CAMPUS DE JABOTICABAL
ESTUDO HISTOLÓGICO DE INTESTINO DELGADO DE
CAMUNDONGOS COLONIZADOS POR CEPAS DE
Escherichia coli
ENTEROPATOGENICAS DE ORIGEM
BOVINA
Simone Barone Salgado Marques
Orientador: Prof. Dr. José Moacir Marin
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP , Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
Ofereço
Agradecimento Especial
Ao meu orientador Prof. Dr. José Moacir Marin, pelo exemplo de profissionalismo,
AGRADECIMENTOS
Sou particularmente agradecida ao Professor Doutor Sebastião Hetem por todo o seu carinho,dedicação e facilidades concedidas ao longo deste trabalho.
À minha grande amiga Professora Doutora Renata Camacho Miziara por toda a sua paciência, amizade e total disponibilidade a mim oferecida.
À Deus, por tornar possível mais uma etapa da minha vida.
À Faculdade de Odontologia de Barretos, por proporcionar a realização deste
trabalho.
À Técnica do laboratório de Histologia da Fundação Educacional de Barretos Terezinha, pela sua ajuda e disponibilidade na confecção do material histológico.
SUMÁRIO
Página
1.INTRODUÇÃO... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 5
2.1. Escherichia coli... 5
2.1.1. Taxonomia... 5
2.1.2. Síndromes gastroentéricas por Escherichia coli... 7
2.1.3. Riscos de infecção por Escherichia coli...10
2.1.4. Mecanismos de patogenicidade por cepas de Escherichia coli...12
2.1.5. Epidemiologia... 16
2.2. Escherichia coli enteropatogênica... 16
2.3. Modelo de infecçãopor Escherichia coli em camundongo... 19
3. OBJETIVO... 22
4.MATERIAIS MÉTODOS... 23
4.1. Linhagens de EPEC... 23
4.2. Animal e infecção... 23
4.3. Exame histológico... 24
4.4. Etapas de preparação de lâminas histológicas... 25
5. RESULTADOS... 27
6. DISCUSSÃO ... 39
7. CONCLUSÕES... 43
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Figura 1: A figura mostra o principal mecanismo de patogenicidade da EPEC,
que é uma lesão provocada pela sua aderência ao epitélio através do
”attaching and effacing” (A/E)... 3 Tabela 1: Sumário das cepas de Escherichia coli diarreiogênicas... 15 Figura 2: Animal controle. Corte longitudinal. Fotomicroscopia do íleo,
aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus” com 20 dias, sem a presença de alterações histológicas e
patológicas. Seta grossa: célula caliciforme, seta fina enterócitos... 28 Figura 3: Animal controle. Corte transversal. Fotomicroscopia do íleo, aumento
de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus”
com 20 dias, sem a presença de alterações histológicas e patológicas... 29 Figura 4: Linhagem1: EPEC padrão, corte longitudinal. Fotomicroscopia do
íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus” com 20 dias, Apresentou epitélio das vilosidades intestinais com bordas regulares e lâmina própria sem infiltrado inflamatório. Seta grossa:
célula caliciforme, seta fina enterócitos... 30 Figura 5: Linhagem 2 patogênica: 537-1 corte longitudinal. Fotomicroscopia
do íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do
camundongo “Mus musculus” com 20 dias, Apresentou epitélio das vilosidades intestinais com bordas regulares e lâmina própria sem infiltrado inflamatório.
Seta: lâmina própria... 31 Figura 6: Linhagem 4: patogênica 304-3 corte longitudinal. Fotomicroscopia
do íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do
camundongo “Mus musculus” com 20 dias, epitélio das vilosidades intestinais com bordas regulares e lâmina própria sem infiltrado inflamatório. Seta:
artefato de técnica... 32 Figura 7: Linhagens 1: EPEC padrão CDC 3111-90 corte
(hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus” com 20 dias,
apresentou epitélio das vilosidades intestinais com bordas regulares e lâmina
própria sem infiltrado inflamatório. Seta: artefato de técnica... 33 Figura 8: Linhagem 2 patogênica: 537-1 corte longitudinal.Fotomicroscopia do
íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus” com 20 dias, apresentou epitélio das vilosidades intestinais com bordas regulares e lâmina própria sem infiltrado inflamatório. Chave:
identifica um vilo; setas: linfócitos... 34 Figura 9: Linhagem 4 patogênica: 304-3 corte longitudinal. Fotomicroscopia
do íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do
camundongo “Mus musculus” com 20 dias, epitélio das vilosidades intestinais com bordas regulares e lâmina própria sem infiltrado
inflamatório... 35 Figura 10: Linhagem 3 patogênica: 263 corte longitudinal. Fotomicroscopia do
íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus” com 20 dias. A camada superficial está rompida em vários locais e apresenta contorno irregular com presença de infiltrado inflamatório.
Seta: rompimento da superfície do epitélio. ... 36 Figura 11: Linhagem 5 patogênica: 988-2 corte longitudinal. Fotomicroscopia
do íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do
camundongo “Mus musculus” com 20 dias, apresentou rompimento e contorno irregular das células epiteliais das vilosidades intestinais, chegando a atingir a lâmina própria, a qual apresentou infiltrado inflamatório. Setas finas,
rompimento do epitélio; seta grossa rompimento do epitélio com invasão da
lâmina própria... 37 Figura 12: Linhagem 5 patogênica: 988-2 corte tranversal. Fotomicroscopia do
íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus” com 20 dias, o epitélio apresentou lesões, observado por pequenos conjuntos de células em degeneração, separados por expansões
epitélio; seta grossa rompimento do epitélio com invasão da lâmina própria.
ESTUDO HISTOLÓGICO DE INTESTINO DELGADO DE CAMUNDONGOS
COLONIZADOS POR CEPAS DE Escherichia coli ENTEROPATOGENICAS DE
ORIGEM BOVINA
RESUMO - A aderência de bactérias patogênicas a receptores na superfície de
células epiteliais tem sido reconhecida como um importante evento inicial da
colonização bacteriana. O principal mecanismo de patogenicidade da EPEC é uma
lesão provocada pela sua aderência ao epitélio através do ”attaching and effacing”
(A/E), que é caracterizado pela íntima adesão da bactéria à célula do hospedeiro, esta
adesão às microvilosidades do enterócito ocorre devido a formação de estruturas
semelhantes a pedestais. O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de
infecção com a Escherichia coli enteropatogenica (EPEC) em camundongo do tipo mus
musculus. A estes animais foram administrados um inoculo de 108 CFU de linhagens
EPEC, sendo que a linhagem 3111-90 foi proveniente de cepas que podem causar
diarréia infantil e as linhagens 537-1, 263, 304-3 e 988-2 foram provenientes de leite
mastítico bovino. As linhagens foram introduzidas em camundongos com vinte dias de
vida por via intraperitonial, e estes foram eutanasiados cinco horas após a inoculação.
Como resultado através de cortes histológicos seriados, verificou-se que algumas das
linhagens inoculadas levaram ao aparecimento de lesões suaves na mucosa intestinal,
com a quebra da camada celular superficial da mucosa, aparecimento de células
epiteliais com contornos irregulares e infiltração de células inflamatórias.
1. INTRODUÇÃO
A Escherichia coli é uma bactéria bacilar Gram-negativa, que é juntamente com o Staphylococcus aureus a mais comum e uma das mais antigas bactérias parasitas do
Homem, sendo o seu habitat natural o lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente.
Possuem fímbrias ou adesinas que permitem a sua fixação, impedindo o arrastamento pela urina ou diarréia. Muitas produzem exotoxinas. A estirpe de E.coli que existe normalmente nos intestinos de um determinado indivíduo é bem conhecida e controlada pelo seu sistema imunitário, e raramente causa problemas, exceto quando há debilidade do indivíduo. A maioria das doenças é devida a E.coli vindas de indivíduos diferentes e portanto de estirpe diferente, não reconhecida pelos linfócitos. As intoxicações alimentares em particular são quase sempre devidas a bactérias de estirpes radicalmente diferentes.
O termo Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) foi criado para designar E.coli de sorotipos que mostraram ser patogênicos para a espécie humana com o potencial particular de causar infecção entérica ao invés de infecção extra-intestinal. Desde que esta definição original de EPEC foi feita, foi demonstrado que a E. coli pode causar doença intestinal através de diversos mecanismos diferentes. O termo EPEC veio para
EPEC foi inicialmente implicada em doenças infecciosas humanas no inicio de 1940 como um resultado de análises de epidemias de gastroenterite infantil aguda. As linhagens de EPEC infectam populações humanas através do mundo e permanecem como uma das causas primárias de diarréia infantil em países em desenvolvimento. No Brasil, por exemplo, linhagens de EPEC são isoladas de 30% ou mais de crianças de baixo status sócio econômico com diarréia.
Historicamente, as linhagens de EPEC têm sido identificadas pelo sorotipo, a combinação distinta de antígenos, O (somático) e H (flagelar), os quais tem sido associados epidemiologicamente, à diarréia infantil. Em 1987, a Organização Mundial
de Saúde reconheceu como sorotipos de EPEC um grupo de 12 sorogrupos O diferentes. Nos últimos 15 anos, entretanto, as ferramentas para identificar EPEC, têm sido refinadas com base na patogênese de EPEC e nos genes de virulência específica que têm sido descritos.
A aderência de bactérias patogênicas a receptores na superfície de células epiteliais tem sido reconhecida como um importante evento inicial da colonização bacteriana.
O principal mecanismo de patogenicidade da EPEC é uma lesão provocada pela sua aderência ao epitélio através do ”attaching and effacing” (A/E), que é caracterizado pela íntima adesão da bactéria à célula do hospedeiro, esta adesão às microvilosidades do enterócito ocorre devido a formação de estruturas semelhantes a pedestais (fig. 1). Os determinantes genéticos para a produção de lesões A/E estão localizados na membrana apical do enterócito (LEE), onde as EPEC secretam uma proteína de membrana de 94-KDa denominada intimina, a qual é responsável pela íntima adesão da bactéria à membrana do enterócito. A intimina é codificada pelo gene eae, o qual se localiza numa ilha de patogenicidade .
Principal mecanismo de patogenicidade da EPEC
Figura 1: A figura mostra o principal mecanismo de patogenicidade da EPEC, que é uma lesão provocada pela sua aderência ao epitélio através do ”attaching and effacing” (A/E), que é caracterizado pela íntima adesão da bactéria à célula do hospedeiro: I) através do pilli; II) a bactéria então injeta o seu próprio receptor chamado de Tir; III) esta adesão às microvilosidades do enterócito ocorre devido a adesão Tir + Intimina (expressa na superfície da bactéria) formando estruturas semelhantes a pedestais
As linhagens que apresentam este tipo de lesão foram reagrupadas com o nome E. coli “attaching/effacing” (AEEC), foram identificadas cinco variantes do gene eae
classificadas em α, , , e . A maioria das linhagens EPEC apresenta uma aderência padrão, chamada de aderência localizada. Este fenômeno está associado com a presença do fator de aderência plasmidial (EAF). O plasmidio EAF não é essencial para a formação de lesões A/E, embora sua presença aumente a eficiência do processo.
rebanhos. Baseado em estudos epidemiológicos, foi levantada a hipótese que as vacas são infectadas com E. coli provenientes de seu meio ambiente (fezes e palha).
Embora a EPEC seja uma causa frequênte de doença no ser humano, tem sido difícil de estabelecer uma metodologia para infecções experimentais em animais utilizando estes microrganismos. Os melhores resultados foram obtidos fornecendo aos camundongos drogas anti-bacterianas antes da realização do experimento, a fim suprimir sua microbiota intestinal endógena. Entretanto este tratamento elimina o equilíbrio competitivo entre a microbiota endógena e as bactérias patogênicas.
O camundongo como modelo de infecção é um animal muito utilizado para este
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Escherichia coli
2.1.1Taxonomia
A espécie bacteriana denominada Escherichia coli é um bastonete Gram negativo, não esporulado, oxidase negativa, móvel por flagelos peritríquios ou não móvel, anaeróbia facultativa capaz de fermentar a glicose e a lactose com produção de ácidos e gases, pertencente à família Enterobacteriaceae. Fontes de carbono como acetato e glicose são usados para crescimento, porém o citrato não pode ser utilizado. A glicose é fermentada a ácidos: lático, acético e fórmico, sendo o ácido fórmico hidrolisado a hidrogênio e dióxido de carbono. Acetoína ou acetil metil carbinol não são formados. Consequentemente, E. coli produz -galactosidase e indol mas não forma sulfito de hidrogênio ou hidrolisa a uréia (BRENNER, 1984; ORSKOV, 1984; ACHA & SZYFRES, 2001).
A E. coli é a espécie comensal predominante na microbiota anaeróbica facultativa do trato intestinal dos humanos e dos animais de sangue quente (DRASAR & HILL,1974) A habilidade para distinguir cepas de E. coli sorologicamente é importante em esclarecer as pesquisas, mostrando que certos tipos de E. coli causam diarréia de
verão ou diarréia infantil. A sorologia é baseada em diferentes antígenos encontrados em estrutura da superfície bacteriana. Os três antígenos fundamentais são O,K,H (ORSKOV & ORSKOV, 1984; MENG et al., 2001). Os antígenos somáticos “O”
descritos, até o momento, 173 antígenos O, 56 H e 100 K diferentes (FRANCO & LANDGRAF, 1996; ACHA & SZYFRES, 2001; MENG et al., 2001).
As cepas de E. coli que produzem gastroenterites em crianças, adultos e animais são denominadas enteropatogênicas, podendo-se distinguir categorias: enteropatogênica clássica (EPEC), enterotoxigênica (ETEC), enteroinvasora (EIEC), enterohemorrágica (EHEC) (LEVINE, 1987; JAY, 1994; HITCHINS et al., 1995; TRABULSI et al., 1996; VARNAM & EVANS, 1996; BUCHANAN & DOYLE, 1997; SILVA et al., 1997; HARRIGAN, 1998; MENG et al., 2001), facultativamente enteropatogênica (FEEC) (JAY, 1994; FRANCO & LANDGRAF, 1996), enteroagregativa (EAggEC) (HITCHINS et al., 1995; TRABULS et al., 1996; FRANCO & LANDGRAF,
1996; VARNAN & EVANS, 1996; BUCHANAN & DOYLE, 1997; HARRIGAN, 1998; MENG et al., 2001), difusivamente aderente (DAEC) (TRABULSI et al., 1996; BUCHANAN & DOYLE, 1997; HARRIGAN, 1998; MENG et al., 2001), uropatogênica
(UPEC), neo natal meningite (NMEC) (ADAM & MOSS, 1997) com base nos fatores de virulência, manifestações clínicas e epidemiologia.
Os primeiros estudos sobre diarréia relacionada com E. coli foram os realizados por ocasião de uma epidemia que ocorreu em uma creche aos meados da década de 1940 que produziu um índice de mortalidade da ordem de 50%. Em meados da década de 1950, comprovaram-se que alguns isolamentos produziam respostas na prova de alça intestinal de coelho parecidas com as que produzia o Vibrio cholerae. Estes achados conduziram os estudos de E. coli como possível agente etiológico de enfermidades semelhantes à cólera na Índia. As primeiras referências de cepas produtoras de enterotoxinas em animais jovens com diarréia apareceram em 1967, e em 1970 descobriu-se que as cepas virulentas produziam enterotoxinas (SACK, 1975).
As cepas de E. coli são importantes como possíveis patógenos transmitidos por alimentos, se encontram nas fezes e em geral têm ampla distribuição, embora em pequenas quantidades, nos ambientes onde se encontram os alimentos. Como microrganismo indicador, a presença de E. coli nos alimentos em quantidades elevadas é utilizada para indicar a possibilidade de contaminação fecal e da presença de outros
transmitido por alimentos, as reduzidas quantidades, geralmente aceitáveis, adquirem novo significado, em especial quando as condições do meio em que se encontra permitem sua multiplicação.
2.1.2 Sindromes gastrointestinais por Escherichia coli
Anterior à década de 70, os informes sobre gastroenterites de origem alimentar relacionadas com E. coli eram esporádicos, entretanto, o surto que ocorreu nos Estados
Unidos, atribuído ao queijo importado, foi o centro de atenção sobre este microrganismo como patógeno transmitido por alimentos. O fato coincidiu com o interesse dos médicos microbiologistas pela E. coli como causa de diarréia em crianças, levando a idealizar
métodos "in vitro" específicos e seguros, e métodos de bioensaio para avaliar os componentes tóxicos e a uma melhor compreensão dos mecanismos de virulência deste microrganismo (JAY, 1994).
As diferentes classes de E. coli apresentam características e síndromes específicas reconhecidas internacionalmente ao longo do tempo. As cepas de EPEC são agentes causais da diarréia infantil (lactentes) e recém nascidos (ROBINS-BROWNE, 1987; PADHYE & DOYLE, 1992; HITCHINS et al., 1995; MENG et al., 2001), entretanto, muitos adultos são considerados portadores não apresentando sintomas da doença, levando a crer que a imunidade adquirida ocorra com o passar do tempo (PADHYE & DOYLE, 1992; MENG et al., 2001).
As cepas de E. coli produtoras de enterotoxinas são conhecidas como ETEC e um número limitado de sorotipos de E. coli está associado com regularidade aos casos de diarréia. A síndrome se caracteriza por diarréia aquosa, é acompanhada de febre baixa, dores abdominais e náuseas. A forma mais severa assemelha-se à cólera: fezes aquosas (água de arroz) que levam à desidratação. O período de incubação varia de oito a 44 horas (média de 26 horas) com alta dose de infeção (106 a 108 células). Em indivíduos desnutridos, a gastroenterite pode durar várias semanas, levando a um quadro de desidratação grave, e nos casos de diarréia dos viajantes, esta pode ser leve e auto-limitante (PADHYE & DOYLE, 1992; SHUTERLAND et al., 1995; FRANCO &
LANDGRAF, 1996).
As cepas de EIEC são capazes de penetrar em células epiteliais do cólon e causar manifestações clínicas semelhantes às infecções causadas por Shigella. A
maioria delas apresenta características bioquímicas peculiares que a torna diferente das demais cepas de. E. coli, tornando-a semelhante à Shigella, como a incapacidade
de descarboxilar a lisina, a não fermentação ou fermentação tardia da lactose e ausência de flagelos. Os limitados sorogrupos conhecidos são 021, 028ac, 029, 0112c, 0124, 0136, 0143, 0144,0152, 0164, 0167, 0173. A gastroenterite é bastante semelhante àquela determinada por Shigella, com desinteria, cólicas abdominais, febre e mal estar geral com eliminação de sangue e muco nas fezes. O período de incubação varia entre oito e 24 horas (média de 11 horas). Estudos realizados com voluntários adultos indicam que a dose infectante é alta (106 a 108 células) (PADHYE & DOYLE, 1992; SHUTERLAND et al., 1995; FRANCO & LANDGRAF, 1996; VARNAM & EVANS, 1996; MENG et al., 2001) enquanto que para a Shigella é de 103, provavelmente devido à baixa resistência ao ácido gástrico e pela diferença da membrana protéica externa (SMALL & FALKOW, 1988).
O grupo de E. coli, denominado EHEC designado para alocar as cepas de E. coli pertencentes ao sorogrupo O157:H7, incriminado como agente etiológico da colite hemorrágica, sendo proposta, atualmente, a inclusão do sorotipo O26:H11.Tais cepas têm algumas propriedades que as diferenciam das demais E. coli, pois não são
se multiplicar ou mesmo não se multiplicar nas temperaturas normalmente empregadas para pesquisa de E. coli em alimentos (44,5°C/45,5°C) (SZABO et al., 1986; HITCHINS et al., 1992; WILLSHAW et al., 1993; BOURGEOIS et al., 1994; FRANCO &
LANDGRAF, 1996). A colite hemorrágica é caracterizada, clinicamente, por dores abdominais severas e diarréia aguda, seguida de diarréia sanguinolenta, diferindo das manifestações clínicas causadas por outros agentes invasores, pela grande quantidade de sangue nas fezes e ausência de febre.
A enterocolite pode evoluir gravemente para síndrome urêmica hemolítica com destruição de eritrócitos e falha aguda dos rins, necessitando de diálise, transplante dos rins e podendo ser fatal (RYAN et al., 1986; ANON, 1987; RILEY, 1987; KARMALY, 1989; MENG et al., 1994; WEAGANT et al., 1995; FRANCO & LANDGRAF, 1996; ACHA & SZYFRES, 2001; MENG et al., 2001). Ainda não se sabe ao certo a dose
infectante necessária para provocar os sintomas a partir da ingestão de alimentos contaminados, porém de acordo com dados obtidos de surtos esta parece ser baixa, entre 10 a 10000 células por grama ou mililitro de produto consumido (LIOR, 1994). Para BUCHANAN & EDELSON (1996) a dose infectiva é de 2 a 2000 células com base nos surtos, nos quais se mostraram acentuadamente ácido tolerante. A cepa denominada E. coli facultativamente enteropatogênica (FEEC), aparentemente associada a surtos esporádicos de diarréia, segundo JAY (1994); FRANCO & LANDGRAF (1996), tal relação, no entanto, não foi ainda provada. Com referência às cepas enteroagregativas (EAggEC), são relatadas como sendo pertencentes a uma linhagem recentemente descrita, com poucos dados disponíveis ao seu respeito. A patogenicidade parece estar relacionada com a adesão à mucosa intestinal, sendo que o modelo de adesão é diferente daquele apresentado por EHEC, EPEC ou EIEC; ocorrendo principalmente no cólon, não sendo observada no íleo ou no duodeno, e é manose resistente. A adesão é mediada por fímbrias que são na verdade, conjunto de microfibrilas associadas em feixes, chamadas BFP “BUNDLE FORMING PILUS”, que são diferentes das outras fímbrias de adesão. Alguns relatos indicam que cepas de EAggEC são capazes de produzir toxinas, genericamente chamadas de enterotoxina
mas que são genética e imunologicamente diferentes das enterotoxinas produzidas por ETEC e interferem no metabolismo celular do enterócito, com ação na absorção de sais e eletrólitos. Parecem estar associadas com casos crônicos de diarréia (diarréia protraída) com sangue em 11% dos casos. Sua ocorrência em alimentos ou em casos de surtos de origem alimentar ainda não foi relatada (BHAN et al., 1989; FRANCO & LANDGRAF, 1996). Segundo HARRIGAN (1998), as cepas de E. coli difusivamente aderente (DAEC) não estão caracterizadas e MENG et al., (2001) associam cepas com diarréia infantil e os dados disponíveis à sua patogenicidade são raros e que nenhum surto associado a alimento foi noticiado.
2.1.3 Riscos de infecção por Escherichia coli
A susceptibilidade a infecção por E. coli segue o exemplo habitual da idade, onde
jovens e indivíduos susceptíveis às infecções sofrem grandes riscos. Infecções devidas às cepas de EPEC e ETEC são particularmente comuns na infância e sorotipos clássicos de EPEC usualmente associados somente com infecções em crianças com menos de 18 meses de idade. Nesta faixa etária, existe evidência de que o sexo masculino é mais susceptível que o sexo feminino (ANTAI & ANOZIE, 1987). As infecções por ETEC são somente, raramente, encontradas em áreas onde as infecções por EPEC estão presentes. Isto é provavelmente devido à competição dos dois microrganismos pelos mesmos sítios de ligação intestinal.
por EHEC é também aumentado pela gasterectomia, antibioticoterapia e agentes bloqueadores de H2 (EDELMAN et al., 1988).
Com exceção das cepas de EHEC, a prevalência da E. coli patogênica é maior em países onde os padrões gerais de higiene são precários. Consequentemente as cepas de ETEC são mais comuns e em muitos casos a principal causa das diarréias dos viajantes (PADHYE & DOYLE, 1992; SHUTERLAND et al., 1995).
A diarréia infantil devido a EPEC foi anteriormente um problema em berçários onde a transmissão por funcionários, ou de criança para criança, pode ter sido importante veículo. Surtos ocorreram em berçários onde o controle diário não era
rigoroso, mas em geral, onde há controle da higiene e em países desenvolvidos, a incidência de EPEC é baixa. Entretanto, o organismo ainda é a maior causa da mortalidade infantil. A alta incidência de EPEC significa que as crianças são expostas diretamente ao agente após a desmama. Crianças que consomem alimentos com formulação artificial são mais expostas ao risco que aquelas que se alimentam ao peito. Isto é comprovadamente devido a carência de água apropriada para reconstituir o alimento desidratado, embora a falha no desenvolvimento da microbiota intestinal protetora possa estar envolvida. Não existe dúvida que em países desenvolvidos a amamentação é mais divulgada (DUGUID et al., 1978), porém os esforços dos educadores de saúde freqüentemente fazem pequeno impacto contra a propaganda sedutora das fábricas de alimentos infantis (VARNAM & EVANS, 1996).
O gado pode ser um importante reservatório de EHEC (MARTIN et al., 1986; BORCZYK et al., 1987) e o consumo de leite cru ou carne crua ou insuficientemente cozida tem sido definido como um fator de risco, uma particular associação a ser considerada é o consumo de hambúrgueres em lanchonetes. Todavia, a tese de que EHEC é uma zoonose transmitida por alimento foi recusada por WALMER & TOUWS (1990), que considerou insuficientes as evidências existentes, para implicar o gado como a origem do organismo na doença humana. Outras pesquisas tem sustentado o conceito de que o gado é incriminado como um reservatório (BRYANT et al., 1989; MONTENEGRO et al., 1990), mas que o risco esteja associado com algum tipo
cocção e a manipulação imprópria dos alimentos (BRYANT et al.,1989). A população alvo pode ser de qualquer faixa etária, sendo os mais susceptíveis os idosos e crianças menores de cinco anos, além de indivíduos imunodeprimidos ou com doenças renais (WEAGANT et al., 1995).
2.1.4 Mecanismo de patogenicidade por cepas de Escherichia coli
A virulência das cepas de EPEC está associada à capacidade de adesão à mucosa do intestino (KAPER, 1987), à invasão das células epiteliais (DONNENBERG et al., 1989; MILIDIS et al., 1989) e à destruição das microvilosidades das células epiteliais
intestinais, sendo esta adesão mediada por um plasmídio (EAF) (FLETCHER et al.,
1990) responsável pela síntese de um fator de enteroaderência. Esse fator corresponde a uma proteína de 50 a 70 KDa, e promove um tipo de aderência ao enterócito denominada localizada (AL), que é característica de EPEC, uma vez que outras cepas de E. coli, quando aderem ao enterócito, têm modelo de aderência chamada difusa (AD) (SCALETSKY et al., 1984; KNUTON et al., 1987; FRANCO & LANDGRAF, 1996). Estudos de microscopia eletrônica têm demonstrado que cepas de EPEC são capazes de induzir profundas alterações no citoesqueleto das células epiteliais, com destruição das microvilosidades e acúmulos de actina no local de adesão. Esse efeito, denominado "attachment and effacement", é característico de EPEC e causado por uma proteína de 94KDa, chamada intimina, cuja produção é mediada por um gene cromossomial chamado eae (“Escherichia coli attaching and effacing”). Quando esse gene está ausente, não há destruição das microvilosidades, indicando que os genes eae e eaf são interdependentes (LEVINE et al., 1985; FRANCO & LANDGRAF, 1996). Embora sejam relatadas a produção de enterotoxina termolábil (LT) e enterotoxina termoestável (ST) por EPEC, para VARNAM & EVANS (1996), tais afirmações se devem provavelmente a incompleta caracterização dos sorogrupos de EPEC e BOUZARI & VARGHESE (1990), sugeriram que o grupo EPEC não produz enterotoxinas, ainda que possa causar diarréia, sendo o fator de aderência mediado por
EHEC tem o mecanismo de patogenicidade relacionado com a produção de citotoxinas denominadas verotoxinas (VTs), cuja atividade biológica pode ser observada em culturas de células Vero, provenientes de rim de macaco verde africano, podem ainda ser chamadas toxinas “Shiga like” (SLTs), pois são semelhantes àquelas produzidas pelo bacilo Shiga (Shigella dysenterieae, tipo 1), causador da disenteria bacilar (O'BRIEN et al., 1982; WEAGANT et al., 1995). São proteínas de alto peso molecular, sendo conhecidas as variantes VT-I (ou SLT-I) e VT-II (ou SLT-II) sendo a primeira neutralizada pela toxina anti-shiga enquanto que a segunda não reage (SCOTLAND et al., 1985). Posteriormente, foi verificado que a verotoxina relacionava-se intimamente, em termos de estrutura e função com a toxina Shiga (stx) produzida por Shigella dysenteriae tipo 1, sendo então proposto o nome de “shiga-like toxins” (SLT)
para identificar estas toxinas (O’BRIEN & HOLMES, 1987). A dupla nomenclatura (VT/SLT) adotada para referir-se à toxina e suas variantes fez com que CALDERWOOD et al. (1996), propusessem uma nova nomenclatura, reconhecendo essas toxinas como
pertencentes a família das toxinas Shiga (stx). Nesta nomenclatura, as E. coli que portam o gene stx ou elaboram stx são referidas como STEC (“Shiga toxin-producing Escherichia coli”). A produção destas é determinada por dois fagos lisogênicos distintos.
KARMAL et al., 1985; RILEY, 1987; O’BRIEN & HOLMES, 1987; KARMALI, 1989; CAPRIOLI et al., 1992) são do sorotipo O157:H7 (WILLSHAW et al., 1993).
Em conformidade com outras cepas de sua espécie, a O157:H7 tem seu “habitat” no solo, água contaminada e material em decomposição. Seu reservatório principal é o trato gastro-intestinal de bovinos, embora também já tenha sido isolada do trato intestinal de suínos e aves (MARKS & ROBERTS, 1993; MENG et al., 1994; SILVA et al., 1997). Foi descrito um novo tipo de E. coli produtora de hemolisina
(enterohemolisina) sendo encontrada em 90% das cepas EHEC, porém a patogenicidade da enterohemolisina não é conhecida, entretanto sua produção é usada
como marcador genético (VARNAM & EVANS, 1996). Algumas cepas EHEC isoladas de animais produzem ST ou LT além de SLT mas a produção de ST ou LT não foi descrita em cepas humanas (SMITH et al., 1988).
A cepa denominada FEEC para JAY (1994), está aparentemente associada a surtos esporádicos de diarréia e por não ter sido provada a sua existência, muitos autores deixam de mencioná-la. E. coli enteroagregativas são cepas patogênicas recentemente descritas, existindo poucos dados ao seu respeito. Sua patogenicidade parece estar relacionada com a adesão à mucosa intestinal, cujo modelo de adesão é diferente daquele apresentado por EHEC, EPEC ou EIEC. A adesão ocorre principalmente no cólon, não sendo observada no íleo ou no duodeno, e é manose resistente. A adesão é mediada por fímbrias que são, na verdade, um conjunto de microfibrilas associadas em feixes, denominados BFP (“bundle forming pilus”) que são diferentes das outras fímbrias de adesão. Alguns relatos indicam que cepas de EAggEC são capazes de produzir toxina, genericamente chamadas LT e ST de acordo com sua resistência térmica, mas são genética e imunologicamente diferentes das enterotoxinas produzidas por ETEC. Sabe-se também que EAggEC interfere no metabolismo celular do enterócito, com ação na absorção de sais e eletrólitos que parece estar associada com casos crônicos de diarréia (diarréia protraída). Entretanto, sua ocorrência em alimentos ou em casos de surtos de origem alimentar ainda não foi relatada (FRANCO & LANDGRAF, 1996). As cepas são auto-aderentes, tendem à auto-aglutinação, sob
clínicas da doença precisam ser completamente descritas (VARNAM & EVANS, 1996; HARRIGAN, 1998). A maioria das cepas testadas possuem plasmídeos de transferência de 55 a 65 MDa; em umas das cepas, o plasmídeo, é acompanhado de polissacarídeo, fímbria de expressão, com propriedades agregativas (VIAL et al., 1988). Lesões histopatológicas distintas são produzidas nos enterócitos das extremidades e laterais das vilosidades, destruindo-as e tornando-as severamente ásperas. O núcleo apresenta o tecido conectivo desnudo permanecendo com a superfície hemorrágica (BHAN et al., 1989). O envolvimento de uma toxina, possivelmente “Shiga-like” tem sido postulada, porém sem evidências (VARNAM & EVANS, 1996).
Tabela 1: Sumário das cepas de Escherichia coli diarreiogênicas
2.1.5 Epidemiologia
Atualmente, em países desenvolvidos, EPEC é isolada em surtos esporádicos com freqüência muito baixa em casos de diarréia endêmica. Entretanto, em países em desenvolvimento, principalmente nos localizados em zona tropical EPEC está entre os principais agentes enteropatogênicos, especialmente, na diarréia dos lactentes, com altos índices de mortalidade. No Brasil, EPEC é responsável por cerca de 30% dos casos de diarréia aguda em crianças pobres com idade inferior a seis meses, com predominância dos sorotipos O111:[H-], O111:[H2], O119:H6 e O55:H6. Entretanto, crianças com idade superior a um ano raramente são afetadas. Estudos recentes têm demonstrado que infecções por EPEC podem estar associadas com diarréia crônica. Nos anos 60-70, diversos surtos causados pelo consumo de água e/ou de alimentos contendo EPEC foram registrado, em diversas partes do mundo. Esses surtos estavam associados com cepas pertencentes principalmente aos sorogrupos O86 e O111, envolvendo tanto crianças quanto adultos (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
O bovino é considerado reservatório natural de EHEC, razão pela qual os alimentos de origem animal principalmente a carne bovina parecem ser o principal veículo desse patógeno. Inúmeros surtos se referem ao consumo de carne bovina mal cozida e diversos produtos à base de carne (rosbifes, hambúrgueres, salsichas tipo “hot dog”), leite cru, vegetais consumidos crus, molhos preparados para saladas, maionese, e ainda cidra de maça recém processada, implicada no surto ocorrido em Massachussets, 1993, onde maçãs contaminadas com adubo orgânico foram utilizadas no processamento da bebida (BRYANT et al., 1989; GRIFFIN & TAUXE, 1991; BELONGIA et al., 1993; MENG et al., 1994; MILLER & KASPAR, 1994).
2.2 Escherichia coli enteropatogênica
invasiva ou enterotoxigênica. A linhagem RDEC – 1 produziu diarréia em 48 dos 62 coelhos quando foi dada pela via oro-gástrica, em doses que variam de 1,5x102 a 4 X1010 bactérias. Foi provado que a E. coli pode produzir diarréia sem ser capaz de invadir a mucosa ou sintetizar enterotoxinas. Linhagens de E. coli similares a RDEC –1, podem responder por algumas das diarréias que ocorrem em humanos associadas a E. coli.
HADAD et al,(1982), verificaram que em bezerros alimentados com colostro ,os quais foram posteriormente alimentados com substituto do leite, contendo uma densidade de 1011 células de EPEC, ocorreu uma colonização das porções mediana e
caudal do intestino delgado, e nestas áreas, 80% dos organismos estavam associados com a parede do intestino, enquanto que as E. coli não enteropatogênicas (NEEC),
falharam em colonizar o intestino delgado ou em estar associadas a ele. Os estudos em microscopia de luz demonstraram uma camada de E. coli enteropatogênica
aderente a superfície da mucosa do jejuno e íleo de bezerros infectados e também demonstraram vilosidades engrossadas, atrofiadas e fundidas com a lâmina própria pelo infiltrado inflamatório. Foram observadas também mudanças na topografia da superfície das células das vilosidades e exposição da lâmina própria em amostras tiradas após a morte dos bezerros.
MOON & WHIPP (1983), mostraram que três linhagens de E. coli enteropatogênica, originalmente isoladas de humanos e que haviam sido demonstradas como sendo causadoras de diarréia em voluntários humanos por mecanismos desconhecidos e também uma linhagem de EPEC de coelho, apresentaram a capacidade de se ligarem intimamente e se desprender das microvilosidades e do citoplasma das células epiteliais intestinais nos intestinos de coelhos e suínos. As atividades de adesão e desprendimento destas EPEC foram demonstradas por exames de microscopia de luz, através de cortes histológicos e também por microscopia eletrônica de varredura. Os autores privaram do colostro tanto os suínos como os coelhos, para detectarem a EPEC nas vilosidades intestinais e verificaram que as lesões (ligações e desprendimento), produzidas pela EPEC são multi-focais, com
linhagens de EPEC, também variaram de freqüência e extensão da lesão produzida no intestino dos animais.
PEETERS et al.,(1988), trabalharam com 568 linhagens de E. coli isoladas de coelhos saudáveis e de coelhos com diarréia,as quais foram separadas em 11 biótipos diferentes de acordo com os modelos de fermentação de 4 carboidratos. Algumas linhagens induziram lesões características de E. coli de adesão e desprendimento (AEEC). Elas se ligaram ao epitélio do intestino delgado terminal e do intestino grosso de coelhos com 5 semanas de idade e após infecção experimental, causaram desprendimento das bordas pregueadas das células das microvilosidades. Entretanto
nesse estudo, a patogenicidade para coelhos desmamados, julgada pelo quadro de diarréia, anorexia e reduzido ganho de peso, variou de acordo com os biótipos das linhagens.
Para VALLANCE & FINLAY(2000), diversos patógenos desenvolveram várias maneiras para infectar seus hospedeiros e causar doenças, incluindo a subversão e exploração de alvos em células hospedeiras. Um microrganismo deste tipo é a E. coli enteropatógena (EPEC). A causa mais comum de diarréia infantil em países em desenvolvimento. A etapa fundamental de virulência das EPEC é a colonização do epitélio intestinal. Após a aderência inicial, EPEC causa uma obliteração localizada de microvilosidades e uma aderência íntima na célula hospedeira de superfície, apresentando características de adesão e lesões (A/E). Considerado um protótipo para a família de bactérias causadoras de lesões A/E, a EPEC tem revolucionado nosso conhecimento e de como esse patógeno infecta seus hospedeiros e ainda causar uma doença. Íntima aderência requer uma secreção tipo III-mediadora de proteínas bacterianas, sendo que algumas são translocadas diretamente dentro das células dos hospedeiros infectados, incluindo seus receptores (Tir). A translocação de proteínas de EPEC também ativam sinais em células abaixo do epitélio, causando uma reorganização do citoesqueleto actiníco do hospedeiro e a formação de estruturas como pedestais em posição inferior a aderência bacteriana.
humanas cultivadas. Recentemente foi demonstrada a indução de lesões A/E em intestinos humanos por cepas EHEC 0157: H7. Ao contrário da EPEC, que colonizou o intestino delgado, a adesão de EHEC foi restrita ao epitélio folículo-associado (FAE) nas placas de Peyers. A complememtação do gene eae em CVD206 (derivado da cepa EPEC E2348/69) com EPEC eae-α (codifica íntimina-α) restaurou a habilidade da bactéria de colonizar a mucosa do intestino delgado. A complementação com EHEC eae-γ (codifica íntimina-γ) resultou em uma cepa aderida e induzindo lesões A/E em placas de Peyers, similar a EHEC.
No estudo de KREJANY et al. (2000) foi descrito que cepas de E. coli
enteropatogenicas (REPEC) sorotipo O103:H2 que produzem lesão A/E em coelhos são uma importante causa de diarréia em filhotes em desmame. Assim como em humanos, as cepas REPEC, possuem o "locus" de aderência com genes envolvidos na formação de lesões A/E. Em estudo histológico de células intestinais de coelhos infectados com esta bactéria foi possível verificar s presença de células de inflamação na lâmina intestinal.
CORREA & MARIN (2001) descreveram a coleta de 2144 amostras de leite de mastite bovina e o isolamento de 182 cepas de E. coli em 141 destas cepas foi possível determinar o antígeno somático (sorogrupo). Doze sorogrupos diferentes foram identificados entre eles O26, O55, O111 e O119, todos eles são sorogrupos EPEC clássicos. Estes sorogrupos representaram 40.0% do numero total de cepas isoladas. Vinte das 57 cepas testadas apresentavam o plasmídeo, nove cepas foram positivas para o gene EaeA e o fator de aderência (EAF) de EPEC, duas cepas foram negativas para o gene EaeA mas positivas para o gene EAF.
2.3 Camundongo como modelo experimental de infecção
MELTON-CELSA et al.(1996), nos seus estudos prévios demonstraram que cepas de E. coli enterohemorragica 091: H21 cresceram em um alto nível em muco de
(SlI-II) produzida pela E. coli 091:H2 1 através do contato com o muco intestinal de camundongo. Os resultados mostraram que tanto o muco intestinal de camundongo como o de humano, ativam diretamente a produção de toxina Shiga-Like. A toxina Shiga Like SLT–II (variante), se torna ativada e mais citotóxica, depois da incubação com muco intestinal de camundongo ou de humano.
WALDOLKOWSKI et al.(1998), analisaram a atividade da E. coli. F-18 e a F-18 col em colonizar o intestino grosso de camundongos tratados previamente com estreptomicina. Os autores verificaram que o aparecimento de possíveis adesões da E. coli F-18 e F-18 col a receptores específicos em células produtoras de muco podem ter
uma importante relação com a capacidade de colonização no intestino grosso de camundongos tratados com estreptomicina. O que ocorre é a predomínio de E. coli F-18
em relação a F-18 col, devido à competição de ambos pelo mesmo receptor.
MUSHIN & DUBOS (1965), verificaram os fatores que afetam a colonização experimental de camundongos com E. coli O26: K60 frente à sobrevivência de bactérias
coliformes normalmente presentes no trato gastrointestinal de camundongos normais. O fato de que os coliformes da microbiota normal não são eliminados, mas sim apenas temporariamente suprimidos pela introdução da linhagem de E. coli 026: K60 testada, pode ser essencial para identificar os sorotipos prevalentes em cada tempo do curso da colonização experimental. Isto comprovou a diferença entre linhagens de coliformes residentes e transitórias nas colônias da microbiota normal de camundongos e foi observada a presença de outras bactérias gram negativas, aeróbias facultativas.
Nos trabalhos de PUNYASHTHITI et al. (1971), Estudos avaliando a enteropatogenicidade de E. coli extraídas de diarréia humana na alça intestinal de camundongos, oferece mais vantagens do que o modelo em coelhos devido ao espaço utilizado ser mais conveniente, ser mais acessível financeiramente e mais fácil de se avaliar os resultados, Além disto o modelo de coelho não se apresenta confiável em relação à reprodutibilidade dos resultados com linhagens de E. coli.
LINDGREN et al. (1993), verificaram que a E. coli K-12 produz altos níveis de toxina Shiga-like tipo II, mas não de Shiga-like tipo I em modelos de camundongos
E. coli enterohemorrágicas que produzem SLT-II, isoladas de pacientes com colites
hemorrágicas. Todas as linhagens testadas foram capazes de colonizarem o intestino de camundongos, entretanto apenas 2 linhagens foram virulentas para os camundongos. Secções histológicas do intestino de camundongos alimentados via oral com a linhagem 091: H21 demonstraram extensiva necrose renal tubular, entretanto resultados hematológicos não foram consistentes com um diagnóstico de Síndrome Urêmica Hemolítica. Neste trabalho foi identificado 2 isolados de E. coli enterohemorrágica que produziam Shiga-like que são altamente patogênicas quando infectados oralmente em camundongos tratados com estreptomicina. Estes estudos
indicaram que a morte de 50% dos camundongos são derivados à associação da produção de SLT-II/IIc, porém a produção de uma única toxina sozinha é insuficiente para explicar a alta virulência neste modelo .
Nos estudos de LINDGREN et al.(1993) , verificaram linhagens de E. coli
3. OBJETIVOS
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Linhagens de EPEC
Cinco linhagens de EPEC foram utilizadas: linhagem humana(Adolfo Lutz) 1-) EPEC padrão CDC 3111-90 eae+, EAF+- ; linhagem patogênica 2-) 537-1- linhagem EPEC-like eae+, EAF+; linhagem patogênica 3-) 263 - linhagem EPEC-like eae+, EAF+; linhagem patogênica 4-) 304-3 eae-, EAF+; linhagem patogênica 5-) 988-2 eae-, EAF+,
Todas as linhagens patogênicas isoladas são originárias do leite mastítico de bovinos e foram obtidas em um outro trabalho (CORREA & MARIN, 2002) e gentilmente foram cedidas para este trabalho. Estas linhagens foram mantidas no laboratório de genética, FORP/USP em caldo Luria (L. broth) e Luria ágar (L. ágar), estes meios foram utilizados para manter as bactérias viáveis e quando necessário o meio cultura McConkey (Difco Laboratories, Detroit, Mich, USA) também foi utilizado. O crescimento bacteriano em L. broth foi mantido em 37ºC por 16 h com agitação. As contagens viáveis das colônias bacterianas foram determinadas pela contagem em
meio ágar.
4.2 Animal e infecção
animais foram selecionados, colocados em gaiolas separadas e mantidos por 20 dias, pois se tornou impraticável a obtenção dos cortes histológicos devido ao diminuto tamanho do fragmento de textura gelatinosa impossibilitando a inclusão destes fragmentos nos blocos de parafina. Depois de decorrido este período a inoculação das estirpes foi realizada nos animais tanto por via oral onde se utilizou a sonda gástrica como também 100 µl da suspensão foi injetada intraperitonialmente. A dose administrada para cada uma das cepas de E. coli enteropatogênica foi de 1,0 ml de uma suspensão de 108 cel/ml (MOON et al.,1983) das culturas das diferentes cepas.
Após a infecção, somente água foi oferecida ao longo do dia para os
camundongos e estes foram observados quanto à ocorrência de diarréia. Para cada linhagem da bactéria e via de administração foram utilizados três animais. Nos animais controle, foi utilizada 0,5 ml de solução fisiológica de cloreto de sódio a 0,9%.
4.3 Exame histológico
Após cinco horas da administração das linhagens, os animais foram eutanasiados por inalação excessiva de éter dietílico. A seguir, os corpos dos animais inteiros, foram fixados em solução de formalina a 10%, por um período de 48 horas. Decorrido o período de fixação os corpos dos animais foram lavados com água corrente e submetidos a uma incisão abdominal, no sentido vertical para que permitisse o acesso ás suas víceras.
Assim então o intestino delgado foi identificado em sua porção inicial e cuidadosamente distendido para que os conteúdos permanecessem em posição. Do segmento do intestino removido foi separado uma fração distal (íleo).
Estas peças de fragmentos de tecido foram processadas através dos métodos mais comuns utilizados em histologia, que permite a obtenção de preparados histológicos permanentes, neste instrumento os objetos são observados por transparência já que os órgãos estudados são muito delicados e extremamente finos (6 micrômetros).
4.4 E tapas da preparação de lâminas histológicas
De acordo com JUNQUEIRA & CARNEIRO(1995), as etapas para confecção de lâminas histológicas estão descritas a seguir
FIXAÇÃO: estabiliza os tecidos a fim de evitar a destruição por suas próprias enzimas. O fixador utilizado foi o formol a 4% em solução tamponada por 12horas.
DESIDRATAÇAO: extração da água dos tecidos pela passagem dos mesmos em concentrações crescentes de etanol, começando com álcool 70% e terminando com o álcool absoluto com duração de 8 horas.
CLAREAMENTO: nesta etapa o etanol é substituído por um líquido miscível com a parafina. O líquido utilizado foi o xilol, por um período de três horas, onde os tecidos tornaram-se translúcidos.
IMPREGNAÇÃO: para a obtenção dos cortes, os tecidos são embebidos e envolvidos por uma substância de consistência firme. A substância utilizada no experimento foi a parafina fundida em estufa a 60 graus celcius por um período de 4 horas, nesta etapa devido ao calor, o xilol evapora e os espaços anteriormente ocupados por ele são ocupados pela parafina, que penetra nos vasos, nos espaços intercelulares e no interior das células, tornando o fragmento de tecido mais fácil para ser levado ao micrótomo .Em seguida, colocou-se o tecido num recipiente de forma retangular contendo um pouco de parafina fundida e deixou-se solidificar a temperatura ambiente, formando um bloco de parafina com o tecido no seu interior. Um bloco de parafina foi utilizado para cada animal em estudo e estes foram seccionados obtendo-se o obtendo-segmento envolvendo a parte do estômago e a porção inicial do intestino de modo a oferecer cortes transversais e longitudinais pela navalha do micrótomo. Estes foram estirados em água quente e, depois colocados na lâmina.
5. RESULTADOS
Cinco linhagens de EPEC foram utilizadas: linhagem 1- EPEC padrão CDC 3111-90 eae+, EAF+- origem humana; linhagem 2- 537-1- linhagem EPEC-like eae+, EAF+; linhagem 3- 263 - linhagem EPEC-like eae+, EAF+; linhagem 4- 304-3 eae-, EAF+; linhagem 5- 988-2 eae-, EAF+,
Animal controle. Corte longitudinal.
40X
Animal controle. Corte transversal.
40X
As secções histológicas dos cortes longitudinais e transversais das linhagens 1, 2 e 4 (fig. 4, 5, 6 e 7, 8 e 9 respectivamente), observadas em microscopia luminosa não evidenciaram a presença de colite, pois os epitélios das cepas em questão se mostraram de forma íntegra, apesar de que, linhagens de E. coli que não apresentavam mecanismos patogênicos, são capazes de se aderirem ao epitélio sem causarem diarréia ou sem serem capazes de invadir a mucosa.
Linhagem 1: EPEC padrão, corte longitudinal.
40X
Linhagem 2 patogênica: 537-1 corte longitudinal.
40X
Linhagem 4: patogênica 304-3 corte longitudinal.
40X
Linhagens 1, 2 e 4. Apresentaram epitélio das vilosidades intestinais com bordas
regulares e lâmina própria sem infiltrado inflamatório (figs. 7, 8 e 9)
Linhagens 1: EPEC padrão CDC 3111-90 corte transversal.
40X
Figura 7: Fotomicroscopia do íleo, aumento de 40x, coloração HE (hematoxilina e eosina) do camundongo “Mus musculus” com 20 dias, apresentou epitélio das vilosidades intestinais com bordas regulares e lâmina própria sem infiltrado inflamatório. Seta: artefato de técnica.
Linhagem 2 patogênica: 537-1 corte longitudinal.
40X
Linhagem 4 patogênica: 304-3 corte longitudinal.
40X
Das 5 cepas utilizadas, as linhagens de números 3 e 5 (fig. 10, 11 e 12),
apresentaram alterações observadas em microscopia de luz, enquanto que as linhagens de números 1, 2, 4 e controle não mostraram alterações.
Nas cepas de números 3 e 5, a partir da secção histológica do corte longitudinal, observamos degeneração epitelial focal e infiltrado inflamatório, caracterizado por uma lesão tipo atachamento e disprendimento( attaching- effacing) devido à erosão irregular do epitélio da mucosa intestinal.
Linhagem 3 patogênica: 263 corte longitudinal.
40X
Linhagem 5 patogênica: 988-2 corte longitudinal.
40X
Linhagem 5 patogênica: 988-2 corte tranversal.
40X
6. DISCUSSÃO
A fixação experimental de um inóculo conhecido de uma bactéria viável no intestino delgado de camundongos não é uma tarefa fácil. FRETER et al. (1983) descreveram que uma linhagem selvagem de E. coli proveniente do intestino humano e a linhagem de E. coli K12 atravessaram o intestino de um camundongo, após a inoculação oral sem a ocorrência de multiplicação bacteriana no intestino e sem evidencia de colonização do mesmo.
MUSHIN & DUBOS (1965) relataram que devem ser utilizadas na inoculação de uma infecção experimental em camundongos, uma quantidade superior a 9x108 células/ml e também que independe do volume da dose de infecção utilizada. A E. Coli
O26: K60 proveniente da diarréia infantil se estabeleceu em camundongos com 13 dias idade ou mais jovens. Em contraste, a porcentagem da colonização em camundongos com 18 dias de idade foram relacionadas as doses utilizadas. Os níveis de infecção com relação a patogenicidade foram consideravelmente menores em animais com 24 dias de idade, neste caso, o número de E. coli tendeu a decrescer rapidamente no trato
gastrintestinal em 48 horas após a infecção. No presente estudo nós utilizamos uma solução contendo 108 células/ml como dose de infecção, pois não foi possível utilizar as dosagens preconizadas por outros autores devido a morte de vários animais, o que implicou nos resultados obtidos, resultando em dados diferentes das linhagens que possuem o gene envolvido com a aderência tecidual.
TZIPORI et al. (1989), descreveram que as linhagens mais virulentas de EPEC foram aquelas que causaram lesões attaching-effacing (A/E) na porção proximal
delgado causaram uma discreta diarréia. Devemos lembrar que as linhagens de E. coli isoladas dos bovinos usadas neste trabalho não foram isoladas das fezes diarréicas de gado, mas vieram do leite mastítico e podem expressar um conjunto de genes de aderência tecidual completamente diferente das linhagens de origem diarréica.
CONLAN & PERRY (1998), utilizaram três linhagens de camundongos CD1, BALB/C, C57BL/6, de acordo com a susceptibilidade de sua colonização intestinal por uma cepa patogênica entérica E. coli 0157:H7. Os animais foram inoculados via introgástrica e o epitélio intestinal destes se tornaram infectados mediante presença do patógeno nas fezes, 26,5% dos camundongos estudados desenvolveram a doença em
resposta à colonização pelo microrganismo. Após a primeira inoculação os camundongos BALB/C pareceram adquirir resistência a recolonização pela mesma E. coli, evidenciadas por uma diminuição das mesmas nas fezes. Este aumento na
resistência foi correlacionado com a presença e persistência da IgA no soro e nas fezes .As implicações destes achados foram utilizados para o desenvolvimento de uma vacina contra E. coli 0157:H7. No nosso estudo apenas uma inoculação foi realizada para cada animal estudado, já que as condições de sobrevida destes seria limitada, pois o biotério onde os animais ficaram não fornecia as condições ideais necessárias como a temperatura, pois o local não era climatizado e estes viviam estressados e morriam facilmente.
WADOLKWSKI et al. (1990), caracterizaram que a E. coli 0157:H7 que produz toxinas Shiga e carrega um plasmídeo que codifica uma adesina para as células intestinais (Henle 407), foram capazes de manter um nível de colonização em cerca de dois terços dos camundongos testados a níveis de células epiteliais de intestino grosso e delgado. No nosso estudo a linhagem 3, e a linhagem 5, também apresentaram aderência nas células epiteliais de intestino grosso e delgado de forma difusa, que foi evidenciada através da microscopia de luz (figs. 10, 11 e 12).
CONLAN et al. (2001), observaram a habilidade de persistência da E. coli 0157:H7 no trato intestinal de camundongo adulto CD1. A aderência da E. coli
embora um isolado obtido após este período produziu uma grande quantidade da toxina shiga-like-2 in vitro.
NAKAGAWA et al. (2002), em seu trabalho, estudaram uma linhagem de E. coli BMES transformada com o gene stx1 (shiga tipo I). A inoculação da bactéria transformante foi feita por via oral e recuperada via fecal em três semanas. Sinais neurológicos bem como mudanças histopatológicas do intestino e dos rins foram observadas dentro de três dias após a infecção, assim como a elevação de citocinas no soro, enquanto que as linhagens BMES colonizadas não mostraram nenhuma mudança patológica. Neste trabalho realizado, pode-se evidenciar que das cinco cepas
inoculadas, somente duas mostram aderência às vilosidades intestinais sugerindo que estas pudessem atuar de forma mais agressiva em função da produção da toxina Shiga.
SHIMIZU et al. (2003), utilizaram uma cepa de E. coli contendo o gene stx 2, o
qual foi inoculado em camundongos. Os camundongos foram previamente alimentados com água contendo sulfato de estreptomicina, conduzindo a um aumento da bactéria nas fezes. Análises periódicas mostraram um aumento da concentração de stx 2 na porção final do intestino, e análises histopatológicas e bioquímicas do sangue revelaram lesões em ambos os rins e órgãos hematopoiéticos, sugerindo assim que a stx 2 desenvolve uma infecção letal em camundongos. Em nosso estudo os camundongos não foram previamente tratados com medicação antibacteriana, sugerindo assim um novo modelo de estudo, provando que a aderência às vilosidades intestinais não estão diretamente vinculadas apenas ao tratamento prévio e sim a uma série de fatores que conferem patogenicidade.
PATON et al. (2001), desenvolveram uma bactéria recombinante E. coli (STEC) que expressa um receptor da toxina Shiga que neutraliza a toxina Shiga com eficiência. Neste estudo os pesquisadores investigaram a capacidade protetora do formaldeído em competir pela ligação com o receptor da toxina Shiga da bactéria recombinante com a própria toxina, fazendo assim com que esta toxina não exerça danos que conduzam a seqüelas como o caso da Síndrome hemolítica urêmica, sugerindo um modelo a ser
A histopatologia do A/E foi caracterizada nos patógenos de EPEC e de STEC (KNUTTON, 1996; KAPER et. al., 1998), as lesões foram observadas em meio de cultura de células de tecido, em modelos experimentais com animais e também em tecidos provenientes de seres humanos infectados com EPEC (NATARO & KAPER, 1998), mas a presença do A/E, não foi claramente observada nos modelos de infecção em camundongos (WADOLKOWSKI et al., 1990). Uma explicação para este problema poderia ser a competição da E. coli endógena da microbiota do camundongo pelos mesmos locais de adesão (FRETER et al., 1983; SHIMIZU et al., 2003), assim sendo, a única maneira de observar a colonização do intestino do camundongo por E. coli
7-CONCLUSÕES:
Verificamos, apesar de que o camundongo ainda não seja um modelo ideal devido a se obterem melhores resultados quando a Streptomicina foi utilizada previamente à infecção, este ainda é de fácil colonização em seu epitélio intestina. É mais fácil a reprodutibilidade dos resultados, é mais acessível financeiramente, oferece mais vantagens do que os coelhos por necessitarem de espaços menores,e também é mais rápido o período gestacional , podendo se obterem filhotes em apenas dezenove dias facilitando assim as pesquisas envolvendo este tipo de modelo.
Verificamos ainda que as linhagens de número três e cinco são capazes de se aderirem ao epitélio intestinal provocando alterações nos mesmos, enquanto que outras
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