Mutagênese induzida por flavonóides presentes do decocto das cascas da aroeira (Schinus terebinthifolius, Raddi)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE - UFRN CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE - CCS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - PPGCSA

MUTAGÊNESE INDUZIDA POR FLAVONÓIDES PRESENTES NO DECOCTO DAS CASCAS DA AROEIRA (Schinus terebinthifolius, Raddi)

FRANCISCO NAPOLEÃO TULIO VARELA BARCA

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ORIENTADORA: PROF. DRA. SÍLVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS

Natal 2008

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Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Barca, Francisco Napoleão Túlio Varela.

Mutagênese induzida por flavonóides presentes do decocto das cascas da aroeira (Schinus terebinthifolius, Raddi) / Francisco Napoleão Túlio Varela. – Natal, RN, 2008.

93 f.

Orientadora: Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

1. Mutagenicidade – Tese. 2. Flavonóides – Tese. 3. EROs – Tese. 4. Schinus terebinthifolius – Tese. I. Medeiros, Sílvia Regina Batistuzzo de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

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PRESIDENTE DA BANCA

PROF. DRA. SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS

BANCA EXAMINADORA

PROF. DR. GERALDO BARROSO CAVALCANTE (UFRN) PROF. DR. ISRAEL FELZENSZWALB (UERJ)

PROF. DR. JOSÉ MARIA BARBOSA FILHO (UFPB)

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AGRADECIMENTOS

A Profa. Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros (Departamento de Genética e Biologia

Celular e Molecular) pela orientação. A Profa. Lucymara Fassarella Agnez Lima

(Departamento de Genética e Biologia Celular e Molecular) pela co-orientação. Prof. Túlio

Flávio Accioly de Lima (Departamento de Farmácia) por permitir realizar parte de

experimentos em seu laboratório. Ao prof. Aldo Gondim Fernandes da Faculdade de

Educação Física da UERN por auxiliar em parte dos trabalhos de finalização. Ao CNPq

por auxílio financeiro nos experimentos. A meus familiares por terem auxiliado desde o

início, apoiando mesmo em momentos difíceis e aos colegas que me incentivaram a

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vii SUMÁRIO

DEDICATÓRIA v

AGREDECIMENTOS vi

LISTA DE ABREVIATURAS viii

RESUMO x

1. INTRODUÇÃO 12

1.1. OBJETIVOS 14

1.1.1. OBJETIVO GERAL 14

1.1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14

2. REVISÃO DA LITERATURA 15

3. INDEXAÇÃO DE ARTIGOS 23

4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES 64

4.1. ANÁLISES ELETROFORÉTICAS 64

4.2. TESTES COM LINHAGENS CC104 65

4.3. EFICIÊNCIA DE TRANSFORMAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL 69 4.4. EXPERIMENTOS In vitro SOBRE REPARO DE LESÕES 71

4.5. ESPECTRO DE MUTAÇÕES 73

4.6. MODELO PARA O MECANISMO DE AÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS

FLAVONÓIDES DA AROEIRA 75

4.7. CONCLUSÕES 75

5. REFERÊNCIAS 77

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LISTA DE ABREVIATURAS A – Adenina.

BER – Sistema de Reparo por Excisão de Bases. bp – Pares de Bases de Nucleotídeos no DNA. C – Citosina.

˚C – Graus Celsius. 13_{C – Carbono.}

DNA – Ácido Desoxirribonucléico.

DSS – Ácido 2,2-Dimetil-2-Silapenteno-5-surfúrico. EDTA – Ácido Etilenodiaminotetraacético.

EROs – Espécies Reativas de Oxigênio. FAPy – Formamidopirimidina.

FPG – Formamidopirimidina Glicosilase. G – Guanina.

g – Grama. h – Horas. 1_{H – Hidrogênio.}

hr – Horas.

H2O2 – Peróxido de Hidrogênio.

IPTG – Indutor gratuito do gene da -Galactosidase. kV/cm – Kilovolt por centímetro.

kg – Kilograma. L – Litros.

LacZ – Gene da -Galactosidase. LB – Meio de Cultura de Luria-Bertani.

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ix mM – Milimolar.

M – Molar.

MS – Espectrometria de Massa. F - Microfaraday

M – Micromolar. min – Minutos.

L- Microlitros mL – Mililitros. nM – Nanomolar. ng – Nanogramas.

NER – Sistema de Reparo por Excisão de Nucleotídios. - Ohms.

ORF – Sequência Aberta de Leitura.

pH – Logarítmo negativo de base da dez da concentração de hidrogênio. pM – Picomolar.

rpoB – Gene da subunidade da RNA polimerase. PCR – Reação em Cadeia de Polimerase.

RMN – Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear. RNA – Ácido Ribonucléico.

rpm - Rotações por minuto.

Sítios AP – Sítios apurínicos ou apiridimídicos de DNA. T – Timidina.

UV – Ultravioleta. V – Volts.

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RESUMO

O decocto feito de cascas da Aroeira (Schinus terebinthifolius_{, Raddi) é usado na}

medicina popular como cicatrizante e anti-inflamatório, mas, apesar de seu efeito

medicinal, também foi demonstrado um efeito mutagênico. O objetivo deste trabalho foi

determinar se os flavonóides da aroeira são os responsáveis pela mutagenicidade bem

como propor um mecanismo de ação. Para tanto, diferentes frações enriquecidas em

flavonóides foram preparadas e os flavonóides foram isolados, purificados e quantificados

via cromatografia de adsorção em gel de sílica. Testes de genotoxicidade, in vitro_{e em}

sistemas bacterianos foram realizados a fim de determinar o mecanismo de ação. Testes

realizados com DNA plasmidial In vitro_{foram indicativos de que as frações enriquecidas}

de flavonóides são capazes de gerar dupla quebra na fita do DNA, bem como são

capazes de gerar sítios abásicos, evidenciados na presença da exonuclease III. O mesmo

teste com DNA plasmidial, mas na presença de cobre [10 M] e de tampão Tris-HCl pH

7.5 [10 M], foi realizado, para determinar se haveria ou não participação de espécies

reativas de oxigênio na indução de danos. A transformação do DNA plasmidial em

diferentes cepas bacterianas, proficientes e deficientes em diferentes vias de reparo de

DNA, na ausência e presença de tampão Tris-HCl pH 7.5 [10 M], sugerem que enzimas

de reparo de lesões oxidativas são necessárias para reparar as lesões geradas pelos

flavonóides e que espécies reativas de oxigênio são geradas e necessárias para

promover as lesões. Teste de mutagenicidade direta com diferentes cepas de Escherichia

coli _{derivadas da linhagem CC104 sugeriram que os flavonóides aumentam a freqüência}

de mutação em cepas deficientes nas enzimas MutM e MutY glicosilases, principalmente

na duplo mutante, sugerindo que as lesões predominantemente oxidativas, são substratos

destas enzimas no DNA. A fim de determinar o espectro de mutação causado pelos

flavonóides da aroeira, DNA plasmidial foi transformado previamente tratado com as

frações enriquecidas em flavonóides em cepas deficientes em enzimas de reparo de

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xi DNA por PCR e sequenciamento dos clones mutantes. Análise dos mutantes obtidos nas

cepas CC104, CC104mut_{M, CC104}mut_{Y e CC104}mut_Mmut_{Y indicaram a predominância}

de mutações do tipo G:C para C:G, que pode estar correlacionada a origem de 8-oxoG,

devido a lesões oxidativas causadas pelos flavonóides. Assim, pode-se concluir que os

flavonóides isolados ou em frações enriquecidas nos mesmos são responsáveis pelo

potencial mutagênico dos extratos da aroeira, que as lesões geradas são oxidativas,

predominando a formação de 8-oxoG, devido à formação de EROs, e que são

reconhecidas por enzimas do sistema de reparo por excisão de base. Desta forma,

propõe-se que os flavonóides possam gerar espécies reativas de oxigênio de duas

maneiras diferentes: i) em uma reação Fenton-like_{, quando os flavonóides estão na}

presença de metais e água ou ii) devido à estrutura interna da molécula de flavonóide

pela disposição e quantidade de grupamento hidroxilas na própria molécula. As lesões

podem ser geradas diretamente (sugerido pelos experimentos de tratamento in vitro_{) ou}

indiretamente (pelos experimentos obtidos com as linhagens CC).

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ABSTRACT

Flavonoids are a diversified family of plant compounds that are involved in pigmentation and protection of plants from the toxicity of sunlight. Flavonoids also have medicinal applications, suggesting that they may be chemoprotective. Recent studies show, however, that some plant flavonoids have oxidative and toxic effects, including Schinus terebinthifolius. In Brazil, extracts of this plant is very used for medical purposes. In this study, we have analyzed the mutagenic potential of three flavonoid-enriched fractions from Brazilian pepper tree bark, using E. coli CC strains deficient and proficient in enzymes involved in DNA repair of oxidative lesions. The highest mutagenic responses were detected in strains MutY defective enzyme and double mutant (CC104mutY and CC104mutMmutY). The spectrum of mutations (resulted from DNA sequencing) induced in a plasmidial DNA was composed mainly of mutations typically caused by oxidative agents; the mutations were predominantly transversions at G:C base pairs, with G:C T:A and G:C C:G transversions the most commonly detected mutations. These data support the hypothesis that the flavonoids in pepper tree bark extract are mutagenic and that the mutations results from the generation of reactive oxygen species (ROS).