UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ANDRÉ MÁRCIO DO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE EXTRATOS DE
Stryphnodendron adstringens
(Martius) Coville
ANDRÉ MÁRCIO DO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE EXTRATOS DE
Stryphnodendron adstringens
(Martius) Coville
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Cristina Duarte Vianna Soares Co-orientadora: Profa. Dra. Rachel Oliveira Castilho
Nascimento, André Márcio do
N244a
Avaliação da qualidade de extratos de Stryphnodendron
adstringens (Martius) Coville
/
André Márcio do Nascimento. –2008. 159 f. : il.
Orientador: Profª Drª Cristina Duarte Vianna Soares Co-Orientadora: Prfª Drª Rachel Oliveira Castilho
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Stryphnodendron adstringens - Teses. 2. Barbatimão - Teses.
3. Taninos - Teses. 4. Cromatografia líquida de alta eficiência - Teses. 5. Extrato etanólico – Teses.6. UV-VIS – Teses. I. Soares, Cristina Duarte Vianna. II. Castilho, Rachel Oliveira. III.Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. III. Título.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Profa. Cristina Duarte Vianna Soares pela orientação neste trabalho, pela confiança
depositada na realização dos trabalhos e por ter me ensinado a doçura e a leveza que a ciência pode ter.
À Profa. Rachel Oliveira Castilho também pela orientação neste trabalho, pelo apoio e
incentivo incansáveis, pelas preces e por sempre acreditar na minha capacidade como aluno e ser humano.
À Profa. Maria das Graças Lins Brandão pela sugestão do tema, pela co-orientação no início
dos trabalhos e por ter me apresentado a medicina tradicional brasileira e sua riquíssima flora.
À Profa. Aparecida Célia Paula dos Santos, do Departamento de Ciências Naturais da UFSJ,
pelo auxílio na coleta do material botânico.
Ao Prof. Luiz Bernardes pelos ensinamentos e pelo auxílio na elucidação das reações químicas dos métodos analíticos estudados.
Aos queridos amigos que me auxiliaram na árdua tarefa das experimentações: Mariana, Luan, Maria Augusta, Bruno, Felipe, Fábio e Vera. Obrigado por estarem do meu lado, em vários momentos no mestrado, sempre com bom ânimo e disposição.
Aos amigos do laboratório de farmacognosia: Uiatã, Fernanda, Aline, Naiara, Wélber e Kátia, pelo convívio agradável, pela troca de experiências e pelos momentos de descontração.
Aos amigos do laboratório de controle de qualidade: Fernando, Isabela, Zé Antônio, André Lima, Ana Gabriela, Taízia, Bruna, Daniela, Michele, Diego, Gustavo “Jonhy”, Tiago, Giovani, Paula, pela agradável companhia, pela troca de experiências e por tornarem o trabalho, às vezes árduo, num divertimento, até mesmo nos finais de semana e feriados.
Ao Cedafar pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho.
À querida amiga Vanessa, por dividir comigo as dificuldades e as alegrias de se fazer uma pós-graduação trabalhando e por estar sempre ao meu lado.
Ao Sr. Geraldo de Oliveira Mata e ao Sr. Rogério de Oliveira Mata, do Laboratório Usmed Ltda., por permitirem a minha ausência na empresa, por acreditarem na minha competência e também pelo apoio financeiro na condução deste trabalho.
Aos amigos e funcionários do Laboratório Usmed Ltda. pela boa convivência e pelo auxílio sem o qual seria impossível realizar este mestrado trabalhando ao mesmo tempo.
Aos grandes amigos, dos dois planos da vida, da Fecove, pelas preces, pela presença incansável, pelo amor e carinho dedicados em todos estes anos. Em especial ao Tio Sílvio pelo carinho e pelas boas conversas nos momentos que mais precisei.
Aos grandes amigos Edmar, por cuidar e manter os pés de barbatimão em sua casa, e Cristiano, pela ajuda no preparo do material botânico. Além disto, pela amizade, companheirismo e apoio incansáveis, em todos estes anos de convivência.
Aos meus pais Paulo André e Maria José, pelo amor incondicional, por me tornarem o homem que sou hoje e por terem investido sempre na minha formação acadêmica. Ao meu irmão Jefferson pelo amor, companheirismo e pela ajuda nos trabalhos. Aos irmãos que já se foram Ângelo e Marcus Vinícius, saudades. À Pretinha, pela companhia fiel.
Às minhas famílias agregadas Souza, Barbosa e Miguel, por terem me acolhido e por estarem do meu lado nos momentos felizes e nos momentos difíceis da minha vida. Em especial à afilhada Júlia, por alegrar a minha vida.
A todos os amigos e familiares que, de uma forma ou de outra, participaram desta caminhada, sofreram e vibraram comigo em cada momento.
Tocando em frente
(Almir Sater e Renato Teixeira)
Ando devagar porque já tive pressa E levo esse sorriso porque já chorei demais Hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe Só levo a certeza de que muito pouco eu sei
Ou nada sei
Conhecer as manhas e as manhãs, O sabor das massas e das maçãs, É preciso amor pra poder pulsar, É preciso paz pra poder sorrir, É preciso a chuva para florir
Penso que cumprir a vida seja simplesmente Compreender a marcha e ir tocando em frente Como um velho boiadeiro levando a boiada Eu vou tocando dias pela longa estrada eu vou Estrada eu sou
Conhecer as manhas e as manhãs, O sabor das massas e das maçãs, É preciso amor pra poder pulsar, É preciso paz pra poder sorrir, É preciso a chuva para florir
Todo mundo ama um dia todo mundo chora, Um dia a gente chega, no outro vai embora Cada um de nós compõe a sua história Cada ser em si carrega o dom de ser capaz
E ser feliz
Conhecer as manhas e as manhãs O sabor das massas e das maçãs É preciso amor pra poder pulsar, É preciso paz pra poder sorrir,
É preciso a chuva para florir
Ando devagar porque já tive pressa E levo esse sorriso porque já chorei demais Cada um de nós compõe a sua história, Cada ser em si carrega o dom de ser capaz
E ser feliz
RESUMO
O barbatimão, Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville, é uma planta medicinal bem conhecida na medicina tradicional brasileira. Tem sido usado como antiinflamatório, adstringente e cicatrizante desde o século XIX. A alta concentração de taninos condensados nas cascas é a responsável pelos seus efeitos terapêuticos. No presente trabalho, extrato glicólico (EG) e extrato etanólico seco (EES) das cascas foram preparados, por percolação. Foram desenvolvidos métodos extrativo-analíticos para determinação de taninos em insumos de barbatimão, bem como se avaliou a qualidade físico-química da droga vegetal e dos extratos. A droga vegetal, o EG e o EES foram caracterizados por CCD. Os EES foram purificados por partição líquido-líquido apresentando maior concentração de marcadores na fração orgânica do que na fração aquosa. O teor de taninos totais dos extratos foi quantificado por espectrofotometria no ultravioleta (UV, 272 nm) e por métodos farmacopeicos espectrofotométricos no visível (Folin Denis, FD, 715 nm e Folin-Ciocalteau, FC, 760 nm). Os métodos farmacopeicos foram verificados quanto à seletividade, linearidade e precisão e comparados com o método UV, por análise de variância. Um método por CLAE usando modo gradiente linear, em fase reversa (C18),
detecção UV em λ 210 nm, foi desenvolvido e validado para quantificação de galocatequina
(GC) e de galato de epigalocatequina (GEGC) nos extratos. O método por UV apresentou linearidade na faixa de concentração de 5 a 30 µg/mL com coeficiente de correlação, r 0,9999 (GEGC). Precisão intra-ensaio (DPR 2,06%) e inter-ensaio (DPR 4,68%) foram satisfatórias; exatidão apresentou 99,72% de recuperação (DPR 2,69%); obteve-se limite de detecção, LD, de 0,23 µg/mL e limite de quantificação, LQ, de 0,71 µg/mL. O método
apresentou-se seletivo e não robusto. O método por CLAE apresentou-se seletivo. A linearidade foi alcançada na faixa de 30 a 330 ng com r 0,9998 (GC), r 0,9986 (GEGC); precisão intra-ensaio, DPR 1,86% (GC) e 1,10% (GEGC), e precisão inter-ensaio, DPR 5,22% (GC) e 2,77% (GEGC) foram satisfatórias; exatidão apresentou 76,50% (DPR 4,53%, GC) e 104,98% (DPR 3,21%, GEGC) de recuperação; obteve-se LD 2,95 ng e LQ 8,94 ng para GC; para GEGC obteve-se, LD 8,81 ng e LQ 26,69 ng. O método apresentou-se robusto para GC e parcialmente robusto para GEGC. A fração orgânica do EES de S.
adstringens apresentou teor de 1,35% (GC) e 1,32% (GEGC), e do EES de S. obovatum
1,22% (GC) e 1,42% (GEGC), por CLAE. Pela determinação de derivados 3-flavonóis nas frações dos extratos secos é possível padronizar os produtos intermediários e obter um melhor controle de qualidade para os produtos acabados.
ABSTRACT
Barbatimão, Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville, is a well-known medicinal plant in the Brazilian traditional medicine. It has been used as anti-inflammatory, astringent and wound healing since the 19th century. The high concentration of condensed tannins in the
bark is responsible for its therapeutic effects. In the present work, barbatimão bark glicolic (GE) and dry ethanolic extracts (EE) were prepared, by percolation. An extractive-analytical method for determining tannins in barbatimão was developed and physical-chemical quality of barks and extracts were assayed. The bark, GE and EE were characterized by the TLC. EE were purified by liquid-liquid partition presented greater concentration of markers in the organic fraction than in aqueous fraction. Totals tannins in the extracts was quantified by ultraviolet spectrophotometry (UV, 272 nm) and by spectrophotometric pharmacopeial visible methods (Folin Denis, FD, 715 nm e Folin-Ciocalteau, FC, 760 nm). The pharmacopeial methods were checked regarding selectivity, linearity, and accuracy and compared to the UV method, by analysis of variance. A HPLC method using linear gradient mode in reverse phase (C18), UV detection at 210 nm, was developed and validated for
quantification of gallocatechin (GC) and epigallocatechin gallate (EGCG) in extracts. The UV method presented linearity in the concentration range 5 to 30 µg/mL with correlation coefficient r 0.9999 (EGCG). Intra-assay precision (RSD 2.06%) and inter-assay precision (RSD 4.68%) were satisfactory, meanwhile, the recovery percentage was 99.72% (RSD 2.69%); yielded limit of detection, LOD, of 0.23 µg/mL and limit of quantification, LOQ, of
0.71 µg/mL. The method showed to be selective and not robust. The HPLC method showed
to be selective. Linearity was achieved in the range from 30 to 330 ng with r 0.9998 (GC), r 0.9986 (EGCG); intra-assay precision, RSD 1.86% (GC) and 1.10% (EGCG), and inter-assay precision, RSD 5.22% (GC) and 2.77% (EGCG) were satisfactory; accuracy presented 76.50% (RSD 4.53% for GC) and 104.98% (RSD 3.21% for EGCG) of recovery; LOD was 2.95 ng and LOQ was 8.94 ng for GC; for EGCG, LOD was 8.81 ng and LOQ was 26.69 ng. The method showed to be robust for GC and partially robust for GEGC. The organic fraction
of S. adstringens EE showed an amount of 1.35% (GC) and 1.32% (EGCG), and S.
obovatum EE presented an amount of 1.22% (GC) and 1.42% (EGCG), by HPLC. By
determining 3-flavonol derivative markers in the fractions of the dry extracts it is possible to standardize the intermediate products and to perform a better quality control for the finished products.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estruturas do ácido gálico e de flavan-3-óis isolados de Stryphnodendron adstringens. ... 29
Figura 2 Estruturas de prorobinetinidinas isoladas de Stryphnodendron adstringens. A letra “a” próxima aos números indica o derivado peracetato... 30
Figura 3 Estruturas de flavan-3-óis e prodelfinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens. A letra “a” próxima aos números indica o derivado peracetato. ... 32
Figura 4 Estruturas de prodelfinidinas diméricas isoladas de Stryphnodendron
adstringens. A letra “a” próxima aos números indica o derivado peracetato. ... 33
Figura 5 Estrutura da prodelfinidina dimérica 4’-O-metilgalocatequina-(4α→8)-4’-O -metilgalocatequina isolada de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al, 1999)... 34
Figura 6 Coleta do material botânico... 39
Figura 7 Distribuição granulométrica da droga vegetal (cascas de barbatimão) micronizada em moinho de facas... 77
Figura 8 Representação da reação característica de identificação de taninos com gelatina (estrutura típica –Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyp-Gly-Pro-)... 78
Figura 9 Reação característica de identificação de taninos com cloreto férrico... 79
Figura 10 Reação característica de identificação de taninos com vanilina em meio ácido (a seta pontilhada indica um segundo sítio reacional em potencial). ... 79
Figura 11 Perfis em CCD para catequina SQR (C), extrato cetônico (EC) e extrato glicólico purificado (EGP) em cromatofolhas de alumínio de sílica gel 60 F254. Eluente:
acetato de etila:tolueno:ácido fórmico:água (80:10:5:5). Reveladores: (a) FeCl3; (b)
vanilina; (c) AlCl3, UV λ 365 nm e (d) NP-PEG, UV λ 365 nm... 82
Figura 12 Perfis em CCD para catequina SQR (C), extrato cetônico (EC) e extrato glicólico purificado (EGP) em cromatofolha de alumínio de sílica gel 60 F254. Eluentes:
tolueno:acetona:ácido fórmico (3:3:1) e tolueno:acetona:ácido acético (3:3:1). Reveladores: (a) FeCl3 e (b) vanilina. ... 84
Figura 13 Perfis em CCD para catequina (C), extrato cetônico (EC) e extrato glicólico purificado (EGP) em cromatofolha de alumínio de sílica gel 60 F254. Eluentes: CHCl3;
CHCl3:acetato de etila (60:40) e CHCl3 acetona: ácido fórmico (75:16,5:8,5).
Reveladores: (a) FeCl3 e (b) vanilina. ... 85
Figura 14 Perfis em CCD para catequina (C), extrato cetônico (EC) e extrato glicólico purificado (EGP) em cromatofolha de alumínio de sílica gel 60 F254. Eluentes: acetona;
acetato de etila:ácido acético:ácido fórmico:água (100:11:11:26); metanol e tolueno:acetona:ácido fórmico (3:1:1). Reveladores: (a) FeCl3 e (b) vanilina. ... 86
alumínio de sílica gel 60 F254. Eluente: acetato de etila:tolueno:ácido fórmico:água
(80:10:5:5). Revelador: FeCl3 1% (p/V)... 94
Figura 16 Perfis em CCD para ácido gálico (AG), galocatequina (GC), epigalocatequina (EGC), catequina (C), proantocianidina B2 (P), galato de epigalocatequina (GEGC), quercetina (Q), extrato etanólico seco (EES) e ponto misto (M) em cromatofolha de alumínio de sílica gel 60 F254. Eluente: butanol, ácido acético e
água (50:10:40). Revelador: FeCl3 1% (p/V). ... 95
Figura 17 Proposta de reação química de oxidação da catequina com a redução do molibdênio do reagente fosfomolibdotúngstico gerando espécies azuis, tais como (PMoW11O40)4-... 96
Figura 18 Sobreposição de espectros: (a) pirogalol antes (2,5 µg/mL, vermelho) e
após reação com reagente Folin-Denis (3,5 µg/mL, preto); (b) extrato etanólico seco 8 µg/mL (preto), extrato etanólico seco após agitação com pó-de-pele (40 µg/mL,
vermelho) e pirogalol 2,5 µg/mL (azul), todos após reação com reagente Folin-Denis... 98
Figura 19 Curva analítica obtida pelo método de Folin-Denis para o pirogalol a λ 715
nm. ... 99
Figura 20 Distribuição dos resíduos da curva analítica para a determinação de pirogalol por Folin-Denis. ... 100
Figura 21 Sobreposição de espectros: (a) pirogalol antes (2,5 µg/mL, vermelho) e
após reação com reagente Folin-Ciocalteau (3,0 µg/mL, preto); (b) extrato etanólico
seco 6,4 µg/mL (vermelho), extrato etanólico seco após agitação com pó-de-pele (32 µg/mL, azul) e pirogalol 2,0 µg/mL (preto), todos após reação com reagente
Folin-Ciocalteau... 104
Figura 22 Curva de analítica obtida pelo método de Folin-Ciocalteau para a catequina
λ 760 nm.... 105
Figura 23 Distribuição dos resíduos da curva analítica para a determinação de pirogalol por Folin-Ciocalteau. ... 106
Figura 24 Espectros de padrões na região ultravioleta faixa λ 200 a 800 nm obtidos
por meio de detector UV/DAD acoplado ao cromatógrafo; a: ombro... 110
Figura 25 Espectros de extrato etanólico seco (50 µg/mL) em solução hidroalcóolica
antes (preto e vermelho) e após (azul) a precipitação com pó-de-pele na região ultravioleta faixa λ 200 a 400 nm. ... 111
Figura 26 Sobreposição dos espectros de extrato etanólico seco 50 µg/mL antes de
reagir com pó-de-pele (preto), extrato etanólicos seco 250 µg/mL após reação com
pó-de-pele (vermelho) e galato de epigalocatequina 15 µg/mL (azul). ... 113
Figura 27 Curva analítica obtida pelo método de espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm para galato de epigalocatequina ... 114
Figura 29 Cromatograma inicial obtido por eluição em gradiente exploratório amplo: 5% a 95% acetonitrila (ACN), 60 min, para extrato etanólico seco de S. adstringens a 10 mg/mL em metanol 10% V/V; volume de injeção 10 µL; fase móvel ACN:água
(5:95) acidificados com ácido fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 ºC; detecção λ
210 nm... 124
Figura 30 Cromatograma inicial obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min, para extrato etanólico seco de S. adstringens a 10 mg/mL em metanol 10% V/V; volume de injeção 10 µL; fase móvel ACN:água (5:95)
acidificados com ácido fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 ºC; detecção λ 210 nm. .. 125
Figura 31 Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min, para a fração orgânica de S. adstringens a 1 mg/mL em metanol 10% V/V; volume de injeção 2,5 µL; fase móvel ACN:água (5:95) acidificados com ácido
fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 ºC; detecção λ 210 nm. Amostra de partida
250 mg de extrato etanólico seco de S. adstringens... 126
Figura 32 Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min, para a fração aquosa de S. adstringens a 1 mg/mL em metanol 10% V/V; volume de injeção 2,5 µL; fase móvel ACN:água (5:95) acidificados com ácido
fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 ºC; detecção λ 210 nm. Amostra de partida
250 mg de extrato etanólico seco de S. adstringens... 127
Figura 33 Sobreposição dos espectros de absorção no infravermelho da fração orgânica I (preta), fração orgânica II (azul) e fração aquosa (vermelho). ... 128
Figura 34 Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min, para o extrato etanólico seco de S. adstringens a 1 mg/mL em metanol 10% V/V; volume de injeção 5 µL; fase móvel ACN:água (5:95) acidificados com ácido
fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 ºC; detecção λ 210 nm. Amostra de partida
250 mg de extrato etanólico seco de S. adstringens... 131
Figura 35 Sobreposição dos cromatogramas do extrato etanólico seco de S.
adstringens a 1 mg/mL em metanol 10% V/V; volume de injeção 5 µL; sem adição de
padrões (linha cheia) e após adição dos padrões (linha tracejada): (1) ácido gálico, (2) galocatequina, (3) epigalocatequina, (4) catequina, (5) proantocianidina B2, (6) galato de epigalocatequina e (7) quercetina. ... 132
Figura 36 Cromatograma dos padrões reunidos em solução (0,1 mg/mL cada em metanol, volume de injeção 2 µL) e espectros ultravioleta de proantocianidina B2 e
quercetina... 134
Figura 37 Curvas analíticas obtidas em dois dias diferentes por CLAE para galocatequina. ... 135
Figura 38 Distribuição dos resíduos das curvas analíticas (dia 1 e dia 2) para a determinação de galocatequina por CLAE... 136
Figura 39 Curvas analíticas obtidas em dois dias diferentes por CLAE para galato de epigalocatequina... 137
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Ácido gálico e flavan-3-óis isolados a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al., 1993, 1997) ... 29
Tabela 2 Prorobinetinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al., 1996b, 1997) ... 31
Tabela 3 Flavan-3-óis e prodelfinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al., 1996a, 1997) ... 32
Tabela 4 Prodelfinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al, 1996a, 1997) ... 33
Tabela 5 Material botânico ... 39
Tabela 6 Relação de substâncias químicas de referência (SQR) utilizadas ... 40
Tabela 7 Classificação de tamises utilizados na análise granulométrica dos pós da casca de barbatimão... 44
Tabela 8 Sistemas eluentes alternativos para análise de extratos de cascas de barbatimão por CCD em sílica gel ... 46
Tabela 9 Quantidades de amostra e de solventes utilizados para avaliação da solubilidade... 50
Tabela 10 Termos descritivos para expressar a solubilidade... 50
Tabela 11 Construção da curva analítica de pirogalol, por espectrofotometria na região visível, λ 715 nm após reação com RFD para doseamento de taninos totais (triplicata,
abrigo da luz) (FARMACOPÉIA, 2002) ... 54
Tabela 12 Construção da curva analítica de pirogalol, por espectrofotometria na região visível, λ 760 nm após reação com RFC para doseamento de taninos totais (triplicata,
abrigo da luz) (EUROPEAN, 2007)... 57
Tabela 13 Construção da curva analítica para galato de epigalocatequina por espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm... 61
Tabela 14 Preparo das soluções fortificadas de galato de epigalocatequina para avaliação da exatidão por espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm... 63
Tabela 15 Condições cromatográficas para a corrida exploratória em gradiente para determinação de taninos em insumos ou produtos vegetais (barbatimão S. adstringens (Martius) Coville)... 66
Tabela 16 Composição do sistema de solvente utilizado para pré-purificação do extrato etanólico seco de barbatimão por partição líquido-líquido... 67
Tabela 18 Preparo das amostras de extrato etanólico seco fortificadas com GC e GEGC, adicionados antes da pré-purificação, para avaliação da exatidão por CLAE... 71
Tabela 19 Preparo das soluções de fração orgânica fortificadas com GC e GEGC, adicionados após a pré-purificação, para avaliação da exatidão por CLAE ... 72
Tabela 20 Condições cromatográficas usuais para análise de extratos de barbatimão ... 74
Tabela 21 Resultados da análise granulométrica da droga vegetal micronizada por meio de tamisação... 77
Tabela 22 Valores de Rf para catequina SQR e amostras de extratos de barbatimão
em cromatofolhas de sílica gel 60 F254 (FARMACOPÉIA, 2002). ... 83
Tabela 23 Valores de Rf para catequina SQR e amostras de extratos de barbatimão
obtidos com diferentes reveladores e sistemas eluentes, sílica gel 60 F254 em
cromatofolhas de alumínio... 84
Tabela 24 Valores de perda por dessecação da droga vegetal (105 ºC, 5 h) ... 87
Tabela 25 Valores de cinzas totais obtidos para a droga vegetal ... 88
Tabela 26 Solubilidade do extrato glicólico e do extrato etanólico seco de barbatimão em diferentes solventes de acordo com termos descritivos da Farmacopéia Brasileira 4ª edição... 89
Tabela 27 Determinação de pH (triplicata) da dispersão a 10% em água e em solução hidroalcóolica dos extratos de barbatimão ... 90
Tabela 28 Teor de resíduo seco (105 ºC, 3 h) para os extratos de barbatimão ... 91
Tabela 29 Valores de densidade relativa para amostras de extrato glicólico de barbatimão... 92
Tabela 30 Valores de Rf para padrões e amostra de extrato etanólico seco de barbatimão obtidos em cromatofolhas de sílica gel 60 F254. Revelador: FeCl3 1% (p/V)
em metanol... 95
Tabela 31 Resultados obtidos para a construção da curva de calibração para pirogalol após reação com reagente de Folin-Denis... 99
Tabela 32 Concentrações de amostras de extrato etanólico seco utilizadas para avaliação da precisão intra-corrida do método Folin-Denis... 101
Tabela 33 Concentrações de polifenóis totais (PT) e de polifenóis não adsorvidos (PNA) obtidos da curva analítica de Folin-Denis, respectivos teores e teor de taninos totais (TT) para precisão intra-corrida ... 101
Tabela 34 Concentrações de amostras de extrato etanólico seco utilizadas para avaliação da precisão inter-corrida do método Folin-Denis... 102
Tabela 36 Resultados obtidos para a construção da curva de calibração para pirogalol após reação com reagente de Folin-Ciocalteau ... 105
Tabela 37 Concentrações de amostras de extrato etanólico seco utilizadas para avaliação da precisão intra-corrida do método de Folin-Ciocalteau ... 107
Tabela 38 Concentrações de polifenóis totais (PT) e de polifenóis não adsorvidos (PNA) obtidos da curva analítica de Folin-Ciocalteau, respectivos teores e teor de taninos totais (TT) para precisão intra-corrida... 107
Tabela 39 Concentrações de amostras de extrato etanólico seco utilizadas para avaliação da precisão inter-corrida do método de Folin-Ciocalteau ... 108
Tabela 40 Concentrações de polifenóis totais (PT) e de polifenóis não adsorvidos (PNA) obtidos da curva analítica de Folin-Ciocalteau, respectivos teores e teor de taninos totais (TT) para precisão inter-corrida... 108
Tabela 41 Resultados obtidos para a construção da primeira curva analítica para o galato de epigalocatequina por espectrofotometria na região ultravioleta λ 272 nm ... 114
Tabela 42 Concentrações de amostras de extrato etanólico seco de S. adstringens utilizadas para avaliação da precisão intra-corrida por espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm... 116
Tabela 43 Teores de polifenóis totais (PT) e de polifenóis não adsorvidos (PNA) obtidos por espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm, e teor de taninos totais
(TT) para precisão intra-corrida ... 116
Tabela 44 Concentrações de amostras de extrato etanólico seco de S. adstringens utilizadas para avaliação da precisão inter-corrida por espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm... 117
Tabela 45 Concentrações de polifenóis totais (PT) e de polifenóis não adsorvidos (PNA) obtidos da curva analítica do método alternativo UV, respectivos teores e teor de taninos totais (TT) para precisão inter-corrida de S. adstringens... 118
Tabela 46 Resultados de exatidão obtidos por espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm, para galato de epigalocatequina em amostras de extrato
etanólico seco de S. adstringens... 119
Tabela 47 Resultados da robustez obtidos por espectrofotometria na região ultravioleta, λ 272 nm para determinação de taninos totais em extrato etanólico seco ... 120
Tabela 48 Comparação das determinações de taninos totais de extrato etanólico seco por avaliação espectrofotométrica ... 121
Tabela 49 Resultados de doseamento (n = 3) obtido por espectrofotometria na região ultravioleta para diferentes espécies e amostras de extratos de barbatimão ... 122
Tabela 50 Condições cromatográficas pré-otimizadas em gradiente para determinação de taninos em insumos ou produtos vegetais (barbatimão S. adstringens (Martius) Coville) ... 124
Tabela 52 Parâmetros cromatográficos obtidos para catequina SQR 1 mg/mL em metanol, volume de injeção 1 µL, em diferentes composições de fase móvel... 129
Tabela 53 Condições cromatográficas em gradiente otimizadas para análise de extratos de barbatimão ... 130
Tabela 54 Resultados dos parâmetros cromatográficos obtidos para os padrões reunidos em solução por CLAE ... 133
Tabela 55 Resultados obtidos para a construção das curvas analíticas para determinação de galocatequina por CLAE... 135
Tabela 56 Resultados obtidos para a construção da curva analítica para galato de epigalocatequina por CLAE ... 137
Tabela 57 Teores de galocatequina (GC) e de galato de epigalocatequina (GEGC) obtidos para precisão intra-corrida... 139
Tabela 58 Teores de galocatequina (GC) e de galato de epigalocatequina (GEGC) obtidos para precisão inter-corrida com mesmo analista. ... 140
Tabela 59 Teores de galocatequina (GC) e de galato de epigalocatequina (GEGC) obtidos para precisão inter-corrida com analistas diferentes... 141
Tabela 60 Resultados de exatidão para quantificação de GC e de GEGC, adicionados antes do processo de pré-purificação, em amostras de extrato etanólico seco de S. adstringens por CLAE... 142
Tabela 61 Resultados de exatidão para quantificação de GC e de GEGC, adicionados após o processo de pré-purificação, em amostras de fração orgânica de extrato etanólico seco de S. adstringens por CLAE ... 143
Tabela 62 Limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) para os marcadores químicos analisados estimados pelas curvas analíticas. ... 144
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACN Acetonitrila
AG Ácido gálico
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
C Catequina
CCD Cromatografia em camada delgada CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CV Coeficiente de variação
DAD Detector de arranjo de diodos
d.p. Desvio padrão
DPR Desvio padrão relativo
EC Extrato cetônico
EGC Epigalocatequina
EGP Extrato glicólico purificado
FAFAR/UFMG Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais
GC Galocatequina
GEGC Galato de epigalocatequina
HPLC High performance liquid chromatography
ICH International Conference on Harmonization
k Fator de retenção
NP-PEG Ácido difenilboriloxietilamínico 1% (p/V) em metanol (NP) e polietilenoglicol 4000 5% (p/V) em etanol (PEG)
OMS Organização Mundial da Saúde
p/p Peso por peso
p/V Peso por volume
P Proantocianidina B2
PA Para análise
PEG Polietilenoglicol
pH Potencial hidrogeniônico
pKa Logaritmo negativo da constante de dissociação de ácido PLL Partição líquido-líquido
Q Quercetina
R Resolução
r Coeficiente de correlação
r2 Coeficiente de determinação
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RE Resolução Específica
RFC Reagente Folin-Ciocalteau
RFD Reagente Folin-Denis
SQR Substância química de referência
SR Solução reagente
T Fator de cauda
TLC Thin layer chromatography
t0 Tempo morto
UV Ultravioleta
V/V Volume por volume
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 23
2 OBJETIVOS ... 26
2.1 OBJETIVO GERAL ... 26
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 26
3 REVISÃO DA LITERATURA... 27
3.1 DESCRIÇÃO VEGETAL ... 27
3.2 CONSTITUIÇÃO QUÍMICA... 28
3.3 AÇÕES FARMACOLÓGICAS... 35
3.4 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS CONDENSADOS... 36
3.4.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ... 38
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 39
4.1 MATERIAL... 39
4.1.1 Amostras botânicas ... 39
4.1.2 Substâncias químicas de referência... 40
4.1.3 Reagentes e outros materiais... 40
4.1.4 Reveladores para cromatografia em camada delgada (CCD) ... 41
4.1.4.1 Cloreto férrico 1% (p/V) em metanol... 41
4.1.4.2 Ácido difenilboriloxietilamínico 1% (p/V) em metanol (NP) e polietilenoglicol 4000 5% (p/V) em etanol (PEG) (NP-PEG)... 41
4.1.4.3 Cloreto de alumínio 5% (p/V) em metanol ... 42
4.1.4.4 Vanilina 1% (p/V) em etanol e ácido sulfúrico 5% (V/V) em etanol ... 42
4.1.5 Equipamentos ... 42
4.2 MÉTODOS... 43
4.2.1 Controle de qualidade da droga vegetal... 43
4.2.1.1 Secagem, divisão e aspecto da droga vegetal... 43
4.2.1.2 Avaliação dos caracteres organolépticos... 43
4.2.1.3 Determinação da granulometria do pó da droga vegetal... 43
4.2.1.4 Testes de identificação ... 44
4.2.1.5 Cromatografia em camada delgada... 45
4.2.1.5.1 Sistema eluente conforme Farmacopéia Brasileira 4ª edição ... 45
4.2.1.5.2 Sistemas eluentes alternativos ... 46
4.2.1.6 Material estranho... 46
4.2.1.7 Determinação de água ... 47
4.2.1.8 Cinzas totais (V.4.2.4) ... 47
4.2.2.1 Preparação do solvente extrator... 47
4.2.2.2 Pó da droga vegetal para o preparo dos extratos glicólicos... 47
4.2.2.3 Preparação dos extratos glicólicos ... 48
4.2.3 Preparação do extrato etanólico seco (EES) de barbatimão... 48
4.2.3.1 Preparação da droga vegetal... 48
4.2.3.2 Preparação dos extratos etanólicos... 48
4.2.4 Controle de qualidade dos extratos da droga vegetal... 49
4.2.4.1 Avaliação dos caracteres organolépticos... 49
4.2.4.2 Avaliação da solubilidade ... 49
4.2.4.3 Avaliação do pH ... 50
4.2.4.4 Resíduo seco ... 51
4.2.4.5 Determinação da densidade relativa... 51
4.2.4.6 Reações de identificação... 51
4.2.4.7 Cromatografia em camada delgada... 52
4.2.4.7.1 Extrato glicólico... 52
4.2.4.7.2 Extrato etanólico seco... 53
4.2.5 Aplicação de métodos analíticos farmacopeicos para quantificação de taninos totais... 53
4.2.5.1 Método espectrofotométrico na região visível (λ 715 nm) utilizando reagente Folin-Denis (RFD) para quantificação de taninos totais em extratos de barbatimão, de acordo com Farmacopéia Brasileira 4ª edição ... 53
4.2.5.1.1 Seletividade ... 53
4.2.5.1.2 Linearidade... 53
4.2.5.1.3 Precisão Intra-corrida e Inter-corrida... 54
4.2.5.2 Método espectrofotométrico na região visível (λ 760 nm) utilizando reagente Folin-Ciocalteau (RFC) para quantificação de taninos totais em extratos de barbatimão, de acordo com Farmacopéia Européia 6ª edição. ... 56
4.2.5.2.1 Seletividade ... 56
4.2.5.2.2 Linearidade... 56
4.2.5.2.3 Precisão Intra-corrida e Inter-corrida... 57
4.2.6 Desenvolvimento e validação de método analítico alternativo por espectrofotometria na região ultravioleta para quantificação de taninos totais em extratos de barbatimão ... 59
4.2.6.1 Seleção e otimização das condições analíticas ... 59
4.2.6.2 Validação do método analítico por espectrofotometria na região ultravioleta... 60
4.2.6.2.1 Seletividade ... 60
4.2.6.2.3 Precisão intra-ensaio e precisão inter-ensaio... 61
4.2.6.2.4 Exatidão... 63
4.2.6.2.5 Limite de detecção e limite de quantificação ... 64
4.2.6.2.6 Robustez ... 64
4.2.7 Desenvolvimento, validação e aplicação de método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação de galocatequina e galato de epigalocatequina em extratos de barbatimão... 65
4.2.7.1 Desenvolvimento do método e otimização das condições cromatográficas ... 65
4.2.7.2 Pré-purificação das amostras de extrato etanólico seco de barbatimão ... 67
4.2.7.2.1 Caracterização das frações orgânicas por espectrofotometria de absorção no infravermelho ... 68
4.2.7.3 Validação do método analítico por CLAE... 68
4.2.7.3.1 Seletividade ... 68
4.2.7.3.2 Linearidade... 69
4.2.7.3.3 Precisão intra-ensaio e precisão inter-ensaio... 70
4.2.7.3.4 Exatidão... 70
4.2.7.3.5 Limite de detecção e limite de quantificação ... 73
4.2.7.3.6 Robustez ... 73
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 75
5.1 CONTROLE DE QUALIDADE DA DROGA VEGETAL... 75
5.1.1 Operações de secagem e de divisão da droga vegetal ... 75
5.1.2 Avaliação dos caracteres organolépticos ... 75
5.1.3 Determinação da granulometria dos pós da droga vegetal ... 76
5.1.4 Reações de identificação... 78
5.1.5 Cromatografia em camada delgada ... 80
5.1.5.1 Sistema eluente conforme Farmacopéia Brasileira 4ª edição ... 80
5.1.5.2 Método com sistemas eluentes alternativos ... 83
5.1.6 Material estranho... 86
5.1.7 Determinação de Água... 87
5.1.8 Cinzas totais ... 87
5.2 CONTROLE DE QUALIDADE DOS EXTRATOS DA DROGA VEGETAL ... 88
5.2.1 Avaliação dos caracteres organolépticos ... 88
5.2.2 Avaliação da solubilidade... 89
5.2.3 Avaliação do pH ... 90
5.2.4 Resíduo seco... 91
5.2.5 Determinação da densidade relativa... 92
5.2.7 Cromatografia em camada delgada ... 93
5.2.7.1 Extrato glicólico ... 93
5.2.7.2 Extrato etanólico seco ... 93
5.3 APLICAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS FARMACOPEICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE TANINOS TOTAIS ... 96
5.3.1 Método espectrofotométrico na região visível (λλλ 715 nm) utilizando λ reagente Folin-Denis para quantificação de taninos totais em extratos de barbatimão, de acordo com Farmacopéia Brasileira 4ª edição ... 97
5.3.1.1 Seletividade... 97
5.3.1.2 Linearidade... 98
5.3.1.3 Precisão Intra-corrida e Inter-corrida ... 101
5.3.2 Método espectrofotométrico na região visível (λλλ 760 nm) utilizando λ reagente Folin-Ciocalteau para quantificação de taninos totais em extratos de barbatimão, de acordo com Farmacopéia Européia 6ª edição .... 103
5.3.2.1 Seletividade... 103
5.3.2.2 Linearidade... 104
5.3.2.3 Precisão Intra-corrida e Inter-corrida ... 106
5.4 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO ALTERNATIVO POR ESPECTROFOTOMETRIA NA REGIÃO ULTRAVIOLETA PARA QUANTIFICAÇÃO DE TANINOS TOTAIS EM EXTRATOS DE BARBATIMÃO... 109
5.4.1 Seleção e otimização das condições analíticas... 109
5.4.2 Validação do método analítico por espectrofotometria na região ultravioleta... 112
5.4.2.1 Seletividade... 112
5.4.2.2 Linearidade... 113
5.4.2.3 Precisão intra-ensaio e precisão inter-ensaio ... 115
5.4.2.4 Exatidão ... 118
5.4.2.5 Limite de detecção e limite de quantificação... 119
5.4.2.6 Robustez ... 120
5.4.3 Comparação entre os métodos oficiais e o método espectrofotométrico na região ultravioleta para determinação de taninos totais... 120
5.4.4 Doseamento dos extratos de barbatimão por espectrofotometria na região ultravioleta, método alternativo... 122
5.5.1 Desenvolvimento do método cromatográfico... 123 5.5.2 Pré-purificação das amostras de extrato etanólico seco de S. adstringens
por partição líquido-líquido... 125
5.5.2.1 Caracterização das frações por espectrofotometria de absorção no infravermelho... 127
5.5.3 Otimização das condições cromatográficas ... 129 5.5.4 Validação do método analítico por CLAE... 132
5.5.4.1 Seletividade... 133 5.5.4.2 Linearidade... 134 5.5.4.3 Precisão intra-ensaio e precisão inter-ensaio ... 139 5.5.4.4 Exatidão ... 141 5.5.4.5 Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)... 144 5.5.4.6 Robustez ... 145
5.5.5 Doseamento do extrato de S. obovatum por CLAE ... 146
1 INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais e da fitoterapia vem se expandindo em todo o mundo sendo uma conseqüência, dentre outros fatores, do alto custo dos medicamentos industrializados e da falta de uma assistência médica e farmacêutica eficazes. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 65 a 80% da população mundial, presente nos países em desenvolvimento (Ásia, África e América Latina) depende da medicina caseira, especialmente a partir do uso de plantas, para seus cuidados primários de saúde. Mesmo assim, poucas espécies de vegetais foram avaliadas visando sua transformação em medicamento fitoterápico (WORLD, 1999).
O desenvolvimento de fitoterápicos é um processo difícil e oneroso que envolve diferentes áreas como: botânica, química e farmacologia, incluindo a toxicologia. Outras áreas do conhecimento também podem estar envolvidas ao longo do processo, tais como antropologia, agronomia, biotecnologia e química orgânica, além da tecnologia farmacêutica e do controle de qualidade (RATES, 2001). A área de controle de qualidade tem um papel fundamental no desenvolvimento de métodos analíticos validados para análise das matérias-primas (drogas vegetais), dos produtos intermediários e dos produtos acabados produzidos a partir destas plantas medicinais. Estes métodos analíticos validados podem ainda constituir monografias farmacopeicas e serem inseridas em compêndios oficiais. As monografias farmacopeicas, portanto, têm como objetivo prover informação científica sobre o controle de qualidade das matérias-primas e dos produtos acabados (WORLD, 1999). No Brasil, existem critérios para a redação dos textos das monografias farmacopeicas, preconizados no Guia para a Redação das Monografias da Farmacopéia Brasileira – Quinta Edição, buscando-se harmonizar e tornar mais objetiva a linguagem adotada nos procedimentos (AGÊNCIA, 2005).
Portanto, a definição de normas para garantir a segurança, qualidade e eficácia das plantas medicinais e dos fitoterápicos tornou-se um objetivo importante, principalmente nos países em desenvolvimento.
A produção de fitoterápicos com plantas nativas é importante e constitui a principal estratégia para proteção e valorização da flora brasileira (BRANDÃO et al., 2006). Para tanto, a eficácia deve ser comprovada e a toxicidade avaliada, bem como devem ser desenvolvidos e validados métodos analíticos para o controle de qualidade das drogas vegetais, dos produtos intermediários e dos produtos acabados.
No Brasil, alguns instrumentos de normatização buscam este objetivo, tais como: a Política Nacional de Medicamentos a qual apóia as pesquisas que visem o
a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS a qual objetiva ampliar as opções terapêuticas aos usuários do SUS, com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à Fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade (BRASIL, 2006b); e
o Decreto Presidencial nº 5.813, de 22 de junho de 2006 o qual elabora a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e garante à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional (BRASIL, 2006a).
As preparações fitoterápicas são muito usadas também em dermatologia e no tratamento de feridas. A eficiência de alguns agentes fitoterápicos, usados na medicina tradicional, vem sendo avaliada e confirmada por meio de pesquisas desenvolvidas em todo o mundo. Produtos contendo extratos de arnica (Arnica montana) (LYSS et al., 1997), calêndula (Calendula officinalis) (KLOUCHEK-POPOVA, et al., 1982; WAGNER et al., 1985; CARVALHO et al., 1991; LOGGIA et al., 1994), hamamelis (Hamamelis virginiana) (HUGHES-FORMELLA et al., 1998), babosa (Aloe vera) (HEGGERS et al., 1996; ZHANG et al., 1996; CHITHRA et al., 1998a, 1998b; CHOI et al., 2001; KRISHNAN, 2006) e Datura alba (PRIYA et al., 2002) por exemplo, apresentam atividades farmacológicas devidamente estabelecidas. As folhas de tanchagem (Plantago sp.) são utilizadas como agente antimicrobiano, cicatrizante e antiinflamatório. Estudos recentes vêm demonstrando a eficácia da planta no tratamento de feridas devido à presença de mucopolissacarídeos com atividade cicatrizante e preventiva da formação de escaras. Estudos in vitro demonstraram que a aderência das bactérias aos polissacarídeos, associada à absorção de fluido e estimulação dos macrófagos, pode estar relacionada à atividade (SAMUELSEN, 2000; SCHMIDGALL, 2000; WESTERHOF et al., 2000). Outros estudos demonstraram que as folhas de Plantago ovata e Plantago major apresentam polissacarídeos com atividade imunoestimulante, que também deve contribuir no mecanismo de ação antiinflamatório e antimicrobiano (GOMEZ-FLORES, 2000; HETLAND, 2000). Obaseiki-Ebor (1985) e Nassis
et al. (1992) relatam que as folhas das espécies do gênero Bryophyllum, conhecidas
popularmente como bálsamo, também possuem atividades anti-histamínica e antimicrobiana que podem estar relacionas à ação cicatrizante.
O uso atual da planta pode ser observado em um levantamento realizado junto aos pacientes da clínica de cirurgia plástica do Hospital Público Regional de Betim (MG) o qual revelou que o barbatimão é uma das plantas medicinais mais utilizadas pela população de baixa renda para o tratamento de feridas (CHAMPS et al., 2003). Esta pesquisa foi realizada em parceria entre o Laboratório de Farmacognosia/Departamento de Produtos Farmacêuticos e o Departamento de Farmácia Social, todos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais (FAFAR/UFMG) e o Departamento de Morfologia/Instituto de Ciências Biológicas também da UFMG.
No mercado brasileiro não existem especialidades farmacêuticas produzidas com barbatimão registradas na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a despeito da existência de estudos científicos comprovando a sua ação no tratamento de feridas crônicas.
A ANVISA regulamenta por meio da Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) nº 48, de 16 de março de 2004, o registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil. Esta resolução exige no ato do protocolo de pedido de registro, a apresentação de relatório contendo, dentre outras informações técnicas (BRASIL, 2006b):
Relatório de controle de qualidade, incluindo análise qualitativa e quantitativa dos princípios ativos e/ou marcadores, quando conhecidos, ou classe de compostos químicos característicos da espécie;
Controle de qualidade do produto acabado, apresentando resultado da prospecção (screening) fitoquímica, ou perfil cromatográfico (fingerprint) por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
A espécie S. adstringens conta com monografia farmacopeica para sua droga vegetal na Farmacopéia Brasileira 4ª edição (FARMACOPÉIA, 2002), entretanto, não existem monografias para produtos intermediários (extratos) e para produtos acabados obtidos com o barbatimão. Além disto, os métodos analíticos preconizados não permitem a padronização dos extratos em termos de marcadores químicos individuais e sim por doseamento de taninos totais, exigem um tempo de análise longo e geram grande quantidade de resíduos tóxicos para o analista e o meio ambiente.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a qualidade de extratos preparados com cascas do tronco de
Stryphnodendron adstringens (barbatimão).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver e validar métodos analíticos aplicáveis ao controle de qualidade de extratos de S. adstringens;
comparar os métodos espectrofotométricos oficiais, com leituras na região do visível, com método desenvolvido para leitura na região do ultravioleta (UV);
avaliar o perfil cromatográfico de extratos de barbatimão por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
3 REVISÃO DA LITERATURA
As plantas medicinais são usadas desde tempos remotos como medicamentos para o tratamento de variedade de doenças, tendo uma função primordial na saúde mundial. Apesar das grandes vantagens observadas na medicina convencional, as plantas ainda têm uma importante contribuição nos tratamentos de saúde.
Estima-se que cerca de 25-30% de todos os medicamentos disponíveis são produtos naturais (plantas, microorganismos e animais) ou são derivados de produtos naturais. Entretanto, poucas plantas têm sido cientificamente estudadas para avaliação de sua qualidade, segurança e eficácia (CALIXTO, 2005).
A Divisão de Medicina Tradicional da OMS reconhece a importância das espécies de plantas usadas pelos Ameríndios como medicamento e recomenda que a eficácia deva ser avaliada por doseamentos farmacológicos e toxicológicos (WORLD, 2002).
Segundo Brandão et al. (2008), a segunda espécie mais freqüentemente mencionada descrita pelos naturalistas do século XIX e descrita na Farmacopéia 1ª edição
é o Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (barbatimão), tradicionalmente usada como
adstringente de acordo com seis naturalistas, devido ao alto teor de taninos (aproximadamente 30%) de suas cascas.
No presente trabalho foram desenvolvidos métodos extrativo-analíticos para determinação de taninos em insumos e produtos vegetais de barbatimão, bem como se avaliou a qualidade físico-química da droga vegetal e dos extratos.
Foram preparados extratos etanólico seco e glicólico a partir da droga vegetal moída. A preparação e a caracterização de extratos glicólicos, ricos em taninos a partir das cascas de barbatimão, já foram desenvolvidas e descritas (ARDISSON et al., 2002). O propilenoglicol foi o solvente escolhido, devido a sua baixa toxicidade e baixa irritação quando comparado ao álcool, sendo o solvente ideal para desenvolver produtos de uso tópico, tais como géis, cremes e loções. Além disto, trabalhos anteriores já demonstraram que o propilenoglicol é bastante efetivo na extração de substâncias polifenólicas (DIEMUNSCH, 1980; MULLER, 1992; JONES et al., 1998).
3.1 DESCRIÇÃO VEGETAL
Dentre as plantas mais utilizadas na medicina popular para o tratamento das feridas estão as cascas da espécie Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville, Fabaceae (FORERO, 1972; MISSOURI, 2007), sinonímia também encontrada Stryphnodendron
característica da região do cerrado brasileiro, ocorrendo desde o sul do Pará até São Paulo e Mato Grosso do Sul.
A palavra Stryphnodendron é originada do grego e significa Strypnós (duro), déndron (árvore), portanto dá-se idéia de lenho duro. Por sua vez, a palavra barbadetiman é um termo específico de origem indígena, ibá-timo, que significa “árvore que aperta”, isto é adstringente (PANIZZA et al., 1988). Espécies de Stryphnodendron recebem também os nomes populares de barba-de-timão, ibatimó, uabatimõ, choranzinho-roxo, casca da virgindade ou da mocidade.
O S. adstringens é uma planta arbórea, de porte pequeno e crescimento muito lento,
tortuosa, inerme, com pouca folhagem e casca rugosa. As folhas são alternas, grandes e bipinadas compostas. Os folíolos são geralmente alternos, glabros, subcoriáceos, orbiculares, medindo cerca de 2 cm de diâmetro, com ápice retuso e base assimétrica. As flores são pequenas, esbranquiçadas, numerosas, dispostas em espigas densas, axilares, medindo cerca de 10 cm de comprimento. Os frutos são do tipo legumes sésseis, contendo várias sementes de coloração castanho-clara e ligeiramente achatadas. As folhas são caducas, permanecendo a árvore despida nos meses de junho e julho, voltando a brotar em agosto. A floração inicia-se em setembro e a frutificação em novembro (CORRÊA, 1984).
A droga vegetal é constituída pelas cascas da árvore, sendo aquelas provenientes de
S. adstringens inscritas na Farmacopéia Brasileira 4ª edição (2002). Segundo a
Farmacopéia, as cascas devem apresentar-se em pedaços de forma e tamanho variáveis, recurvadas no sentido transversal e medindo em geral 12 cm de espessura. A superfície externa da casca deve ser de cor parda esverdeada e com placas esbranquiçadas, quando recoberta por liquens. Podem ser muito rugosas e profundamente escavadas em todos os sentidos. Sua superfície interna deve ser parda avermelhada viva, muitas vezes enrugada transversalmente e estriada longitudinalmente, devido à presença de grandes feixes de fibras. São inodoras e causam sensação adstringente.
3.2 CONSTITUIÇÃO QUÍMICA
do tipo 1 face à presença de hidroxila na posição C-5 do anel A e são denominadas prodelfinidinas.
Figura 1 Estruturas do ácido gálico e de flavan-3-óis isolados de Stryphnodendron
adstringens.
Tabela 1Ácido gálico e flavan-3-óis isolados a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al., 1993, 1997)
Substância Estrutura
Ácido gálico 1
(+)-galocatequina 2
(-)-epigalocatequina 3
(-)-epigalocatequina-3-O-galato 4
4’-O-metilgalocatequina 5
A ocorrência natural de várias prorobinetinidinas novas nas cascas de barbatimão foi demonstrada. A fração solúvel em acetato de etila do extrato acetona:água obtido das cascas secas foi cromatografada em Sephadex LH-20 e as frações contendo oligoflavonóides foram posteriormente ultrapurificadas por cromatografia em contra-corrente multi-camada espiralada (CCMCE) e CLAE de fase reversa C18, obtendo-se os compostos 1-8 apresentados na Figura 2 e na Tabela 2 (MELLO et al., 1996b, 1997). As prorobinetinidinas são proantocianidinas do tipo 2 devido à ausência de hidroxila na posição C-5 do anel A.
Tabela 2 Prorobinetinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al., 1996b, 1997)
Substância Estrutura
robinetinidol-(4β→8)-epigalocatequina 1
robinetinidol-(4α→8)-galocatequina 2
robinetinidol-(4α→8)-epigalocatequina 3
robinetinidol-[4β→6(8)]-galocatequina 4
robinetinidol-(4β→8)-epigalocatequina-3-O-galato 5
robinetinidol-(4α→6)-galocatequina 6
robinetinidol-(4α→6)-epigalocatequina 7
robinetinidol-(4α→8)-epigalocatequina-3-O-galato 8
Outros seis flavan-3-óis e oito proantocianidinas do Tipo 1, classificadas como prodelfinidinas, também foram isolados das cascas de barbatimão por Mello e colaboradores (1996a, 1997). Dois novos flavan-3-óis foram isolados:
epigalocatequina 3-O-(3,5-dimetil)-galato e
epigalocatequina 3-O-(3-metóxi-4-hidróxi)benzoato.
Das proantocianidinas isoladas, quatro novas tiveram suas estruturas elucidadas: epigalocatequina-(4β→8)-epigalocatequina 3-O-(4-hidróxi)benzoato;
epigalocatequina (4β→6)-epigalocatequina;
galocatequina-(4α→8)-epigalocatequina-3-O-galato e
galocatequina-(4α→8)-epigalocatequina-3-O-(4-hidróxi)benzoato.
As estruturas dos compostos isolados são apresentadas nas Figuras 3 e 4 e nas Tabelas 3 e 4.
Figura 3 Estruturas de flavan-3-óis e prodelfinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens. A letra “a” próxima aos números indica o derivado peracetato.
Tabela 3 Flavan-3-óis e prodelfinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al., 1996a, 1997)
Substância Estrutura
4’-O-metilgalocatequina 4
epigalocatequina 3-O-(3,5-dimetil)-galato 5
epigalocatequina 3-O-(3-metóxi-4-hidroxibenzoato) 6
epigalocatequina-(4β→8)-galocatequina 7
epigalocatequina-(4β→8)-epigalocatequina 8
epigalocatequina-(4β→8)-epigalocatequina-3-O-galato 9
epigalocatequina-(4β→8)-epigalocatequina-3-O-(p-hidróxi)benzoato 10
Figura 4 Estruturas de prodelfinidinas diméricas isoladas de Stryphnodendron adstringens. A letra “a” próxima aos números indica o derivado peracetato.
Tabela 4 Prodelfinidinas diméricas isoladas a partir do extrato acetato de etila das cascas secas de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al, 1996a, 1997)
Substância Estrutura
epigalocatequina-(4β→6)-epigalocatequina 12
galocatequina-(4α→8)-epigalocatequina-3-O-galato 13
Figura 5 Estrutura da prodelfinidina dimérica 4’-O-metilgalocatequina-(4α→8)-4’-O -metilgalocatequina isolada de Stryphnodendron adstringens (MELLO et al, 1999).
Portanto, as cascas de S. adstringens são uma fonte rica de proantocianidinas com unidades pirogalol com atividade biológica (MELLO et al., 1996a).
É importante esclarecer que os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela policondensação de duas ou mais unidades flavan-3-ol e flavan-3,4-diol. Essa classe de taninos também é conhecida como proantocianidina devido ao fato de os taninos condensados produzirem pigmentos avermelhados da classe das antocianidinas, tais como cianidina e delfinidina, após degradação com ácido mineral diluído a quente.
Santos e colaboradores (2002) avaliaram comparativamente a composição de taninos de três espécies diferentes conhecidas por barbatimão Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, Stryphnodendron polyphyllum (Mart.) e Dimorphandra mollis (Benth). Os resultados mostraram diferenças marcantes entre os gêneros Stryphnodendron e
Dimorphandra, e também diferenças químicas entre as espécies do mesmo gênero, as
3.3 AÇÕES FARMACOLÓGICAS
As plantas ricas em taninos são empregadas na medicina tradicional no tratamento de diversas moléstias, tais como diarréia, hipertensão arterial, reumatismo, hemorragias, feridas, queimaduras, problemas estomacais (azia, náusea, gastrite e úlcera gástrica), problemas renais e do sistema urinário e processos inflamatórios em geral (HASLAM, 1996; DE BRUYNE et al., 1999; DUFRESNE, 2001).
Alguns estudos preliminares mostram significativas atividades biológicas para espécies do gênero Stryphnodendron: atividade anti-tirosinase (BAURIN et al., 2002); moluscicida (BEZERRA et al., 2002); interferência no metabolismo energético em fígado de ratos (REBECCA et al., 2003); cicatrizante e antiinflamatória (LOPES et al., 2005).
Acredita-se que as atividades farmacológicas dos taninos são devidas, pelo menos em parte, a três características gerais que são comuns em maior ou menor grau aos dois grupos de taninos, condensados e hidrolisáveis (HASLAM, 1996, 1998; SIMÕES et al., 2004):
1. Complexação com íons metálicos (ferro, manganês, vanádio, cobre, alumínio, cálcio, entre outros);
2. Atividade antioxidante e seqüestradora de radicais livres e
3. Habilidade de complexar com outras moléculas incluindo macromoléculas tais como proteínas e polissacarídeos.
Os taninos ajudam no processo de cicatrização de feridas, queimaduras e inflamações através da formação de uma camada protetora (complexos tanino-proteína e/ou tanino-polissacarídeo) sobre a pele ou mucosa danificada, ocorrendo, abaixo desta, o processo natural de cura (reestruturação do epitélio e formação de vasos). Processo similar ocorre provavelmente em casos de úlcera gástrica, em que uma camada de tanino-proteína complexados protege a mucosa do estômago (HASLAM, 1998; AUDI et al., 1999).
cicatrização, os taninos precipitam as proteínas dos tecidos lesados, formando um revestimento protetor que favorece a sua regeneração (HEIJMEN et al., 1997; PANIZZA et al. 1988, NETO et al., 1996). Seria interessante, portanto, o desenvolvimento de produtos com a planta, os quais possam ser utilizados para o tratamento de feridas (ARDISSON et al., 2002).
Na medicina popular, decoctos ou infusos das cascas in natura desta espécie são também utilizados nas leucorréias, diarréias e como um agente antiinflamatório devido à presença de proantocianidinas detectadas na fração solúvel acetônica da droga vegetal (SIQUEIRA, 1982; SANTOS et al., 1987; LIMA et al., 1998).
Rebecca e colaboradores (2002) estudaram a toxicidade do extrato aquoso total de barbatimão, após administração oral em camundongos, sendo que os resultados indicaram que uma administração num período prolongado produz efeitos tóxicos nos animais experimentais. Por outro lado, o extrato fitoterapêutico das cascas de S. adstringens não se mostrou genotóxico em células germinativas e somáticas de D. melanogaster (SOUSA et al., 2003).
Ishida e colaboradores (2006) demonstraram a ação antifúngica, contra Candida
albicans, de subfrações do extrato bruto de S. adstringens devido a presença de taninos
condensados.
3.4 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS
CONDENSADOS
Para a determinação de taninos condensados podem ser usados diversos métodos analíticos, apesar da quantificação ser um processo delicado tendo em vista que a extração é difícil de ser alcançada e nem todos os métodos baseados nas características fenólicas destes compostos são específicos, além da complexidade devido a diversidade de estruturas encontradas neste grupo de substâncias (BRUNETON, 1999). Muitos métodos analíticos têm sido usados para quantificar os taninos em drogas vegetais (SCHOFIELD, 2001):
a) Métodos que incluem despolimerização oxidativa, como o doseamento com butanol-ácido o qual promove uma reação colorimétrica onde o tanino condensado se fragmenta formando antocianidina de cor vermelha que pode ser dosada por espectrofotometria na região do visível.
Um método por injeção de fluxo, utilizando-se vanilina como reagente, foi proposto para determinação de taninos condensados (FERREIRA & NOGUEIRA, 2000); c) Métodos colorimétricos para fenólicos totais, tais como os doseamentos com azul da
Prússia, com reagente de Folin-Denis ou com reagente de Folin-Ciocalteau. Estes métodos são baseados em reações de oxi-redução com formação de complexo colorido com máximo de absorção na região do espectro visível. Infante e colaboradores (2008) propuseram um sistema de injeção de fluxo para determinação de taninos totais baseado na reação com o reagente de Folin-Denis;
d) Métodos que envolvem reações de clivagem ácida, incluindo tiólise e degradação por floroglucinol. Nestas reações, a unidade final da cadeia polimérica dos taninos condensados é liberada com um substituinte permitindo-se determinar a composição e o tamanho do polímero de tanino condensado.
e) Métodos gravimétricos utilizando-se sal de itérbio (Yb+3) ou polivinilpirrolidona (PVP)
como reagentes.
f) Métodos baseados na inibição da atividade enzimática de diversas enzimas.
g) Métodos que envolvem reações de precipitação: ou com proteínas, tais como a albumina bovina sérica, ou com polietilenoglicol 4000 (PEG 4000), substâncias que formam complexos insolúveis com os taninos condensados.
h) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), tanto de fase normal quanto de fase reversa.
i) Métodos por inibição do crescimento microbiano, onde se avalia o impacto da presença dos taninos no crescimento microbiano ou a formação de ligação entre os taninos com as bactérias de forma similar aos doseamentos de precipitação por proteína citados previamente.
A Farmacopéia Brasileira 2ª edição (FARMACOPÉIA, 1959) apresenta monografia para o barbatimão especificando um teor de no mínimo 20% de taninos totais, valor este modificado pela publicação mais recente de monografia para a mesma droga vegetal na Farmacopéia Brasileira 4ª edição (FARMACOPÉIA, 2002) preconizando um teor bem menor de taninos totais, de no mínimo 8%, que deve ser determinado pelo método colorimétrico de Denis. Nesta pesquisa, buscou-se trabalhar com o método colorimétrico de Folin-Ciocalteau preconizado pela Farmacopéia Européia 5ª edição no método 2.8.14 Determinação de taninos em drogas vegetais presente nos Métodos em Farmacognosia (EUROPEAN, 2004). O método de Folin-Ciocalteau é uma versão melhorada do método de Folin-Denis onde a possibilidade de formação de precipitado neste último interfere nas medidas espectrofotométricas (SCHOFIELD, 2001).
a droga vegetal, entretanto, ainda não há trabalhos publicados indicando a presença, o teor e a identificação estrutural desta classe de substâncias na droga vegetal da espécie S.
adstringens.
3.4.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Os taninos condensados podem ser quantificados usando-se CLAE. Ambas as colunas de fase normal e fase reversa tem sido aplicadas (CHEYNIER et al., 1999; LAZARUS et al., 1999; WATERHOUSE et al., 1999). CLAE de fase reversa foi usada para separação de taninos condensados de baixo peso molecular, mas a ordem de eluição não está relacionada ao grau de polimerização (CHEYNIER, et al., 1999). A separação de grandes polímeros (≥ tetrâmeros) com este método não é possível. A presença de muitos
isômeros com polaridade similar resulta em sobreposição de tempos de retenção (LAZARUS et al., 1999; WATERHOUSE et al., 1999). CLAE de fase normal foi usada para separar oligômeros de taninos condensados e polímeros (LAZARUS et al., 1999) de vários produtos vegetais alimentícios. A ordem de eluição aumenta com o aumento no grau de polimerização.
Vários métodos de detecção têm sido aplicados conjuntamente com CLAE para determinação de taninos condensados. A detecção por ultravioleta é a mais comumente utilizada (WATERMAN & MOLE, 1994). Entretanto, este método não é específico para os taninos condensados na presença de outros polifenóis (LAZARUS et al., 1999). Métodos alternativos incluem detecção eletroquímica e fluorescência (WATERMAN & MOLE, 1994; LAZARUS et al., 1999). As informações estruturais para a identificação de oligômeros de taninos condensados podem ser obtidas usando-se espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear e hidrólise química (HAMMERSTONE et al., 1999).
