PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
TESE DE DOUTORADO
Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral:
Influências do Isolado, da Cinética e do Modo de
Operação
Andréa Farias de Almeida
ESTRATÉGIAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE BIOINSETICIDA
VIRAL: INFLUÊNCIAS DO ISOLADO, DA CINÉTICA E DO
MODO DE OPERAÇÃO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Engenharia Química, sob a orientação da Profª. Drª. Márcia Regina da Silva Pedrini e a co-orientação da Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo.
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / CT / PPGEQ /
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nicolas Solimo”.
Almeida, Andréa Farias de.
Estratégias de produção in vitro de bioinseticida viral: Influências do isolado, da cinética e do modo de operação / Andréa Farias de Almeida. – Natal, 2010.
133 f. : il.
Orientadora: Márcia Regina da Silva Pedrini. Co-orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.
1. Baculovírus AgMNPV – Produção in vitro – Tese. 2. Baculovírus recombinante – Tese. 3. Bioinseticida viral - Produção – Tese. 4. Pragas da soja - Controle biológico – Tese. I. Pedrini, Márcia Regina da Silva. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Título.
Agradeço antes de tudo à minha mãe, presente em todos os momentos da minha vida, sempre.
Às minhas orientadoras, Márcia Pedrini e Gorete, pela orientação e dedicação prestadas para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Engenharia Bioquímica que de alguma forma ajudou-me na realização do ajudou-meu trabalho, em especial, agradeço a Graciana Clécia e Cinthia Meirelly pela ajuda nos experimentos.
À pesquisadora Marlinda Lobo de Souza, do Laboratório de Genética Molecular de Micro-organismos e Invertebrados (LGM) - Núcleo de Controle Biológico da Embrapa/Cernagen, por ter cedido os clones selvagens do baculovírus AgMNPV: AgMNPV-MP2, AgMNPV-MP5 e AgMNPV-2D.
Ao pesquisador Bergmann Ribeiro, da Universidade de Brasília (UNB), por ter cedido o baculovírus recombinante vAgEGT∆-lacZ para realização deste trabalho.
Aos professores Everaldo Silvino e Paulo Marinho que estiveram presentes à minha banca de qualificação contribuindo muito com seus conhecimentos.
Processos, Natal/RN, Brasil.
Orientação: Profª. Drª. Márcia Regina da Silva Pedrini Co-orientação: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo
___________________________________________________________________________
RESUMO:
A preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substituição dos inseticidas químicos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos químicos convencionais. Em particular, os vírus do tipo baculovírus são uma grande alternativa devido à especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propagação. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produção in vitro de baculovírus. Deste modo, poderá aumentar a oferta de vírus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estratégias de produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV e do seu recombinantevAgEGT∆-LacZ, como influência do isolado, da cinética e do modo de operação, foram analisadas como alternativa para futura ampliação de escala na produção deste bioinseticida viral. A produção em batelada de três isolados selvagens do baculovírus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclusão a partir das infecções em células de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avaliação comparativa com recombinante vAgEGT∆-LacZ. A seleção identificou o isolado AgMNPV-MP5 como melhor produtor de corpos de oclusão de (5,30±0,85) x108 OB/mL em 8 dias de infecção. A produção in vitro do vAgEGT∆-LacZ foi foco principal deste trabalho, pois não há, na literatura, a produção deste recombinante em sistemas de cultivo em suspensão. Foi realizado estudo da multiplicidade de infecção para identificar a quantidade de inóculo viral para o cultivo. A partir daí, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão para um volume final de 10m³ de suspensão de células infectadas. O aumento da produção de corpos de oclusão obtidos a partir do vAgEGT∆-LacZ foi analisado utilizando a estratégia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infecção. Esta estratégia permitiu aumento de três vezes na produção de corpos de oclusão quando comparada à produção em cultivos em batelada (5,3x107 e 1,8x107 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ mostrou-se competitivo em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV-MP5.
Palavras-chaves: baculovírus, baculovírus recombinante, produção in vitro,
Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT -LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT -LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT -LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process.
Lista de Figuras ... i
Lista de Tabelas...iii
Lista de Variáveis... iv
Nomenclatura ...vii
1 Introdução Geral... 2
2 Revisão Bibliográfica... 8
2.1 Baculovírus ... 8
2.1.1 Baculovírus AgMNPV ... 10
2.2 Produção in vitro de baculovírus ... 12
2.2.1 Passagem seriada ... 15
2.2.2 Multiplicidade de infecção (MOI)... 18
2.2.3 Titulação viral (TCLD50) ... 19
2.3 Estratégias de produção in vitro de baculovírus... 21
2.3.1 Processo em batelada ou descontínuo ... 22
2.3.2 Processo em batelada-alimentada ou descontínuo-alimentado ... 29
2.3.3 Processo de produção em baixa MOI (Low MOI)... 32
3 Seleção dos isolados selvagens de baculovírus AgMNPV ... 35
3.1 Introdução ... 35
3.2 Metodologia experimental ... 38
3.2.1 Células ... 38
3.2.2 Vírus ... 39
3.2.3 Cálculo do TCLD50 dos isolados selvagens ... 40
3.2.4 Produção in vitro dos isolados de baculovírus selvagem ... 41
3.2.5 Cálculo dos parâmetros cinéticos para produção in vitro... 41
3.3 Resultados e discussão... 42
3.4 Conclusão... 52
4 Produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT
∆
-LacZ... 54
4.1 Introdução ... 54
4.2 Metodologia experimental ... 58
4.2.4 Cálculo TCLD50 e MOI do vAgEGT∆-LacZ... 59
4.2.5 Passagem seriada do baculovírus vAgEGT∆-LacZ ... 60
4.2.6 Obtenção dos parâmetros cinéticos na produção do baculovírus vAgEGT∆-LacZ 60 4.2.7 Comparação da produção de corpos de oclusão dos baculovírus AgMNPV-MP5 e vAgEGT∆-LacZ... 60
4.3 Resultados e discussão... 61
4.3.1 Estudo da multiplicidade de infecção (MOI) ... 61
4.3.2 Passagem seriada (escalonamento da produção in vitro) ... 67
4.3.3 Comparação da produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 e o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ ... 73
4.4 Conclusão... 77
5 Produção em batelada-alimentada do baculovírus recombinante vAgEGT
∆
-LacZ... 80
5.1 Introdução ... 80
5.2 Metodologia experimental ... 83
5.2.1 Células ... 83
5.2.2 Vírus ... 84
5.2.3 Solução de alimentação ... 84
5.2.4 Produção em batelada-alimentada ... 85
5.3 Resultados e discussão... 85
5.3.1 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes ... 86
5.3.2 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes combinada com o meio de cultura SF900II ... 90
5.3.3 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: meio de cultura SF900II ... 93
5.4 Conclusão... 96
6 Conclusão Geral ... 98
Referências ... 101
Figura 2.1. Estrutura da forma oclusa dos baculovírus ... 9
Figura 2.2 Ciclo da multiplicação in vitro de baculovírus (adaptado de ROHRMANN, 1999) ... 12
Figura 2.3. Estrutura do virion... 14
Figura 2.4 Núcleo de células infectadas apresentando dois tipos de fenótipos: (A) Baculovírus muitos poliedros (MP); (B) Baculovírus com poucos poliedros (FP) (Fonte: PEDRINI, 2003). ... 16
Figura 2.5 Gel de eletroforose que mostra a mudança genotípica do baculovírus Helicoverpa armigera SNPV durante passagem seriada em cultura de células. (Fonte: PEDRINI et al., 2005a) ... 18
Figura 2.6 Clivagem do anel tetrazólio do MTT ... 20
Figura 2.7 Curva característica de processo em batelada: Xv – concentração de células viáveis; [S] – concentração de substrato ... 23
Figura 2.8 Curva característica da produção de OB em células de inseto: [OB] – concentração de OB; τi – tempo inicial de pós-infecção e τf – tempo final de pós-infecção ... 28
Figura 2.9 Curva representativa de um processo em batelada-alimentada: Xv – concentração de células viáveis; [S] – concentração de substrato... 30
Figura 3.1 Infecções com os isolados selvagens de baculovírus AgMNPV ... 43
Figura 3.2 Produção volumétrica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV... 47
Figura 3.3 Produção específica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV... 49
Figura 3.4 Células Sf21 infectadas com AgMNPV-MP5 em 4 d.p.i ... 50
Figura 4.1 Processo de produção em batelada (Fonte: RHODES, 1996)... 57
Figura 4.2 Cinética de crescimento das células Sf21 infectadas com diferentes MOIs de BV do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. ... 62
Figura 4.3 Produção de OB do baculovírus vAgEGT∆-LacZ ... 65
Figura 4.4 Perfis da produção volumétrica de OB do baculovírus vAgEGT∆-LacZ com diferentes MOIs ... 66
Figura 4.5 Passagem seriada do baculovírus vAgEGT∆-LacZ... 68
Tabela 2.1 Gênero da família Baculoviridae... 10
Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos das infecções com os isolados selvagens... 44
Tabela 3.2 Velocidade média de infecção ... 46
Tabela 4.1 Parâmetros cinéticos das infecções com diferentes MOIs... 64
Tabela 4.2 Velocidades médias de produção de OB ... 66
Tabela 4.3 Quantidade de OB produzido em cada passagem do cultivo ... 71
Tabela 4.4 Resultado da ANOVA para produção de OB ... 75
a Absorbância maxima (0% de resposta)
b Fator de inclinação
CC Concentração celular (células/mL)
CMCT Concentração máxima de células totais (células/mL) CMOB Concentração maxima de OBs (OB/mL)
COB Concentração de OB (OB/mL)
D Fator de diluição
D0 Diluição na qual a resposta foi 50%
dt
dP Velocidade de variação de produto (mg/d)
dt
dS Velocidade de variação de substrato (mg/d)
dt
dX Velocidade de variação de crescimento (células/d)
dt
dXNVNI Velocidade de variação de crescimento das células não infectadas e não viáveis (células não infectadas não viáveis/d)
dt
dXVI Velocidade de variação de crescimento das células viáveis infectadas
(células viáveis infectadas/d)
dt
dXVNI Velocidade de variação de crescimento das células não infectadas
(células não infectadas/d)
MC Média da contagem de células
MOB Média da contagem de OBs
N Número de etapas ou passagens
P Concentração de produto (mg/mL)
PEOB Produção específica de OBs (OB/Célula)
qs Velocidade específica de consumo de substrato (mg/mL.d) qp Velocidade específica de formação de produto (mg/mL.d) R2 Coeficiente de correlação
Ri Velocidade de infecção (célula/mL.d)
Rp Velocidade de formação de produto (OB/mL.d) S Concentração final de substrato (mg/mL) S0 Concentração inicial de substrato (mg/mL)
td Tempo de duplicação (d)
V Volume (mL)
Vf Volume final (mL ou m³)
Vi Volume inicial (mL ou m³)
X Concentração de células (células/mL)
XNVNI Concentração de células não viáveis não infectadas (células/mL) XVI Concentração de células viáveis infectadas (células/mL)
Y0 Absorbância mínima (100% de resposta)
YS Rendimento do crescimento de células por unidade de substrato
αpOB Taxa específica de produção de OB (OB/mL.d)
αpv Taxa de produção de vírus por célula infectada
∆ Fator de diluição
µ Velocidade específica de crescimento (d-1)
µap Velocidade específica de crescimento aparente (d-1) µx Velocidade específica de crescimento celular (d-1)
µ(τ) Velocidade específica de crescimento no tempo de pós-infecção (d-1)
τ Tempo de pós-infecção (d)
τd Tempo final de infecção (d)
τei Tempo inicial da replicação (d)
τf Tempo final de intensa produção de OB (d)
τi Tempo inicial de intensa produção de OB (d)
τvrs Tempo em que o primeiro virion foi liberado (d)
AcMNPV Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus
AgMNPV Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus
AgMNPV-2D Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone 2D
AgMNPV-MP2 Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone MP2
AgMNPV-MP5 Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone MP5
ANOVA Análise de variância
BEVS Sistemas de vetores de expressão em baculovírus
BM-5 Linhagem de célula Bombyx mori
BTI-Tn-5B1-4 Linhagem de célula da Trichoplusia ni
BV Budded virus – vírus extracelular
CHO Células do ovário do hamster chinês
CPE Ensaio do efeito citopático
DIP Partículas interferentes defectivas
egt Gene ecdisteroide udp-glicosil transferase
FP Mutantes few polyhedra – Mutantes poucos poliedros GmMNPV Galleria mellonella multiple nucleopolyhedrovirus
GV Granulovírus
HaSNPV Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus
HzSNPV Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus
IPLB-LD-652Y Linhagem de célula Lymantria díspar
IPLB-Sf21 Linhagem de célula Sf21 de Spodoptera frugiperda
MIP Manejo Integrado de Pragas
MNPV multiple nucleopolyhedrovirus
MOI Multiplicity of infection - Multiplicidade de infecção
MP Mutantes many polyhedra – mutantes muitos poliedros MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difenil tetrazólio
NPV Nucleopoliedrovírus
OB Occlusion body – corpos de oclusão
ODV Occlusion derived virus - Vírus derivado do OB
SFM Serum free medium - meio sem soro
SfMNPV Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus
SNPV Single nucleopolyhedrovirus
TCLD50 Dose letal para infectar 50% da cultura de tecidos TOH Time of harvest – tempo de coleta após infecção
TOI Time of infection – tempo de infecção
tPA Ativador plasminogênico tecidual
UFP Unidades formadoras de placas
UFL-AG-286 Linhagem de célula de Anticarsia gemmatalis
vAgEGT∆-LacZ Baculovírus recombinante de Anticarsia gemmatalis multiple
Capítulo 1
1 Introdução Geral
Os inseticidas químicos têm papel importante no desenvolvimento da produção agrícola, principalmente quando se trata do Manejo Integrado de Pragas (MIP). O MIP compõe-se de um conjunto de técnicas que busca o equilíbrio com a natureza, ao aperfeiçoar a atuação de inimigos naturais, com a utilização mínima de inseticidas químicos. No entanto, esses produtos, mesmo em quantidades mínimas, são tóxicos e apresentam ampla capacidade de atuação em relação a outros animais ecologicamente importantes e potencialmente úteis à agricultura. Além disso, sua utilização frequente favorece o aumento da resistência das pragas.
Para países exportadores de produtos agrícolas, como o Brasil, existe ainda uma razão comercial suplementar para redução do uso de inseticidas químicos. Segundo Hamilton; Sunding; Zilberman (2003), as pesquisas mostram a utilização de inseticidas químicos como o problema mais sério em relação à qualidade dos alimentos consumidos. Os consumidores têm mostrado uma forte preferência por produtos que são cultivados em ambientes com menor exposição à inseticida químico (LISANSKI, 1994). Exemplo disto é o aumento do mercado de produtos orgânicos que estão livres de inseticidas químicos, ou, até mesmo, ausentes de defensivos agrícolas (LEVIDOW; BIJMAN, 2002).
A propagação de baculovírus é realizada através dos próprios hospedeiros (cultivo in
vivo) ou utilizando as células embrionárias ou epiteliais isoladas destes hospedeiros (cultivo in vitro).
No cultivo in vitro de baculovírus, destaca-se a importante contribuição das células animais, principalmente as células de inseto, na expressão de proteínas recombinantes através de sistemas de vetores de expressão em baculovírus, do inglês baculovirus expression vectors
systems (BEVS) e na produção de bioinseticida viral. As células de inseto, devido às
vantagens que as oferecem em relação às células de mamíferos, são facilmente cultivadas in
vitro e sua manutenção é relativamente simples (KING; POSSEE, 1992). Deste modo, o
conhecimento das metodologias de cultivo das células de inseto permitiu estudar o ciclo de replicação/propagação de vários baculovírus (KING; POSSEE, 1992) e com isso, a produção de baculovírus despertou interesse na agricultura como alternativa ao controle de pragas.
Os baculovírus são patógenos de artrópodes, principalmente insetos da ordem Lepidóptera, caracterizam-se por possuir corpo de oclusão, do inglês occlusion body (OB), e um cristal proteico (poliedrina ou granulina) que envolve os virions (partículas virais) protegendo-os no ambiente. Eles têm sido utilizados com sucesso como agentes de controle de pragas agrícolas (GRANADOS; FEDERICI, 1986; MOSCARDI, 1999). Estes bioinseticidas são utilizados na agricultura em vários países. Por exemplo, na América do Norte dois produtos são utilizados no controle de pragas de florestas, o TM Biocontrol (Orgyia pseudotsugata nucleopolyhedrovirus) e o Gypchek (Lymantria dispar
nucleopolyhedrovirus) (WOOD; GRANADOS, 1991). Nos Estados Unidos, Canadá e na Europa o baculovírus também é utilizado como agente contra pragas florestais do algodão, tomate, milho, repolho e outros vegetais. No Brasil, um bioinseticida denominado baculovírus anticarsia, cujo princípio ativo é o Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), já foi empregado para o controle da praga da soja, em uma área de tratamento biológico de 1,6 milhão de hectares, ou seja, mais de 10% da área cultivada de soja no país (MOSCARDI, 1999). Atualmente, essa área foi reduzida para 300 mil hectares devido à manifestação de outras pragas na lavoura de soja (MOSCARDI, comunicação pessoal).
infectadas. As lagartas infectadas coletadas no campo são conduzidas ao laboratório para purificação e formulação viral. Esse processo é ineficiente devido à necessidade da presença de lagartas na lavoura e tendo aplicação em poucos meses do ano, somente durante o cultivo de soja. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de alternativas de processos com base na produção in vitro (MOSCARDI; SOUZA, 2002; RODAS et al., 2005; CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006; REZENDE; CASTRO; SOUZA, 2008). Assim, a produção de baculovírus em larga escala, utilizando cultivo de células poderá aumentar a oferta de vírus na aplicação em lavouras, suprindo a necessidade deste bioinseticida no cultivo da soja, uma vez que as empresas produtoras ainda não atendem a demanda pelo produto (MOSCARDI; SOUZA, 2002).
Apesar das vantagens ambientais conferidas ao tratamento com baculovírus, um fator importante que limita o interesse da indústria e a aceitação dos agricultores da sua utilização no controle insetos-praga, é a baixa velocidade de ação desses vírus sobre os hospedeiros naturais. A larva infectada pode levar de 5 a 8 dias para morrer e permitindo que o inseto, mesmo infectado, ainda cause danos à lavoura (MOSCARDI, 1999).
Com os recursos da engenharia genética têm sido criados micro-organismos entomopatogênicos (patogênicos a insetos) geneticamente modificados, que apresentam características adicionais àquelas dos patógenos não modificados. Com baculovírus não é diferente, alguns baculovírus têm sido modificados geneticamente para ampliar a ação viral sobre seus hospedeiros (O’REILLY; MILLER, 1991; PINEDO et al., 2003). Outra característica importante, sendo um parasita obrigatório, o baculovírus só se multiplica no interior do seu hospedeiro, logo, é considerado bastante seguro para ser modificado geneticamente, não apresentando riscos de invasão e multiplicação fora do ambiente de liberação (MOSCARDI; SOUZA, 2002).
devido às impurezas presentes nas amostras. Contudo, a produção de baculovírus em cultivo de células apresenta instabilidade em relação à atividade viral (formação de mutantes).
A instabilidade da virulência é evidenciada pelo efeito passagem (diminuição da produção dos corpos de oclusão durante o cultivo seriado de baculovírus), que pode ser minimizada pela redução de passagens, nos cultivos em batelada, utilizando biorreatores de volumes maiores para produzir a mesma quantidade de corpos de oclusão (CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007).
Deste modo, adaptar sistemas de produção que são utilizados há muito tempo com sucesso em processos com células microbianas (bactérias, fungos ou leveduras), tais como processo descontínuo alimentado, para a produção in vitro de bioinseticidas virais é importante para o aumento da produção deste bioproduto. Vale salientar que o estudo cinético do processo descontínuo também é necessário, pois é de extremo interesse para o conhecimento dos parâmetros cinéticos do crescimento das células de inseto e do processo de infecção utilizados nesta produção.
Neste contexto, objetiva-se aplicar estratégias de cultivo para produção in vitro do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) – seleção de isolados, estudo da multiplicidade de infecção, modo de operação de cultivo - visando a obtenção de bioinseticida viral para o controle da praga da soja A. gemmatalis. Será avaliada a produção de corpos de oclusão utilizando como inóculo o vírus extracelular dos isolados selvagens AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 para selecionar o isolado que demonstrar melhor desempenho em relação a sua produtividade, e comparar esta produtividade com o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. O baculovirus recombinante
vAgEGT∆-LacZ não possui dados referentes ao seu cultivo em suspensão, portanto, será analisada a produção deste recombinante utilizando a linhagem Sf21, bem como, a avaliação cinética da produção deste bioinseticida viral.
Capítulo 2
2 Revisão Bibliográfica
2.1 Baculovírus
Os baculovírus são vírus isolados de invertebrados, principalmente de lepidópteros, que possuem alta especificidade e não oferecem riscos ao homem e ao ambiente, pois não se replicam em vertebrados e em plantas, características que os tornam excelentes agentes de biocontrole de pragas agrícolas.
Os baculovírus são vírus da família Baculoviridae, que contêm DNA circular de fita dupla como material genético, variando de tamanho entre 80 e 180 kbases (CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006), são caracterizados pelos nucleocapsídeos em forma de bastão, envelopados, apresentando um diâmetro entre 40-50nm e comprimento entre 200-400nm (O’REILLY; MILLER; LUCKOW, 1994). Os nucleocapsídeos encontram-se no interior de uma matriz proteica, formando os chamados corpos de oclusão (OB – occlusion bodies). Os corpos de oclusão possuem cerca de 0,15 a 15 µm de diâmetro (BILIMORIA, 1991) que permitem a sobrevivência das partículas infectivas fora de seu hospedeiro natural (KING; POSSEE, 1992).
caracterizados pela forma ovicilíndrica do corpo de oclusão, denominada grânulo, com dimensão entre 0,3 e 0,5µm (CROOK, 1991), que geralmente possui uma única partícula viral contendo somente um nucleocapsídeo, ocluso pela matriz proteica constituída pela proteína granulina, conforme observa-se na Figura 2.1.
Figura 2.1. Estrutura da forma oclusa dos baculovírus
A nomenclatura dos baculovírus é baseada no nome do hospedeiro do qual foi isolado. Por exemplo, o baculovírus isolado da lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda, recebe o nome de Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), isolado por Smith em 1978; o baculovírus isolado da lagarta da alfafa, Autographa californica, é chamado de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), isolado por Vail em 1971; outro exemplo clássico é o baculovírus isolado da lagarta da soja, Anticarsia
gemmatalis, denominado Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV),
isolado por Allen e Knell em 1977.
nova proposta de classificação incluem-se mais quatro gêneros (JEHLE et al., 2006), conforme mostra a Tabela 2.1.
Tabela 2.1 Gênero da família Baculoviridae
Gênero Membros
Alfabaculovírus NPVs de Lepidópteros
Betabaculovírus GVs de Lepidópteros
Gamabaculovírus NPVs de Hymenópteros
Deltabaculovírus NPVs de Dípteros
Diversos baculovírus já foram estudados, mas o baculovírus mais explorado em se tratando da sua biologia molecular é o Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), seu modelo de replicação é caracterizado e aceito como protótipo para os demais baculovírus, o que permitiu desenvolver baculovírus recombinantes para o controle de pragas e para serem utilizados como vetor de expressão de genes heterólogos. Além disso, o AcMNPV foi o primeiro baculovírus a ser totalmente sequenciado. Tendo em vista que a eficácia e segurança na utilização de baculovírus como vetores de expressão ou como bioinseticidas dependem do profundo conhecimento da biologia desses vírus e suas interações com seus hospedeiros naturais. Com o desenvolvimento de baculovírus geneticamente modificados para serem utilizados como bioinseticidas, questões de biossegurança e análise de riscos devem ser consideradas.
2.1.1 Baculovírus AgMNPV
caracterizados, dentre eles destaca-se o isolado de AgMNPV (LD-79) obtido, em 1979, a partir larvas A. gemmatalis infectadas no campo de cultivo de soja perto de Londrina/PR. Este isolado é rotineiramente produzido in vivo para uso como um bioinseticida no Brasil (MOSCARDI, 1989) e aplicado nas culturas de soja para o controle biológico do seu hospedeiro natural A. gemmatalis.
A utilização do baculovírus AgMNPV no Brasil representa o maior programa mundial de aplicação de bioinseticida viral como controle biológico de pragas. Ele vinha sendo aplicado anualmente para o controle da lagarta Anticarsia gemmatalis (principal desfolheadora da lavoura de soja) em mais de um milhão de hectares de soja (MOSCARDI, 1999) o que proporcionava anualmente ao país, uma economia de 13 milhões/reais ao ano, uma vez que eliminava a aplicação de cerca de 1,5 milhão de litros de inseticidas nas lavouras brasileiras (MOSCARDI; SOUZA, 2002). Recentemente, o seu uso vem diminuindo, devido ao aparecimento de outras pragas na cultura da soja e da estratégia agressiva de vendas das empresas de inseticidas químicos (MOSCARDI, comunicação pessoal). Entretato, este ainda é o maior exemplo mundial de utilização de um inseticida viral, além disso, representa um modelo importante de substituição de agrotóxicos, que são altamente prejudiciais ao homem e ao meio ambiente, por um controle ambientalmente correto.
2.2 Produção in vitro de baculovírus
Para multiplicação de baculovírus em cultura de células, o ciclo de infecção ocorre em três fases básicas: inicial (early), tardia (late), e muito tardia (very late). Essas três fases correspondem biologicamente a: (i) reprogramação da célula para replicação viral, (ii) produção de BV, e (iii) produção de OB (O’REILLY, MILLER; LUCKOW, 1994).
A Figura 2.2 mostra o ciclo de infecção in vitro dos baculovírus. A primeira indicação de infecção por vírus é o inchaço do núcleo celular e a formação de um material granular no centro do núcleo que podem ser observados na fase inicial do processo (LUA; REID, 2000). As alterações morfológicas (núcleo celular hipertrofiado) que podem ser visualizadas ao microscópico ótico recebem o nome de efeito citopático. A próxima fase de infecção (tardia) é caracterizada pela formação de uma estrutura densa, chamada estroma virogênico, onde ocorre uma intensa produção de vírus extracelular (BV) e replicação do DNA viral. Na terceira fase (muito tardia), há a síntese de novo da membrana que envolve os nucleocapsídeos para formação do envelope viral e a posterior oclusão dos virions na matriz proteica formando os corpos de oclusão (OB).
A replicação de baculovírus em células de inseto é caracterizada pela produção de dois fenótipos diferentes que são produzidos em tempos distintos no ciclo de infecção. O vírus extracelular ou budded virus (BV) é produzido no início do ciclo de infecção (fase tardia –
late) e responsável pela infecção de células a células no hospedeiro (infecção sistêmica). O
segundo fenótipo é caracterizado pelo empacotamento do virion (partícula viral) em uma matriz proteica (fase muito tardia – very late), este fenótipo é denominado de corpo de oclusão ou occlusion body (OB) (BLISSARD, 1996). O OB é menos infectivo para cultura de células de inseto devido ao empacotamento proteico, mas, é responsável pela infecção de inseto para inseto (infecção horizontal) através da ingestão do OB presente na dieta alimentar do hospedeiro.
A partícula viral chamada de vírus derivado do corpo de oclusão ou occlusion derived
virion (ODV) são os virions contidos no interior do OB. O ODV pode conter um ou vários
nucleocapsídeos. Os GVs, por exemplo, contêm, geralmente, um único nucleocapsídeo por envelope e, um único ODV por OB. Em contraste, cada OB de um NPV contém vários ODVs (BLISSARD, 1996). Portanto, quando se libera ODV de um OB de NPV tem-se mais possibilidade de infectar as células devido ao número maior de nucleocapsídeos em seu interior.
Figura 2.3. Estrutura do virion
(Fonte: http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_protein/13.html)
A produção de baculovírus em cultivo de células é relativamente fácil quando comparada com o processo de produção in vivo e oferece algumas vantagens: podem ser selecionadas linhagens específicas, preservadas e armazenadas em meios criogênicos para sua utilização no futuro e podem ser testadas para assegurar que estejam livres de contaminantes que certamente afetariam a qualidade do produto final (KING; POSSEE, 1992). No entanto, o processo de produção in vitro de baculovírus apresenta algumas limitações. Uma das limitações é a diminuição da eficiência de infecção (virulência) do vírus pela rápida acumulação de mutantes FP (few polyhedra) ou de partículas interferentes defectivas (DIPs) resultantes de passagens sucessivas do vírus em cultivo de células.
Diversos estudos têm abordado a produção in vitro de baculovírus para produção de proteínas recombinantes e de bioinseticida viral, dentre eles destacam-se: Chan; Greenfield; Reid (1998) utilizando células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante de Autographa
californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), como sistema de expressão, para
utilizando células Sf9 caracterizando o efeito passagem; Almeida, (2005) utilizando duas linhagens de S. frugiperda, Sf21 e Sf9, verificou a capacidade de produção de corpos de oclusão do baculovírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) em cultivos em shaker; Castro et al. (2006) verificaram a infectividade do baculovírus Anticarsia
gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em diferentes linhagens de células: Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4, Anticarsia gemmatalis UFL-AG-286, S. frugiperda
IPLB-SF-21AE e Sf9, L. dispar IPLB-LD- 652Y e por fim, a B. mori BM-5 com a finalidade de quantificar a produção viral, observar a morfologia e a síntese de proteínas; Pedrini et al. (2006) utilizando células de Helicoverpa zea para produção e estabilidade através da passagem seriada dos baculovírus Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus (HaSNPV) e Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus (HzSNPV); Gioria; Jäger; Claus. (2006) utilizando as células Anticarsia gemmatalis UFL-AG-286 verificaram a produção dos corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) produzidos em suspensão; Rezende; Castro; Souza. (2008) também utilizando o baculovírus AgMNPV verificou a produção de corpos de oclusão e estabilidade deste virus cultivado sucessivas vezes em células Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4.
Estes estudos evidenciam o grande interesse no cultivo de baculovírus para a produção de proteínas ou bioinseticidas virais.
2.2.1 Passagem seriada
A passagem seriada consiste em uma série consecutiva de infecções virais em células hospedeiras. Nestas infecções virais, utiliza-se o inóculo (normalmente, vírus extracelular) obtido da infecção anterior e, assim, sucessivamente. Com isto, pode ser analisada a estabilidade do vírus durante seu cultivo em células e a produção dos corpos de oclusão durante o processo de aumento de escala.
mutantes durante as passagens do cultivo de células pode comprometer o sistema in vitro para produção de baculovírus em larga escala.
Os mutantes FPs são caracterizados por um decréscimo na formação de OB e um aumento significativo na formação de BV. Os OBs produzidos praticamente não contêm partículas virais infecciosas, portanto, possuindo baixa ou nenhuma infectividade aos seus hospedeiros.
A Figura 2.4 mostra o núcleo de células infectadas que apresentam os dois tipos de variantes produzidos in vitro: os baculovírus muitos poliedros (MP) e os baculovirus com poucos poliedros (FP) que podem ser observados durante a passagem seriada de baculovírus em cultivo de células hospedeiras.
Figura 2.4 Núcleo de células infectadas apresentando dois tipos de fenótipos: (A) Baculovírus muitos poliedros (MP); (B) Baculovírus com poucos poliedros (FP) (Fonte: PEDRINI, 2003).
Diversos mutantes FP de Autographa californica MNPV (AcMNPV) e Galleria
mellonella MNPV (GmMNPV) têm sido caracterizados. A geração de mutantes FP destes
AcMNPV e GmMNPV. Esta região contém o gene 25K FP, que é essencial para formação da matriz proteica e do corpo de oclusão (OB) (revisado por BISCHOFF; SLAVICEK, 1997). Os mutantes de Lymantria dispar MNPV (LdMNPV) com fenótipos alterados na formação do poliedro (PF) são gerados com alta freqüência durante a passagem seriada em cultivo de células. A maioria destes mutantes exibe todas as características dos mutantes FP. As mutações encontradas nos isolados de LdMNPV foram mapeados para o gene 25 K FP e após analisados não continham grandes inserções ou deleções como são normalmente encontrados nos mutantes FP dos baculovírus AcMNPV e GmMNPV (BISCHOFF; SLAVICEK, 1997).
A rápida geração de fenótipo (FP) também foi observada na produção in vitro de baculovírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), detectada após somente duas passagens do isolado SfMNPV em cultura de células Sf9 (PEDRINI; WOLFF; REID, 2004). Em cultivos realizados por Almeida (2005) utilizando também um isolado de SfMNPV cultivado em células Sf9, observou-se uma maior estabilidade deste isolado, visto que a diminuição da sua produtividade (indicativo de formação de mutantes) foi identificada após a quarta passagem em células.
Outro tipo frequente de alteração genética é a produção de DIPs, estas partículas contêm apenas parte do genoma viral, replicam mais rapidamente que o vírus padrão. A maioria das partículas defectivas está presente em altas passagens seriadas do vírus e é produzida mais rapidamente quando se utiliza uma multiplicidade de infecção (MOI) muita alta (SOUZA et al., 2003).
Figura 2.5 Gel de eletroforose que mostra a mudança genotípica do baculovírus Helicoverpa
armigera SNPV durante passagem seriada em cultura de células. (Fonte: PEDRINI et al.,
2005a)
2.2.2 Multiplicidade de infecção (MOI)
A infectividade de um vírus depende de vários fatores, entre eles, da proporção de partículas virais completas, ou infecciosas; da suscetibilidade da célula hospedeira (ex. quantidade de receptor) e da chance desta partícula encontrar o receptor e penetrar na célula. Quando células suscetíveis são misturadas com uma suspensão de vírus, estas podem receber um, dois, três, dez partículas virais ou nenhuma. Isto depende da proporção entre a quantidade de vírus infecciosa presente no inóculo (título viral) e a quantidade de células utilizada no momento da infecção (TOI). Esta relação é denominada de multiplicidade de infecção ou
2.2.3 Titulação viral (TCLD50)
O título do estoque viral é a concentração de partículas virais infecciosas. O título não é equivalente à concentração total de partículas virais porque nem todas as partículas virais são infecciosas.
Existe uma ampla variabilidade de ensaios que podem ser utilizados para detectar e quantificar o título viral. Cada método tem suas vantagens e desvantagens, os dois principais métodos utilizados para quantificar as partículas virais infecciosas são: o ensaio de placas (plaque assay) e o ensaio do efeito citopático (CPE). Ambos os tipos de ensaios têm sido utilizados frequentemente para quantificar o título viral (DARLING et al., 1998).
No ensaio em placas (plaque assay), o vírus entra nas células após um período de 1 hora de adsorção, o inóculo viral é removido e uma camada de agarose é adicionada na placa. A camada restringe os focos de infecção às células adjacentes, por que cada placa possui uma única partícula infecciosa, a concentração de vírus infeccioso pode ser determinada pela contagem das placas formadas pelas diferentes diluições virais. O título é expresso em unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL) e a MOI em UFP (unidades formadoras de placas) adicionada por célula (DEE; SHULLER, 1997).
Outro método comumente utilizado para titulação viral é o ensaio da diluição do ponto final (endpoint dilution assay). Este método produz alta variabilidade na qual é inerente às propriedades biológicas, mas é também um método de avaliação qualitativa utilizado para identificar as células infectadas, especialmente quando possuem proteínas, tais como a β -galactosidase (MENA; RAMÍREZ; PALOMARES, 2003).
No ensaio de diluição de ponto-final, as diferentes diluições virais são inoculadas em múltiplas culturas em monocamadas. O título obtido a partir deste método é conhecido como a dose letal para infectar 50% da cultura de tecidos (TCLD50) que pode ser convertida em UFP pela seguinte relação estatística UFP/mL = 0,69 x TCLD50/mL (DEE; SHULLER, 1997).
possui uma coloração magenta, permitindo quantificar as células viáveis com auxílio do espectrofotômetro (leitora de microplacas) a 570nm.
Como o baculovírus é um vírus lítico, ou seja, ocasiona a lise celular, portanto, espera-se com a infecção uma diminuição do crescimento celular. Tal redução poderá espera-ser estimada pela medida a concentração de células viáveis utilizando o MTT e, consequentemente, poderá ser correlacionada com o título viral (MENA; RAMÍREZ; PALOMARES, 2003). A Figura 2.6 mostra a clivagem do anel tetrazólio do MTT provocada pela enzima mitocondrial redutase para formação dos cristais de formazan.
Figura 2.6 Clivagem do anel tetrazólio do MTT (Fonte: en.wikipedia.org/wiki/File:Mtt_scheme.gif)
Para determinar o TCLD50, uma curva sigmoidal é ajustada aos dados obtidos através da absorbância lida, obedecendo à seguinte Equação (1):
b
D D a Y
Y
+ + =
0 0
1
(1)
Onde:
Y – absorbância
a – absorbância máxima (0% de resposta) D – diluição
D0 – diluição na qual a resposta foi 50% (1/TCLD50)
b – fator de inclinação
Então, para obter-se o valor de TCLD50/mL, pode ser utilizada a seguinte Equação:
V D mL TCLD
. 1 /
0
50 = (2)
Onde:
V – volume da diluição viral adicionado em cada poço.
D0 - diluição na qual a resposta foi 50% (1/TCLD50)
2.3 Estratégias de produção in vitro de baculovírus
Para se decidir sobre o modo de operação mais adequado para produção em biorreator,
vários fatores devem ser levados em consideração. Em escala industrial, os principais fatores
são: (i) características da linhagem de célula utilizada, tais como estabilidade de expressão do
produto, grau de resistência aos metabólitos inibitórios e ainda, resistência à tensão de
cisalhamento; (ii) a demanda de mercado do produto; (iii) experiência técnica da equipe
responsável para ambos os processos de desenvolvimento e regulatórios (VÉLIZ;
RODRIGUEZ; CORDERO, 2008).
As diferentes estratégias de operação utilizadas normalmente nos cultivos com
micro-organismos são aplicáveis também aos cultivos com células animais, tais como: cultivo
descontínuo (batelada ou batch), cultivo descontínuo alimentado (batelada-alimentada ou
fed-batch), cultivo contínuo e cultivo contínuo com retenção de células, também conhecido como
perfusão. Neste item, a abordagem será somente sobre os cultivos em batelada e batelada
alimentada que foram utilizados como estratégias na produção in vitro do baculovírus
2.3.1 Processo em batelada ou descontínuo
O processo em batelada ou descontínuo de produção consiste em inocular uma única vez a suspensão celular sem qualquer suplementação adicional de nutrientes/substrato (sistema fechado), o volume é mantido constante durante o cultivo. A concentração celular aumenta desde a concentração de inóculo variando normalmente de 1,0 a 5,0x105 células viáveis/mL até atingir valores máximos entre 4,0 a 6,0x106 células viáveis/mL, com velocidades específicas de crescimento oscilando entre 0,48 e 0,96d-1, com tempo necessário para atingir a máxima concentração celular de aproximadamente 5 dias (CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007). Neste tipo de processo, existe uma limitação quanto ao esgotamento de nutrientes e/ou acúmulo de metabólitos tóxicos ou inibidores (ALTAMIRANO et al., 2004).
A estratégia de operação em batelada é a mais simples de ser executada, portanto, a mais empregada nos cultivos. É utilizada em frascos de cultivo em monocamadas (estacionário), nos frascos agitados (Erlemeyers ou spinners) e, ainda, em biorreatores variando escala de pequena a intermediária para propagação de inóculo e também em várias indústrias para produção em escala. No caso da propagação de inóculo, a cutura é cessada quando as células atingem a fase exponencial de crescimento, que promove alta concentração de biomassa multiplicando-se com máxima velocidade. Dessa maneira, garantindo que estas células, quando inoculadas em reator com alto volume, possuem uma mínima fase de adaptação, e assim reduzindo o período de improdutividade (VÉLIZ; RODRIGUEZ; CARDERO, 2008).
A baixa produtividade desses cultivos é limitada pela concentração de células obtidas, considerando que o produto necessariamente precisa das células para se desenvolver, consequentemente, ocorre uma baixa concentração do produto ao final do processo. Entretanto, uma estratégia variante conhecida como “bateladas repetidas” é uma alternativa interessante. Esta estratégia consiste em realizar o cultivo em batelada por um tempo necessário até atingir uma concentração desejada do produto. Neste momento, parte do conteúdo do biorreator é coletada. A suspensão de células remanescente dentro do biorreator é utilizada como inóculo para uma nova batelada. Este procedimento pode ser repetido várias vezes, até que seja observada uma redução na concentração celular ou na formação do produto desejado.
A Figura 2.7 mostra o comportamento da concentração de biomassa e de substrato durante um processo em batelada. Este comportamento em termos de células, nutrientes, e concentração de produtos pode ser descritos matematicamente pelos balanços de massa e expressões cinéticas, tais como a Equação de Monod, que descreve os efeitos dos nutrientes e concentração de metabólitos através das velocidades específicas de reação (AUGUSTO; BARRAL; PICCOLI, 2007).
Equações de balanço:
X dt
dX
⋅
=µ (3)
X q dt dS
S ⋅ −
= (4)
X q dt dP
P.
= (5)
Onde:
µ – velocidade específica de crescimento (d-1)
X – concentração de células (células/mL)
qS –velocidade de específica de consumo de substrato (mg/mL.d)
qp – velocidade de específica de formação de produto (mg/mL.d)
dt dX
– velocidade de variação de crescimento (células/d)
dt dS
– velocidade de variação de substrato (mg/d)
dt dP
– velocidade de variação de produto (mg/d)
O termo µ da Equação (3) é historicamente proveniente do cultivo microbiano no qual
a morte natural das células é insignificante durante o crescimento. No caso do cultivo de
células animais, há sempre uma quantidade mensurável de morte celular (quantificado por
método de exclusão), e esta é incluída no cálculo da velocidade específica de crescimento.
Power (1993) desenvolveu um modelo cinético que representa a dinâmica da população de
células (viáveis e mortas) e a cinética de produção de baculovírus que descreve o modelo
células animais, o valor de µ obtido a partir do crescimento de células viáveis é chamado de velocidade de crescimento “aparente” (µap), que é a diferença entre a velocidade específica de crescimento (µ) e a taxa de mortalidade ou velocidade específica de morte celular (Kd) representados na Equação (6):
µap = µ - Kd (6)
Substituindo a Equação (6) na Equação (3) obtém-se a equação para o crescimento de células viáveis não infectadas (XVNI) antes da inoculação com o baculovírus, conforme Equação (7):
VNI d VNI X K dt dX ⋅ −
=(µ ) (7)
Similarmente, a concentração das células não viáveis não infectadas (XNVNI) depende da concentração de células viáveis não infectadas e é dado pela Equação (8):
VNI d NVNI X K dt dX ⋅
= (8)
Onde Kd é a constante de mortalidade de 1ª Ordem, portanto, a velocidade específica de morte celular. Valores de µ e Kd são obtidos a partir da quantificação do número de células e viabilidade retirados durante os experimentos de crescimento celular. A metodologia mais
utilizada para determinação da concentração de células mortas é o método por exclusão por
corante, e não se aplica quando a lise celular é significativa (no caso, quando a infecção é
estabelecida). A velocidade especifica de morte celular pode ser calculada conforme indica a
Equação (9). ) 0 ( . ) 0 ( ). 1 ( ). ( VNI t ap NVNI NVNI d X e X X K ap − −
Para o cálculo de Kd pela Equação (9), o número de células viáveis não infectadas do começo (XVNI(0)) foi normalizado em relação ao número de células não viáveis não infectadas (XNVNI(0)).
Na ausência da infecção viral, o substrato (S) é consumido a uma velocidade constante (qs) através do crescimento exponencial das células animais em suspensão, Equação (10).
VNI S X
q dt dS
⋅ −
= (10)
O termo qs representa a velocidade de consumo de substrato em cada célula viável não infectada. Esta velocidade especifica de consumo é considerada proporcional à velocidade de crescimento, conforme a Equação (11):
s s
Y
q = µ (11)
Onde Ys é o rendimento do crescimento de células por unidade de substrato. Os valores de µ e Ys podem ser estimados a partir dos experimentos de crescimento celular.
No processo de infecção, após a inoculação viral, considerando alta multiplicidade de infecção e que todas as células tornam-se infectadas imediatamente. O modelo cinético é baseado no “sincronismo” da infecção celular, assim, o número de células viáveis infectadas é igual ao número de células viáveis não infectadas no tempo de infecção (TOI). No modelo, é considerado que o crescimento celular é inibido após a exposição ao vírus.
Para estimar a velocidade específica de crescimentoµ(τ)das células infectadas utiliza-se a Equação (12):
VI d
VI
X K
dt dX
⋅ −
Onde Kd é a taxa de mortalidade das células infectadas, refletindo o impacto letal do vírus. A velocidade específica de crescimento (µ) das células infectadas é uma função do tempo de pós-infecção (τ), e é considerado igual às células não infectadas enquanto o virus está em estágio inicial da replicação (τei) (POWER; NIELSEN, 1996).
Como outros parâmetros de infecção, Kd é uma função do tempo que as células têm sido infectadas (τ). Este valor é igual à medida da taxa de mortalidade das células não infectadas enquanto a infecção não é iniciada. Após este momento, a taxa de mortalidade é zero até o tempo final da infecção (τd), ponto em que ocorre a lise celular. A lise da população de células infectadas é descrita por uma taxa de mortalidade infinita, conforme Equação (13):
K d
=
) (τ
d
K 0 0 (13)
∞
Cada célula infectada passa por um ciclo específico de eventos durante seu período de infecção. As células infectadas produzem vírus extracelular (na fase inicial do processo de infecção) a uma taxa dependente do número de células viáveis infectadas, dada pela Equação (14):
V K X dt
dV
dv VI pv( ). − .
=α τ (14)
Onde: Kdv taxa de decomposição do virus e αpv é a taxa de produção de vírus por célula
infectada. Assumindo sincronismo de infecção, esta taxa de produção é em função do tempo
em que as células foram infectadas (τ). Ela é constante e positiva enquanto as células estão em
fase de produção viral, que dura do tempo em que o primeiro virion foi liberado (τvrs) até o tempo de quantidade máxima de vírus extracelular (τvre).
para τ ≤τei
para τei <τ ≤τd
Para quantificação dos corpos de oclusão (OB) produzidos na fase mais tardia do processo de infecção utiliza-se a Equação (15):
) ( ).
( )
(
OB K
X dt
OB d
dpOB VI
pOB −
=α τ (15)
A taxa específica de produção de OB (αpOB) é constante no tempo de inicio da intensa
produção de OB (τi) até o tempo do final da produção intensa de OB (τf).
A Figura 2.8 apresenta o perfil da produção de OB em células de inseto, a curva prediz
um aumento linear e constante na atividade de produção de OB com o tempo, portanto, o
cálculo da constante αpOB pode ser obtido através de um ajuste linear aos pontos
experimentais da produção de OB durante a intensa atividade viral. Esta constante é a
velocidade média de produção de OB no processo de infecção.
2.3.2 Processo em batelada-alimentada ou descontínuo-alimentado
O processo descontínuo alimentado, também conhecido como processo por batelada alimentada ou, simplesmente, fermentação descontínua alimentada é definido como uma técnica onde um ou mais nutrientes são adicionados durante o cultivo e os produtos permanecem até o final do cultivo (CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007). A vazão de alimentação pode ser constante ou variar com o tempo, e adição de substrato pode ser continua ou intermitente. A mudança de volume pode ou não ocorrer, dependendo da concentração de substrato e da taxa de evaporação do sistema (CARVALHO; SATO, 2001).
A alimentação de nutrientes ao longo do processo permite aumentar a quantidade total de nutrientes utilizados pelas células, o que proporciona maiores concentrações finais de células e produto. Esta alimentação de nutrientes pode ser administrada utilizando diferentes maneiras: adição por pulsos, adições segundo perfis escalonados e adições à vazão constante (CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007).
A utilização do processo descontínuo alimentado pode ser útil quando se procura contornar alguns fatores como: a minimização dos efeitos do controle do metabolismo celular - para que não haja superprodução de um determinado produto ou síntese de uma enzima desnecessária; prevenção da inibição por substrato – o controle da vazão de alimentação permite que se evite o trabalho em condições inibitórias, melhorando a produtividade e/ou rendimento dos bioprocessos; a minimização da formação de produtos de metabolismo tóxicos que é particularmente crítica em processos em que se deseja a obtenção de altas concentrações celulares, como é o caso do cultivo de células animais, neste tipo de cultivo os metabólitos tóxicos mais comuns são lactato e amônia (revisado por CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007).
diminuição da produção de lactato, associada ao aumento na viabilidade celular e na produção de tPA. O controle da velocidade de fornecimento de substrato ao sistema permite que se mantenha a velocidade de crescimento celular em intervalos desejados que minimize a formação destes produtos tóxicos para as células, possibilitando altas concentrações celulares e, consequentemente, aumento na quantidade de produto formado. (CARVALHO; SATO, 2001).
A definição clássica de alimentada é limitar o fornecimento de um substrato, geralmente glicose, como uma ferramenta para controlar a velocidade específica de crescimento. Esta estratégia, no entanto, não é possível para células animais, pois concentração muito baixa de substrato poderia induzir a apoptose (morte programada) das células (AUGUSTO; BARRAL; PICCOLI, 2007). A batelada-alimentada para cultura células animais é uma questão mais de limitar a formação de subprodutos metabólicos e fornecimento de nutrientes (SPENS, 2006).
A Figura 2.9 mostra o perfil da concentração de biomassa e substrato em um processo em batelada-alimentada, característica fundamental é a concentração de substrato permanecer constante durante o processo.
As Equações (16), (17) e (18) representam o processo descontínuo-alimentado e permitem estimar as variáveis cinéticas, bem como sua otimização:
X V F X dt dX . − ⋅
=µ (16)
(
S S)
q X V F dt dS S ⋅ − −= 0 (17)
P V F X q dt dP
P − ⋅
= . (18)
Onde:
µ – velocidade específica de crescimento (d-1)
X – concentração de células (células/mL)
F – vazão volumétrica de alimentação (mL/d)
V – volume de cultivo (mL)
P – concentração de produto (mg/mL)
S0 – concentração inicial de substrato (mg/mL)
S – concentração final de substrato (mg/mL)
qS –velocidade de consumo de substrato (mg/mL.d)
qp – velocidade de formação de produto (mg/mL.d)
dt dX
– velocidade de variação de crescimento (células/d)
dt dS
– velocidade de variação de substrato (mg/d)
dt dP
Observa-se que essas equações distinguem-se daquelas apresentadas para o cultivo em batelada pelos termos relativos à adição, a uma vazão (F), de meio de cultura ou solução de nutrientes, com concentração de substrato (S0).
Uma desvantagem do cultivo em batelada-alimentada é o longo tempo de residência do produto no ambiente de cultivo. Durante o tempo de cultivo, o produto sofre influências devido à presença de proteases e glicosidases, estas enzimas podem degradá-lo e, em alguns casos, destrói uma fração importante do material ativo sintetizado (revisado por VÉLIZ; RODRIGUEZ; CARDERO, 2008).
2.3.3 Processo de produção em baixa MOI (Low MOI)
Existem algumas maneiras para infectar as células de inseto em suspensão no que se refere à multiplicidade de infecção. A MOI pode ser classificada em alta e baixa. Em processos de batelada geralmente emprega-se uma alta MOI na fase exponencial de crescimento, essencialmente as células serão infectadas imediatamente, o que resulta no sincronismo da infecção das células de inseto (WONG et al., 1996). O sincronismo de infecção favorece o rendimento na produção de baculovírus, mas a utilização de alta MOI pode resultar na formação de partículas interferentes defectivas (DIPs) durante a passagem seriada do vírus provocando assim o chamado efeito passagem (WICKHAM et al., 1991).
Utilizando baixa MOI com um tempo de infecção mínimo, ou seja, uma concentração muito baixa de células viáveis, poderá minimizar a formação de mutantes ou de DIPs (KOOL et al.,1991; ZHENG; GREENFIELD; REID, 1999). A amplificação viral em baixa MOI é a melhor estratégia para preservar a integridade genética do vírus prevenindo a formação destes interferentes.
A multiplicidade de infecção (MOI) é, provavelmente, o conceito mais amplo utilizado nas pesquisas de produção de vírus (MARANGA et al., 2004). A utilização da baixa multiplicidade de infecção (Low MOI) para produção de baculovírus em sistema de células de inseto é uma alternativa atrativa para o processo de ampliação de escala, pois, há uma diminuição no tempo de produção, no custo do equipamento e na possibilidade de contaminação (ZHANG; ENDEN; MERCHUK, 2005). Existe ainda um incentivo comercial para utilizar baixas MOIs, devido ao menor custo de obtenção de inóculo viral, ou seja, menos quantidade de vírus é utilizada para infectar as células (WONG et al., 1996).
Nos cultivos em batelada tradicionalmente emprega-se uma MOI que varia de intermediária a alta necessitando de dois processos paralelos de ampliação de escala – um para as células e outro para os vírus. A utilização de MOI tão baixa quanto 0,0001 UFP/Célula permite o processo de infecção, ainda que se utilize este baixo nível de vírus. Utilizando baixa MOI no sistema células Sf9/AcMNPV para produção de β-galactosidase, a quantidade de proteína recombinante obtida foi comparável ao obtido no sistema utilizando alta MOI, portanto sem perdas no rendimento de produção (WONG et al., 1996).
Capítulo 3
3 Seleção dos isolados selvagens de baculovírus AgMNPV
Neste capítulo, será mostrado a cinética de crescimento celular e de produção dos corpos de oclusão obtidos das infecções com três isolados genéticos do baculovírus AgMNPV purificados em cultura de células, AgMNPV-2D (padrão), AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5. A seleção de isolados genéticos estáveis que possuem o melhor desempenho na capacidade de produção in vitro de bioinseticidas virais foi necessária para a comparação entre o AgMNPV selvagem e seu recombinante vAgEGT∆-LacZ que integra o estudo da produção in vitro de corpos de oclusão utilizados como bioinseticidas.
3.1 Introdução
Os baculovírus encontram-se naturalmente como populações heterogêneas de genótipos virais (MARUNIAK; BROWN; KUNDSON, 1984; SHAPIRO et al., 1991). O estudo das variações ocorridas espontaneamente em baculovírus pode ser fundamental para o entendimento de mecanismos envolvidos na patogenicidade e especificidade destes isolados. Existe grande interesse em conhecer os mecanismos genéticos responsáveis por essa variação e a avaliação dessa diversidade tem mostrado a existência de grande variabilidade genética, seja de diferentes tipos de baculovírus ou dentro de um mesmo isolado.
hospedeiros diferentes e classificados como vírus distintos (BROWN; MARUNIAK; KNUDSON, 1984; GOTO; MINOBE; LIZUKA, 1992).
Estudos foram realizados com o AgMNPV na identificação e distinção de diferentes genótipos virais, e na construção do mapa físico de seu genoma. Isolados foram purificados por plaque assay, no qual os DNA virais foram submetidos à análise de restrição. Inicialmente, foram detectados seis variantes genotípicos (MARUNIAK, 1989), a partir de um isolado viral coletado em 1979 no Brasil (AgMNPV-79). Em seguida, a partir desses variantes e utilizando a mesma técnica, foram selecionados 45 clones virais. Desses, o DNA do protótipo denominado AgMNPV-2D, representando 40% dos isolados obtidos, foi mapeado e um total de 51 sítios de restrição foram determinados (JOHNSON; MARUNIAK, 1989). A região do gene da poliedrina do vírus AgMNPV-2D foi sequenciada, sendo identificada uma ORF (open reading frame), ou seja, as sequências de DNA compreendidas entre o códon de início da tradução e um códon de terminação, com a capacidade de codificar um polipeptídio de 245 aminoácidos (cerca de 735pb), com massa molecular de 28,55 kDa (ZANOTTO et al., 1992). O sequenciamento dessa região e do genoma completo do isolado AgMNPV-2D (OLIVEIRA et al., 2006), juntamente com estudos filogenéticos mostraram que o AgMNPV apresenta organização genômica e identidade de sequência com os vírus
Choristoneura fumiferana defective MNPV (CfDefNPV), Autographa californica multiple
nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus
(OpMNPV) e Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus (BmMNPV) entre outros baculovírus (ZANOTTO; KESSING; MARUNIAK, 1993; OLIVEIRA et al., 2006).
