Methods of detection and typing of methicillin resistant Staphylococcus aureus isolated from animals

* Rad primljen za štampu 19. 10. 2012. godine.

** V. Radosavljević, Jadranka Žutić, Naučni Institut za veterinarstvo Srbije, Beograd; Ljiljana Pavlović, Institut za javno zdravlje Dr M. Jovanović Batut, Beograd; Tamara Bošković, Minis -tarstvo Poljoprivrede, šumarstva i vodoprivrede R. Srbije, Beograd; O. Radanović, M. Žutić, Naučni Institut za veterinarstvo Srbije, Beograd

DOI: 10.2298/VETGL1402089R UDK: 636.4+577.121:631.53.04+631.53.048

METODE DETEKCIJE I TIPIZACIJE METICILIN-REZISTENTNIH

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

IZOLOVANIH IZ ŽIVOTINJA*

METHODS OF DETECTION AND TYPING OF METHICILLIN RESISTANT

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATED FROM ANIMALS

Radosavljević V., Žutić Jadranka, Pavlović Ljiljana, Bošković Tamara,

Radanović O., Žutić M.**

U radu je izvršena evaluacija metoda detekcije meticilin rezisten­ tnog Staphylococcus aureus (MRSA) upotrebom dva molekularna i tri fenotipska testa u postupku ispitivanja 70 sojeva S. aureus izolo­ vanih iz životinja. Skorašnji nalaz novog mecA homologa, mecALGA251, umanjuje značaj dokazivanja prisustva mecA gena kao potvrdne me­ tode u identiikaciji meticilin rezistentnog Staphylococcus aureus. Iz ovog razloga je, pored multipleks PCR seta prajmera (16S rDNK, nuc, mecA) za detekciju mecA gena, korišćen i multipleks PCR set praj­ mera (spa, mecA, pvl, mecALGA251) za diferencijaciju mecALGA251 od mecA, sa istovremenom detekcijom lukF-PV i spa genskih fragme­ nata. Kod svih 70 ispitivanih izolata detektovano je prisustvo speci­ ičnog 16S rDNK

fragmenta i nuc gena koji kodira termostabilnu nu­

Rod Staphylococcus obuhvata čitav niz oportunističkih patogena različitog značaja u veterinarskoj medicini. Najznačajnijim se među njima smatra Staphylo­ coccus (S.) aureus zbog njegove izražene adaptabilnosti i mogućnosti da uzroku -je različita patološka stanja, od blagih kožnih infekcija do smrtonosnih bakteri-je -mija. Bitno svojstvo stailokoka je njihova sposobnost da stvore rezistenciju pre -ma antimikrobnim sredstvi-ma.Otpornost prema meticilinu bazira se na prisustvu mecA gena, koji kodira sintezu izmenjenog penicilin vezujućeg proteina (PBP2a), i njegovim niskim ainitetom prema beta-laktamskim antibioticima (Kwon i sar., 2005). MecA gen se nalazi na stailokoknoj hromozomskoj kaseti – mobilnom ge -netskom elementu na hromozomu (SCC – staphylococcal chromosomal casette mec) (Chambers,1997). Pojava meticilin rezistentnih sojeva S. aureus (MRSA)

je utvrđena nedugo nakon njegovog uvođenja u kliničkuupotrebu. Prva pojava rezistencije na meticilin zabeležena je 1961. godine među bolničkim izolatima u Engleskoj (Jevons, 1961). Prve meticilin rezistentne stailokoke poreklom od ži -votinja izolovane su 1972. godine iz mleka krava sa mastitisom (Devriese i sar., 1972). Iako se meticilin već duže vreme ne koristi u lečenju stailokoknih infekcija, akronim MRSA se i dalje koristi kao oznaka rezistencije na beta-laktamske anti -biotike. Meticilin rezistentni sojevi S. aureus izolovani su iz 30 odsto teladi u Ho-landiji (Graveland i sar., 2008), kao i iz 39-70% svinja na liniji klanja (de Neeling i sar., 2007; Tenhagen i sar., 2009). MRSA sojevi su takođe izolovani i iz konja i kućnihljubimaca (Walther et al., 2006; Weese et al, 2006), brojlera (Persoons i sar., 2009) svinja (van Duijkeren i sar., 2007; Žutić i sar., 2012a) i krava sa subkli -ničkim mastitisom (Žutić i sar., 2012b). Poseban problem predstavlja mogućnost prenošenja sojeva MRSA sa životinja na ljude, pogotovo od kada je utvrđeno da je prisustvo MRSA tipa ST398 mnogo učestalije kod poljoprivrednika, veterinara i klaničnog osoblja u odnosu na opštu populaciju (Voss i sar., 2005; Wulf i sar., 2007). U više država su utvrđene kliničke infekcije ljudi izazvane ovim tipom S. aureus (van Loo i sar., 2007; Witte i sar, 2007). Iz učestale pojave meticilin -rezis-tentnihstailokokakod ljudi i životinja proizašla je potreba primene brzih i pouzda-nih metoda detekcijeantimikrobnerezistencije. Više autora upućuje na upotrebu cefoksitinakaomarkera rezistencije na meticilin (Felten i sar., 2002; Swenson i sar., 2005; Swenson i sar., 2007), a cefoksitindiskdifuzioni metod je preporučeni metod za detekcijuMRSA (CLSI, 2008). Međutim, pouzdanost detekcije rezisten-cije primenom fenotipskih testova nije uvek zadovoljavajuća, s obzirom na č inje-nicu da na ekspresiju gena značajno utiču uslovi spoljašnje sredine i faktorikul -tivacije (Martineau i sar., 2000). Za identiikaciju sojeva MRSA putem detekcije

mecA gena koristi se i lančana reakcija polimeraze (PCR). Skorašnji nalaz novog

mecA homologa, mecA_LGA251, sa svega 70% homologije sa poznatim mecA gen-om, umanjio je značaj testiranja na prisustvo mecA gena kao potvrdne metode za dokazivanje meticilin rezistentnog Staphylococcusaureus (MRSA). Stoga se pre -poručuje primena multipleks PCR za diferencijaciju mecALGA251 od mecA, sa

vremenom detekcijom lukF-PV i spa genskih fragmenata, što omogućava i direkt -no spa tipiziranje sekvenciranjem PCR amplikona (Stegger i sar., 2012). Cilj ovog rada je evaluacija mogućnosti detekcije meticilin rezistentnih sojeva S. aureus pri-menom fenotipskih i molekularnih metoda.

Za ispitivanje je korišćeno ukupno 70 sojeva S. aureus, izolovanih iz kli -ničkog materijala poreklom od domaćih životinja (goveda i svinje). Identiikacija sojeva S. aureus izvršena je standardnim bakteriološkim metodama uz primenu komercijalnih testova (Slidex Staph Plus, bioMerieux ; BBL Crystal G/P ID kit, Becton Dickinson). Ispitujući sojevi S. aureus zasejani su na hromogenu pod -logu (chromID MRSA, bioMerieux) i inkubirani na temperaturi od 37oC u aerobnim uslovima tokom 24 sata.Svi izolati su takođe ispitivani na prisustvo rezistencije disk difuzionom metodom na Mueller Hinton II agaru (bioMerieux), primenom dis -ka cefoksitina od 30 µg (Rosco, Dans-ka) i interpretacijom rezultata prema pre -poruci CLSI (2008). Svih 70 sojeva S. aureus je ispitano na prisustvo produkta mecA gena, penicillin vezujućeg proteina (PBP2a) pomoću lateks aglutinacionog testa (Slidex MRSA Detection, bioMerieux). Test je izvršen prema uputstvu proiz -vođača. Za ekstrakciju DNK iz 24 časa starih kultura je korišćen QIAamp DNA mini kit (Qiagen), prema uputstvu proizvođača.

Materijal i metode rada / Material and methods

Tabela 1. Prajmeri korišćeni za detekciju MRSA Table 1. Primers used for MRSA detection

Prajmer / Primer Sekvenca / Sequence Veličina produkta / _{Product size}

Multipleks / Multiplex PCR(16S, nuc, mecA)

16S1 5’-GTG CCA GCA GCC GCG GTAA-3’ _{886 bp}

16S2 5’-AGA CCC GGG AAC GTA TTC AC-3’

mec1 5’-GGG ATC ATA GCG TCA TTA TTC-3’ _{527 bp}

mec2 5’-AAC GAT TGT GAC ACG ATA GCC -3’ nuc1 5’-TCA GCA AAT GCA TCA CAA ACAG-3’

255 bp nuc2 5’ -CGT AAA TGC ACT TGC TTC AGG-3’

Multipleks / Multiplex PCR(spa, mecA, pvl, mecA_LGA251)

spa-1113F 5’ – TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC – 3’

200-600 bp spa-1514R 5’ – CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT – 3’

mecA P4 5’ – TCCAGATTACAACTTCACCAGG – 3’

162 bp mecA P7 5’ – CCACTTCATATCTTGTAACG – 3’

pvl-F 5’ – GCTGGACAAAACTTCTTGGAATAT – 3’

~85 bp pvl-R 5’ – GATAGGACACCAATAAATTCTGGATTG – 3’

mecALGA251 MultiFP 5’ – GAAAAAAAGGCTTAGAACGCCTC – 3’

Za utvrđivanje mecA statusa korišćena su dva multipleks PCR testa: 1. Multipleks PCR (16S, nuc, mecA), pri čemu je istovremeno vršena amplii -kacija Staphylococcus speciičnih regija 16S rDNK, mecA gena i nuc gena (Poul-sen i sar., 2003) (tabela 1). Prajmeri za rad su sintetisani u Metabion GmbH, Ne -mačka. Za pripremu PCR smeše korišćen je HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Ger -many), prema uputstvu proizvođača.Umnožavanje DNKfragmenata je vršeno u PCR aparatu (Mastercycler, Eppendorf, Nemačka). Nakon inicijalne denaturacije DNK pri temperaturi od 94°C u trajanju od 5 minuta, reakcija (30 ciklusa) se od -vijala u sledećim temperaturnim uslovima: 30 sekundi na 94oC, 30 sekundi na

55oC i 30 sekundi na 72oC, sa završnom elongacijom na 72oC u trajanju od dva minuta. PCR proizvodi su vizuelizovani na 2% agaroznom gelu (Bio-Rad) sa eti -dijum-bromidom na UV transiluminatoru. Na osnovu DNK markera (DNA Ladder, 50-1000 bp, Fermentas) određena je približna molekulska masa PCR produkata. Kao negativna kontrola korišćen je referentni soj S. aureus ATCC 29213, a kao pozitivna kontrola meticilin rezistentan S. aureus ATCC 43300.

U slučajevima nuc i mecA ampliikacije, u multipleks PCR reakciji su, osim 16S rDNK fragmenta veličine 886 bp, bili prisutni i mecA fragment DNK veličine 527 bp i nuc fragment DNK veličine 225 bp. Pozitivna (MRSA ATCC 43300) i ne -gativna (S. aureus ATCC 29213) kontrola su korišćene za svaku PCR reakciju.

2. Multipleks PCR (spa, mecA, pvl, mecA_LGA251) za diferencijaciju mecA_LGA251

od mecA, sa istovremenom detekcijom lukF-PV i spa genskih fragmenata. Za po -tvrdu rezistencije prema meticilinu detekcijom mecA gena i istovremeno utvrđi -vanje prisustva mecC (mecALGA251) gena, spa gena i Panton Valentin Leukocidin (PVL ili lukF-PV) kodirajućih gena, korišćen je multipleks PCR prema Stegger i sar. (2012) (tabela 1). Prajmeri za rad su sintetisani u Metabion GmbH, Nemačka. Za pripremu PCR smeše korišćen je HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Nemačka), prema uputstvu proizvođača. Umnožavanje DNK fragmenata je vršeno u PCR aparatu (Mastercycler, Eppendorf, Nemačka). Nakon inicijalne denaturacije DNK pri temperaturi od 94oC u trajanju od 5 minuta, reakcija (30 ciklusa) se odvijala u sledećim temperaturnim uslovima: 30 sekundi na 94oC, 60 sekundi na 59oC i 60 sekundi na 72oC, sa završnom elongacijom na 72oC u trajanju od 10 minuta. PCR proizvodi su vizuelizovani na 2% agaroznom gelu (Bio-Rad) sa etidijum-bromi -dom na UV transiluminatoru. Na osnovu DNK markera (DNA Ladder, 50-1000 bp, Fermentas) određena je približna molekulska masa PCR produkata.

Pri kultivaciji na hromogenoj podlozi, od 70 ispitujućih sojeva Staphylococ­ cus aureus, njih je 5, nakon 24h inkubacije na temperaturi od 37oC raslo u vidu okruglih,konveksnih, zeleno do sivkasto obojenih kolonija sa zelenim rubovima, prečnika oko 1,5 mm (slika 1). Preostalih 65 sojeva nije pokazalo rast niti nakon 72 sata inkubacije.

Slika 1. Kolonije MRSA na hromogenoj podlozi / Figure 1. Colonies of MRSA at chromogen medium

Ispitivanjem osetljivosti svih 70 sojeva, istih je 5 sojeva, koji su rasli na hro -mogenoj podlozi, pokazalo rezistenciju na cefoksitin, pri čemu se zona inhibici -je kretala od 14-16 mm. Takođe -je, primenom lateks aglutinacionog testa ovih 5 sojeva dalo pozitivnu reakciju, odnosno kod njih je dokazano prisustvo penici -lin vezujućeg proteina (PBP2a). Ampliikacijom Staphylococcus-speciičnih regija 16S rDNK u ispitivanim izolatima potvrđena je pripadnost svih ispitivanih izolata rodu Staphylococcus. Kod svih 70 ispitivanih izolata detektovano je prisustvo nuc gena, koji kodira termostabilnu nukleazu speciičnu za S. aureus. Kod 5 od 70 izo -lata ampliikovan fragment mecA gena, veličine 527 bp (slika 2 i 3).

Zone inhibicije utvrđene disk difuzionom metodom sa cefoksitinom su date u tabeli 2.

Nasuprot tome, nijedan od izolata koji su pokazali osetljivost na cefoksitin i odsustvo PBP2a nije pokazao traku za mecA gen u multipleks PCR testovima. Tabela 2. Veličina zona inhibicije oko diskova cefoksitina u disk difuzionoj metodi i rezultat

PCR detekcije mecA gena

Table 2. Size of inhibition zones around cefoxitin disks in disk diffusion method and the result of mecA gene PCR detection

mecA rezultat /

mecA result ResultBroj /

Prečnik zone inhibicije (mm) / Inhibition zone diameter (mm)

≤

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30≥ Pozitivno /

Positive 5 1 2 2

Negativno /

Negative 65 1 3 10 21 17 8 5

Dakle, i cefoksitin-rezistentni i osetljivi sojevi su pokazali potpunu saglasnost re -zultata dobijenih pomoću multipleks PCR i primenom fenotipskih metoda. Kod svih ispitivanih izolata je utvrđeno prisustvo spa gena, čime je omogućena dalja karakterizacija i tipizacija izolovanih sojeva. U ispitivanim izolatima S. aureus ni-je detektovano prisustvo mecALGA251, niti Panton-Valentin leukocidin (PVL) kodira -jućeg gena.

Slika 2. Multipleks PCR(16S, nuc, mecA). M – molekularni marker 50-1000bp

(Fermenas), 1-5 – MRSA izolati, 6 – Pozitivna kontrola (MRSA ATCC 43300), 7 – Negativna kontrola (S. aureus ATCC29213)

Figure 2. Multiplex PCR (165, nuc, mecA). M – molecular marker 50-1000 bp (Fermentas), 1-5 MRSA isolates, 6 – Positive control (MRSA ATCC 43300), 7 – Negative control (S. aureus ATCC29213)

Slika 3.Multipleks PCR(spa, mecA, pvl, mecA_LGA251). M – molekularni marker 50-1000bp,

1-5 – MRSA izolati, 6 – Pozitivna kontrola (MRSA ATCC 43300), 7 – Pozitivna kontrola (PVL pozitivan S.aureus), 8 – Pozitivna kontrola (S. aureus mecA_LGA251),

9 – Negativna kontrola (S. aureus ATCC29213).

Figure 3. Multiplex PCR (spa, mecA, pvl, mecA_LGA251). M – molecular marker 50-1000bp, 1-5 – MRSA isolates, 6 – Positive control (MRSA ATCC 43300), 7 – Positive control (PVL pozitivan S.aureus), 8 – Positive control (S. aureus mecA_LGA251), 9 – Negative control (S. aureus ATCC 29213)

M 1 2 3 4 5 6 7

Dokazivanje mecA gena ili njegovog proizvoda, penicilin vezujućeg protei -na (PBP2a), smatra se zlatnim standardom za potvrdu MRSA (Skov i sar., 2006). Skorašnje studije su pokazale da je test disk difuzije sa cefoksitinom značajno po -uzdaniji u odnosu na većinu trenutno korišćenih fenotipskih metoda, poput testo -va sa oksacilinom (Swenson i sar. 2007). U našem istraživanju je utvrđena pot -puna korelacija između rezultata fenotipske i genotipske identiikacije S. aureus i detekcije rezistencije na cefoksitin. Pérez-Roth i sar. (2002) su takođe utvrdili pot -punu konzistentnost rezultata fenotipskih testova i multipleks PCR u identiikaciji i detekciji rezistencije na oksacilin i mupirocinu.

Genotipska detekcija mecA se koristi kao referentni standard za identiikaci -ju MRSA, kao primarni ili potvrdni test (Chambers, 1997). PCR je od velike koristi u dokazivanju bakterijskih infekcija izazvanih rezistentnim sojevima S. aureus, s obzirom na to da detektuje gen rezistencije, dok se fenotipskim tehnikama doka -zuju rezultati ekspresije gena. Na ekspresiju gena mogu uticati uslovi spoljašnje sredine i uslovi kultivacije bakterija, što može izazvati sumnju u rezultate i isprav -no tumačenje podataka dobijenih prime-nom fe-notipskih metoda. Nedav-no je ot -kriven novi mecA homolog (mecA_LGA251), čije je prisustvo utvrđeno u sojevima S. aureus koji pripadaju klonalnim kompleksima (CC) 130, CC1943 i ST 425, porek -lom od krava (García-Álvarez i sar, 2011). Kod mecALGA251 gena je utvrđeno sve -ga 70% homologije nukleotida sa mecA, a gen se nalazi u novootkrivenom SCC elementu označenom kao SCCmec tip XI. Do sada je utvrđeno da su izolati koji sadrže mecALGA251 rezistentni prema β-laktamskim antibioticima, ali njihovo pris -ustvo nije moguće dokazati standardnim PCR metodom za detekciju mecA ge-na, zahvaljujući različitom sadržaju nukleotida (García-Álvarez i sar, 2011; Shore i sar., 2011). Fenotipski rezistentni (cefoksitin/oksacillin) izolati, kod kojih pomoću PCR nije moguće utvrditi prisustvo mecA gena se nazivaju BORSA (Borderline oxacillin-resistant S. aureus). Otkrićem mecA_LGA251 dobijena je genetska potvrda BORSA MRSA fenotipa.

Primenom hromogene podloge, cefoksitin disk-difuzionog, lateks-aglutina -cionog testa i multipleks PCR testa sa dva seta prajmera dobijeni su identični re -zultati u identiikaciji 5 meticilin rezistentnih od 70 ukupno ispitanih sojeva Staphy­ lococcus aureus. U našim je ispitivanjima kultivacija na hromogenoj podlozi po -kazala visoku selektivnost, što upućuje na mogućnost korišćenja ovih vrsta pod -loga za kultivaciju, posebno pri ispitivanjima većeg broja uzoraka. Cefoksitin disk difuzioni test je, kao preliminarni metod, prikladan za izvođenje u laboratorijama. U istraživanju je korišćena multipleks PCR metoda metoda koja omogućava brzu i istovremenu detekciju i diferencijaciju obe mecA varijante i njhovog Panton-Val

-Diskusija / Discussion

entine leukocidin (PVL) lokusa, koja daje osnovu za tipizaciju, genetsku analizu i grupisanje izolata daljim spa sekvenciranjem. Multipleks PCR metodom je doka -zano da sojevi kod kojih je detektovana rezistencija na meticilin nisu BORSA već MRSA. Povećanje incidencije meticilin rezistentnih sojeva stailokoka postaje sve značajniji problem u humanoj i veterinarskoj medicini. Stoga je pouzdano i rano otkrivanje ove vrste rezistencije od prioritetnog značaja. Pri tome je neophodno kontinuirano praćenje ovog problema, kako bi se na osnovu relevantnih podataka donosile preporuke i programi sa ciljem sprečavanja širenja rezistencije i smanjili njeni postojeći nivoi.

NAPOMENA / ACKNOWLEDGMENT:

Rad je inansiran od strane Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja, R. Srbije, prema Pro -jektu TR 31079.

The work is inanced by the Ministry of Education, Science and Technological Development of the Repulic of Serbia, according

tothe Project TR 31079.

1. Chambers HF. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 781-91.

2. Clinical and Laboratory Standards Institute / NCCLS Performance Standards for Antimicrobial

Susceptibility Testing, 15th informational supplement, M100-S15. Wayne Pa: Clinical and

Laboratory Standards Institute; 2008.

3. de Neeling A, van den Broek M, Spalburg E, van Santen-Verheuvel M, Dam-Deisz W, Boshuizen H, van de Giessen A, van Duijkeren E, Huijsdens X. High prevalence of methicillin resis -tant Staphylococcus aureus in pigs. Vet Microbiol 2007; 122: 366-72.

4. Devriese LA, Van Damme LR, Fameree L. Methicillin (cloxacillin)-resistant Staphylococcus aureus

strains isolated from bovine mastitis cases. Zentralbl Veterinarmed B 1972; 19: 598-605. 5. Felten A, Grandy B, Lagrange PH, Casin I. Evaluation of three techniques for detection of low le vel

methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA): A disk diffusion method with cefox -itin and moxalactam, the Vitek 2 system, and the MRSA-screen latex agglutination test. J Clin Microbiol 2002; 40: 2766-71.

6. García-Álvarez L, Holden MT, Lindsay H, Webb CR, Brown DF, Curran MD, Walpole E, Brooks K, Pickard DJ, Teale C, Parkhill J, Bentley SD, Edwards GF, Girvan EK, Kearns AM, Pichon B, Hill RL, Larsen AR, Skov RL, Peacock SJ, Maskell DJ, Holmes MA. Meticillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the UK and Denmark: a descriptive study. Lancet Infect Dis 2011; 11: 595-603. 7. Graveland H, Wagenaar JA, Broekhuizen-Stins MJ, Oosting-Schothorst I, Schoormans AH, van

Duijkeren E, Huijsdens X, Mevius D, Heederik D. Methicillin-resistant Staphylococcus au­

reus (MRSA) in veal calf farmers and veal calves in the Netherlands. American Society

for Microbiology Conference on Antimicrobial Resistance in Zoonotic Bacteria and Food -borne Pathogens, Copenhagen. 2008: 62-3.

8. Jevons MP. Celbenin-resistant staphylococci. Br Med J 1961; 1: 124-5.

9. Kwon NH, Park KT, Moon JS, Jung WK, Kim SH, Kim JM, Hong SK, Koo HC, Joo YS, Park YH. Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) characterization and molecular analysis for methicillin-resistant Staphylococcus aureus and novel SCCmec subtype IVg

isolated from bovine milk in Korea. J Antimicrob Chemother 2005; 56:624-32.

10. Martineau F, Picard FJ, Lansac N, Ménard C, Roy PH, Ouellette M, Bergeron MG. Correlation be -tween the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic

susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Anti -microb Agents Chemother 2000; 44: 231-8.

11. Persoons D, Van Hoorebeke S, Hermans K, Butaye P, de Kruif A, Haesebrouck F, Dewulf J. Meth -icillin-resistant Staphylococcus aureus in poultry. Emerging Infect Dis 2009; 15: 452-3.

12. Pérez-Roth E, Claverie-Martín F, Batista N, Moreno A, Méndez-Álvares S. Mupirocin resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates in a Spanish hospital. Co-ap -plication of multiplex PCR assay and conventional microbiology methods. Diag Microbiol Infect Dis 2002; 43: 123-8.

13. Poulsen A, Skov R, Pallesen L. Detection of methicillin resistance in coagulase-negative staphy -lococci and in staphy-lococci directly from simulated blood cultures using the EVIGENE MRSA Detection Kit. J Antimicrob Chemotherapy 2003; 51: 419-21.

14. Shore AC, Deasy EC, Slickers P, Brennan G, O’Connell B, Monecke S. Detection of staphylococ -cal cassette chromosome mec type XI carrying highly divergent mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr genes in human clinical isolates of clonal complex 130 methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55: 3765-73.

15. Skov R, Smyth R, Larsen AR, BolmstrÙm A, Karlsson A, Mills K. Phenotypic detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus by disk diffusion testing and etest on Mueller-Hinton agar. J Clin Microbiol 2006; 44: 4395-9.

16. Stegger M, Andersen PS, Kearns A, Pichon B, Holmes MA, Edwards G, Laurent F, Teale C, Skov R, Larsen AR. Rapid detection, differentiation and typing of methicillin-resistant Staphy­

lococcus aureus harbouring either mecA or the new mecA homologue mecA(_LGA251). Clin

Microbiol Infect 2012; 18(4):3 95-400.

17. Swenson JM, Tenover FC; the Cefoxitin Disk Study Group. Results of disk diffusion testing with cefoxitin correlate with presence of mecA in Staphylococcus spp. J Clin Microbiol 2005;

43: 3818-23.

18. Swenson JM, Lonsway D, McAllister S, Thompson A, Jevitt L, Patel JB. Detection of mecA-me -diated Resistance Using Cefoxitin Disk Diffusion (DD) in a Collection of Staphylococcus

aureus Expressing Borderline oxacillin MICs. Diagn Microbiol Infect Dis 2007; 58: 33-9.

19. Tenhagen BA, Köster G, Wallmann J, Heuwieser W. Prevalence of mastitis pathogens and their resistance against antimicrobial agents in dairy cows in Brandenburg, Germany. J Dairy Sci 2006; 89: 2542-51.

20. van Duijkeren E, Jansen MD, Flemming SC, de Neeling H, Wagenaar JA, Schoormans AH, van Nes A, Fluit AC. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pigs with exudative epi -dermitis. Emerging Infect Dis 2007; 13: 1408-10.

21. van Loo I, Huijsdens XW, Tiemersma E, de Neeling AJ, van de Sande-Bruinsma N, Beaujean D, Voss A, Kluytmans J.. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus of ani -mal origin. Emerging Infect Dis 2007; 13: 1834-9.

22. Voss A, Loeffen F, Bakker J, Klaassen C, Wulf M.. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pig farming. Emerging Infect Dis 2005; 11: 1965-6.

23. Walther B, Monecke S, Ruscher C, Friedrich AW, Ehricht R, Slickers P, Soba A, Wleklinski CG, Wieler LH, Lübke-Becker A. Comparative molecular analysis substantiates zoonotic potential of equine methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 2009;

47: 704-10.

24. Weese J, Caldwell F, Willey B, Kreiswirth B, McGeer A, Rousseau J, Low D. An outbreak of meth -icillin-resistant Staphylococcus aureus skin infections resulting from horse to human transmission in a veterinary hospital. Vet Microbiol 2006; 114: 160-4.

25. Witte W, Strommenger B, Stanek C, Cuny C. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 in

humans and animals, central Europe. Emerging Infect Dis 2007; 13: 255-8.

27. Žutić M, Ćirković I, Pavlović Lj, Ašanin J, Jovanović S, Žutić j, Ašanin R. First isolation methicil -lin-resistant Staphylococcus aureus from pigs clinical samples in Serbia. Acta Vet Brno

2012a; 81: 225-7.

28. Žutić M, Ćirković I, Pavlović Lj, Žutić J, Ašanin J, Radanović O, Pavlović N. Occurrence of methi -cillin-resistant Staphylococcus aureus in milksamples from Serbian cows withsubclinical

mastitis. African J Microbiol Res 2012b; 6: 5887-89.

METHODS OF DETECTION AND TYPING OF METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATED FROM ANIMALS

Radosavljević V., Žutić Jadranka, Pavlović Ljiljana, Bošković Tamara, Radanović O., Žutić M.

In this work there was evaluated the method of detection of methicillin resistant

Staphylococcus aureus (MRSA) by using two molecular and three phenotypic tests in in

-vestigation procedure of 70 strains of S.aureus isolated from animals. Recent indings of

the new mecA homologue, mecA_LGA251,minimise the signiicance of mecA gene presence

detection as a conirmation method of methicillin resistant Staphylococcus aureus identii

-cation. For this reason, along with multiplex PCR set of primers(165rDNK, nuc, mecA) for detection mecA gene, there was also used multiplex PCR set of primers (spa, mecA, pvl,

mecALGA251) for differentiation mecALGA251 from mecA, with simultaneous detection of luk-PV

and spa gene fragments. In all 70 investigated isolates there was detected the presence

of speciic 16 SrDNK fragment and nuc gene which encodes a thermostable S. aureus

nu-clease, while in 5 out of 70 S. aureus isolates, there was proven mecA gene presence us

-ing two multiplex PCR tests. In the investigated strains there was determined neither mecC

(mecALGA251)gene presence, nor Panton Valentine Leukocidin encoding gene. By applica -tion cefoxitin disk-diffusion, latex-agglutina-tion and two multiplex PCR tests, the identical results in identiication 5 methicillin resistant out of 70 investigated S. aureus strains were

obtained. In our investigation there was determined a complete correlation between the re

-sults of phenotypic and genotypic identiication of methicillin resistant S. aureus.

Key words: Staphylococcus aureus, MRSA, cefoxitin, multiplex PCR, mecA_LGA251

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ТИПИЗАЦИИ МЕТИЦИЛЛИН-РЕЗИСТЕНТНЫХ

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ВЫДЕЛЕНЫХ ИЗ ЖИВОТНЫХ

В. Радосавлевич, Ядранка Жутич, Лиляна Павлович, Тамара Бошкович, О. Раданович, М. Жутич

В этой статье мы оценили метод обнаружения метициллин-резистентного Staph­ ylococcus aureus (MRSA) употребляя два молекуларных и три фенотипических тестов,

оценивая 70 штаммов S. aureus выделеных из животных.Последние результаты но

-ENGLISH

вого mecA гомолога, mecA_LGA2514 уменьшают важность доказать наличие mecA гена,

как подтверждающего метода в выявлении метициллин-устойчивого Staphylococus aureus. По этой причине, в дополнение к нескольким наборам PCR-праймеров для

обнаружения mecA генов, использовали и детали мультиплексного PCR набора прай

-меров (spa, mecA, pvl, mecALGA2514) с дифференциациeй mecALGA2514 от mecA путем об -наружения lukF-PV и фрагментов гена SPA. У всех 70 исследованных штаммов был

обнаружен конкретный фрагмент 16 S rDNK и nuc ген, кодирующий термостабиль

-ную нуклеазу Staphylococus aureus, а в 5 из 70 изолятов Staphylococus aureus с по

-мощью двух мультиплекс PCR-анализ обнаружен ген mecA. В тестируемых штаммах

не обнаружены mecC ген и Пантон-Валентайналейкоцидин кодирующий ген. С помо

-щью диск-дифузного Cefoxitin-a, латекс аглютационного и два мультиплексных PCR

анализов, получены идентичны результаты в идентификации пяти метициллин-рези

-стентных из 70 обследованных штаммов Staphylococus aureus. В нашем исследова

-нии обнаружена абсолютная корреляция между результатами фенотипической и ге

-нотипической идентификации метициллин-устойчивого Staphylococus aureus.

Ключeвые слова: Staphylococus aureus, MRSA, Cefoxitin, мультиплекс PCR,