Lílian Nogueira
Estudo comparativo do estresse oxidativo entre tilápias (
Oreochromis
niloticus
) e cascudos (
Pterygoplichthys anisitsi
) expostos a óleo
diesel e a biodiesel.
Lílian Nogueira
Estudo comparativo do estresse oxidativo entre tilápias (
Oreochromis
niloticus
) e cascudos (
Pterygoplichthys anisitsi
) expostos a óleo
diesel e a biodiesel.
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de São José do Rio Preto.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Alves de Almeida
Nogueira, Lílian.
Estudo comparativo do estresse oxidativo em tilápias (Oreochromis niloticus) e cascudos (Pterygoplichthys anisitsi) expostos a óleo diesel e
a biodiesel / Lílian Nogueira. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2011. 81 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Eduardo Alves de Almeida
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Ecologia animal. 2. Peixes – Efeito da poluição da água. 3. Água – Poluição. 4. Biodiesel – Toxicologia. 5. Combustíveis Diesel - Toxicologia. I. Almeida, Eduardo Alves de. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.
CDU – 597:504.054
Lílian Nogueira
Estudo comparativo do estresse oxidativo entre tilápias (
Oreochromis
niloticus
) e cascudos (
Pterygoplichthys anisitsi
) expostos a óleo
diesel e a biodiesel.
Dissertação apresentada para obtenção do tí-tulo de Mestre em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de São José do Rio Preto.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Eduardo Alves de Almeida
UNESP - São José do Rio Preto, SP
Orientador
Prof. Dr. José Maria Monserrat
Universidade Federal do Rio Grande, FURG - Rio Grande, RS
Prof. Dr. Camilo Dias Seabra Pereira
Universidade Santa Cecília, UNISANTA - Santos, SP
Dedicatória
Dedico esta dissertação a minha mãe Eloiza Nogueira,
a meus avós Hilda Martins Nogueira e Antonio Nogueira
e ao meu irmão João Alberto Saldanha Jr.
Se cheguei até aqui, foi graças ao apoio e carinho
que vocês sempre me oferecem!
A todos meus amigos, em especial, à Karen Midori Nemoto
pela paciência e pela irmã que se tornou nestes dois últimos anos!
Dedico, também, ao meu namorado Thiago Yukio Kikuchi Oliveira que,
mesmo à distância, me apoia nos momentos mais difíceis.
Agradecimentos
Dedico meus sinceros agradecimentos para:
– o Professor Doutor Eduardo Alves de Almeida. Sou imensamente grata por acreditar em mim e ter me orientado desde minha Iniciação Científica com tamanha paciência e amizade, sempre me incentivando a seguir em frente nas horas de alegrias e descobertas e principalmente nas horas de cansaço!
– a todos os amigos da equipe do Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquá-tica pela amizade, pelas risadas e por toda ajuda prestada em todos os momentos (sem vocês este trabalho seria impossível e menos divertido!), todos vocês contribuíram com alguma parte essencial do meu mestrado, até mesmo com um sorriso nas horas de desânimo!
– o meu namorado Thiago Yukio Kikuchi Oliveira pela ajuda com a metodologia deste e outros tantos trabalhos durante a minha vida acadêmica;
– a Divisão de Biodiesel do Grupo JBS-Friboi por ter nos fornecido o biodiesel;
– o Centro de Aquicultura da UNESP de Jaboticabal (CAUNESP) por ter nos cedido os espécimes de cascudo marrom;
Resumo
Atualmente, combustíveis fósseis como o óleo diesel estão sendo gradualmente substituí-dos pelo biodiesel, uma fonte de energia renovável, mais barata e menos poluente. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos tóxicos desta nova fonte de energia e se é mais ou menos pre-judicial do que o diesel derivado do petróleo sobre os organismos aquáticos. No Brasil, desde janeiro de 2010, o biodiesel B5 está sendo obrigatoriamente utilizado como combustível e na composição de óleos lubrificantes no lugar do petrodiesel. Sendo assim, este trabalho analisou comparativamente as respostas bioquímicas que desencadeiam o estresse oxidativo e suas con-sequências, entre duas espécies de peixes, a tilápia do Nilo,Oreochromis niloticus, e o cascudo marrom, Pterygoplichthys anisitsi, após a exposição ao óleo diesel e ao biodiesel. Para isso os animais foram submetidos à exposição ao óleo diesel, biodiesel B5, B20 e B100 nas concentra-ções de 0,01 e 0,1 mL/L por dois e sete dias. Em seguida, amostras de fígado e brânquias foram retiradas para as análises da 7-etóxi-resorufina-O-deetilase (EROD), glutationa-S-transferase (GST), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e níveis de malondialdeído (MDA). ParaO. niloticus, na maioria das análises, o biodiesel B5 demonstrou ser a mistura que mais alterou a atividade das enzimas e aumentou a peroxidação lipídica e a mistura B20 foi menos prejudicial, pois alterou apenas a atividade da catalase e a atividade da EROD de forma mais discreta que os outros tratamentos. Já com P. anisitsi, as misturas B5 e B20 alteraram a maioria das enzimas testadas, e em alguns casos induziu mais a atividade enzimática que o óleo diesel. Contudo, o sistema antioxidante dos cascudos foi mais eficiente no combate às EROs, visto que apresentou apenas pequena peroxidação nas brânquias gerada pela exposição ao B20 e ao B100. Considerando as espécies, o tempo de exposição e as con-centrações testadas, o biodiesel de sebo animal e suas misturas demonstraram provocar estresse oxidativo e alterações enzimáticas emO. niloticuseP. anisitsitanto quanto o diesel puro. Por-tanto, embora seja um combustível mais biodegradável, que emite menos gases de efeito estufa, os resultados deste estudo mostram que o biodiesel e suas misturas também apresentam riscos para a biota aquática.
Palavras-chaves: óleo diesel, biodiesel,Oreochromis niloticus, Pterygoplichthys anisitsi,
Abstract
Currently, fossil fuels such as diesel are being gradually replaced by biodiesel, a renewa-ble energy source, cheaper and less polluting. However, little is known about the toxic effects of this new energy source and whether it is more or less harmful than petroleum-derived die-sel on aquatic organisms. In Brazil, since January 2010, B5 biodiedie-sel is mandatorily used as fuel and in the composition of lubricating oils instead of diesel oil. Thus, this study compared the biochemical responses that trigger oxidative stress and its consequences among two spe-cies of fish, the Nile tilapia, Oreochromis niloticus, and the armored catfish,Pterygoplichthys anisitsi after exposure to diesel oil and biodiesel. Fish were exposed to diesel fuel, biodiesel, B5, B20 and B100 at concentrations of 0.01 and 0.1 mL/L for two and seven days. Then, samples of liver and gills were removed for analysis of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD), glutathione-S-transferases (GST), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione pe-roxidases (GPx) and malondialdehyde (MDA). ForO. niloticus, in most of the analysis, B5 was the compound that most affected the activity of enzymes and increased lipid peroxidation, and B20 blend was less harmful, since it changed only the catalase activity and EROD. In the case of P. anisitsi, B5 and B20 blends changed most of the enzymes tested, and in some cases induced a higher enzyme activity than the diesel. However, the antioxidant system of the armored catfish was more effective in combating the ROS, since they presented only a small gills peroxidation generated by exposure to B20 and B100. Taking into account the fish species, exposure period and concentrations tested, biodiesel from animal tallow and its blends with diesel oil generated oxidative stress and enzymatic changes in O. niloticusand P. anisitsi as much as pure diesel. Therefore, even being a more biodegradable fuel that emits less greenhouse gases, the results of this study showed that biodiesel and its blends also present hazards to aquatic biota.
Key-words: diesel oil, biodiesel, Oreochromis niloticus, Pterygoplichthys anisitsi,
Sumário
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de abreviaturas e siglas
1 Introdução p. 17
1.1 Combustíveis fósseis, biodiesel e poluição aquática . . . p. 17
1.2 Biomarcadores de contaminação . . . p. 18
1.3 Estresse oxidativo . . . p. 19
1.4 Fases do metabolismo de destoxificação . . . p. 20
1.4.1 Fase I . . . p. 20 1.4.1.1 Citocromo P450 . . . p. 21
1.4.1.2 7-etoxirresorufina-0-deetilase (EROD) . . . p. 22
1.4.2 Fase II . . . p. 23
1.4.2.1 Glutationa S-transferase (GST) . . . p. 23
1.4.2.2 Superóxido dismutase (SOD) . . . p. 23
1.4.2.3 Catalase (CAT) . . . p. 24
1.4.2.4 Glutationa peroxidase (GPx) . . . p. 24 1.5 Espécies de peixes para estudos de Ecotoxicologia . . . p. 25
2 Objetivos p. 27
3.1 Organismos testes . . . p. 28
3.2 Protocolo de exposição dos organismos testes ao diesel e biodiesel . . . p. 28 3.3 Preparo das misturas de biodiesel . . . p. 29
3.4 Descarte de resíduos tóxicos e de água contaminada . . . p. 29
3.5 Análises bioquímicas . . . p. 30
3.5.1 Preparo das amostras para análise das enzimas EROD, GST, SOD,
CAT e GPx . . . p. 30
3.5.2 7-etoxirresorufina-0-deetilase (EROD) . . . p. 30
3.5.3 GlutationaS-transferase (GST) . . . p. 30
3.5.4 Superóxido dismutase (SOD) . . . p. 31
3.5.5 Catalase (CAT) . . . p. 31
3.5.6 Glutationa peroxidase (GPx) . . . p. 31 3.5.7 Análise de proteínas . . . p. 31
3.5.8 Peroxidação lipídica . . . p. 31
3.6 Análise estatística . . . p. 32
4 Resultados p. 33
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel . . . p. 33
4.1.1 EROD . . . p. 33
4.1.2 Glutationa-S-Transferase . . . p. 36 4.1.2.1 Fígado . . . p. 36
4.1.2.2 Brânquias . . . p. 38
4.1.3 Superóxido dismutase . . . p. 40
4.1.3.1 Fígado . . . p. 40
4.1.3.2 Brânquias . . . p. 42
4.1.4 Catalase . . . p. 44
4.1.4.2 Brânquias . . . p. 45
4.1.5 Glutationa peroxidase . . . p. 47 4.1.5.1 Fígado . . . p. 47
4.1.5.2 Brânquias . . . p. 49
4.1.6 Peroxidação lipídica . . . p. 51
4.1.6.1 Fígado . . . p. 51
4.1.6.2 Brânquias . . . p. 52
5 Discussão p. 55
6 Conclusões p. 64
Referências p. 66
Apêndice A -- Testes de normalidade e homogeneidade das variâncias p. 70
Apêndice B -- Resultados gerados pelo testepost-hocde Fischer e de comparação
múltipla das médias p. 74
Lista de Figuras
1 Esquema simplificado de sistemas oxidativos e antioxidantes dentro de uma
célula. . . p. 19
2 Esquema simplificado das fases do metabolismo de destoxificação. . . p. 21
3 Ciclo catalítico do citocromo P450. . . p. 22
4 Reação mostrando atividade do citocromo P450 sobre a 7-etoxirresorufina.
Adaptado de Whyte et al. (2000). . . p. 22
5 Reação de substituição catalisada pela GST no substrato CDNB. . . p. 23
6 Esquema mostrando a atividade antioxidante da GPx sobre o peróxido de
hidrogênio. . . p. 25
7 Espécies utilizadas nos experimentos. . . p. 28
8 Gráfico da atividade da EROD em fígado deO. niloticus. . . p. 35
9 Gráfico da atividade da GST em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 37 10 Gráfico da atividade de GST em brânquia deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 39
11 Gráfico da atividade da SOD em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 41
12 Gráfico da atividade da SOD nas brânquias deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 43
13 Gráfico da atividade da catalase em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 45
14 Gráfico da atividade da catalase em brânquias deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 46
15 Gráfico da atividade da GPx em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 48
16 Gráfico da atividade da GPx em brânquia deO. niloticuseP. anisitsi. . . p. 50 17 Gráfico da concentração de MDA em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. . . . p. 52
Lista de Tabelas
1 Análise de variância da atividade enzimática da EROD deO. niloticus e P.
anisitsipara cada período de exposição. . . p. 33 2 Análise de variância da atividade enzimática da GST em fígado deO.
niloti-cuseP. anisitsipara cada período de exposição. . . p. 36 3 Análise de variância da atividade enzimática da GST nas brânquias de O.
niloticuseP. anisitsi. . . p. 38 4 Análise de variância da atividade enzimática da SOD no fígado deO.
niloti-cuseP. anisitsi. . . p. 40 5 Análise de variância da atividade enzimática da catalase no fígado deO.
ni-loticuseP. anisitsi. . . p. 44 6 Análise de variância da atividade enzimática da catalase nas brânquias deO.
niloticuseP. anisitsi. . . p. 46 7 Análise de variância da atividade enzimática da GPx nas brânquias de O.
niloticuseP. anisitsi. . . p. 49 8 Análise de variância da atividade enzimática da catalase nas brânquias deO.
niloticuseP. anisitsi. . . p. 53 9 Teste de homogeneidade das variâncias dos dados para os tratamentos de um
mesmo período de exposição deO. niloticus. . . p. 70
10 Teste de homogeneidade das variâncias dos dados para os tratamentos de um
mesmo período de exposição deP. anisitsi. . . p. 71
11 Teste de normalidade dos dados da atividade enzimática ou concentração
en-tre os dois períodos de exposição do mesmo tratamento paraO. niloticus. . . p. 72
12 Teste de normalidade dos dados da atividade enzimática ou concentração
13 Teste de homogeneidade das variâncias dos dados da atividade enzimática ou concentração emO. niloticusentre os dois períodos de exposição do mesmo
tratamento. . . p. 73
14 Teste de homogeneidade das variâncias dos dados da atividade enzimática ou concentração emP. anisitsi entre os dois períodos de exposição do mesmo
tratamento. . . p. 73 15 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade de EROD emO. niloticusentre os tratamentos de
dois dias exposição. . . p. 74
16 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade de EROD emO. niloticusentre os tratamentos de
sete dias exposição. . . p. 74
17 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade de EROD em P. anisitsi entre os tratamentos de
dois dias exposição. . . p. 74 18 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade de EROD em P. anisitsi entre os tratamentos de
sete dias exposição. . . p. 75
19 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade de GST hepática emO. niloticusentre os
tratamen-tos de sete dias exposição. . . p. 75
20 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da GST hepática emP. anisitsientre os tratamentos
de dois dias exposição. . . p. 75 21 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade de GST hepática emP. anisitsientre os tratamentos
de sete dias exposição. . . p. 75
22 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da GST nas brânquias deO. niloticusentre os
23 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da GST em brânquias deO. niloticusentre os
tra-tamentos de sete dias exposição. . . p. 76
24 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da GST em brânquias deP. anisitsientre os
trata-mentos de dois dias exposição. . . p. 76 25 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade da GST em brânquias deP. anisitsientre os
trata-mentos de sete dias exposição. . . p. 76
26 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da SOD em fígado de O. niloticusentre os
trata-mentos de dois dias exposição. . . p. 77
27 Matriz gerada pelo testepost-hocde comparação múltipla das médias, indi-cando todas as diferenças significativas da atividade da SOD em fígado deP.
anisitsientre os tratamentos de dois dias exposição. . . p. 77 28 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade da SOD em fígado deP. anisitsientre os
tratamen-tos de sete dias exposição. . . p. 77
29 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da SOD em brânquias deP. anisitsientre os
trata-mentos de dois dias exposição. . . p. 77
30 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da SOD em brânquias deP. anisitsientre os
trata-mentos de sete dias exposição. . . p. 78 31 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade de catalase em fígado deO.niloticusentre os
trata-mentos de sete dias exposição. . . p. 78
32 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da catalase em fígado deP. anisitsientre os
33 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da catalase em fígado deP. anisitsientre os
trata-mentos de sete dias exposição. . . p. 78
34 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da atividade da GPx em fígado deO. niloticus entre os
trata-mentos de sete dias exposição. . . p. 79 35 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade da GPx em fígado deP. anisitsientre os
tratamen-tos de dois dias exposição. . . p. 79
36 Matriz gerada pelo testepost-hocde comparação múltipla das médias, indi-cando todas as diferenças significativas da atividade da GPx em fígado deP.
anisitsientre os tratamentos de sete dias exposição. . . p. 79 37 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da atividade da GPx em brânquias deO. niloticusentre os
tra-tamentos de sete dias exposição. . . p. 79 38 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da concentração de MDA em fígado de O. niloticus entre os
tratamentos de sete dias exposição. . . p. 80
39 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da concentração de MDA em brânquias deO. niloticusentre os
tratamentos de dois dias exposição. . . p. 80
40 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças significativas da concentração de MDA em brânquias deO. niloticusentre os
tratamentos de sete dias exposição. . . p. 80 41 Matriz gerada pelo teste post-hocde Fischer, indicando todas as diferenças
significativas da concentração de MDA em brânquias de P. anisitsi entre os
Lista de abreviaturas e siglas
β - NF β- naftoflavona
AhR Receptor aril hidrocarboneto
B100 Combustível 100% biodiesel
B20 Combustível com 80% de óleo diesel e 20% de biodiesel
B5 Combustível com 95% de óleo diesel e 5% de biodiesel
CAT Catalase
CDNB 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
cit P450 Citocromo P450
CYP1A Isoforma 1A do citocromo P450
EROD 7-etoxirresorufina-0-deetilase
EROs Espécies reativas de oxigênio
F Valor retornado pelo teste ANOVA e de Levene
gl Graus de liberdade
GPx Glutationa peroxidase
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa
GSSG Glutationa dissulfeto
GST Glutationa S-transferase
H Valor retornado pelo teste de Kruskal-Wallis
HPA Hidrocarboneto policíclico aromático
HPLC High performance liquid chromatography
MDA Malondialdeído
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
nmol/mg de tecido nanomol/ miligrama de tecido
p Valor de probabilidade do teste de hipótese
pmol/min/mg de proteína picomol/minuto/miligrama de proteína
TBA Ácido tiobarbitúrico
U/mg de proteína Unidade/miligrama de proteína UV/ Vis Ultra-violeta/ luz visível
17
1
Introdução
1.1
Combustíveis fósseis, biodiesel e poluição aquática
O ambiente é continuamente preenchido por compostos químicos artificiais produzidos e liberados por comunidades urbanas e indústrias. Nos últimos sessenta anos, temos sido aler-tados sobre os potenciais riscos e efeitos adversos a longo prazo que essas substâncias podem provocar a todos nossos ecossistemas (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Ge-ralmente, os ambientes aquáticos são o destino final dos contaminantes de origem antrópica e grande parte dessas substâncias são potencialmente genotóxicas ou carcinógenas (JHA, 2004).
Entre os diferentes tipos de poluentes, o petróleo e seus derivados são os produtos mais toxi-cologicamente relevantes em relação ao meio aquático (PACHECO; SANTOS, 2001). Estima-se que as fontes de contaminação de águas continentais estejam relacionadas a vazamentos de produtos como o óleo diesel, provenientes de tanques subterrâneos de armazenamento e de du-tos de transporte, que acabam atingindo rios e outras vias aquáticas (SIMONATO; ALBINATI; MARTINEZ, 2006). Assim, a poluição originada por tais vazamentos nestes ecossistemas pode resultar na deposição de grandes quantidades de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) (HAMOUTEN et al., 2002), conhecidos por seus efeitos carcinogênicos (PACHECO; SANTOS, 2001).
Segundo Vieira et al. (2007), o óleo diesel é uma mistura complexa que consiste basica-mente em hidrocarbonetos olefínicos, parafínicos e aromáticos. A dispersão na água da fração insolúvel do óleo diesel causa danos diretos aos peixes, visto que fazem contato com suas su-perfícies corpóreas e brânquias (PACHECO; SANTOS, 2001). Já a fração solúvel em água, composta por muitos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, está relacionada a efeitos ge-notóxicos que levam a formação de neoplasias em fígado de peixes bentônicos (BAUMANN, 1998), e a efeitos toxicológicos, como por exemplo, alteração nos níveis plasmáticos de cortisol (PACHECO; SANTOS, 2001) e ao estresse oxidativo (ACHUBA; OSAKWE, 2003; VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003; ZHANG et al., 2004).
1.2 Biomarcadores de contaminação 18
biodiesel, que é uma mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos derivados de gordura animal e óleos vegetais. O biodiesel é utilizado em soluções de B2 (2% de biodiesel com 98% de óleo diesel) até B100 (100% biodiesel, sem adição de combustível fóssil), sendo que quase todo o motor a diesel pode ser executado em B2 até B20 com características de desempenho comparáveis ao diesel 100% fóssil.
Pesquisas demonstram que o biodiesel é mais biodegradável (PASQUALINO; MONTANÉ; SALVADÓ, 2006; PRINCE; HAITMANEK; LEE, 2008) e produz menos gases de efeito es-tufa que o óleo combustível derivado de petróleo (LEE; HERAGE; YOUNG, 2004; BALAT; BALAT, 2010). Contudo, apenas um estudo foi realizado para verificar os efeitos tóxicos dessa substância em organismos aquáticos, no qual foi observado que esse composto e suas misturas com óleo diesel apresentam menor toxicidade aguda em microcrustáceos (Daphnia magna) e alevinos de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) que o petrodiesel (KHAN; WARITH; LUK, 2007). Assim, pouco se sabe sobre os efeitos toxicológicos, tais como estresse oxidativo, cau-sado pelo biodiesel e suas misturas em ambientes aquáticos.
No Brasil, desde primeiro de janeiro de 2010, passou a ser obrigatório o uso do B5 em todo óleo diesel consumido (MINISTÉRIO DE MINAS E ENERGIA, 2010). Já utilização de biodi-esel puro e de suas misturas com óleo dibiodi-esel em teores diversos do autorizado pela legislação vigente, de acordo com a Resolução ANP nº2, de 29 de janeiro de 2008, fica restrito ao uso es-pecífico, ou seja, a utilização em caráter experimental em frota cativa ou equipamento industrial locado em seu estabelecimento (AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E BIOCOMBUSTÍVEIS, 2008). Dessa forma, estudos são necessários para se conhecer o im-pacto que esses novos compostos podem ter sobre o ambiente aquático.
1.2
Biomarcadores de contaminação
Biomarcador de contaminação é qualquer resposta biológica a um poluente ambiental me-dida nos fluídos e tecidos corpóreos de um organismo ou em seus produtos, como fezes e urina (GESTEL; BRUMMELEN, 1996). Os biomarcadores são ferramentas capazes de detectar as primeiras mudanças nas respostas biológicas na fase inicial da contaminação ambiental (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003), podendo ajudar na adoção de medidas para evitar que a poluição chegue a níveis irreversíveis.
siste-1.3 Estresse oxidativo 19
mas de defesa antioxidantes, são bastante utilizados como biomarcadores de contaminação.
1.3
Estresse oxidativo
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são formadas e degradadas por organismos aeró-bios, e são encontradas em concentrações fisiológicas dentro das células para um funcionamento normal (NORDBERG; ARNER, 2001). O estresse oxidativo irá ocorrer quando a taxa de pro-dução dessas espécies reativas de oxigênio excede a taxa de sua decomposição por sistemas an-tioxidantes, levando a um aumento do dano oxidativo em diferentes alvos celulares (ALMEIDA et al., 2005). As EROs podem reagir rapidamente com a maioria das biomoléculas, iniciando uma cadeia de formação de radicais livres. Para que essa reação em cadeia seja finalizada, o radical livre deve reagir com outro radical livre, eliminando os elétrons desemparelhados, ou ainda, reagir com um composto antioxidante (NORDBERG; ARNER, 2001).
A redução do oxigênio molecular via transferência de um elétron que dá origem a várias espécies reativas de oxigênio é resumida pela Equação 1.1.
O2 −→e− O·−
2 e−
−−→
H+
H2O2 −→e− .OH + OH−−e−−→
H+
2 H2O (1.1)
As três principais formas de EROs são o radical ânion superóxido (O.−
2 ), o peróxido de
hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (.OH). O metabolismo e vias de formação desses
com-postos encontram-se resumidos na Figura 1.
Figura 1:Esquema simplificado de sistemas oxidativos e antioxidantes dentro de uma célula. Ânion superóxido
é produzido em quantidades significativas no citosol por mono-oxigenases, Fe2+ou Cu+ e na mitocôndria pelo
1.4 Fases do metabolismo de destoxificação 20
As EROs são, devido a sua alta reatividade, potencialmente tóxicas, mutagênicas e carci-nogênicas (NORDBERG; ARNER, 2001). Elas podem reagir com diferentes alvos celulares originando lesões oxidativas às macromoléculas (ALMEIDA et al., 2003), como o DNA, lipí-deos e proteínas. No caso do DNA, podem promover sua fragmentação, oxidação de purinas, tendo efeito mutagênico (MARNETT, 2000). Também são responsáveis pela peroxidação li-pídica em ácidos graxos, o que promove a destruição de biomembranas (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
A peroxidação lipídica ou lipoperoxidação é a oxidação de ácidos graxos poli-insaturados, sendo uma importante consequência do estresse oxidativo causada pelas espécies reativas de oxigênio (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). O metabolismo microssomal de hidrocarbonetos aromáticos pode dar origem a radicais capazes de oxidar membranas biológi-cas, como já foi observado em peixes expostos ao sedimento contaminado por tais compostos (COSSU et al., 1997). As reações geradas pela peroxidação lipídica resulta em uma série de compostos como cetonas e aldeídos, dentro dos quais o malondialdeído (MDA) tem sido usado como indicativo de estresse oxidativo (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
As vias de biotransformação de compostos químicos, que acabam por gerar espécies reati-vas de oxigênio, e os sistemas antioxidantes capazes de combater esses radicais fazem parte do metabolismo de destoxificação dos organismos.
1.4
Fases do metabolismo de destoxificação
O metabolismo de destoxificação de compostos químicos possui três fases: na primeira irá ocorrer reações de oxidação, redução ou hidrólise, na segunda acontecem as reações de conju-gação e na terceira há a excreção dos metabólitos (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003) (Figura 2).
1.4.1
Fase I
Segundo Van der Oost, Beyer e Vermeulen (2003) a primeira fase do metabolismo expõe ou adiciona grupos funcionais reativos através de reações de oxidação, redução ou hidrólise. Dessa forma, a característica mais importante dessa fase é transformar compostos lipofílicos em produtos mais solúveis em água, facilitando a excreção destes metabólitos. Além disso, para a maioria dos compostos químicos as reações dessa fase são catalisadas por enzimas mono-oxigenases microssomais, como o citocromo P450 (cit P450), citocromo b5 e NADPH
1.4 Fases do metabolismo de destoxificação 21
Figura 2:Esquema simplificado das fases do metabolismo de destoxificação. Quando as reações não estão bem acopladas, pode-se gerar EROs. Enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) presentes nas células impedem que as EROs provoquem lesões em macromoléculas.
1.4.1.1 Citocromo P450
As reações da fase I são catalisadas por uma família de enzimas mono-oxigenases, os ci-tocromos P450, que são hemeproteínas ligadas à membrana, localizadas predominantemente no retículo endoplasmático de células hepáticas (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Essa família de enzimas está envolvida com o metabolismo oxidativo de uma grande quantidade de substratos, como drogas e outras substâncias químicas, além de compostos endó-genos como esteroides, hormônios, ácidos graxos e prostaglandinas. Entretanto, alguns inter-mediários desse metabolismo são altamente reativos e podem interagir com muitas biomolécu-las (SARASQUETE; SEGNER, 2000).
A fase I da biotransformação de compostos químicos via sistema mono-oxigenases mi-crossomais segue um ciclo de reações (Figura 3). Tal ciclo é um mecanismo para garantir a transferência de elétrons para o cit P450, porém esta cadeia de reações também é responsá-vel pela formação de EROs, quando há um excesso de substrato disponíresponsá-vel para oxigenação (MUNRO; GIRVAN; MCLEAN, 2007).
1.4 Fases do metabolismo de destoxificação 22
Figura 3: Ciclo catalítico do citocromo P450. O elemento Fe representa o átomo de ferro presente no grupo
heme do P450. Em primeiro lugar, o substrato (RH) se liga ao sítio ativo da enzima. Em seguida, o ferro presente na porção heme é reduzido pela transferência de um elétron da flavoproteína NADPH citocromo P450 redutase. Depois, o O2é ligado. Neste ponto, o ciclo pode continuar ou ser interrompido, resultando na liberação de um
ânion superóxido. O próximo passo envolve a transferência de um segundo elétron via citocromo b5, seguida
pela quebra da ligação da molécula de O2, podendo haver liberação de peróxido de hidrogênio. Logo após, há
a formação de um substrato-radical, seguida pela hidroxilação desse radical e consequente liberação do produto (ROH). Adaptado de Munro, Girvan e McLean (2007).
1.4.1.2 7-etoxirresorufina-0-deetilase (EROD)
Para se verificar a atividade catalítica da isoforma CYP1A, utiliza-se a análise da 7-etoxirresorufina-0-deetilase (EROD). Esta análise é um método cinético que mede a0-desalquilação do substrato
não fluorescente 7-etoxirresorufina em um produto fluorescente, a resorufina (SARASQUETE; SEGNER, 2000) (Figura 4).
Figura 4:Reação mostrando atividade do citocromo P450 sobre a 7-etoxirresorufina. Adaptado de Whyte et al. (2000).
1.4 Fases do metabolismo de destoxificação 23
1.4.2
Fase II
O metabolismo da fase II envolve a adição de um ligante endógeno, geralmente um grupo polar, ao composto químico parental ou a seus metabólitos, para facilitar sua excreção (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). As glutationa S-transferases apresentam esse tipo de função. No caso das enzimas antioxidantes, tais como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx) formam um sistema de defesa que tende a diminuir a concentração de oxirradicais. Tais enzimas são importantes na conversão de radicais reativos em moléculas não reativas (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
1.4.2.1 Glutationa S-transferase (GST)
As glutationa S-transferases são um grupo de enzimas da fase II que catalisam a reação de conjugação da glutationa (GSH) com uma variedade de compostos eletrofílicos, envolvendo a destoxificação de intermediários reativos e de radicais oxigênio. A maioria dos estudos que determinam a atividade de GST total utilizam o substrato artificial 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) por ser substrato para a maioria das isoformas de GSTs (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003) (Figura 5).
Análises em peixes expostos ao óleo diesel (ZHANG et al., 2004; SIMONATO; ALBI-NATI; MARTINEZ, 2006; SIMONATO; GUEDES; MARTINEZ, 2008) demonstram o au-mento significativo da atividade da GST hepática. Tais achados reforçam que a atividade da GST pode ser usada como um bom biomarcador de contaminação por derivados de petróleo (SIMONATO; GUEDES; MARTINEZ, 2008).
Figura 5: Reação de substituição catalisada pela GST no substrato CDNB. Notem que a GSH é introduzida na posição 1 no lugar do Cl, dando origem a um conjugado de glutationa.
1.4.2.2 Superóxido dismutase (SOD)
As SODs são um grupo de metaloenzimas que catalisam a transformação de radicais su-peróxido (O.−
1.4 Fases do metabolismo de destoxificação 24
eucarióticas, o radical superóxido pode ser metabolizado na mitocôndria pela SOD dependente de Mn (Mn-SOD) e no citosol pela SOD dependente de Cu ou Zn (Cu/Zn-SOD) (Figura 1) (NORDBERG; ARNER, 2001).
2 O·−
2 + 2 H + −→
H2O2+ O2 (1.2)
Zhang et al. (2004) mostraram que, em peixes da espécieCarassius auratusexpostos à 0,05 e 0,1 mL/L de óleo diesel, a atividade da SOD aumentou após dois dias de tratamento. Segundo esses pesquisadores, a elevação na atividade dessa enzima indicou um aumento na concentração de O.−
2 devido à presença do contaminante.
1.4.2.3 Catalase (CAT)
As CATs são heme-enzimas (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003) encontra-das dentro de peroxissomos e promovem a redução do H2O2 em H2O mais O2 (Equação 1.3)
(ZHANG et al., 2004).
2 H2O2 −→ O2+ 2 H2O (1.3)
A vantagem da função antioxidante da catalase é que a eliminação do H2O2 impossibilita a
formação do radical hidroxil, como acontece na reação de Fenton (Equação 1.4) produzida por metais de transição, que podem estar presentes em proteínas como a ferritina (NORDBERG; ARNER, 2001).
2 H2O2+ Cu+/Fe2+ −→ .OH + OH−+ Cu2+/Fe3+ (1.4)
1.4.2.4 Glutationa peroxidase (GPx)
A GPx catalisa a redução de peróxido lipídicos e de hidrogênio (ZHANG et al., 2004). Todas as isoformas utilizam a glutationa como doadora de elétrons, transformando os peróxidos orgânicos em álcoois (Equação 1.5) (NORDBERG; ARNER, 2001).
ROOH + 2 GSH−→ROH + GSSG + H2O (1.5)
1.5 Espécies de peixes para estudos de Ecotoxicologia 25
redutase (GR), que utiliza os elétrons do NADPH (Figura 6) (NORDBERG; ARNER, 2001; VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
Figura 6: Esquema mostrando a atividade antioxidante da GPx sobre o peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é reduzido pela GPx através da oxidação de duas moléculas de GSH formando GSSG. Em seguida, a GSSG pode voltar ao estado reduzido sob ação da GR sob o consumo de NADPH. Adaptado de Nordberg e Arner (2001)
A GPx é uma enzima que possui um papel muito importante dentro do sistema antioxi-dante, visto que previne danos às biomembranas relacionados à peroxidação lipídica (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Além disso, sabe-se que diversas isoformas de GST podem apresentar atividade de GPx (ALMEIDA et al., 2005).
1.5
Espécies de peixes para estudos de Ecotoxicologia
Ao selecionar um organismo teste para avaliar os efeitos biológicos de poluentes, vários fatores devem ser considerados, incluindo a presença e persistência destes organismos em po-pulações significativas na área estudada, histórico de pré-exposição, importância ecológica da espécie, sua sensibilidade aos contaminantes e sua fisiologia (ROMÉO; GNASSIA-BARELLI, 1995).
A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus, Cichlidae) representa um modelo de peixe larga-mente estudado em ecotoxicologia. Várias respostas bioquímicas têm sido bem caracterizadas neste peixe relacionadas à exposição de vários compostos tóxicos (RODRIGUEZ-FUENTES; GOLD-BOUCHOT, 2004; GOLD-BOUCHOT et al., 2006; TRÍDICO et al., 2010). A tilápia do Nilo é um dos mais comuns peixes de água doce cultivados comercialmente no Brasil, em-bora seja uma espécie exótica. Este peixe pode ser afetado por poluentes solúveis em água, bem como por partículas insolúveis na interface ar-água, devido ao seu hábito nectônico.
fra-1.5 Espécies de peixes para estudos de Ecotoxicologia 26
27
2
Objetivos
Este trabalho teve por objetivos:
• Analisar o nível de estresse oxidativo gerado pela exposição ao diesel e ao biodiesel B5, B20 e B100 em fígado e brânquias de uma espécie de peixe de hábito nectônico (tilápia do Nilo,Oreochromis niloticus) e em outra espécie de hábito bentônico (cascudo marrom, Pterygoplichthys anisitsi).
• Verificar qual das duas espécies de peixe é mais susceptível aos contaminantes, consi-derando que espécies nectônicas podem ter acesso tanto à fração solúvel e insolúvel do biodiesel, enquanto que espécies de fundo, provavelmente, terão acesso somente à fração solúvel em água. Dessa forma, poderemos avaliar se tais organismos são adequados como sentinelas em estudos de monitoramento ambiental.
• Analisar se os biomarcadores 7-etoxirresorufina-O-deetilase (EROD), glutationa-S-trans-ferase (GST), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e o malondialdeído (MDA) são alterados nas concentrações testadas de óleo diesel, B5, B20 e B100 para as duas espécies de peixe em questão.
28
3
Material e Métodos
3.1
Organismos testes
As espécies de peixes utilizadas nos experimentos foram a tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus, e o cascudo marrom,Pterygoplichthys anisitsi(Figura 7), de ambos os sexos. O peso e o tamanho das tilápias foram respectivamente de 57,12±14,14 g e 11,83±0,96 cm (média ±desvio padrão). O peso dos cascudos utilizados foi de 158,01±38,76 g e o seu tamanho foi
de 19,86±2,0 cm (média±desvio padrão).
Os espécimes de tilápia do Nilo foram obtidos na Escola Agrícola de Monte Aprazível - SP e os de cascudo marrom foram cedidos pelo Centro de Aquicultura da UNESP de Jaboticabal (CAUNESP) - SP.
Figura 7:Espécies de peixes utilizadas nos experimentos. A)Oreochromis niloticus, tilápia do Nilo. B) Pterygo-plichthys anisitsi, cascudo marrom.
Este trabalho possui permissão da Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, UNESP, São José do Rio Preto (CEUA-IBILCE/UNESP) (protocolo n◦. 01/09 CEUA).
3.2
Protocolo de exposição dos organismos testes ao diesel e
biodiesel
3.3 Preparo das misturas de biodiesel 29
controle, um para o grupo óleo diesel na concentração de 0,01 mL/L e outro com 0,1 mL/L, um para o grupo biodiesel B5 na concentração de 0,01 mL/L e outro com 0,1 mL/L, um para o grupo biodiesel B20 na concentração de 0,01 mL/L e outro com 0,1 mL/L e finalmente, um para o grupo biodiesel B100 na concentração de 0,01 mL/L e outro com 0,1 mL/L. Cada compartimento dos aquários continha apenas um indivíduo, totalizando cinco animais por grupo experimental. A temperatura da água durante os experimentos foi mantida em torno de 25◦C.
Para cada período de exposição, 45 espécimes de O. niloticus e de P. anisitsi foram dis-tribuídos aleatoriamente entre os aquários. Após um período de dois e sete dias de exposição aos contaminantes, os peixes foram anestesiados com benzocaína (90 mg/L de água) e suas brânquias e fígados foram retirados e armazenados à -80◦C.
As doses utilizadas neste trabalho foram baseadas em um estudo anterior (NOGUEIRA et al., no prelo) realizado por nosso grupo de pesquisa em que as tilápias foram expostas a doses de 0,1 e 0,5 mL/L de óleo diesel por dois e sete dias. No entanto, as tilápias expostas à dose mais elevada morreram após quatro dias de experimento. Assim, adotamos uma dose de 0,1 mL/L e uma dose dez vezes menor (0,01 mL/L) neste trabalho atual para garantir a sobrevivência dos animais até o final do experimento.
3.3
Preparo das misturas de biodiesel
O biodiesel puro (B100), produzido a partir de sebo animal, foi obtido junto ao Divisão de Biodiesel do Grupo JBS-Friboi (Lins, SP). A análise química do biodiesel foi realizada pela empresa que nos forneceu o combustível e está em anexo neste trabalho (Anexo A).
No laboratório, com auxílio de uma proveta, fizemos soluções de 5% de biodiesel B100 com 95% de óleo diesel puro e 20% de biodiesel B100 com 80% de óleo diesel, resultando nas misturas B5 e B20, respectivamente. Tal método também foi empregado no trabalho de Khan, Warith e Luk (2007). O óleo diesel deste trabalho foi comprado em um posto de gasolina antes de fazerem a mistura com o biodiesel.
3.4
Descarte de resíduos tóxicos e de água contaminada
3.5 Análises bioquímicas 30
eles.
Este trabalho de Mestrado sendo parte integrante do projeto Jovem Pesquisador "Estudo de variações bioquímicas em tilápias como biomarcadores de contaminação ambiental"(FAPESP, 2006/03873-1) contou com a permissão da Comissão Interna de Segurança Química do IBILCE/ UNESP.
3.5
Análises bioquímicas
3.5.1
Preparo das amostras para análise das enzimas EROD, GST, SOD,
CAT e GPx
Para as análises enzimáticas da EROD, GST, CAT, SOD e GPx, o fígado e as brânquias foram homogeneizados (1:4, massa:volume) em tampão Tris 20 mM, pH 7,4, contendo sacarose 0,5 mM, KCl 0,15 mM e 1 mM de inibidor de protease (PMSF), e centrifugados a 10.000 x g por 20 minutos. A porção sobrenadante foi retirada e centrifugada novamente a 50.000 x g por uma hora. A porção sobrenadante foi novamente coletada para análise da atividade da GST, SOD, CAT e GPx. Para análise da EROD, os peletes resultantes apenas das amostras de fígado foram homogeneizados em 100µL de tampão Tris 100 mM, pH 7,5, contendo EDTA 1 mM, ditiotreitol 1 mM, KCl 100 mM e 20% de glicerol.
3.5.2
7-etoxirresorufina-0-deetilase (EROD)
A EROD foi medida por método fluorimétrico adaptado de Burke e Mayer (1974). O mé-todo consiste na formação de resorufina, que é fluorescente (λexcit=537 nm, λemiss=583 nm), catalisada pela isoforma 1A do citocromo P450. Foram adicionados à cubeta 1950µL de tam-pão fosfato de potássio 80 mM, pH 7,4, além de 20µL de solução de 7-etoxirresorufina 335 µM, 20µL de NADPH 10 mM e 10µL de amostra de fígado previamente preparada. A reação foi observada por três minutos, a 30◦C. Dados foram expressos em pmol/min/mg de proteína.
3.5.3
Glutationa
S-transferase (GST)
3.5 Análises bioquímicas 31
3.5.4
Superóxido dismutase (SOD)
A atividade da SOD foi medida pelo método de McCord e Fridovich (1969). Tal método baseia-se em um sistema de geração de superóxido (xantina/xantina oxidase) acoplado à re-dução do citocromo c pelo radical ânion superóxido, provocando aumento de absorbância em 550 nm a 25◦C. A adição da amostra contendo a SOD promove uma inibição na velocidade de redução do citocromo c, uma vez que a SOD compete com o citocromo pelo superóxido. Dados foram expressos em U/mg de proteína.
3.5.5
Catalase (CAT)
A atividade da CAT foi medida pelo método de Beutler (1975), quantificando a velocidade de decomposição do peróxido de hidrogênio pela enzima, através do decréscimo de absorbância em 240 nm a 30◦C. Dados foram expressos em U/mg de proteína.
3.5.6
Glutationa peroxidase (GPx)
A análise da GPx foi feita pela técnica de Sies et al. (1979). Este método baseia-se na medida do decréscimo de absorbância a 340 nm, promovido durante a redução da glutationa dissulfeto (GSSG). A redução é catalisada por glutationa redutase (GR) em presença de NADPH a 30◦C. Dados foram expressos em U/mg de proteína.
3.5.7
Análise de proteínas
A quantificação de proteínas foi feita pelo método de Bradford (1976) e foi utilizada apenas para o cálculo da atividade específica de cada enzima.
3.5.8
Peroxidação lipídica
Para avaliar os níveis de peroxidação lipídica nos tecidos, foi analisada a presença do pro-duto formado entre o malondialdeído (MDA) e o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), via cromatogra-fia líquida de alta performance (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) acoplada ao detector de UV/Vis (ALMEIDA et al., 2003, 2004).
3.6 Análise estatística 32
de n-butanol e quantificado no HPLC-UV/Vis em 532 nm, em termos da curva de calibração utilizando como padrão o MDA obtido pela hidrólise do tetrametoxipropano. O sistema de HPLC (ESA) constitui-se de uma bomba modelo ESA 584 e de detector de UV/Vis modelo ESA 526. A coluna utilizada foi ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm, 5µm). O monitoramento do cromatograma e a identificação e quantificação do pico foram realizados utilizando o software EZ Chrom Elite (Agilent Technologies). A fase móvel foi composta por solução de fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,0 com 40% metanol, bombeada isocraticamente (0,9 mL/min). Dados foram expressos em nmol/mg de tecido.
3.6
Análise estatística
Para cada espécie de peixe foram feitas as seguintes análises:
• Comparações entre os diferentes tratamentos para um mesmo período de exposição: foi realizado teste de homogeneidade das variâncias (Levene) e quando os dados se apresen-taram paramétricos, utilizou-se ANOVA One-Way seguido pelo teste de Fisher LSD, caso contrário, foi utilizado Kruskal-Walllis.
No caso desta análise os dados que inicialmente apresentaram variâncias não homogêneas foram normalizados em termos de logaritmo da atividade enzimática ou concentração. Esse procedimento foi feito para os seguintes dados referentes às tilápias: GST hepática, GPx e MDA branquiais dos dois períodos de exposição, catalase hepática e branquial de sete dias. No caso dos cascudos esse procedimento se limitou aos dados da EROD hepática de sete dias, catalase hepática de dois dias, GST hepática e das brânquias com dois dias de tratamento e MDA das brânquias com sete dias de exposição.
• Comparação da atividade enzimática ou concentração entre os dois períodos de exposição de um mesmo tratamento (mesma dose e mesmo contaminante): primeiramente avaliou-se a normalidade (Shapiro-Wilk) e homogeneidade (Levene) dos dados. Quando os dados se apresentaram paramétricos foi aplicado o teste t de Student e, em caso de dados não-paramétricos, teste de Mann-Whitney. Quando já no teste de Shapiro-Wilk, os dados não apresentavam distribuição normal, o teste de homogeneidade não foi aplicado. Esta aná-lise só foi realizada para os grupos que apresentaram diferenças significantes em relação ao controle em dois ou sete dias de exposição.
33
4
Resultados
Dados sobre normalidade, homogeneidade das variâncias e as matrizes geradas pelo teste de Fisher LSD para cada tempo de exposição de todos os biomarcadores aqui analisados estão dispostos em tabelas no apêndice deste trabalho.
4.1
Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel
4.1.1
EROD
Houve diferenças na atividade da EROD entre os tratamentos em ambos os períodos de exposição para as duas espécies de peixe (Tabela 1).
Tabela 1:Análise de variância da atividade enzimática da EROD deO. niloticuseP. anisitsipara cada período de
exposição.
EROD
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 7,6934 8 5,91.10−6* 23,1257 8 8,07.10−12*
Atividade em 7 dias 40,2116 8 2,10.10−15* 44,4366 8 4,44.10−16*
Nota:* Valores significativos (p<0,05).
No caso das tilápias, em dois dias de exposição, a enzima teve sua atividade aumentada nos grupos expostos às duas concentrações de óleo diesel e B20 e para a concentração de 0,1 mL/L de B5 em relação ao controle. A atividade da EROD dos animais expostos às duas concentrações de biodiesel puro foi estatisticamente igual ao controle (Tabela 15 e Figura 8). Após sete dias de exposição, com exceção dos grupos expostos ao biodiesel puro, todos os outros grupos tiveram a atividade aumentada em relação ao controle (Tabela 16 e Figura 8). Além disso, nesse mesmo período a atividade da EROD foi menor nos peixes submetidos ao B20 0,01 mL/L em relação diesel e B5 de mesma concentração e ao B20 0,1 mL/L em relação aos grupos expostos ao diesel e B5 de 0,1 mL/L (Tabela 16 e Figura 8).
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 34
(p= 0,039958) (Figura 8).
Para os cascudos, a atividade da EROD foi maior que o controle para todos os grupos com exceção dos animais expostos por dois dias às duas concentrações de biodiesel B100 e expostos por sete dias a menor dose de B100. Em dois dias, a menor concentração de óleo diesel, B5 e B20 induziu maior atividade enzimática quando comparados respectivamente aos grupos expostos a maior dose dos mesmos tratamentos. O mesmo fenômeno ocorreu com os animais expostos por sete dias ao B5 (Tabelas 17 e 18 e Figura 8).
A atividade do CYP1A nos cascudos após dois dias de tratamento foi maior para os grupos diesel 0,1 mL/L (p= 0,000234) e B5 0,01 (p= 0,044506) mL/L e menor para B20 0,01 mL/L (p= 0,000780) em relação aos mesmos grupos de sete dias de exposição (Figura 8).
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 35
Figura 8: Gráfico da atividade da EROD em fígado de O. niloticus. O gráfico referente a atividade da EROD
emP. anisitsiencontra-se em maior escala para melhor visualizar as diferenças entre os tratamentos.a Diferença
significativa em relação ao controle.b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. c Diferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 36
4.1.2
Glutationa-S-Transferase
4.1.2.1 Fígado
A GST hepática foi significativamente diferente entre os tratamentos nos dois períodos de exposição paraP. anisitsie e, no caso deO. niloticus, apenas no sétimo dia de exposição (Tabela 2).
Tabela 2: Análise de variância da atividade enzimática da GST em fígado deO. niloticuseP. anisitsipara cada
período de exposição.
GST
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 1,287024 8 0,280945 10,8051 8 1,66.10−7*
Atividade em 7 dias 5,996171 8 0,000074* 2,6842 8 0,020552*
Nota:* Valores significativos (p<0,05).
No fígado das tilápias expostas por sete dias, a atividade da GST aumentou no grupo con-taminado por óleo diesel 0,1 mL/L em relação ao controle, enquanto que no grupo exposto ao biodiesel B100 0,01 mL/L a atividade foi menor comparado ao controle e ao diesel, B5 e B20 0,01 mL/L e B100 0,1 mL/L. (Tabela 19 e Figura 9).
Além disso, a GST nas tilápias apresentou maior atividade nos animais expostos ao diesel 0,1 mL/L após sete dias que naqueles expostos por dois dias (p= 0,037041). No caso do grupo exposto ao B100 0,01 mL/L a atividade caiu ao longo do tempo de exposição (p= 0,009024) (Figura 9).
A GST presente no fígado dos cascudos foi maior em quase todos os grupos expostos por dois dias aos contaminantes, a exceção foram os grupos óleo diesel 0,1 mL/L e B5 0,01 mL/L que não apresentaram diferenças. A atividade da GST foi menor no grupo exposto ao B20 0,01 mL/L por sete dias (Tabelas 20 e 21 e Figura 9).
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 37
Figura 9: Gráfico da atividade da catalase em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. cDiferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados expressos em
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 38
4.1.2.2 Brânquias
A atividade da GST nas brânquias apresentou alterações no tratamento nos dois períodos de exposição para ambas as espécie de peixe (Tabela 3).
Tabela 3:Análise de variância da atividade enzimática da GST nas brânquias deO. niloticuseP. anisitsi.
GST
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 3,800911 8 0,002527* 4,330607 8 0,001057*
Atividade em 7 dias 9,741180 8 0,000001* 5,300167 8 0,000216*
Nota:* Valores significativos (p<0,05).
Nas tilápias, em dois dias, o grupo B100 na concentração de 0,01 mL/L exibiu menor ati-vidade de GST nas brânquias quando comparado ao controle e a todos os outros tratamentos, exceto ao B100 de maior concentração (Tabela 22 e Figura 10). Depois de sete dias, os gru-pos diesel e B5 de maior concentração apresentaram maior atividade em relação ao controle, enquanto os animais expostos às duas concentrações de biodiesel B100 mostraram uma menor atividade de GST. Nesse mesmo tempo de exposição, os grupos expostos a menor concentração de B20 e B100 apresentaram menor atividade de GST que no grupo diesel e B5 0,01 mL/L, sendo que neste último a atividade também foi menor em relação a sua maior concentração. A atividade branquial dessa enzima também foi menor em B100 0,1 mL/L que em B20 0,1 mL/L, porém esses dois tratamentos apresentaram menor atividade que os grupos diesel e B5 de concentração 0,1 mL/L (Tabela 23 e Figura 10).
Entre dois e sete dias de exposição, houve redução na atividade dessa enzima apenas nas tilápias expostas às concentrações de 0,1 mL/L de biodiesel B100 (p= 0,003573)(Figura 10).
A GST nas brânquias dos cascudos foi maior em relação ao respectivo controle para todos os grupos expostos por dois dias e, no caso de sete dias, os únicos grupos que não apresentaram diferenças foram B5 nas duas concentrações e óleo diesel 0,01 mL/L (Tabelas 24 e 25 e Figura 10). A atividade da GST diminuiu de dois para sete dias nos grupos expostos à concentração de 0,01 mL/L de óleo diesel (p= 0,025048) e B5 (p= 0,006536)e aumentou para a maior dose de B100 (p= 0,008250)(Figura 10).
tam-4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 39
bém induziu maior atividade de GST nas brânquias dos cascudos em relação a todos os outros contaminantes, com exceção do biodiesel B20 0,01 mL/L (Figura 25).
Figura 10: Gráfico da atividade de GST em brânquia deO. niloticuseP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior
concentração. cDiferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados expressos em
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 40
4.1.3
Superóxido dismutase
4.1.3.1 Fígado
Segundo a análise de variância, a atividade da SOD hepática apresentou diferenças entre tratamentos de dois dias em tilápias e para os tratamentos de sete dias em cascudos (Tabela 4). O teste de Kruskall-Wallis detectou diferença entre os tratamentos de dois dias para os cascudos, no qual houve uma maior atividade da enzima para as duas concentrações de B100 em relação ao diesel 0,1 mL/L. Porém, como nenhum tratamento de dois dias foi diferente do controle, então, essa alteração não possui nenhum significado.
Tabela 4:Análise de variância da atividade enzimática da SOD no fígado deO. niloticuseP. anisitsi.
SOD
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 6,942200 8 0,000017* - -
-Atividade em 7 dias 1,775456 8 0,115615 3,106536 8 0,009323*
Nota:* Valores significativos (p<0,05).
A atividade da SOD depois de dois dias em O. niloticus foi menor nos grupos expostos às duas concentrações de biodiesel B5, quando comparada ao respectivo controle. O contrário ocorreu com o grupo tratado com biodiesel puro (0,1 mL/L), em que a atividade dessa enzima foi maior em relação ao controle e aos demais tratamentos. O grupo exposto ao B100 0,01 mL/L também apresentou maior atividade da SOD quando comparado ao grupo exposto ao diesel e B5 de mesma dosagem. O mesmo ocorreu em B20 0,1 mL/L quando comparado ao B5 0,1 mL/L (Tabela 26 e Figura 11). Ao longo do tempo, a atividade da SOD diminuiu em B5 (p= 0,002133) e B100 (p= 0,001352) de concentração 0,1 mL/L (Figura 11).
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 41
Figura 11: Gráfico da atividade da SOD em fígado deO. niloticus eP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. c
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 42
4.1.3.2 Brânquias
Não houve alterações na atividade da SOD emO. niloticustanto no segundo dia de expo-sição (H= 13,0040600; gl= 8; p= 0,111700), quanto no sétimo dia (F= 1,246416; gl= 8; p= 0,302387) (Figura 12). A atividade desta enzima foi a única que apresentou diferenças entre os dois períodos para os grupos controles (p= 0,009650), sendo que em sete dias a atividade foi menor que em dois dias.
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 43
Figura 12: Gráfico da atividade da SOD nas brânquias deO. niloticuseP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. cDiferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados expressos em
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 44
4.1.4
Catalase
4.1.4.1 Fígado
A análise de variância detectou diferenças na atividade da catalase em ambos os períodos de exposição dos experimentos com cascudo. Em tilápias houve diferença apenas após o sétimo dia de tratamento (Tabela 5).
Tabela 5:Análise de variância da atividade enzimática da catalase no fígado deO. niloticuseP. anisitsi.
CAT
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 0,427413 8 0,896783 2,621465 8 0,023140*
Atividade em 7 dias 3,875088 8 0,002326* 4,193810 8 0,001336*
Nota:* Valores significativos (p<0,05).
Após sete dias de tratamento, com exceção do grupo exposto à menor concentração de óleo diesel, a atividade da catalase nas tilápias aumentou em relação ao grupo controle. Além disso, a atividade enzimática no grupo exposto ao diesel na concentração de 0,01 mL/L foi menor que nas tilápias expostas ao diesel na concentração 0,1 mL/L e B5 0,01 mL/L(Tabela 31 e Figura 13). Do segundo para o sétimo dia de exposição, a atividade dessa enzima aumentou nos ani-mais dos grupos expostos ao diesel 0,1 mL/L (p=0,006507), ao B5 0,01mL/L (p=0,001827), ao B5 0,1 mL/L (p=0,001179), ao B20 0,01 mL/L (p=0,001454), ao B20 0,1 mL/L (p=0,009129), ao B100 0,01 mL/L (p=0,018668) e ao B100 0,1 mL/L (p=0,009024) (Figura 13).
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 45
Figura 13:Gráfico da atividade da catalase em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. c
Diferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados expressos em média±desvio padrão.
4.1.4.2 Brânquias
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 46
Tabela 6:Análise de variância da atividade enzimática da catalase nas brânquias deO. niloticuseP. anisitsi.
CAT
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 0,688664 8 0,698678 0,965114 8 0,478420
Atividade em 7 dias 1,427610 8 0,219725 1,217809 8 0,316734
Figura 14:Gráfico da atividade da catalase em fígado deO. niloticuseP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior
concentração. cDiferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados expressos em
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 47
4.1.5
Glutationa peroxidase
4.1.5.1 Fígado
A atividade da GPx nas tilápias do Nilo não sofreu alterações entre tratamentos aplicados no segundo dia, de acordo com o teste de Kruskal-Wallis (F= 0,799098; gl= 8; p= 0,607227) apenas no sétimo dia, conforme a análise de variância (F= 2,550972; gl= 8; p= 0,026449). Neste período de exposição, a atividade da GPx nos peixes expostos ao diesel 0,01 mL/L foi maior que nos grupos controle e exposto ao diesel com maior concentração (Tabela 34 e Figura 15).
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 48
Figura 15: Gráfico da atividade da GPx em fígado deO. niloticus eP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. cDiferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados expressos em
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 49
4.1.5.2 Brânquias
A análise de variância mostrou que houve diferenças entre os tratamentos de sete dias aos quais as tilápias foram submetidas. Não houve diferenças entre os tratamentos de nenhum período de exposição para os cascudos (Tabela 7).
Após sete dias de exposição, a atividade de GPx foi menor nos grupos expostos à menor concentração de diesel e B5 em relação ao controle. A atividade da enzima no grupo exposto ao diesel de dose 0,01 mL/L também foi menor que no diesel 0,1 mL/L, e B20 e B100 de concentração 0,01 mL/L (Tabela 37 e Figura 16). Além disso, em ambos os grupos diesel e B5 de 0,01 mL/L a GPx ficou reduzida no sétimo dia quando comparada ao segundo dia de exposição (p= 0,004631 e p= 0,004640, respectivamente).
Tabela 7:Análise de variância da atividade enzimática da GPx nas brânquias deO. niloticuseP. anisitsi.
GPx
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 1,509902 8 0,188231 0,991908 8 0,459148
Atividade em 7 dias 2,512453 8 0,028456* 0,287406 8 0,965684
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 50
Figura 16: Gráfico da atividade da GPx em brânquia deO. niloticuseP. anisitsi. a Diferença significativa em
relação ao controle. b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. c
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 51
4.1.6
Peroxidação lipídica
4.1.6.1 Fígado
Tilápias expostas aos contaminantes por um período de dois dias não apresentaram altera-ção na concentraaltera-ção de MDA, de acordo com o teste de Kruskal-Wallis (F= 1,481335; gl= 8; p= 0,198345). De acordo com a análise de variância, alterações ocorreram apenas após sete dias de exposição (F= 11,130065; gl= 8; p= 1,47.10−7).
Após sete dias, tilápias do grupo B5 0,1 mL/L apresentaram peroxidação maior em relação ao controle e ao B5 0,01 mL/L. O grupo B100 de maior dose apresentou menor concentração de MDA que o controle (Tabela 38 e Figura 17). Do segundo para o sétimo dia, houve aumento da lipoperoxidação no grupo exposto ao B5 0,1 mL/L (p= 0,000811).
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 52
Figura 17:Gráfico da concentração de MDA em fígado deO. niloticuseP. anisitsi.aDiferença significativa em
relação ao controle. b Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior
concentração. cDiferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados expressos em
média±desvio padrão.
4.1.6.2 Brânquias
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 53
Houve aumento na concentração de MDA nos grupos expostos ao B5 0,1 mL/L e ao B100 de ambas as dosagens após dois dias, quando comparamos com o grupo controle. Neste mesmo período, a peroxidação lipídica nos animais expostos ao B100 0,01 mL/L foi maior que na-queles que receberam o tratamento com diesel e B5 na concentração de 0,01 mL/L. O mesmo aconteceu com os animais expostos ao B100 0,1 mL/L em relação ao grupo B20 de mesma concentração (Tabela 39 e Figura 18).
Após sete dias de exposição, a peroxidação nas brânquias das tilápias expostas à dosagem 0,1 mL/L de B100 foi maior que no controle e nos peixes expostos aos demais tratamentos, exceto ao B100 de menor dose (Tabela 40 e Figura 18).
ParaP. anisitsi, apenas os tratamentos de dois dias apresentaram diferenças entre si (Tabela 8). A peroxidação nas brânquias dos animais expostos à concentração de 0,1 mL/L de B20 e B100 foi maior que no controle (Tabela 41). Além disso, para esses mesmos grupos houve aumento na concentração de MDA de dois para sete dias (p= 0,002953 para B20 e p= 0,047236 para B100) (Figura 18). Além disso, a concentração de MDA no controle de sete dias foi maior que no de dois dias (p= 0,001090).
Tabela 8:Análise de variância da atividade enzimática da catalase nas brânquias deO. niloticuseP. anisitsi.
MDA
Tilápia Cascudo
Efeito F gl P F gl P
Atividade em 2 dias 3,402453 8 0,005210* 2,656332 8 0,021662*
Atividade em 7 dias 4,925113 8 0,000393* 1,732161 8 0,124367
4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 54
Figura 18: Gráfico da concentração de MDA em brânquia deO. niloticuseP. anisitsi. a Diferença significativa
em relação ao controle.b
Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. c
55
5
Discussão
Espécies reativas de oxigênio são continuamente produzidas nos sistemas biológicos como produtos do metabolismo oxidativo (ALMEIDA et al., 2003) e a biotransformação de compos-tos químicos pode gerar uma quantidade excessiva destes composcompos-tos, levando o organismo a uma situação de estresse oxidativo (LÓPEZ-BAREA; PUEYO, 1998).
Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos estão presentes em derivados de petróleo e são descritos na literatura como sendo agonistas de receptores aril hidrocarboneto em vários or-ganismos, incluindo os peixes. A ativação desses receptores promove uma cadeia de rea-ções que irá sintetizar a isoforma 1A do citocromo P450 (CYP1A), levando ao aumento de atividade dessa enzima (WHYTE et al., 2000). Trabalhos com exposição de peixes a HPAs (KOPECKA-PILARCZYK; CORREIA, 2009; TRÍDICO et al., 2010) e derivados de petróleo (GOLD-BOUCHOT et al., 2006; PATHIRATNE; CHANDRASEKERA; PATHIRATNE, 2009) também demonstraram a indução dessa enzima. Em nossos estudos, a atividade da EROD foi altamente induzida emO. niloticusem todos os grupos expostos ao óleo diesel e suas misturas com biodiesel, com exceção daqueles expostos ao biodiesel puro. O biodiesel puro não contém HPAs, portanto não induziu a atividade de tal enzima.
