Viabilidade e proliferação celulares

O ensaio metabólico colorimétrico do MTT avaliou a citocompatibilidade das amostras e a capacidade de sustentar o crescimento das células osteoblásticas após os tempos de 1 e 7 dias de cultivo (MOSMANN, 1983). Foram utilizadas três amostras para cada teste e foram semeadas 1x103 _{células/mL. Após os tempos de}

cultivo o meio de cultura foi removido e os poços contendo as amostras foram lavados 3 vezes com solução tampão PBS a 0,1M. Em seguida, foram adicionados a cada poço 600 L de meio DMEM contendo 60 L de MTT (5mg/mL). As amostras foram incubadas por 4 horas a 37° C, no escuro. Após esse tempo, a solução contendo MTT foi substituída por uma solução de 600 L de dimetil sulfóxido (DMSO) dos quais 100 L foram transferidos para uma nova placa. A absorbância do MTT foi medida em 570 nm por um leitor Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA).

3.4.5.2 Fosfatase alcalina

Após 7 e 14 dias de cultivo, a fosfatase alcalina foi medida utilizando o SensoLyte® pNPP Kit de Ensaio de Fosfatase Alcalina (Anaspec, Inc.), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os osteoblastos foram lavados duas vezes com PBS e as células foram lisadas com Triton X-100. O meio contendo o lisado celular foi coletado e centrifugado a 2500 rpm durante 5 min a 4° C. 100 µl de sobrenadante foram transferidos para uma placa de cultura de 96 poços e 50 µL de solução de substrato pNPP foi adicionado a cada poço. Após 30 min de incubação, 100 µL da solução foi transferido para um novo poço e a absorvância medida num leitor de microplacas Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA), utilizando um filtro de comprimento de onda de 405 nm.

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Variação da Tensão na Deposição dos Filmes

Esta seção abordará os resultados obtidos após a deposição de filmes em amostras de tântalo, utilizando-se um tempo de tratamento de 300 segundos, variando-se a tensão de 350 a 500 V. O tempo escolhido foi baseado em testes preliminares onde se obteve a maior proporção atômica de Ca e P, determinadas por EDS, em diferentes potenciais estudados (Apêndice B)

4.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de raios X (Superfície da amostra)

As superfícies das amostras de tântalo sem recobrimento e após tratamento com PEO durante 300 segundos em diferentes tensões (350, 450 e 500 V) foram analisadas por MEV. A Figura 8 mostra a micrografia superficial da amostra de tântalo sem revestimento.

Figura 8: Micrografia eletrônica de varredura da superfície do tântalo.

Comparando as micrografias das amostras de tântalo, após tratamento com PEO em diferentes tensões (Figura 9), com as micrografias de tântalo sem tratamento (Figura 8), podemos verificar uma grande mudança na topografia das superfícies, salientando-se que as imagens obtidas são representativas de toda região amostral.

Na micrografia da amostra tratada com 350 V (Figura 9 a) podemos verificar a existência de poros bem distribuídos, de tamanhos variados e a ausência de estruturas de revestimento observadas nas figuras 9 b e 9 c. A partir de 450 V (Figura 9 b) pode-se observar um pequeno aumento no tamanho dos poros e o surgimento de estruturas de revestimento de tamanhos variados sobre os mesmos. Com o tratamento de 500 V, observa-se que os poros foram recobertos pelo material do revestimento e as estruturas, de tamanhos variados, apresentam-se de forma mais aglomerada (Figura 9 c). A formação deste filme é semelhante ao observado por Sun, Han e Huang (2007) ao depositarem um filme de hidroxiapatita na forma cristalina em substratos de Ti6Al4V pelo processo PEO.

Esta estrutura porosa, de grande importância para o processo de osteointegração, permite uma “ancoragem biológica”, ou seja, o crescimento ósseo no interior dos poros. O sucesso de um implante também irá depender do tamanho desses poros. Na literatura existem diferentes estudos sobre a melhor faixa de tamanho de poros para implantes que se encontram no intervalo entre 50 µm e 500 µm de diâmetro (RYAN et al., 2006; VASCONCELLOS et al., 2008). Os osteoblastos apresentam tamanho da ordem de dezenas de mícrons, por este motivo, poros

menores que 10 m não oferecem espaço suficiente para o crescimento das células ósseas em seu interior, mas oferecem uma rugosidade superficial, necessária ao processo de adesão celular na interface osso-implante(LI et al, 2005).

Figura 9: Micrografias eletrônicas de varredura da superfície do tântalo após tratamento com PEO durante 300 segundos em diferentes tensões: (a) 350 V, (b) 450 V, (c) 500 V .

A avaliação química qualitativa por espectroscopia de energia dispersiva (EDS), foi realizada para complementar a análise da morfologia superficial dos revestimentos obtidos. Os resultados são apresentados na Figura 10.

350 450 500 0 10 20 30 40 50 60 P ro po rç ão a tô mic a (%) Diferença de potencial (V) C O P Ca Ta

Figura 10: Proporções atômicas determinadas por EDS das superfícies de amostras de tântalo tratadas por PEO em diferentes tensões (350, 450 e 500V).

O elemento presente em maior proporção atômica, nas três tensões utilizadas, é o oxigênio, sendo que sua proporção apresentou uma pequena diminuição com o aumento da tensão. Este elemento é incorporado devido às reações principais no processo de oxidação no anodo (substrato de tântalo). Na interface substrato/eletrólito a água sofre um processo de ionização produzindo íons O-2

segundo a reação:

2H2O βO²ˉ + 4H+ Equação(3)

Os íons O-2 _{reagem com Ta (no substrato) ou íons Ca}+2 _{(presentes na}

solução) e são incorporados no revestimento, na forma de óxidos.

O aumento da tensão de 350 para 450 V fez com que a proporção de fósforo, RP, aumentasse cerca de três vezes. Quando a diferença de potencial foi

aumentada para 500 V, a quantidade de fósforo incorporada diminuiu. O aumento de RP com o aumento da tensão deve ter ocorrido devido à hidrólise do glicerofosfato na

solução na região adjacente ao eletrodo onde a temperatura é mais alta, gerando a formação de uma quantidade maior de íons fosfatos, os quais são incorporados ao substrato. A diminuição da proporção de fósforo presente na superfície do substrato em 500 V pode ser explicada pelo aumento da temperatura provocada pela maior diferença de potencial, o que pode ter causado a difusão dos íons para o interior do substrato. Isto pode ser confirmado comparando-se a proporção de fósforo na superfície e no corte transversal do substrato de tântalo no tratamento de 500 V (Figura 19).

A proporção atômica de cálcio praticamente dobra de 350 a 450 V, permanecendo constante em 500 V. A maior proporção de cálcio na superfície do revestimento em relação ao fósforo, cerca de cinco vezes maior, pode ter ocorrido também, devido à maior decomposição do acetato de cálcio na região próxima ao substrato, onde a temperatura é maior.

Grupos fosfatos, aderidos ao substrato de tântalo, carregados negativamente, combinam-se com íons cálcio, carregados positivamente, formando fosfatos de cálcio que posteriormente podem se transformar em hidroxiapatita (ANDRADE, DOMINGUES, 2006).

A maior proporção de tântalo na tensão de 350 V confirma a ausência de revestimento nesta condição. Ocorre uma grande diminuição, de aproximadamente

92%, da proporção de tântalo com o aumento da diferença de potencial de 350 para 450 V. Além disto, este elemento não foi detectado na amostra tratada com 500 V (Figura 10), o que pode ser explicado pela formação do revestimento composto por outros elementos sobre o substrato.

Carbono teve sua proporção aumentada com o aumento da tensão e encontra-se distribuído de maneira uniforme sobre o substrato, conforme o mapeamento realizado por EDS para este elemento. Como o substrato foi tratado exposto à atmosfera e em solução aquosa, é provável que os átomos de carbono tenham sido incorporados na forma de dióxido de carbono (CO2) em todos os

tratamentos, com as diferentes tensões utilizadas. O CO2 do ar reage com íons

hidroxila (OH-_{), que se encontram livres na solução, formando o ácido carbônico}

(H2CO3). A decomposição do ácido carbônico leva a formação de carbonatos e, desta

forma, poderá também ocorrer a formação de carbonato de cálcio (CaCO3). Átomos

de carbono também podem ter sido incorporados na forma de acetatos (CH3COO)-

provenientes da dissociação do acetato de cálcio, usado como eletrólito. Segundo Miyake et al (1990), nas hidroxiapatitas sintéticas, os íons carbonatos localizam-se em canais e podem ocupar os mesmos sítios dos íons fosfatos. Isto também pode explicar a diminuição de fósforo e o aumento da proporção de carbono nos revestimentos produzidos sob maior diferença de potencial.

4.1.2 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectroscopia de Energia Dispersiva de raios X (Corte Transversal)

A Figura 11 mostra a microestrutura de um corte transversal de uma amostra de tântalo com espessura de aproximadamente 35,3 µm como recebida.

Figura 11: Micrografia eletrônica de varredura do corte transversal de um substrato de tântalo.

Após ter sido realizado o corte transversal dos substratos de tântalo sem tratamento e tratados por PEO, os mesmos foram embutidos em uma resina de poliéster Teclago, lixados por uma politriz Teclago PVV, com as lixas de 320, 420, 800 e 1200 mesh, polidos com o auxílio de um agente polidor de alumina e feltro

Microestruturas de cortes transversais de substratos de tântalo, após deposição do revestimento durante 300 segundos, nas diferentes tensões estudadas, são mostradas na Figura 12. Em geral, pode-se verificar uma região interna distinta, de aparência mais compacta e uniforme, o que corresponde ao substrato do tântalo. A região mais externa de aspecto poroso e irregular corresponde ao revestimento formado sobre o substrato. No tratamento realizado com a tensão de 500 V nota-se um aumento no tamanho dos poros que chegam a ter aproximadamente 20 µm e, conforme já discutido na seção 4.1.1, quanto maior o tamanho do poro, melhor o crescimento das células ósseas em seu interior.

Pode-se observar algumas falhas entre o revestimento e o substrato de tântalo, principalmente nas menores tensões utilizadas (350 e 450 V).

Figura 12: Micrografias eletrônicas de varredura de cortes transversais do substrato de tântalo recobertos com filmes depositados com tratamentos de 300 s em diferentes tensões:

(a) 350 V, (b) 450 V e (c) 500 V.

A avaliação química qualitativa por espectroscopia de energia dispersiva (EDS), também foi realizada nos revestimentos das amostras cortadas de forma transversal para complementar a análise da morfologia dos revestimentos obtidos. Foram analisados 5 pontos nos revestimentos de cada tratamento utilizado, calculando-se uma média da proporção de cada elemento.

350 450 500 0 10 20 30 40 50 60 Prop or ção at ôm ica ( %) Diferença de Potencial (V) C O Ca Ta P

Figura 13 _{– Proporções atômicas determinadas por EDS dos cortes transversais de} amostras de tântalo tratadas em diferentes tensões.

As Figuras 14, 15, 16, 17 e 18 apresentam a região da secção substrato/revestimento onde foram realizados os mapeamentos dos elementos carbono, oxigênio, cálcio, fósforo e tântalo, nas amostras tratadas com 350, 450 e 500V.

A maneira como as diversas espécies químicas se orientam, se posicionam e se movimentam na região da interface entre o eletrodo e o eletrólito será responsável pela constituição da estrutura do revestimento.

Nas três tensões estudadas, observa-se que a quantidade de oxigênio detectada no revestimento é maior que a do substrato, o que pode confirmar a existência de óxidos no revestimento. A quantidade de oxigênio encontrado no interior do substrato (conforme mapeamento por EDS- Figura 14) pode estar associada à presença deste elemento na composição inicial da amostra de tântalo sem tratamento e também a um processo de difusão dos átomos, do revestimento para o interior do substrato. Essa difusão é possível devido a dissociações dos átomos que formam os óxidos de tântalo no revestimento nas altas temperaturas atingidas no estado de plasma.

Também foi detectada no revestimento, nos três tratamentos realizados, a presença de tântalo e cálcio, como consequência da formação de óxidos de cálcio e

tântalo. A proporção atômica de cálcio no interior no revestimento da amostra tratada a 350 V é muito pequena (aproximadamente 3%), sendo que esta proporção aumenta e se mantém praticamente constante, em torno de 12%, para 450 e 500 V (Figura 13). Este aumento provavelmente ocorreu pois, a região onde ocorre o plasma, contém íons ativados que foram depositados sobre a superfície do substrato e são difundidos para o interior do mesmo, devido à influência da alta temperatura local e concentração das espécies ativadas. Atinge-se uma superfície de saturação a qual, muitas vezes, pode ser formada com tratamentos com duração de 3 a 5 minutos (YEROKHIN,1999). Átomos de fósforo somente foram incorporados no interior do revestimento, provavelmente na forma de fosfatos, na maior tensão utilizada. Experimentalmente verifica-se que o coeficiente de difusão de uma espécie depende da temperatura. Porém, a difusão dos átomos de cálcio prevalece. Isto pode ter ocorrido pois, ânions poliatômicos, neste caso, ânions fosfatos, são por natureza menos móveis. Segundo Paula (2010) os íons movem-se com diferentes velocidades de acordo com o seu tamanho e carga e, mesmo com o aumento da voltagem aplicada, chega um ponto em que essa velocidade deixa de aumentar e a densidade de corrente mantem-se constante.

Os mapas de EDS apresentam grande quantidade de tântalo nos revestimentos e sua presença pode ter ocorrido por um processo de difusão do substrato para o revestimento durante os tratamentos, com a formação dos óxidos de tântalo ou pela ejeção de metal fundido pela ação dos microarcos.

A quantidade de carbono no substrato pode ser devido a sua presença na composição inicial da amostra, antes do tratamento ou por contaminação por espécies atmosféricas durante a medida. Da mesma forma que na análise superficial das amostras por EDS, este elemento encontra-se bem distribuído nos revestimentos devido sua incorporação na forma de CO2 e também na forma de carbonatos e

acetatos. A pequena diminuição da proporção de carbono e oxigênio com o aumento da tensão de 450 para 500 V pode ter ocorrido pela liberação de CO2 com o

Figura 14: Mapeamento por EDS de cortes transversais de amostras tratadas por 300 s em 350, 450 e 500V onde se pode observar a distribuição de oxigênio.

Figura 15: Mapeamento por EDS de cortes transversais de amostras tratadas por 300 s em 350, 450 e 500V onde se pode observar a distribuição de tântalo.

Figura 16: Mapeamento por EDS de cortes transversais de amostras tratadas por 300 s em 350, 450 e 500V onde se pode observar a distribuição de cálcio.

Figura 17: Mapeamento por EDS de cortes transversais de amostras tratadas por 300 s em 350, 450 e 500V onde se pode observar a distribuição de carbono.

Figura 18: Mapeamento por EDS de um corte transversal de uma amostra tratada por 300 s em 500V onde se pode observar a distribuição de fósforo.

Analisando-se os gráficos da Figura 19, que comparam as proporções atômicas dos elementos nas camadas superficiais e na região mais interna dos revestimentos, podemos verificar que as proporções de cálcio e fósforo são maiores na superfície do que na seção transversal do revestimento. A proporção de tântalo tem uma grande diminuição na região superficial com o aumento da tensão, estando praticamente ausente na superfície do substrato, na maior diferença de potencial utilizada. Isto pode confirmar a existência de óxidos de tântalo formados mais próximos ao substrato sendo, posteriormente, recobertos (nas maiores tensões) pela formação de outros compostos (por exemplo, fosfatos de cálcio e apatitas), na parte mais externa do revestimento.

Estes resultados são similares aos obtidos por Han, Sun e Huang (2008) ao estudarem o mecanismo de formação de revestimentos de hidroxiapatita em substratos deTi6Al4V através do processo de oxidação eletrolítica, com os mesmos eletrólitos utilizados neste trabalho, utilizando uma tensão de 450 V e tempos de tratamento de 1, 3, 5, 8, 15 e 20 min. Os resultados mostraram que as camadas mais externas do revestimento possuíam maiores quantidades de cálcio, fósforo e oxigênio, enquanto que as camadas internas possuíam maior quantidade de titânio e oxigênio.

Figura 19– Comparação entre as proporções atômicas de diferentes elementos determinadas por EDS na superfície e nos cortes transversais de amostras de tântalo

4.1.3 Medidas de espessura por microscopia eletrônica de varredura

A Figura 20 apresenta os resultados das medidas de espessura dos revestimentos e do substrato de tântalo efetuadas nas amostras tratadas durante 300 segundos, nas três tensões estudadas. Pode-se observar que, quanto maior a tensão utilizada, maior a espessura dos filmes depositados enquanto que, ao mesmo tempo, ocorre a diminuição da espessura do substrato de tântalo.

350 450 500 0 10 20 30 40 50 E sp es su ra ( m) Diferença de Potencial (V) Tântalo Revestimento

Figura 20: Espessuras dos substratos de tântalo e dos revestimentos, determinadas por MEV em cortes transversais das amostras tratadas em diferentes potenciais.

Os dados apresentados no gráfico podem ser comparados com as micrografias dos cortes transversais das amostras da Figura 12. A diminuição da espessura do substrato de tântalo já foi explicada anteriormente pela análise de EDS, a qual mostra a presença deste elemento nos revestimentos causada pela difusão do Ta do substrato para o revestimento, formando óxidos.

O maior crescimento do revestimento em comparação com a redução da espessura do metal revela que, além do processo de oxidação do substrato de tântalo o revestimento cresce também pela incorporação dos elementos presentes na solução eletrolítica.