da ativação da 2-5A s in te ta s e , fo ram p u rif ic a d a s p o r cromatografia em co lunas de DEA -celulo se e as amostras co lo cad as em frasco s co ntend o líquido de cintilação . A co ntagem em cp m fo i feita em analisad o r (Beta) de líquid o de cintilação (PACKARD, M o d elo : l600 TRI- CARB) e a taxa de 2-5A sintetase fo i expressa em nm o l de AMP, inco rp o rad o na mo lécula de 2-5A p o r mg de pro teína po r 60 minuto s.
T i t u l a ç ã o d e i n t e r f e r o n . A ativ id ad e
in te rf e ro g ê n ic a no p lasm a e n o c é re b ro (extrato cerebral sem NP40 e 2-lS-mercaptoetanol) fo i medid a pela inibição d o efeito cito p ático do vírus EMC so bre as células L-92913 .
M arco v istz R, Leal EC, M ato s DCS, A raújo HP, Tsiang H . Im uno geiiicidade da cepa av irulenta R V 1 9 4 - 2 do v írus rãbico em cam undo ngo s . Rev ista da So ciedade Brasileira de M edicina Tro pical 2 9 :5 7 9 - 5 8 3 , no v - dez , 1 9 9 6 .
100 TCID50 d o vírus EMC e reincubad as a 37°C em am biente de C 02 (5% ) p o r mais 24 horas.
O título d o interfero n fo i d ado p elo inverso da d iluição d as am o stras testad as que apresentaram 50% de efeito cito pático causado p elo EMC.
D o s a g e m d e p r o t e í n a s . As pro teínas dos
extratos de cérebro s foram d osadas co m base na d iferença de abso rbância a 235 e 280nm 28.
E f e i t o p r o t e t o r . T rê s g ru p o s d e 24
cam und o ngo s BALB/ c foram ino culad o s co m 50pl de uma susp ensão do vírus RV194-2, por via intracerebral, nas co ncentraçõ es de 100, 1.000, 10.000 PFU. Um outro grupo tam bém co m 24 cam und o ngo s, fo i ino culad o co m PBS (50pl/ animal), p o r via intracerebral. Duas semanas ap ó s a ino culação , cada um dos grupos citad o s fo i subdividid o em dois grupos d e 12 animais e desafiados, intracerebralmente, co m a cep a CVS nas co ncentraçõ es de 30 e 100 D L50, resp ec tiv am en te. O s anim ais fo ram observados, quanto o aparecimento de sintomas da raiva, durante 30 dias após o desafio.
RESULTADOS
T í t u l o d e a n t i c o r p o s a n t i - r ã b i c o s , i n d u ç ã o d e i n t e r f e r o n e a t i v i d a d e d a 2 - 5 A s i n t e t a s e . A
Tabela 1 mostra os resultados do título de antico rp o s neutralizantes anti-rábico s, da p resença d e interfero n no p lasm a e no cérebro , assim co m o , a ativid ade da 2-5'A sintetase no céreb ro de cam und o ngo s ino culad o s co m o vírus RV194-2.
T a b e l a 1 - T í t u lo d e a n t i c o r p o s a n t i - r á b i c o s i n d u ç ã o d e i n t e r f e r o n e a t i v i d a d e d a 2 - 5 A s i n t e t a s e n o p l a s m a e n o c é r e b r o d e c a m u n d o n g o s i n o c u l a d o s c o m v í r u s R V 1 9 4 - 2 .
D ias Plasma Cérebro
apos AcN IFN IFN U/ mg 2-5A inoculação Ul/ ml U/ ml de ptn nmoi/ mg/ h
c 0 < 40 < 40 0.30 2 0.67 2560 2560 1,10 4 2,67 2560 > 5120 2.00 8 68.13 1280 640 1,15 12 204.00 320 320 1.00 16 204,00 < 40 < 40 0 Um grupo de 15 camundongos BALB/ c foi inoculado com o vírus RV194-2 por via intracerebral (100 PFU/ animal). Cada resultado representa a média aritmética de três animais: AcN = anticorpos neutralizantes: IFN = interferon; C = indica o s valores obtidos a partir de animais inoculados somente co m PBS (controle).
Os antico rp o s neutralizantes circulantes foram d etectad o s a partir d o 22 dia ap ó s a in o c u laç ão d o v íru s e o títu lo au m ento u pro gressivamente até o 12a dia, m antend o -se a seg u ir c o n stan te até o d ia 16, q u and o o exp erim ento fo i encerrad o .
A p resença de interfero n no plasma e no cérebro aumentou a partir do 22 dia, d ecrescend o a partir do 8S dia.
A ind ução da 2-5 A sintetase o co rreu em paralelo à p ro d ução de interfero n no cérebro , mostrando um p ico m áxim o de sua atividade no 42 dia ap ó s a ino culação do vírus, co m uma qued a gradativa a partir do dia 8 .
E f e i t o p r o t e t o r . A Tabela 2 mostra o efeito
d o vírus rábico RV194-2 na ind ução da resistência de cam und o ngo s BALB/ c quand o desafiad os co m a cep a CVS.
T a b e l a 2 - E f e i t o p r o t e t o r d o v í r u s R V 1 9 4 - 2 e m c a m u n d o n g o s B A L B /c .
Concentração Taxa de so brevivência (%) do vírus Vírus desafio (CVS) RV194-2 30 DL50 100 DL50
0 2/ 12 (16.7) 0/ 12 (0) 100 12/ 12 (100) 12/ 12 (100) 1.000 12/ 12 (100) 12/ 12 (100) 10.000 12/ 12 (100) 12/ 12 (100) Três grupos de 24 camundongos BALB/ c foram inoculados com 50yg de uma suspensão do vírus RV194-2 por via intracerebral nas co ncentraçõ es de 100. 1.000. 10.000 PFLL Duas semanas após a inoculação, cada um dos três grupos foi subdividido em dois grupos de 12 animais e desafiados intracerebralmente com a cepa CVS nas co ncentraçõ es de 30 e 100 DL50. respectivamente. Os anim ais fo ram o b serv ad o s d urante 30 d ias ap ó s o d esafio . 0 = Representa o grupo de animais inoculados com PBS e desafiados com o vírus CVS.
Os três grupos de cam und o ngo s inoculados co m d iferentes co ncentraçõ es ( 100, 1.000 e 10.000 PFU) de vírus foram 100% pro tegidos quand o d esafiad o s co m 30 e 100 DL50 de vírus CVS p o r via intracerebral.
O grupo de animais co ntro le ino culad o s so m ente co m 30 e 100 DL50 de vírus CVS (d esafio ) tiveram uma mortalidade de 83,7 e 100%, respectivamente.
DISCUSSÃO
O s re s u lta d o s o b tid o s n e s te e s tu d o demonstraram que os cam und o ngo s BALB/ c, inoculad os por via intracerebral co m o vírus avirulento RV194-2, apresentaram altos títulos d e in terfero n e d e an tico rp o s an ti-ráb ic o s neutralizantes, além da p ro teção co ntra o vírus parental virulento, CVS.
A p ro d ução de interfero n é uma das primeiras d efesas do organismo co nsequente de uma infecção virai11141521 e a im po rtância de seu p apel, em d iferentes m o d elo s animais infectad o s co m vírus rábico tem sido bem documentada19. Em co nco rd ância co m esses dados, também enco ntram o s altas taxas de interferon no plasma e no cérebro dos animais
M arco v istz R, Leal EC, M ato s DCS, A raújo HP, Tsiang H. Im uno genicidade d a cepa av irulenta R V 1 9 4 - 2 do v írus rábico em cam undo ngo s . Revista da So ciedade Brasileira d e M edicina Tro pical 2 9 - 5 7 9 - 5 8 3 no v - dez 19 9 6 .
ino culad o s co m o vírus RV194-2. A lém disso, a 2-5A sintetase, um dos marcadores da presença e ação d o interfero n em um organism o e em culturas de tecid o s3 13, aumentou sua taxa paralelam ente à d o interfero n produzid o no cérebro dos animais ino culad o s co m o vírus RV194-2. Esses resultados evid enciam que o interfero n pro d uzid o no s animais infectad os co m o vírus RV194-2 é tão ativo quanto o pro d uzid o em resp o sta à infecçõ es p o r cep as virulentas20.
Estudo imuno histo quím ico realizado por Dietzscho ld e co l9 mostrou que o vírus CVS d isseminou mais rápido d o có rtex para o cerebelo e infecto u mais neurô nio s d o que o v íru s R V 1 9 4 - 2 , n o SN C d o s a n im a is . P o ste rio rm e n te , re su ltad o s se m e lh an te s m o strando reduzida cap acid ad e da rep licação d o v íru s R V 194-2 n o SN C d o s an im ais. P o ste rio rm e n te , re su latd o s se m e lh an te s mo strando a cap acid ad e da rep licação d o vírus RV 194-2 no SNC d e cam u nd o ng o s, q uand o co m parad a co m a cep a CVS, tam bém foram observad o s p o r outros pesquisad ores7 16 17 18. Essa m eno r eficiência da d issem inação do vírus RV194-2 no SNC, provavelmente, permite um m aio r tem p o de exp o sição das partículas virais ou antígeno s virais às células d o sistema imune, e em parte, exp licaria o s altos título s de antico rpo s anti-rábico s enco ntrad o s no plasma dos cam und o ngo s BALB/ c ino culad o s co m o vírus RV194-2.
Po r outro lad o , o vírus RV194-2 mostrou-se altamente im uno gênico , induzindo pro teção ao s cam und o ngo s quand o d esafiad os co m o vírus CVS. Esta pro teção , certamente, foi devida ao s altos níveis de antico rp o s e de interfero n enco ntrad o s no s animais ino culad o s co m o vírus RV194-2. É im po rtante no tar que vários autores têm dem o nstrad o a impo rtância dos interferons co m o ímumoduladores na evolução da infecção rábica2122, e na eficácia de vacinas anti-rábicas12.
Os resultados aqui apresentado s sugerem que a cep a RV194-2 p o d e ser um excelente instrumento para os estud os so bre a interação dos sistemas nervo so e imunitário, e talvez uma pro misso ra candidata para estudos de novas vacinas.
SUMMARY
R V 194- 2 rabies v irus, a n av irulent m ut ant o f CVS strain, induces a n inapparent infectio n limited
to the cent ral nerv o us sy stem (C N S) in adult m ice ino culat ed intracerebrally . This f a c t suggest that im m une respo nse o f the ho st is able to elim inat e the v irus in CNS. F o r this reaso n, w e hav e s t udied the induct io n o f int erfero n a n d the hum o ral im m une re s p o n s e s in B A L B / c m i c e a f t e r R V 1 9 4 - 2 ino cula t io n. These m ice p re s e n t e d high lev els o f int erfero n in the plas m a a n d in the brain, w ith elev ated lev els o f neut raliz ing antirabies antibo dies. The 2- 5 A sy nthetase, a n e nz y m e m a rk e r o f int erfero n actio n, w as analy z ed in the b rain o f ino culat ed anim als. Its e nha ncem ent in p arallel to the int erfero n pro duct io n in the brain, sho w ed bio chem ical ev idence that this int erfero n is activ e. Forty fiv e day s aft er R V 1 9 4 - 2 v irus ino culatio n, m ice w ere pro t ect ed against a challenge w ith the CVS v irulent strain. The results p res ent ed herein show that R V 194- 2 strain has a bigh lev el o f im m uno genicit y .
K e y - w o rd s : R a b i e s v i r u s . I n t e r f e r o n . Im m uno genicit y .
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