ROSANA FERNANDES ANTONIO
AVALIAÇÃO DA BIOATIVIDADE DE REVESTIMENTOS PRODUZIDOS SOBRE TÂNTALO POR OXIDAÇÃO ELETROLÍTICA ASSISTIDA POR PLASMA.
“AVALIAÇÃO DA BIOATIVIDADE DE REVESTIMENTOS PRODUZIDOS SOBRE TÂNTALO POR OXIDAÇÃO ELETROLÍTICA ASSISTIDA POR PLASMA”.
Orientador: Prof. Dr. Nilson Cristino da Cruz
SOROCABA 2016
Antonio, Rosana Fernandes.
Avaliação da Bioatividade de Revestimentos Produzidos Sobre Tântalo por Oxidação Eletrolítica Assistida por Plasma / Rosana Fernandes Antonio, 2016 105 f. : il.
Orientador: Nilson Cristino da Cruz Tese (Doutorado)–Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências, Bauru, 2016
1. Bioatividade. 2. Hidroxiapatita. 3. Tântalo. 4. Oxidação Eletrolítica assistida por plasmas. I. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências. II. Título.
A Deus, que permitiu que eu chegasse até aqui, me dando sabedoria, iluminando, protegendo, sustentando, levantando-me nas horas difíceis e até mesmo me carregando com seus braços fortes de Pai.
Ao Prof. Dr. Nilson Cristino da Cruz pela orientação, paciência, amizade, pelo conhecimento transmitido e pelos conselhos como professor e como amigo.
À Profª. Drª Elidiane C. Rangel não apenas pelo exemplo de uma grande professora, por ajudar na discussão do trabalho, orientações e incentivo diante das dificuldades, bem como pelo exemplo de uma grande mulher e amiga, por mostrar que podemos ser “fortes”, mesmo nos sentindo fracos, enfim, me fazendo ver que esta luta “vale a pena”, me fortalecendo durante minha caminhada.
Ao técnico do laboratório e amigo, Rafael Parra Ribeiro por todas as análises realizadas com tanto profissionalismo, por participar na discussão dos resultados, pela paciência e amizade, por estar sempre sorrindo, tornando as dificuldades mais amenas, pela excelente convivência durante estes anos.
A Profª Drª Bruna Antunes Mas pela realização dos ensaios biológicos in vitro, pela discussão dos resultados obtidos e pela transmissão do conhecimento, que engrandeceram os resultados deste trabalho.
Ao Joaquim Olímpio Pereira Neto e à Faculdade de Tecnologia (FATEC) pela ajuda no embutimento das amostras tratadas.
A todos os amigos do laboratório, principalmente a Lívia Sottovia, por toda a ajuda na operação do equipamento, troca de informações, paciência ao transmitir seus conhecimentos, amizade e pelo incentivo nos momentos difíceis.
A minha linda família, pelas palavras de incentivo, orações, pela preocupação, por acreditar na minha luta e entender minha ausência durante estes anos, por estar tão presente em minha vida mesmo estando distante fisicamente, não tenho palavras para expressar meu amor e agradecimento.
A minha pequena, amada e querida filha Beatriz, por ser a minha força para lutar, sempre me incentivando mesmo sabendo que ficaria ausente, por não me deixar chorar dizendo que sou forte, me elogiar quando me sentia pequena e frágil, me acompanhar em todos os caminhos que a vida tem nos levado sem nunca reclamar; dizer que te amo, ainda é muito pouco!
O tântalo vem se destacando entre os biomateriais metálicos devido a propriedades como baixa reatividade química, ótima ductibilidade, elevada resistência à corrosão e ótima bioatividade. Neste trabalho foi utilizada a técnica de oxidação eletrolítica assistida por plasma (PEO- do ingês, Plasma Electrolytic Oxidation) em substrato de tântalo, utilizando-se como eletrólito uma solução de acetato de cálcio e glicerofosfato dissódio, com a finalidade de se crescer um revestimento de hidroxiapatita sobre a superfície metálica. No processo PEO empregou-se pulsos de tensão contínua com frequência de 100 Hz e foram avaliados os efeitos da variação da diferença de potencial aplicada entre os eletrodos, que foi variada de 350 a 500 V, e do tempo de tratamento, que variou de 60 a 600 s. Para análises da composição química e estrutural dos revestimentos foram utilizadas espectroscopias de reflexão/absorção no infravermelho (IRRAS) e de energia dispersiva de raios X (EDS) e difração de raios X (XRD), enquanto que a morfologia da superfície foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Empregando-se a técnica de perfilometria determinou-se a rugosidade das superfícies tratadas. A bioatividade dos revestimentos foi avaliada a partir de ensaios de adesão e crescimento de células osteoblásticas. Os melhores resultados foram obtidos com amostras tratadas em 500V com um tempo mínimo de 300 s. Nestas condições foi possível a formação de um revestimento de hidroxiapatita cristalina, confirmada por XRD. Os espectros obtidos com IRRAS também confirmaram a presença de espécies químicas responsáveis pela formação de hidroxiapatita como fosfatos (PO43-), hidroxilas (OH-) e carbonatos (CO3-2). As amostras tratadas apresentaram bioatividade e viabilidade celular maiores que as observadas com o tântalo como recebido, devido às estruturas cristalinas de hidroxiapatita juntamente com a elevada rugosidade superficial obtida com o tratamento. A energia térmica gerada nas amostras durante o tratamento foi um fator determinante para se explicar a formação da hidroxiapatita.
due to its special properties such as low reactivity, excellent ductility, high resistance to corrosion as well as high bioactivities. In this work Plasma Electrolytic Oxidation technique PEO, was employed on Tantalum substrate using a calcium acetate and
glycerophosphate sodium with the goal of generating a coating of hydroxyapatite on the metallic surface. In this PEO process, DC pulses of 100 Hz were used. The differential of potential between the electrodes in the range of 350 V to 500 V were applied that lasted from 60s to 600s and their *effects were evaluated. For chemical composition and structural analysis of coating, Infrared Reflection Absorption Spectroscopy (IRRAS) were employed together with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) and diffraction of X-ray (XRD). The morphology of the surface was evaluated with Electronic Scanning Microscopy. With profilometry techniques the roughness of the treated surface was determined. The bioactivity of the coating was assessed by testing the adhesion and development of osteoblastic cells. The best results were obtained with samples undergoing a tension of 500 V lasting for a minimum of 300 s. Under these conditions it was possible to form hydroxyapatite
crystal that was confirmed by DRX. The spectra obtained with IRRAS also confirmed
the presence of chemical species responsible for the formation of hydroxyapatite such as phosphate groups (PO43-), hydroxyls (OH-) and carbonates (CO32-). The treated samples show greater cellular bioactivity and viability than those observed in raw tantalum due to the crystal structure of hydroxyapatite together with high surface roughness obtained as a result of the treatment. The thermal energy generated in samples during the treatment was a determining factor for explaining the formation of hydroxyapatite.
Figura 1: Curvas da variação da tensão em relação à corrente elétrica na oxidação eletrolítica assistida por plasma. A curva “a” representa as reações que ocorrem na interface metal/solução, onde há liberação de gás e a curva “b” representa o processo
de oxidação na superfície do anodo (crescimento do filme) ... 26
Figura 2: Interações entre um feixe de elétrons e a amostra ... 30
Figura 3: Vibrações moleculares: estiramento (a) e deformação angular (b) ... 33
Figura 4: Interferência entre raios a nível planar ... 35
Figura 5: Representação esquemática de um difratômetro ... 36
Figura 6: Reação da hidrólise do nitrofenilfosfato pela ALP ... 38
Figura 7: Representação esquemática do sistema eletrolítico de oxidação ... 41
Figura 8: Micrografia eletrônica de varredura da superfície do tântalo ... 46
Figura 9: Micrografias eletrônicas de varredura da superfície do tântalo após tratamento com PEO durante 300 segundos em diferentes tensões: (a) 350 V, (b) 450 V, (c) 500 V ... 47
Figura 10: Proporções atômicas determinadas por EDS das superfícies de amostras de tântalo em diferentes tensões (350, 450 e 500 V). ... 47
Figura 11: Micrografia eletrônica de varredura do corte transversal de um substrato de tântalo... 49
Figura 12: Micrografias eletrônicas de varredura de cortes transversais de substratos de tântalo recobertos com filmes depositados com tratamentos de 300 s em diferentes tensões: (a) 350 V, (b) 450 V e (c) 500 V ... 50
Figura 13: Proporções atômicas determinadas por EDS dos cortes transversais de amostras de tântalo tratadas em diferentes tensões. ... 51
Figura 14: Mapeamento por EDS de cortes transversais de amostras tratadas por 300 s em 350, 450 e 500V onde se pode observar a distribuição de oxigênio. ... 53
Figura 15: Mapeamento por EDS de cortes transversais de amostras tratadas por 300 s em 350, 450 e 500V onde se pode observar a distribuição de tântalo. ... 53
Figura 16: Mapeamento por EDS de cortes transversais de amostras tratadas por 300 s em 350, 450 e 500V onde se pode observar a distribuição de cálcio.. ... 54
tratamento: (a) 60 s, (b) 180 s, (c) 300 s e (d) 600 s. ... 70 Figura 32: Proporções atômicas determinadas por EDS dos cortes transversais de amostras de tântalo tratadas em 500 V com diferentes tempos de tratamento. ... 71 Figura 33: Mapeamento por EDS de cortes transversais de tântalo após tempo de tratamento de 60, 180, 300 e 600s: carbono e oxigênio ... 72 Figura 34: Mapeamento por EDS de cortes transversais de tântalo após tempo de tratamento de 60, 180, 300 e 600s: tântalo, cálcio e fósforo ... 73 Figura 35: Micrografias eletrônicas de varredura de cortes transversais do substrato de tântalo recoberto com filmes depositados com 500 V em diferentes tempos de
tratamento: (a) 300s e (b) 600s...74 Figura 36: Proporções atômicas determinadas por EDS de um corte transversal de
ACP Fosfato de cálcio amorfo
ALP Alcaline Phosphatase
DMSO Dimetil sulfóxido DRX Difração de raios X
EDS Espectroscopia de energia dispersiva EPP Electrolytic plasma processing
FA Fosfatase alcalina
FTIR Fourier transform infrared HA Hidroxiapatita
ICSD Inorganic Crystal Structure Database IIIP Implantação Iônica por Imersão em Plasma
IR Infravermelho
IRRAS Espectroscopia de reflexão/absorção no infravermelho MAO Oxidação por micro arcos
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MTT Brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio PEB Plasma Electrolytic Boriding
PEC Plasma Electrolytic Carburising
PECVD Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition PED Plasma Electrolytic Deposition
1 INTRODUÇÃO ... 15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 17
2.1 Bioatividade e Osteointegração ... 17
2.2 Fosfatos de Cálcio ... 18
2.2.1 Processos de recobrimento com substâncias bioativas sobre substratos metálicos ... 21
2.3 Tântalo ... 23
2.4 Oxidação Eletrolítica Assistida por Plasma ... 24
2.4.1 O Processo com oxidação eletrolítica assistida por Plasma ... 24
2.4.2 Aplicações da Oxidação eletrolítica assistida por plasmas no tratamento de tântalo ... 28
2.5 Técnicas de Caracterização ... 29
2.5.1 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de raios x ... 29
2.5.2 Espectroscopia de Absorção/Reflexbão no Infravermelho ... 32
2.5.3 Difratometria de raios X ... 34
2.5.4 Perfilometria ... 36
2.5.5 Ensaios biológicos in vitro ... 37
2.5.5.1 Viabilidade e proliferação celulares ... 37
2.5.5.2 Fosfatase alcalina ... 38
3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ... 39
3.1 Preparação das amostras ... 39
3.2 Preparação da solução ... 40
3.3 Oxidação Eletrolítica Assistida por Plasma ... 40
3.4 Caracterização dos filmes ... 42
3.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de raios X ... 42
3.4.2 Espectroscopia de Absorção/Reflexão no Infravermelho ... 42
3.4.3 Difratometria de raios X ... 43
3.4 4 Perfilometria ... 44
3.4.5 Ensaios biológicos in vitro ... 44
3.4.5.1 Viabilidade e proliferação celulares ... 44
3.4.5.2 Fosfatase alcalina ... 45
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 45
4.1 Variação da Tensão na Deposição dos Filmes ... 45
4.1.4 Espectroscopia de Absorção/Reflexão no Infravermelho ... 58
4.1.5 Difratometria de raios X ... 60
4.1.6 Perfilometria ... 63
4.1.7 Estudo da Energia mínima para obtenção de hidroxiapatita ... 64
4.2 Estudo da variação do tempo de tratamento sobre a produção dos revestimentos ... 65
4.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva (Superfície da amostra) ... 66
4.2.2 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva (Corte Transversal) ... 69
4.2.2.1 Estudo do perfil composicional dos revestimentos por Espectroscopia de Energia Dispersiva...73
4.2.3 Medidas de espessura por microscopia eletrônica de varredura ... 76
4.2.4 Espectroscopia de Absorção/Reflexão no Infravermelho ... 77
4.2.5 Difratometria de raios X ... 78
4.2.6 Perfilometria ... 82
4.2.7 Estudo da Energia mínima para obtenção de hidroxiapatita ... 83
4.3 Mecanismo de formação de Ta2O5, HA, α-TCP e CaCO3 em revestimentos por PEO ... 84
4.4 Ensaios biológicos in vitro ... 87
4.4.1 Viabilidade e proliferação celulares ... 87
4.4.2 Fosfatase alcalina ... 88
5 CONCLUSÕES ... 90
REFERÊNCIAS ... 92
APÊNDICE A ... 100
APÊNDICE B ... 102
1 INTRODUÇÃO
Atualmente muitos estudos têm sido realizados em busca de materiais para a fabricação de implantes, principalmente na área ortopédica e odontológica, que apresentem uma boa interação com os tecidos ósseos, estimulando sua integração ao corpo humano (AZEVEDO et al, 2008; HUSSEIN, MOHAMMED, AL-AQEELI, 2015).
O grupo de materiais que mais se assemelha à composição do osso é o das cerâmicas à base de fosfato de cálcio, como a hidroxiapatita. Essas cerâmicas vêm se destacando em razão da semelhança química, mineralógica e cristalográfica com a do esqueleto humano (KARVAT et al, 2005). Porém, sua baixa resistência mecânica limita sua aplicação em regiões sujeitas a esforços mecânicos elevados. A incorporação de outras espécies pode melhorar consideravelmente as propriedades mecânicas desses biomateriais. Implantes porosos de alumina com fosfato de cálcio, por exemplo, foram fabricados para melhorar a resistência mecânica, mantendo a bioatividade e propriedades de osteocondução de cerâmicas de fosfato de cálcio (JUN et al, 2003).
Dentro do corpo humano, o implante, formado por ligas metálicas, pode sofrer vários tipos de corrosão, alterando as propriedades físicas do material. Portanto, a biocompatibilidade e a resistência à corrosão são propriedades fundamentais e, desta forma, novas ligas têm sido testadas quanto à sua aplicabilidade como biomateriais (WIDU et al, 1999). Processos eletroquímicos de corrosão combinados com esforços mecânicos cíclicos podem causar uma maior liberação de íons metálicos levando a falhas no implante (GIORDANI et al, 2003). Geralmente os produtos de corrosão são sais do metal que, estando no meio extracelular, podem ser nocivos aos tecidos causando assim inflamação e posterior necrose dos mesmos (NETO, DUARTE, 1978). Dentre os metais usados para implante, o que mais resiste a todos os tipos de corrosão é o titânio e suas ligas, seguido por nióbio e tântalo (NASCIMENTO,2009).
O tântalo vem ganhando utilização crescente devido ao seu módulo de elasticidade que se situa entre o do osso esponjoso e o do osso cortical (1-16 GPa). Sua biocompatibilidade manifesta através do crescimento osteoblástico, que chega a preencher 40 a 50% das cavidades porosas em cerca de 4 semanas, proporcionando sua aplicação em inúmeras circunstâncias osteoarticulares em que se necessita de preenchimento ósseo. Mais frequentemente é utilizado em cirurgias reconstrutoras do quadril e joelho e, notadamente, em deficiências acetabulares em artroplastia de revisão de quadril (GOMES, 2010). Revestimentos de hidroxiapatita podem ser depositados sobre a superfície de substratos de tântalo a partir do processo de oxidação via eletrólise, ou Oxidação eletrolítica assistida por plasma (PEO), com excelente aplicação em implantes ósseos. A oxidação eletrolítica assistida por plasma combina o plasma atmosférico e a eletrólise convencional com o objetivo de alterar superfícies metálicas, devido à presença de espécies reativas e energéticas (GUPTA, 2007). No processamento com PEO, filmes cerâmicos são produzidos por polarização anódica, com tensões que podem chegar a 1000 V, sobre metais imersos em uma solução eletrolítica aquosa. A ocorrência de descargas elétricas localizadas, também chamadas “microarcos”, as quais dependem de um valor crítico de tensão, juntamente com as características da solução eletrolítica e da sua interação com o metal, determinam a estrutura, a composição química e a morfologia do revestimento na amostra (YEROKHIN, 1999).
A influência dos eletrólitos nas características elétricas de filmes depositados sobre tântalo em processos de oxidação anôdica foi investigada em trabalhos anteriores (FERNÁNDEZ et al, 1981; MONTERO, FERNANDEZ, ALBELLA, 1987; ALBELLA, MONTERO, MARTINEZ-DUART, 1987) porém, informações sobre revestimentos cerâmicos de hidroxiapatita depositados sobre tântalo através do processo PEO para ser utilizado como implante, ainda são bastante escassas.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Bioatividade e Osteointegração
Materiais utilizados para a substituição e regeneração da estrutura óssea enquadram-se na classe dos biomateriais. Estes materiais devem apresentar um conjunto de propriedades físicas, químicas e biológicas compatíveis com os tecidos vivos hospedeiros, de modo a estimular uma resposta adequada dos mesmos. Os materiais sintéticos utilizados para estes fins podem ser metais, polímeros, compósitos, cerâmicas e vidros (KAWACHI, 2000; GUASTALDI, APARECIDA, 2010).
Segundo Turrer e Ferreira (2008) existem quatro tipos de respostas do tecido hospedeiro a implantes:
- a morte do tecido ao redor do material, se o mesmo for tóxico;
- a formação de cápsula de tecido fibroso se o material não é tóxico e biologicamente inativo (bioinerte);
- a formação de uma interface de adesão contínua entre tecido e implante se o material não é tóxico e é biologicamente ativo;
- a substituição do material pelos tecidos, se o material não é tóxico e se degrada, sendo resbsorvido.
Dependendo da natureza da interação do material usado como implante com o tecido vivo, estes materiais podem ser classificados como: bioinertes, biotoleráveis e bioativos. Um material bioinerte não induz resposta local do sistema imunológico, no entanto um material biotolerável induz uma resposta mínima, sendo aceito pelo organismo receptor. O material bioativo permite uma resposta biológica específica na interface com o tecido vivo, possibilitando a formação de uma ligação entre o tecido e o próprio material (GUASTALDI, APARECIDA, 2010).
Neste sentido, muitos estudos têm sido realizados para se obter implantes que combinem a bioatividade das cerâmicas de fosfato de cálcio e a boa resistência mecânica de outro material bioinerte ou biotolerável como, por exemplo, os metais.
2.2 Fosfatos de Cálcio
Fosfatos de cálcio tem se destacado como biomateriais pois possuem características importantes na reposição e regeneração do tecido ósseo devido à semelhança com a fase mineral do osso, apresentando excelente biocompatibilidade e bioatividade. A presença dos íons cálcio e fosfato nestes materiais estimula a interação entre a cerâmica e os fluídos biológicos (KAWACHI, 2000; GUASTALDI,
APARECIDA, 2010).
A hidroxiapatita (HA, Ca5(PO4)3OH) está presente em ossos e dentes de todos os vertebrados, representando 5% do peso total de um indivíduo adulto, 55% da composição de ossos, 96% da composição do esmalte dentário e 70% da dentina. Por este motivo, sua utilização em finalidades clínicas se deve primeiramente à alta compatibilidade e osteointegração, uma forte conexão entre osso e implante. Além disto, não provoca toxicidade local ou sistêmica ou reações inflamatórias. Em consequência disto, a HA tem sido o fosfato de cálcio mais estudado e mais utilizado em aplicações clínicas (GUASTALDI, APARECIDA, 2010).
Uma importante propriedade da HA é a possibilidade de substituições catiônicas e aniônicas em sua estrutura cristalina. Íons Ca2+ podem ser substituídos não apenas por cátions metálicos bivalentes, mas por grande número de cátions monovalentes, além de alguns íons trivalentes, pertencentes aos elementos da família das Terras Raras. Os íons fosfato (PO43-) e hidroxilas (OH-) também podem ser substituídos. A cristalinidade, os parâmetros de rede, o tamanho dos cristalitos, a textura superficial, a estabilidade e a solubilidade da HA, podem ser alteradas em decorrência destas substituições (GUASTALDI, APARECIDA, 2010).
substituições causam efeitos opostos nos parâmetros de rede: substituição do tipo A causa expansão no eixo a e contração no eixo c, enquanto que a substituição do tipo B causa contração no eixo a e expansão no eixo c. Com a substituição do tipo B observa-se a diminuição do tamanho dos cristais e da cristalinidade.Também pode ocorrer a substituição dos íons OH- e PO43- simultaneamente, formando HA carbonatada do tipo AB (LAFON, CHAMPION, BERNACHE-ASSOLLANT, 2008). Estudos realizados por Paganias et al (2012) mostraram que implantes de tântalo poroso recobertos com apatitas carbonatadas levam à um desenvolvimento mais rápido do tecido ósseo, quando comparado a implantes sem este tipo de recobrimento, resultando em uma fixação mais estável entre implante e osso.
Alguns estudos, efetuados por longos períodos de tempo, mostram que a lenta biodegradação de cerâmicas de hidroxiapatita pode limitar o seu uso clínico. É necessário que o processo de degradação do biomaterial seja concomitante com a reposição do osso em formação, ou seja, a velocidade de reabsorção do implante deve ser compatível com a velocidade de formação do osso para que a redução de resistência do implante seja compensada pelo aumento da resistência do osso formado (RIBEIRO, 2003). A hidroxiapatita só começa a ser reabsorvida gradualmente apenas após 4 ou 5 anos de implantação (DE GROOT,1980;
GUASTALDI, APARECIDA, 2010). Uma reabsorção mais rápida, que também evitaria
a presença de material estranho ao organismo por períodos muito longos, pode ser obtida com o aumento da área superficial (pó > sólido poroso > sólido denso), com o decréscimo da cristalinidade, com a diminuição do tamanho dos grãos e pela substituição de CO32- nos sítios de fosfato (NORDSTRÖM, KARLSSON,1990).
A adição de íons magnésio na fase apatita tem atraído pesquisadores devido ao seu significativo impacto no processo de mineralização. Rey et al (2007) verificaram que quando íons Mg2+ substituem os íons Ca+2 (substituições catiônicas) também ocorre um aumento da solubilidade da hidroxiapatita.
Muitos estudos têm sido realizados em relação às propriedades e comportamento biológico de outros fosfatos de cálcio para serem utilizados como biomateriais. Um dos objetivos é o de se aumentar a taxa de degradação do material do implante, em relação a HA, e também aumentar o índice de bioatividade (o tempo necessário para ocorrer 50% da ligação interfacial entre um biomaterial e o tecido ósseo) (HENCH,1998; GUASTALDI, APARECIDA, 2010).
Fosfato de cálcio amorfo (ACP) cuja fórmula química é Ca3(PO4)2.nH2O, apresenta interesse como biomaterial, pois pode se transformar em HA de forma direta ou através de fases intermediárias como fosfato octacálcico (OCP) e HA deficiente em cálcio. Também aparece como uma fase metaestável em soluções aquosas supersaturadas, antes da formação de fosfatos de cálcio. Além disto, possui maior solubilidade no meio biológico em comparação à HA, o que lhe proporciona maior velocidade de degradação (JULIEN et al, 2007).
Fosfato octacálcico (OCP) apresenta fórmula química Ca8(HPO4)2(PO4)4.5H2O e também aparece como uma fase metaestável na formação da HA. Esta transformação ocorre através da sua hidrólise, juntamente com o consumo de íons Ca2+ do fluido biológico. Também possui maior velocidade de reabsorção em comparação à HA estimulando a regeneração, principalmente em aplicações onde se necessita que ocorra uma formação óssea de maneira mais rápida (DEKKER, 2005).
Fosfato tricálcico (TCP) pode ocorrer em até 4 formas alotrópicas sendo que, as de maior relevância, devido as boas capacidades de osteocondução, são as formas alotrópicas α-TCP (sistema monoclínico) e -TCP (sistema romboédrico). A fase α-TCP apresenta maior bioatividade que a fase -TCP devido ao arranjo estrutural desta fase, o qual possibilita que maior quantidade de íons Ca2+ e PO43- seja trocada com o meio biológico (PIRES, BIERHALZ, MORAES, 2015).
2.2.1 Processos de recobrimento com substâncias bioativas sobre substratos metálicos.
Vários procedimentos têm sido empregados para o recobrimento de implantes metálicos com camadas de substâncias bioativas. Entre estes processos pode-se citar algumas técnicas: “Ion Sputtering”, “Plasma Spray”, Sol-Gel, métodos biomiméticos e a eletrólise. Entre estas técnicas, o “Plasma Spray” é a única utilizada para fins comerciais. O pó de HA transportado por um jato de plasma é fundido e ionizado depositando-se sobre o substrato metálico (JARCHO, 1992). Resultados clínicos satisfatórios colocaram uma série de implantes recobertos com HA por “Plasma Spray” no mercado, mas ainda existem algumas desvantagens deste método. A falta de interação química entre o revestimento de HA e o metal, mostra que a ligação entre eles é apenas mecânica, o que faz com que a cerâmica se torne frágil, com baixa resistência à fadiga (PILLIAR et al, 1993). Além disto, as altas temperaturas do plasma, podem causar processos de decomposição da HA, o que modifica sua bioatividade (SERGO, SBAIZERO, CLARKE, 1997).
As vantagens em se aplicar a técnica “Sol-Gel” na fabricação de filmes finos em diferentes substratos, além do baixo custo das instalações, são: a utilização de uma baixa temperatura durante o processamento, a possibilidade do recobrimento de superfícies maiores e a possibilidade de um maior controle das características da camada depositada, permitindo a obtenção de diferentes fosfatos de cálcio. A grande vantagem desta técnica é um maior controle da microestrutura e da morfologia de materiais através da escolha oportuna da composição da solução sol-gel e dos parâmetros de cura (FERRARA, 2010). Um estudo mais recente realizado por Catauro (2016) avaliou formação de revestimentos de CaO/SiO2 modificando a superfície de
titânio comercialmente puro de grau 4, através da técnica sol-gel, avaliando a sua bioatividade e biocompatibilidade. Os materiais preparados pelo processo sol-gel têm se mostrado ser mais bioativos do que aqueles com a mesma composição mas preparados com diferentes métodos. Na literatura ainda não existem relatos da
utilização desta técnica na formação de revestimentos de apatitas sobre substratos
de tântalo, como material a ser utilizado em implantes.
por exemplo, os polímeros. Materiais de formas mais complexas, como materiais porosos, também são favorecidos. O método consiste em colocar o substrato a ser recoberto em uma solução sintética (SBF) de composição iônica semelhante à do plasma sanguíneo. Ocorre a nucleação de HA sobre os íons silicato, adsorvidos na superfície do substrato. Estes íons são originados de uma placa de vidro G bioativo, colocada na solução. A maior desvantagem deste método é o tempo longo para a formação do revestimento, o que leva a uma baixa produtividade (REIS, MONTEIRO, 1996).
A eletrólise é o processo eletroquímico onde ocorrem reações não espontâneas pela passagem da corrente elétrica em uma célula eletrolítica composta por dois eletrodos, a solução eletrolítica e uma fonte de tensão. Neste processo ocorrem reações de oxirredução, sendo que o anodo é o eletrodo onde ocorre a oxidação e o catodo é o eletrodo em que ocorre a redução (LI et al., 2008).
A oxidação anódica é uma das técnicas mais utilizadas para modificação de superfícies metálicas, possibilitando a formação de camadas de óxidos através da passagem da corrente elétrica. As superfícies metálicas carregadas reagem com os íons presentes na solução eletrolítica e uma grande variação nas propriedades químicas e mecânicas pode ser obtida.
2.3 Tântalo
Entre os biomateriais metálicos, o tântalo está ganhando cada vez mais atenção. Este elemento é um metal de transição, sólido metálico de cor prateada e apresenta uma variedade de aplicações, seja como metal puro ou na forma de óxidos ou ligas. Este fato se deve a propriedades relevantes como baixa reatividade (inércia química), ótima ductibilidade, alto ponto de fusão (2980 °C), elevada capacitância, excelente condução de calor e eletricidade, alta bioatividade in vivo (KATO et al, 2000) e elevada resistência à corrosão (BERMUDEZ et al, 2005). Sua elevada resistência à corrosão pode ser explicada pela formação de um filme de óxido na superfície do metal quando exposto as condições atmosféricas normais, de alta resistência e impermeabilidade, chamada de “camada de passivação”. O óxido formado é o Ta2O5, devido sua grande estabilidade (ADAMS, ALIYA, 1990).
O tântalo é resistente a uma grande variedade de ácidos, soluções salinas e compostos orgânicos, além das combinações desses reagentes. Pode ser atacado apenas por ácido fluorídrico, ácido sulfúrico e bases fortes. A resistência à corrosão deste metal pode ser comparada à resistência dos vidros (ADAMS, ALIYA, 1990).
Pelo fato de não sofrer corrosão em contato com fluídos corporais o tântalo não causa irritações no tecido ou rejeições pelo organismo. Este fato, aliado à sua alta biocompatibilidade, faz com que este elemento seja utilizado em cirurgias reparadoras do crânio e em implantes ortopédicos na forma de parafusos para fixação de fraturas (CHRISTIE, 2003) e em “stents” vasculares para evitar colapso de artérias.
Mareci et al (2009), estudaram a resistência à corrosão de ligas Ti-Ta em diferentes meios de saliva artificial, contendo NaF e ácido lático para aplicação odontológica, variando a porcentagem em massa de tântalo (30, 40, 50 e 60%). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados do mesmo teste realizado para a liga Ti-6Al-7Nb. A maior resistência à corrosão de todas as ligas Ti -Ta testadas, foi atribuída à formação do óxido Ta2O5 na superfície do implante, o qual é mais estável que TiO2 neste meio. Pode-se verificar que a adição de tântalo ao titânio aumenta a resistência mecânica, além de aumentar a resistência à corrosão.
amostras porosas de Titânio. A biocompatibilidade foi estudada através de ensaios MTT e estudos de imunoquímica e observou-se excelente crescimento, adesão e diferenciação celulares nas estrururas de tântalo poroso, quando comparadas ao titânio poroso. Estes resultados indicam que as estruturas porosas de Tântalo proporcionam uma maior fixação biológica devido à sua composição química, alta molhabilidade e a sua maior energia de superfície.
Leng et al (2006) estudaram a adesão de células endoteliais a substratos de aço 316L, titânio grau 2 e tântalo. Este último apresentou maior biocompatibilidade com o sangue que os outros substratos pois uma maior quantidade de células foram aderidas por unidade de área, comprovando sua grande biocompatilidade em contato com fluidos corpóreos.
Apesar das suas excelentes características, o elevado custo na produção de implantes de tântalo, tem limitado sua aceitação. Porém, deve-se considerar a maior durabilidade deste material, tendo em vista que ele pode ser utilizado como biomaterial por um longo período de tempo, sem causar prejuízos.
2.4 Oxidação eletrolítica assistida por plasma
2.4.1 O Processo com Oxidação eletrolítica assistida por plasmas.
Como o plasma formado na interface metal-solução eletrolítica envolve todas as superfícies do substrato, além de ser um tratamento rápido, com um equipamento semelhante aos banhos eletrolíticos clássicos, uma produção em série de materiais mais complexos pode ser realizada (YEROKHIN, 1999).
O mesmo processo pode receber a denominação de Deposição eletrolítica com plasma (PED) quando se deseja a formação de revestimentos sobre a amostra. Este processo pode ser dividido em oxidação eletrolítica por Plasma (PEO) e saturação eletrolítica por plasma(PES) (YEROKHIN, 1999).
O processo PES, por sua vez, também pode ter outras denominações: carbonetação eletrolítica por plasma (PEC) (DURADGY et al, 1986); nitretação eletrolítica por plasma (PEN) (LAZARENKO et al,1979) e boretação eletrolítica por plasma (PEB) (KUZENKOV, SAUSHKIN, 1997) entre outros. Todos estes processos mostraram resultados promissores nas características tribológicas das camadas superficiais formadas, resistência à corrosão, bom desempenho como barreira térmica, além do baixo custo do processamento.
O processo PEO é utilizado para converter a superfície de metais em uma camada de óxido cerâmico como alumina, sílica, titânia, entre outros (YEROKHIN, 2004). O substrato metálico, mergulhado em uma solução eletrolítica aquosa, sofre um processo de oxidação, ocorrendo a formação de um revestimento em sua superfície. Isto só é possível pela ação de descargas elétricas localizadas chamadas “microarcos”, os quais irão determinar o crescimento, a estrutura, a composição química e a morfologia do revestimento. Estes revestimentos proporcionam uma maior resistência ao desgaste, resistência à corrosão, além de aumentar a proteção térmica (CURRAN, CLYNE, 2006).
Nos tratamentos eletrolíticos convencionais, os quais utilizam diferenças de potencial relativamente baixas, a cinética dos processos que acontecem nos eletrodos obedece a lei de Faraday e a relação entre a tensão e a corrente obedece a Lei de Ohm.
Comparando a curva “a” na região entre 0 e U1 com a curva “b” na região entre 0 a U4, podemos verificar que um aumento na diferença de potencial faz com que ocorra um aumento proporcional da corrente, da mesma forma que na eletrólise convencional. A partir destes valores os sistemas passam a ter comportamentos diferentes.
Figura 1: Curvas da variação da tensão em relação à corrente elétrica na oxidação
eletrolítica assistida por plasma. A curva “a” representa as reações que ocorrem na interface metal/solução, onde há liberação de gás e a curva “b” representa o processo de oxidação na
superfície do anodo (crescimento do filme) (adaptado de YEROKHIN et al., 1999).
tão altos quanto 104 K. Na região compreendida entre U2 e U3, ocorre uma queda na corrente devido à formação do filme de óxido sobre o substrato (conforme mostra a curva “b”) e a consequente estabilização do plasma (YEROKHIN et al, 1999). A partir do ponto U3 a corrente se mantem praticamente constante, mesmo com o aumento da tensão e os micros-arcos se transformam em arcos de alta potência térmica.
Na curva “b” uma fina camada de óxido que se forma naturalmente sobre a superfície do metal começa a dissolver no ponto “U4” (ponto que corresponde ao potencial de corrosão do material) (YEROKHIN et al, 1999). Entre os pontos U4 a U5 ocorre a formação de um filme de óxido poroso, causando um aumento na corrente elétrica até o ponto U5. Neste ponto ocorre a ruptura da rigidez dielétrica do filme, principalmente por ionizações por impacto, o que causa o surgimento de microarcos elétricos. São observadas centelhas uniformes que envolvem todo o eletrodo. No ponto U6 o mecanismo de ionização por impacto é reforçado pelo início do processo de ionização térmica, acompanhado pelo surgimento de centelhas isoladas e que se movem rapidamente por toda a superfície do eletrodo. Na região entre os pontos “U6 -U7” a ionização térmica vai sendo parcialmente bloqueada pelo aumento da espessura do filme de óxido e ocasiona a diminuição da descarga no substrato. Descargas de baixa energia são acompanhadas pela diminuição da corrente e da quantidade de microarcos. A partir do ponto U7 as microdescargas que acontecem ao longo do filme penetram através do substrato e se transformam em arcos intensos, de alta potência, conduzindo a oscilações de corrente. Em decorrência deste fato danos podem ser causados no revestimento como, por exemplo, o surgimento de trincas (YEROKHIN et al, 1999).
2.4.2 Aplicações da Oxidação eletrolítica assistida por plasmas no tratamento de tântalo
Wang et al (2013) estudaram as características e o comportamento do crescimento interno e externo de revestimentos formados por óxidos de tântalo em substrato de tântalo puro, utilizando uma solução eletrolítica formada por acetato de cálcio e -glicerofosfato disódio através da oxidação por PEO. Os autores não obtiveram a formação de hidroxiapatita. A análise dos revestimentos mostrou apenas a presença de Ta2O5, TaO e de CaTa2O6, em maior quantidade. Os mesmos se mostraram porosos, com boa adesão e sem interface aparente com o substrato de tântalo. Os resultados obtidos utilizando-se tensões de 350 e 450 V, não mostraram diferenças em relação ao crescimento do revestimento. No primeiro estágio, de 0 a 1 min de tratamento, houve um grande aumento na espessura total do revestimento, sendo que o crescimento externo é dominante sobre o interno. De 1 a 5 min a espessura total do revestimento aumenta de forma mais lenta, sendo que o crescimento externo diminui sua velocidade e o crescimento interno mantém o mesmo comportamento. No último estágio analisado (de 5 a 15 min em 350 V e de 5 a 20 min em 450 V) o crescimento interno do revestimento se torna predominante.
Petkovi´c et al (2011) utilizaram o processo de oxidação eletrolítica a plasma para obterem revestimentos de óxidos em substratos de tântalo utilizando 0.001 M do ácido H4SiW12O40 (pH 2.8) como eletrólito. O processo PEO foi dividido em três fases estudando-se a variação da tensão em relação ao tempo de tratamento. Através dos estudos realizados pode-se chegar à conclusão de que a morfologia do revestimento óxido é fortemente dependente do tempo de tratamento. Os óxido encontrados no revestimento foram WO3, Ta2O5 e SiO2. Análises por XRD mostraram que a quantidade de WO3 aumenta com o tempo de tratamento, enquanto que a quantidade de Ta2O5 e SiO2 diminuem. Durante o tratamento, a densidade das descargas diminuem enquanto o diâmetro dos poros aumenta resultando, consequentemente, no aumento da rugosidade do revestimento óxido.
óptica (OES). A densidade espacial das microdescargas é maior após 2,5 min de tratamento e sofre uma redução consideravel durante os 5 minutos seguintes, permanecendo praticamente constante para tratamentos mais longos. Foram detectadas pequenas microdescargas (com área de seção transversal de 0,1 mm2) durante todo o tratamento com PEO, enquanto que a presença de microdescargas de tamanho médio (com área de secção transversal entre 0,1 mm2 e 0,2 mm2) e microdescargas de maior tamanho (com área de seção transversal maior que 0,2 mm2) tornaram-se visíveis apenas no final do tratamento. Durante todo o processo pode-se observar que a espessura média do revestimento aumentou cerca de 1,3 µm/min. Os revestimentos apresentaram uma microestrutura típica do processo PEO com duas regiões distintas, ou seja, camada interna fina, compacta e adjacente ao substrato de tântalo e uma camada externa porosa. Com aumento do tempo do processo PEO, as microdescargas criaram defeitos nos revestimentos, proporcionando maior rugosidade da superfície.
O processo de oxidação anódica em tântalo metálico foi investigado por Sowa et al (2013), usando uma solução eletrolítica composta por silicato de potássio (K2SiO3) e hidróxido de potássio (KOH) em diferentes tensões (100, 200 e 400 V). Quando o processo foi realizado à tensão de 400 V, pode-se observar o desenvolvimento de uma estrutura altamente porosa, típica do processo de oxidação eletrolítica assistida por plasma. Silício foi encontrado na forma de sílica e outras espécies de silicatos, sendo a sílica a forma predominante. A anodização sob condições específicas mostrou ser eficiente na melhoria da resistência à corrosão de tântalo quando em contato com fluídos corpóreos (solução fisiológica de Ringer).
2.5 Técnicas de Caracterização
2.5.1 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios X
informações com resoluções maiores, tornando-se importantes métodos de caracterização de superfícies (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009).
Os dois métodos mais importantes são a microscopia eletrônica de varredura e a microscopia eletrônica de transmissão. Porém, esta revisão será restrita à microscopia eletrônica de varredura (MEV), devido à sua utilização na caracterização das amostras no presente trabalho.
O funcionamento do MEV se baseia na emissão de feixes de elétrons a partir de uma fonte de filamento de tungstênio. Os elétrons são acelerados a energias entre 0,5 e 30 KeV. O sistema formado por lentes magnéticas condensadoras é responsável pela correção do percurso dos elétrons em direção à objetiva, a qual determina o tamanho do feixe que atinge a superfície da amostra a ser analisada (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009). Este feixe de elétrons altamente energéticos irá interagir com os átomos que compõe a amostra gerando uma grande variedade de sinais: elétrons secundários, elétrons retroespalhados, elétrons Auger, raios X e luminescência catódica (Figura 2). Estes sinais fornecem vários tipos de informações utilizadas em diferentes análises.
Figura 2: Interações entre um feixe de elétrons e a amostra
(adaptado de HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009)
secundários têm baixo poder de penetração na amostra, pois possuem baixa energia e o sinal gerado por eles depende do ângulo de incidência do feixe e da ondulação da superfície da amostra sob análise. Desta forma, a emissão de elétrons secundários fornece informações sobre a topografia da superfície da amostra.
Elétrons retroespalhados possuem energia mais alta que os elétrons secundários, chegando a atingir profundidades maiores na amostra e, desta forma, informam características das camadas mais profundas. É importante observar que os elétrons retroespalhados produzidos em regiões mais profundas na amostra, também têm energia suficiente para originar elétrons secundários quando estão voltando para a superfície.
Microscópios eletrônicos de varredura podem possuir um espectrômetro por energia dispersiva (EDS) acoplado para análises composicionais da amostra. Quando átomos da amostra são bombardeados pelo feixe de elétrons do microscópio, ocorre a ejeção de um elétron de uma camada mais interna de um átomo originando uma vacância (espaço vazio). Este espaço vazio é preenchido pela transição de um elétron de uma das camadas intermediárias. Dois fenômenos podem ser produzidos nesta transição: a emissão de um fóton de raio X característico ou a emissão de um outro elétron de uma camada mais externa que pode ter absorvido este fóton. O elétron emitido é conhecido como “Auger” (LENG, 2008). Este elétron possui energia característica do material, sendo que sua energia máxima é de aproximadamente 2 keV.
Outro fenômeno que também pode ocorrer é a “fluorescência”. Quando um elétron salta de uma camada de maior energia para uma de menor energia, com a finalidade de preencher uma vacância, a diferença de energia pode ser emitida do átomo como um fóton de raio-X. Este fóton pode ser absorvido por outro átomo, o qual irá emitir outro raio-X, porém, de menor energia.
No processo chamado de Luminescência Catódica, ocorre a liberação de energia da amostra na forma de luz (fótons). Estes fótons são emitidos em consequência de transições eletrônicas de baixa energia por elétrons das camadas mais externas do átomo. A de-excitação de átomos ou moléculas também pode provocar a emissão deste tipo de fóton.
2.5.2 Espectroscopia de Absorção/Reflexão no Infravermelho
A região espectral do infravermelho compreende a faixa com números de onda de 12.800 a 10 cm-1 (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009) e se encontra entre a região de micro-ondas e a região da luz visível do espectro eletromagnético. As frequências de vibração da maioria das moléculas abrangem a faixa de 670 a 4.000 cm-1, que corresponde ao infravermelho (IR) médio.
A Espectroscopia de Absorção/Reflexão no Infravermelho, IRRAS, pode identificar grupos químicos, fornecendo informações importantes sobre a composição química da amostra a ser analisada (PAVIA, 2010).
A maioria dos instrumentos para a região do infravermelho (IR) médio, até o início da década de 80 empregava redes de difração. Atualmente, a maioria dos espectrômetros utiliza transformada de Fourier por apresentar diversas vantagens:
- possuem poucos elementos ópticos, não possuem fendas, portanto, a potência que atinge o detector é bem maior do que nos instrumentos do tipo dispersivos, aumentando a razão sinal/ruído;
- possuem poder de resolução extremamente alto e alta reprodutibilidade do comprimento de onda;
- podem obter dados de todo espectro de forma muito rápida (1 segundo ou menos), pois todos os comprimentos de onda da fonte atingem o detector de forma simultânea (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009).
energia rotacionais para cada nível vibracional, líquidos e sólidos apresentam rotação reduzida, mostrando apenas bandas vibracionais.
Existem dois modos de vibrações moleculares: estiramento e deformação angular (Figura 3). O estiramento depende da variação na distância interatômica ao longo de um eixo, enquanto a deformação depende da variação no ângulo entre duas ligações.
Figura 3: Vibrações moleculares: Estiramento (a) e Deformação Angular (b)
Amostras sólidas de difícil manipulação podem ser analisadas qualitativa e quantitativamente por espectrometria de reflexão no IR. Os espectros obtidos são similares aos espectros de absorção. O gráfico de reflectância indica a fração refletida da energia da radiação incidente com a variação no número de onda ou comprimento de onda. Espectros de amostras em pó podem ser obtidos com sucesso através de espectrometria IR de refletância difusa com transformada de Fourier, permitindo um preparo rápido da amostra sem alteração em sua composição original.
2.5.3 Difratometria de raios X
A técnica de difração de raios X é a mais indicada na determinação das fases cristalinas presentes em materiais cerâmicos, pois, na maior parte dos sólidos cristalinos os átomos se dispõem em planos cristalinos ordenados separados entre si por distâncias da mesma ordem de grandeza dos comprimentos de onda desta radiação (ALBERS et al, 2002). Os raios X, de comprimento de onda , incidem na superfície de um cristal a um ângulo θ e, ao serem espalhados, sofrem interferências construtivas e destrutivas e o resultado deste processo é a difração.
A Lei de Bragg, conforme a equação 1, estabelece a relação entre o ângulo de difração e a distância entre os planos que a originaram, os quais são característicos para cada fase cristalina:
n = βd sen θ Equação(1) Onde:
n: um valor inteiro
μ comprimento de onda dos raios X incidentes d: distância interplanar do cristal
A figura a seguir ilustra a formação de picos de difração conforme a lei de Bragg quando vista no nível de planos cristalinos:
Figura 4: Interferência entre raios a nível planar
As linhas horizontais na Figura 4 representam os planos cristalinos, e as setas representam os raios-x incidentes no cristal. O ângulo de Bragg (θ) é o ângulo onde há um pico de intensidade, devido à interferência construtiva das ondas espalhadas relativo ao plano hkl.
Ao incidirmos o feixe em ângulos variáveis em uma amostra com certa distribuição de pequenos cristalitos e colocarmos essas intensidades em função do ângulo de espalhamento βθ (ângulo entre a onda incidente e a onda espalhada), iremos obter um gráfico chamado difratograma.
Figura 5: Representação esquemática de um difratômetro
Cada estrutura cristalina produz um padrão de difração característico. O difratograma resultante da análise é composto ângulos de difração (no eixo x) e intensidades (no eixo y), e pode ser comparado a padrões produzidos por estruturas conhecidas e previamente analisadas do Comitê da Junta de Padrões de Difração de Pós (JCPDS) da ASTM como, por exemplo, para os vários fosfatos de cálcio, analisados neste trabalho. Logo, a localização e a intensidade dos picos fornecerão um espectro característico que será utilizado na análise qualitativa. Essa análise identificará a presença de fases cristalinas, mas não de fases amorfas ou de baixa cristalinidade.
2.5.4 Perfilometria
ser realizadas em diferentes pontos da amostra, calculando-se a média aritmética dos valores encontrados.
2.5.5 Ensaios biológicos in vitro
Para se estudar a biocompatibilidade de um novo material, experimentos in vitro e in vivo devem ser realizados com a finalidade de se avaliar os possíveis efeitos locais e sistêmicos do material em contato com tecidos e células (RICKERT, 2006). Testes in vitro devem ser realizados antes dos testes in vivo, conforme as regras das agências regulatórias e protocolos padrões como, por exemplo, a ISO (International Organization for Standardization) e a ASTM (American Society for Testing and Materials).
Testes in vitro, em escala laboratorial, são mais rápidos (comparados aos testes in vivo) e obrigatórios além de apresentarem custo menor. Todavia, muitos não representam todas as condições fisiológicas de forma apropriada. Mas, mesmo assim, são considerados efetivos para o primeiro passo em avaliações de biocompatibilidade.
2.5.5.1 Viabilidade e proliferação celulares
Ensaios de oxidação metabólica do MTT (brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio), um sal de coloração amarela e solúvel em água, são utilizados para determinar a viabilidade celular, determinando quanto do MTT adicionado ao meio foi reduzido pela atividade metabólica celular formando cristais de formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em água). Desta forma, a mortalidade celular ou a perda da permeabilidade da membrana, inibem a incorporação deste corante. A quantidade de formazan, medida por espectrofotometria, é diretamente proporcional à atividade mitocondrial e a viabilidade celular. Mossman (1983) foi o primeiro a sugerir este teste. Este procedimento é simples e possibilita a análise de citotoxidade de grande número de amostras.
2.5.5.2 Fosfatase alcalina
A enzima fosfatase alcalina (ALP) pode ser encontrada em altas concentrações nas células ósseas (osteoblastos). Ela é responsável por catalisar uma reação de hidrólise que converte o p-nitrofenilfosfato dissódio em p-nitrofenol, aumentando a concentração local de fosfato inorgânico (Figura 6). O p-nitrofenol pode ser dissociado em p-nitrofenolato, de coloração amarela, o qual absorve luz em 400 nm, podendo então ser quantificado através de um espectrofotômetro. Desta forma, o aumento da quantidade de fosfatase alcalina, demostra o aumento da atividade osteoblástica (COLEMAN, 1992).
3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
A preparação das amostras, o sistema para processamento a plasma em meio eletrolítico e as técnicas de caracterização dos filmes obtidos, foram realizadas no Laboratório de Plasmas Tecnológicos, LaPTec, do Campus da Unesp em Sorocaba.
3.1 Preparação das amostras
Os substratos de tântalo utilizados, com dimensões de 10 mm X 25 mm X 0,03 mm, possuíam a seguinte composição (determinada por Espectroscopia de Energia Dispersiva de raios X):
Elementos % Atômica % em Massa
Carbono 16,68 1,57
Oxigênio 12,56 1,57
Silício 2,92 0,64
Tântalo 67,32 95,39
Mercúrio 0,52 0,82
Tabela 1: Composição do substrato de tântalo: proporção atômica e proporção em massa
dos elementos presentes.
3.2 Preparação da solução
Tratamentos com oxidação eletrolítica assistida por plasma (PEO) tem proporcionado a formação de revestimentos de hidroxiapatita em ligas metálicas utilizando-se como solução eletrolítica glicerofosfato disódio e acetato de cálcio. Estudos realizados por Sun et al. (2007) e Antonio et al (2014) mostraram que, com uma solução com 0,2 mol.L-1 de acetato de cálcio e 0,02 mol.L-1 de glicerofosfato de sódio, utilizando-se o sistema PEO, foi possível obter um revestimento de hidroxiapatita em ligas de Ti6Al4V e Ti grau 4, respectivamente.
A solução eletrolítica utilizada para realização deste trabalho foi composta de glicerofosfato disódio e acetato de cálcio com concentrações de 0,02 mol.L-1 e 0,2 mol.L-1 respectivamente. O preparo da solução foi realizado através da mistura de 4,32 g de glicerofosfato disódio e 35,24 g de acetato de cálcio, pesados em uma balança analítica Quimis® colocados em um béquer de 500 mL e dissolvidos em aproximadamente 200 mL de água destilada. Em seguida, colocou-se a solução em um balão volumétrico de 1 L, completando-se o volume com água destilada.
Para cada amostra tratada foi utilizado cerca de 300 ml de solução e, para garantir que as condições de igualdade de tratamento fossem mantidas, a solução eletrolítica foi trocada a cada experimento.
3.3 Oxidação eletrolítica assistida por plasma
Para a realização do processamento a plasma foi utilizado um sistema constituído por uma fonte de tensão MAO-30 da Plasma Technology Ltd e um sistema de eletrodos, os quais se encontram no Laboratório de Plasma Tecnológico da Unesp de Sorocaba.
0,1 A/cm2, sendo que os valores foram registrados a cada minuto. O ciclo de trabalho, definido pela equação 2, foi fixado em 60%.
on 100%
on off t
Dt x
t t
Equação 2
Onde:
- (� + � ��) é a duração do pulso - � é o tempo ligado
- � �� é o tempo desligado do pulso.
O tempo de tratamento foi variado de 60 a 600 s. A temperatura da solução foi medida com um termômetro e, antes do início das deposições, se manteve em torno de 26° C, enquanto que durante o tratamento as leituras foram feitas próximas ao eletrodo, a cada minuto, obtendo-se um valor máximo de aproximadamente 60° C.
3.4 Caracterização dos filmes
A morfologia da superfície e a espessura das amostras foram investigadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A rugosidade dos filmes depositados a plasma eletrolítico foi medida por perfilometria. A composição química dos filmes foi analisada por espectroscopia de energia dispersiva (EDS), enquanto a estrutura química foi analisada por espectroscopia de absorção/reflexão no infravermelho (IRRAS), e difração de raios X (DRX). Foi avaliado também o efeito dos filmes depositados a plasma sobre o tântalo no crescimento de células osteoblásticas.
3.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raio X
O estudo morfológico das amostras antes e após o tratamento foi realizado por um Microscópio Eletrônico de Varredura (JEOL JSM-6010LA) e um Espectrômetro de Energia Dispersiva (Oxford Instruments - EDS 6650), acoplado ao microscópio, foi usado para análise composicional das amostras. A distância entre o detector e a amostra foi de 10 mm, a energia do feixe de elétrons de 20 keV e as micrografias foram obtidas através da emissão de elétrons retroespalhados e secundários. Os equipamentos mencionados pertencem ao Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais (LMCMat) da Unesp-Sorocaba.
3.4.2 Espectroscopia de Absorção/Reflexão no Infravermelho
3.4.3 Difratometria de raios X
As análises do substrato de tântalo e das amostras tratadas por Difração de Raios X foram realizadas em um equipamento Panalytical – X´Pert PRO MPD, com tubo de cobre e detector de ionização, do Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais (LMCMat) da Unesp-Sorocaba. A fonte de raios X operou em 45 kV e 40 mA no modo 2 Theta-Theta com feixe incidente em 0,5°, varredura dos ângulos de 20° a 90°e fenda divergente fixa de 1/32°. Foi utilizado um passo de 0,05º e o tempo por passo foi de 3 segundos.
Para uma melhor certificação dos resultados obtidos nos difratogramas, foi realizado o refinamento de estruturas cristalinas, através do “Método Rietveld”, utilizando-se o programa X’Pert HighScorePlus tendo como base de dados o PDF (Powder Diffraction File- PDF2-2003 distribuído pelo Joint Commitee on Powder Diffraction Standards– JCPDS).
3.4.4 Perfilometria
As medidas de rugosidade dos filmes obtidos após o tratamento foram realizadas com o perfilômetro Veeco Dektak D150 do Laboratório de Plasmas Tecnológicos (LaPTec) da Unesp-Sorocaba. Os valores de rugosidade apresentados correspondem à média aritmética de 10 medidas realizadas em diferentes regiões da amostra.
Os parâmetros utilizados para a análise das amostras
Raio da ponta 12,5 µm
Duração da medida 15 s
Comprimento de varredura 2000 µm
Carga Aplicada 3,0 mg
Tabela 2: Parâmetros para a análise das amostras
3.4.5 Ensaios biológicos in vitro
3.4.5.1 Viabilidade e proliferação celulares
3.4.5.2 Fosfatase alcalina
Após 7 e 14 dias de cultivo, a fosfatase alcalina foi medida utilizando o SensoLyte® pNPP Kit de Ensaio de Fosfatase Alcalina (Anaspec, Inc.), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os osteoblastos foram lavados duas vezes com PBS e as células foram lisadas com Triton X-100. O meio contendo o lisado celular foi coletado e centrifugado a 2500 rpm durante 5 min a 4° C. 100 µl de sobrenadante foram transferidos para uma placa de cultura de 96 poços e 50 µL de solução de substrato pNPP foi adicionado a cada poço. Após 30 min de incubação, 100 µL da solução foi transferido para um novo poço e a absorvância medida num leitor de microplacas Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA), utilizando um filtro de comprimento de onda de 405 nm.
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Variação da Tensão na Deposição dos Filmes
Esta seção abordará os resultados obtidos após a deposição de filmes em amostras de tântalo, utilizando-se um tempo de tratamento de 300 segundos, variando-se a tensão de 350 a 500 V. O tempo escolhido foi baseado em testes preliminares onde se obteve a maior proporção atômica de Ca e P, determinadas por EDS, em diferentes potenciais estudados (Apêndice B)
4.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de raios X (Superfície da amostra)
Figura 8: Micrografia eletrônica de varredura da superfície do tântalo.
Comparando as micrografias das amostras de tântalo, após tratamento com PEO em diferentes tensões (Figura 9), com as micrografias de tântalo sem tratamento (Figura 8), podemos verificar uma grande mudança na topografia das superfícies, salientando-se que as imagens obtidas são representativas de toda região amostral.
Na micrografia da amostra tratada com 350 V (Figura 9 a) podemos verificar a existência de poros bem distribuídos, de tamanhos variados e a ausência de estruturas de revestimento observadas nas figuras 9 b e 9 c. A partir de 450 V (Figura 9 b) pode-se observar um pequeno aumento no tamanho dos poros e o surgimento de estruturas de revestimento de tamanhos variados sobre os mesmos. Com o tratamento de 500 V, observa-se que os poros foram recobertos pelo material do revestimento e as estruturas, de tamanhos variados, apresentam-se de forma mais aglomerada (Figura 9 c). A formação deste filme é semelhante ao observado por Sun, Han e Huang (2007) ao depositarem um filme de hidroxiapatita na forma cristalina em substratos de Ti6Al4V pelo processo PEO.
menores que 10 m não oferecem espaço suficiente para o crescimento das células ósseas em seu interior, mas oferecem uma rugosidade superficial, necessária ao processo de adesão celular na interface osso-implante(LI et al, 2005).
Figura 9: Micrografias eletrônicas de varredura da superfície do tântalo após tratamento
com PEO durante 300 segundos em diferentes tensões: (a) 350 V, (b) 450 V, (c) 500 V .
A avaliação química qualitativa por espectroscopia de energia dispersiva (EDS), foi realizada para complementar a análise da morfologia superficial dos revestimentos obtidos. Os resultados são apresentados na Figura 10.
350 450 500
0 10 20 30 40 50 60
P
ro
po
rç
ão
a
tô
mic
a
(%)
Diferença de potencial (V)
C O P Ca Ta
Figura 10: Proporções atômicas determinadas por EDS das superfícies de amostras de
O elemento presente em maior proporção atômica, nas três tensões utilizadas, é o oxigênio, sendo que sua proporção apresentou uma pequena diminuição com o aumento da tensão. Este elemento é incorporado devido às reações principais no processo de oxidação no anodo (substrato de tântalo). Na interface substrato/eletrólito a água sofre um processo de ionização produzindo íons O-2 segundo a reação:
2H2O βO²ˉ + 4H+ Equação(3)
Os íons O-2 reagem com Ta (no substrato) ou íons Ca+2 (presentes na solução) e são incorporados no revestimento, na forma de óxidos.
O aumento da tensão de 350 para 450 V fez com que a proporção de fósforo, RP, aumentasse cerca de três vezes. Quando a diferença de potencial foi aumentada para 500 V, a quantidade de fósforo incorporada diminuiu. O aumento de RP com o aumento da tensão deve ter ocorrido devido à hidrólise do glicerofosfato na solução na região adjacente ao eletrodo onde a temperatura é mais alta, gerando a formação de uma quantidade maior de íons fosfatos, os quais são incorporados ao substrato. A diminuição da proporção de fósforo presente na superfície do substrato em 500 V pode ser explicada pelo aumento da temperatura provocada pela maior diferença de potencial, o que pode ter causado a difusão dos íons para o interior do substrato. Isto pode ser confirmado comparando-se a proporção de fósforo na superfície e no corte transversal do substrato de tântalo no tratamento de 500 V (Figura 19).
A proporção atômica de cálcio praticamente dobra de 350 a 450 V, permanecendo constante em 500 V. A maior proporção de cálcio na superfície do revestimento em relação ao fósforo, cerca de cinco vezes maior, pode ter ocorrido também, devido à maior decomposição do acetato de cálcio na região próxima ao substrato, onde a temperatura é maior.
Grupos fosfatos, aderidos ao substrato de tântalo, carregados negativamente, combinam-se com íons cálcio, carregados positivamente, formando fosfatos de cálcio que posteriormente podem se transformar em hidroxiapatita
(ANDRADE, DOMINGUES, 2006).
92%, da proporção de tântalo com o aumento da diferença de potencial de 350 para 450 V. Além disto, este elemento não foi detectado na amostra tratada com 500 V (Figura 10), o que pode ser explicado pela formação do revestimento composto por outros elementos sobre o substrato.
Carbono teve sua proporção aumentada com o aumento da tensão e encontra-se distribuído de maneira uniforme sobre o substrato, conforme o mapeamento realizado por EDS para este elemento. Como o substrato foi tratado exposto à atmosfera e em solução aquosa, é provável que os átomos de carbono tenham sido incorporados na forma de dióxido de carbono (CO2) em todos os tratamentos, com as diferentes tensões utilizadas. O CO2 do ar reage com íons hidroxila (OH-), que se encontram livres na solução, formando o ácido carbônico (H2CO3). A decomposição do ácido carbônico leva a formação de carbonatos e, desta forma, poderá também ocorrer a formação de carbonato de cálcio (CaCO3). Átomos de carbono também podem ter sido incorporados na forma de acetatos (CH3COO) -provenientes da dissociação do acetato de cálcio, usado como eletrólito. Segundo Miyake et al (1990), nas hidroxiapatitas sintéticas, os íons carbonatos localizam-se em canais e podem ocupar os mesmos sítios dos íons fosfatos. Isto também pode explicar a diminuição de fósforo e o aumento da proporção de carbono nos revestimentos produzidos sob maior diferença de potencial.
4.1.2 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de raios X (Corte Transversal)
A Figura 11 mostra a microestrutura de um corte transversal de uma amostra de tântalo com espessura de aproximadamente 35,3 µm como recebida.
Figura 11: Micrografia eletrônica de varredura do corte transversal de um substrato de
