INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
‐
RIO CLARO
EFEITOS DO ÓLEO DA SEMENTE DE NEEM (Azadirachta indica A. JUSS) NOS OVÓCITOS E GLÂNDULAS SALIVARES DE CARRAPATOS Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806) (ACARI: IXODIDAE).
Rio Claro 2014
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR)
RAFAEL NEODINI REMEDIO
EFEITOS
DO
ÓLEO
DA
SEMENTE
DE
NEEM
(
Azadirachta
indica
A.
JUSS)
NOS
OVÓCITOS
E
GLÂNDULAS
SALIVARES
DE
CARRAPATOS
Rhipicephalus
sanguineus
(LATREILLE,
1806)
(ACARI:
IXODIDAE).
Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular).
Orientador: Profa. Dra. Maria Izabel Camargo‐Mathias
Co‐orientador: Dr. Pablo Henrique Nunes
Rio
Claro
A. Juss) nos ovócitos e glândulas salivares de carrapatos Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae) / Rafael Neodini Remedio. - Rio Claro, 2014
96 f. : il., figs.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Maria Izabel Camargo-Mathias Coorientador: Pablo Henrique Nunes
1. Ácaro. 2. Controle. 3. Fitoterápico. 4. Morfologia. 5. Microscopia. 6. Carrapato-marrom-do-cão. I. Título.
Dedico este trabalho aos meus pais, avós e irmãos,
“O fracasso é a oportunidade de se
começar de novo, com inteligência”
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus, por tudo que tem me proporcionado. Agradeço também a meus pais, Paulo e Rosângela, meus avós, Waldir e Maria Cândida, meus irmãos, Leandro e Vitor, e minha namorada Júlia, e a todos os meus familiares, pela força e pelo apoio incondicional.
Não poderia deixar de agradecer a minha orientadora, a Profa. Dra. Maria Izabel Camargo-Mathias, por todos os anos de convivência e amizade, e pelo grande auxílio no desenvolvimento deste estudo. Agradeço a meu co-orientador, o Dr. Pablo Henrique Nunes, pela amizade, pelos bons momentos e pela enorme ajuda prestada a este trabalho. Agradeço também a todos que de alguma forma colaboraram com a execução desta tese: Prof. Dr. Moacir Forim, Prof. Dr. Odair Correa Bueno, Marcela Ceccato, Dra. Karim C. S. Furquim, Dra. Gislaine Cristina Roma, Dra. Patrícia Rosa de Oliveira, Luis Adriano Anholeto, Mônica Iamonte, Antônio T. Yabuki, Gerson Mello Souza, e a todas as pessoas cujos nomes não foram mencionados, mas que se considerem no direito de estarem aqui. Agradeço a meus grandes amigos de Graduação e de Pós-Graduação, pelos momentos de reflexão e também de descontração. Agradeço também aos professores da Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL) pela amizade e receptividade.
RESUMO
Os carrapatos Rhipicephalus sanguineus têm atraído, nos últimos anos, a atenção de pesquisadores, bem como de órgãos gerenciadores da saúde pública, por estarem se tornando grandes pragas urbanas, transmissoras de doenças para cães e humanos. Por esta razão, a busca por formulações com ação acaricida tem sido preocupação constante das indústrias farmacêuticas veterinárias. No entanto, a grande maioria dos produtos atualmente comercializados apresenta alta toxicidade aos hospedeiros dos ectoparasitas e ao meio ambiente, induzindo, inclusive, resistência nos carrapatos. Métodos alternativos de controle, como o uso de extratos de plantas, por exemplo, têm se tornado cada vez mais interessantes, já que apresentam menores custos e baixa toxicidade. Neste sentido, destaca-se a espécie
Azadirachta indica (neem), cujos extratos de folhas e sementes apresentam reconhecido
estruturais observadas no ovário e nas glândulas salivares indicaram, desta forma, a possível ocorrência de prejuízos no desempenho reprodutivo e alimentar destes animais a longo prazo, inviabilizando os ovócitos e as células dos ácinos secretores. Isso comprova o potencial do óleo das sementes de neem no controle de R. sanguineus.
ABSTRACT
Rhipicephalus sanguineus ticks have attracted, in recent years, the attention of
researchers as well as public health managers, since they have become major urban pests, transmitters of diseases to humans and dogs. For this reason, the search for formulations with acaricide action has been constant concern of veterinary pharmaceutical industries. However, the vast majority of products currently commercialized exhibits high toxicity to the hosts of these ectoparasites and to the environment, even inducing resistance in ticks. Alternative control methods such as the use of plant extracts, for example, have become increasingly interesting, since they have reduced costs and low toxicity. In this sense, Azadirachta indica (neem) species stands out, as its leaf and seed extracts have recognized repellent, insecticide and acaricide potential. Thus, this study aimed to evaluate the morphological alterations resulting from the action of neem in the ovary and salivary glands of semi-engorged R.
sanguineus female ticks, subjected to the topical application of the oil extracted from neem
reproductive and feeding performance of these animals, making oocytes and cells of secretory acini unfeasible. This demonstrates the potential of neem seed oil in the control of R.
sanguineus.
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO GERAL ... 10
II. OBJETIVO ... 17
III. CAPÍTULO 1 ... 18
1.1. RESUMO ... 19
1.2. ABSTRACT ... 20
1.3. INTRODUÇÃO ... 21
1.4. MATERIAL E MÉTODOS ... 23
1.4.1. Carrapatos R. sanguineus ... 23
1.4.2. Azadirachta indica (neem) ... 23
1.4.3. Procedimentos experimentais ... 23
1.4.4. Análise morfológica ... 24
1.5. RESULTADOS ... 27
1.5.1. Microscopia de Luz Convencional (MLC) ... 27
1.5.2. Microscopia Confocal de Varredura a Laser (MCVL) ... 28
1.5.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ... 29
1.5.4. Figuras ... 31
1.6. DISCUSSÃO ... 39
1.7. CONCLUSÃO ... 45
1.8. BIBLIOGRAFIA ... 46
IV. CAPÍTULO 2 ... 52
2.1. RESUMO ... 53
2.2. ABSTRACT ... 54
2.3. INTRODUÇÃO ... 55
2.4. MATERIAL E MÉTODOS ... 57
2.4.1. Carrapatos R. sanguineus ... 57
2.4.2. Azadirachta indica (neem) ... 57
2.4.3. Procedimentos experimentais ... 57
2.4.4. Análise morfológica ... 58
2.5. RESULTADOS ... 61
2.5.1. Microscopia de Luz Convencional (MLC) ... 61
2.5.2. Microscopia Confocal de Varredura a Laser (MCVL) ... 63
2.5.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ... 63
2.5.4. Figuras ... 66
2.6. DISCUSSÃO ... 73
2.7. CONCLUSÃO ... 79
2.8. BIBLIOGRAFIA ... 80
V. DISCUSSÃO GERAL ... 86
VI. CONCLUSÕES ... 88
I. INTRODUÇÃO GERAL
A necessidade de se encontrar alternativas ecologicamente seguras para o controle de pragas, em substituição aos pesticidas sintetizados quimicamente, tem levado pesquisadores a voltarem sua atenção ao uso de biopesticidas, especialmente aqueles derivados de espécies vegetais (BRAHMACHARI, 2004). Dentro deste contexto, as árvores de neem (Azadirachta
indica A. Juss) têm se destacado como fontes potenciais de uma grande quantidade de
inseticidas naturais, pesticidas e agroquímicos (RAIZADA et al., 2001; BRAHMACHARI, 2004). Além disso, seus componentes não persistem no ambiente, são degradados por raios ultravioletas e apresentam menos efeitos tóxicos do que os pesticidas sintéticos tradicionais (VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004).
O neem é uma planta pertencente à Família Meliaceae, originária das regiões sul e sudeste da Ásia, embora também possa ser encontrado em áreas tropicais e subtropicais da África, América e Austrália (SCHMUTTERER, 1990; VIETMEYER, 1992; ATAWODI, ATAWODI, 2009). Apresenta atividade anti-séptica, antiviral e antifúngica, além de indícios de efeitos antiinflamatórios, hipotensivos, contraceptivos (VIETMEYER, 1992; ATAWODI, ATAWODI, 2009) e inúmeros outros benefícios, incluindo o controle de muitas espécies consideradas pragas (VIETMEYER, 1992).
A A. indica contém inúmeros princípios biologicamente ativos, que agem de formas
diferentes em circunstâncias diferentes (VIETMEYER, 1992; ATAWODI, ATAWODI, 2009). Eles podem ser divididos em duas classes principais: os isoprenóides, como a azadiractina, salanina e nimbina; e os não-isoprenóides, que incluem proteínas, aminoácidos, carboidratos, entre outros (VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004).
no desenvolvimento e reprodução, além de prejuízos nos processos de muda (VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004).
Inúmeros testes demonstraram indícios de que os compostos químicos presentes no neem podem afetar inúmeras espécies de insetos, bem como ácaros, nematódeos, fungos, bactérias e até mesmo vírus (VIETMEYER, 1992). Pragas de interesse agrícola, médico e veterinário podem ser controladas por meio de repulsão, interrupção da alimentação ou mesmo morte, e o uso do neem parece ser útil por um ou mais destes mecanismos (ATAWODI; ATAWODI, 2009). Os organismos-alvo absorvem os componentes do neem como se fossem hormônios reais, devido à sua proximidade em forma e estrutura a alguns hormônios vitais a insetos e outros invertebrados. No entanto, ao penetrar no organismo, estes compostos bloqueiam o sistema endócrino destes animais, causando alterações comportamentais e fisiológicas que resultam em seu controle reprodutivo (VIETMEYER, 1992).
Em virtude de sua natureza parasítica e da capacidade de transmitir microorganismos patogênicos para humanos e outros vertebrados (OLIVER, 1989; JONGEJAN, UILENBERG, 2004), estes animais têm sido alvos de grande preocupação por parte de pesquisadores envolvidos no controle populacional de carrapatos. Estes ácaros são ectoparasitas hematófagos, classificados em três Famílias: Ixodidae, Argasidae e Nuttalliellidae (HORAK et al., 2002). Devido às características de seu comportamento alimentar, podem causar danos diretos aos seus hospedeiros (DANTAS-TORRES, 2008), como paralisia, toxicose, irritações e alergias (JONGEJAN; UILENBERG, 2004). Além disso, constituem o grupo mais importante de vetores de patógenos dentro do Filo Arthropoda, sendo comparados apenas aos mosquitos (DANTAS-TORRES, 2010).
A Família Ixodidae inclui um grande número de espécies de interesse médico, veterinário e econômico, a maioria delas pertencendo aos gêneros Amblyomma, Dermacentor,
Ixodes, Haemaphysalis e Rhipicephalus (DANTAS-TORRES, 2008). São conhecidos como
“carrapatos duros”, devido à presença de uma placa ou escudo dorsal esclerotizado. (DANTAS-TORRES, 2008; BLAGBURN, DRYDEN, 2009). Desenvolvem-se em quatro estágios: ovos, larvas, ninfas e adultos (OLIVER, 1989). Dependendo do número de hospedeiros aos quais se fixam durante seu ciclo de vida, podem ser classificados como espécies mono, di ou trioxenas (um, dois ou três hospedeiros, respectivamente), e geralmente acasalam-se no corpo do próprio hospedeiro (JONJEJAN; UILENBERG, 2004).
Do ponto de vista veterinário, o “carrapato-marrom-do-cão”, Rhipicephalus
infecciosos aos cães (DANTAS-TORRES, 2010), e muitas das doenças por ele transmitidas podem acometer inclusive os seres humanos (OYAFUSO et al., 2002). Estes carrapatos são originários da região Paleártica e atualmente podem ser encontrados em qualquer país do continente americano, sendo, possivelmente, a espécie observada com maior freqüência em todo o mundo (GUGLIELMONE et al., 2014). Foram transferidos da região de origem para muitos países provavelmente pela importação de cães domésticos infestados (DANTAS-TORRES et al., 2006) e podem parasitar cães que vivem tanto em áreas urbanas quanto rurais, estando altamente adaptados a viver em habitações humanas. São prevalentes do final da primavera ao início do outono em áreas temperadas (PAPADOPOULOS et al., 1996), e por todo o ano em regiões tropicais e subtropicais (DANTAS-TORRES, 2010).
São carrapatos pequenos (machos com 2.28-3.18 mm de comprimento e 1.11-1.69 mm de largura; fêmeas com 2.4-2.7 mm de comprimento e 1.44-1.68 mm de largura), sem ornamentos e de comportamento trioxeno (DANTAS-TORRES, 2008). O acasalamento ocorre no hospedeiro durante a alimentação (BLAGBURN; DRYDEN, 2009), e embora a fêmea possa iniciar seu processo alimentar sem a presença do macho, somente completará o processo de ingurgitamento se acasalada (SANCHES et al., 2012), alcançando cerca de 100 vezes o seu tamanho em jejum (BLAGBURN; DRYDEN, 2009). De acordo com Dantas-Torres (2010), estes carrapatos utilizam as quelíceras para perfurar a pele do hospedeiro e, então, inserem seu hipostômio e quelíceras na epiderme, ocasionalmente atingindo as camadas superiores da derme. Durante a infestação, suas glândulas salivares secretam uma substância conhecida como cemento, que forma o cone de fixação na superfície da epiderme (SZABÓ, BECHARA, 1999; DANTAS-TORRES et al., 2010). O período de alimentação pode durar de alguns dias a várias semanas, dependendo do hospedeiro considerado e do estágio de desenvolvimento do carrapato (TROUGHTON, LEVIN, 2007; DANTAS-TORRES et al., 2010).
também foi detectada (SZABÓ et al., 2005; MORAES-FILHO et al., 2011). Estas análises revelaram que as diferenças entre indivíduos de linhagens distintas de R. sanguineus são maiores do que previamente assumido, podendo estar relacionadas às variações na biologia e na capacidade vetora desta espécie de carrapatos ao redor do mundo (SZABÓ et al., 2005). Desta forma, estudos recentes indicam a possível existência de mais de uma espécie sob o nome “R. sanguineus” ao redor do mundo (MORAES-FILHO et al., 2011). Isso pode indicar a ocorrência de mais de uma espécie do gênero Rhipicephalus na região Neotropical (OLIVEIRA et al., 2005).
Embora se alimentem preferencialmente em cães, os carrapatos R. sanguineus podem ser encontrados em uma grande variedade de animais domésticos e selvagens, como gatos, roedores, aves e outros pequenos mamíferos (DANTAS-TORRES et al., 2006; BLAGBURN, DRYDEN, 2009). Além disso, casos de parasitismo humano por R. sanguineus têm sido descritos ocasionalmente (CARPENTER et al., 1990; MANFREDI et al., 1999; USPENSKY, IOFFE-USPENSKY, 2002). Isso confere enorme importância veterinária, médica e econômica a estes carrapatos, despertando a atenção de órgãos que gerenciam a saúde pública (PAZ et al., 2008). Os indivíduos pertencentes às linhagens tropicais e subtropicais são reconhecidos transmissores de Ehrlichia canis, agente causador da erliquiose monocítica canina, e Babesia canis, causadora da babesiose canina (BLAGBURN; DRYDEN, 2009). Além disso, alguns estudos indicam que podem ser vetores potenciais de Leishmania chagasi, causadora da leishmaniose visceral canina (DANTAS TORRES et al., 2010) e Rickettsia
rickettsii, causadora da “febre maculosa das Montanhas Rochosas” (CUNHA et al., 2009),
entre outros.
O sistema reprodutor das fêmeas de carrapatos ixodídeos consiste em um ovário não-pareado em forma de U, dois ovidutos e um único útero, além de glândulas acessórias e uma abertura genital (COONS; ALBERTI, 1999). Em R. sanguineus, o ovário é único e tubular, encontrado na parte posterior do corpo. É constituído por um lúmen estreito delimitado por uma delicada parede de células epiteliais cúbicas, na qual inúmeros ovócitos de tamanhos variados encontram-se fixados e se desenvolvendo simultaneamente, mas assincronicamente (OLIVEIRA et al., 2005b). Durante seu processo de crescimento, os ovócitos podem ser classificados em cinco estágios. O estágio I corresponde ao período de crescimento citoplasmático reduzido, que ocorre antes da alimentação no hospedeiro. No estágio II, o crescimento é grande, iniciado pela ingestão de sangue. O estágio III corresponde à fase vitelogênica, e se inicia com os primeiros sinais de ocorrência de grânulos de vitelo no citoplasma. O estágio IV é caracterizado pelo fim da vitelogênese e pela deposição do córion, cuja síntese se iniciou durante o estágio anterior. No estágio V começa a ovulação, quando os ovos passam para o lúmen do ovário (SONENSHINE, 1991; COONS; ALBERTI, 1999).
importantes papéis no balanço hídrico durante o estágio de jejum, enquanto os granulares possivelmente secretam os produtos necessários para a alimentação, incluindo: o cemento para o cone de fixação, compostos anticoagulantes, agentes vasoativos que aumentam o fluxo de sangue no local de fixação, enzimas com funções ainda não definidas, além de substancias tóxicas com poder paralisante, entre outras.
Sob diferentes formulações e tipos de aplicações, variados métodos de controle têm sido desenvolvidos para inúmeras espécies de carrapatos a partir das folhas, casca e sementes do neem. O uso do óleo de neem obtido pela prensagem das sementes se mostrou eficaz no controle de carrapatos Amblyomma variegatum, com pouco ou nenhum efeito adverso (NDUMU et al., 1999). Em Hyalomma dromedarii, a azadiractina diluída em acetona não teve efeitos significativos em grandes concentrações, mas abaixo de 5000 mg/L, contudo, causou expressiva queda na alimentação de larvas, ocasionando redução nas taxas de ecdise, além da diminuição do peso das fêmeas ingurgitadas (AL-RAJHY et al., 2003). O uso de extratos das sementes de neem também se mostrou eficiente em H. anatolicum excavatum, afetando a taxa de eclosão de ovos e gerando, assim, larvas incompletamente desenvolvidas ou mortas, além de induzir a morte de adultos em jejum (ABDEL-SHAFY; ZAYED, 2002).
Em R. decoloratus, o uso do óleo de neem em concentrações que variaram de 20 a 100% se
mostrou eficaz, gerando mortalidade em todos os casos (CHOUDHURY, 2009). O neem também demonstrou significativo potencial acaricida no controle do carrapato bovino, R.
microplus, ocasionando mortalidade nos primeiros dias após tratamento, interferindo na
reprodução e gerando alterações na oviposição, com efeitos comparáveis a alguns piretróides sintéticos (SRIVASTAVA et al., 2008; BROGLIO-MICHELETTI et al., 2010).
grânulos protéicos também foram detectadas (DENARDI et al., 2011). Ultraestruturalmente, Denardi et al. (2012) observaram ovócitos jovens com morfologia irregular, aumento no número de mitocôndrias alteradas, desorganização no retículo endoplasmático rugoso (RER), além da presença de vacúolos autofágicos e de figuras mielínicas. Os ovócitos maduros, por sua vez, apresentaram redução no número e no comprimento das microvilosidades em contato com o pedicelo, desorganização de cisternas do RER, alterações mitocondriais e no córion, bem a presença de vacúolos autofágicos no citoplasma.
Ao contrário dos produtos comerciais, os compostos provenientes do neem são responsáveis por alterações vitais extremamente sutis, que podem impedir o artrópode de se reproduzir ou mesmo de realizar a metamorfose, prejudicando assim suas gerações futuras (VIETMEYER, 1992). Como apresenta uma grande quantidade de modos de ação, é menos provável que seja desenvolvida resistência aos compostos derivados do neem, em comparação aos produtos químicos sintéticos (BRAHMACHARI, 2004), o que o torna extremamente adequado a um controle integrado de parasitas (SCHMUTTERER, 1990).
Provavelmente, a qualidade mais importante do neem é apresentar pouca ou nenhuma toxicidade aos animais de sangue quente (VIETMEYER, 1992). Nenhum efeito adverso nas funções reprodutivas e desenvolvimento pós-natal foi observado em ratos alimentados com ração enriquecida com azadiractina (SRIVASTAVA; RAIZADA, 2007). Aves e morcegos comem a polpa doce dos frutos do neem, sem efeitos prejudiciais aparentes (VIETMEYER, 1992). A administração oral de azadiractina a ratos machos e fêmeas também não demonstrou efeitos tóxicos nem mortalidade, sendo aparentemente bem tolerada em altas doses (RAIZADA et al., 2001). Quando aplicado sobre a pele de ratos, os extratos da semente de neem não ocasionaram anormalidades no sistema circulatório (VIETMEYER, 1992). Além disso, o extrato aquoso da polpa da semente do neem também se mostrou atóxico em ratos (SCHMUTTERER, 1990).
II. OBJETIVO
Este trabalho teve como objetivo avaliar as alterações morfológicas provocadas pela aplicação tópica do óleo extraído das sementes de neem (Azadirachta indica), em diferentes concentrações, no ovário e glândulas salivares de fêmeas semi-ingurgitadas de carrapatos
Rhipicephalus sanguineus, por meio de técnicas em microscopia de luz convencional,
III. Capítulo 1
EFEITOS MORFOLÓGICOS DO ÓLEO DA SEMENTE DE NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS) COM CONCENTRAÇÕES CONHECIDAS DE AZADIRACTINA NOS OVÓCITOS DE FÊMEAS SEMI‐
INGURGITADAS DE RHIPICEPHALUS SANGUINEUS (ACARI: IXODIDAE).
Morphological effects of neem (Azadirachta indica A. Juss) seed oil with known azadirachtin concentrations on the oocytes of semi‐engorged Rhipicephalus sanguineus ticks (Acari: Ixodidae).
REMEDIO, R.N.; NUNES, P.H.; ANHOLETO, L.A.; OLIVEIRA, P.R.; CAMARGO‐MATHIAS, M.I.
Artigo submetido ao Periódico Parasitology Research SITUAÇÃO: Aceito para publicação
1.1. RESUMO
A preocupação com os efeitos prejudiciais causados pelos pesticidas sintéticos tem levado à busca por alternativas seguras e ecológicas para o controle de pragas. Neste contexto, o neem (Azadirachta indica) se destaca, devido às suas propriedades repelentes e seus efeitos em diversos artrópodes, incluindo os carrapatos. Por este motivo, este estudo teve como objetivo demonstrar o potencial do neem como método de controle para carrapatos
Rhipicephalus sanguineus, importantes vetores de doenças do ponto de vista veterinário. Para
isso, fêmeas semi-ingurgitadas de R. sanguineus foram submetidas ao tratamento com o óleo da semente de neem enriquecido com azadiractina, seu componente principal, e seus ovários avaliados por meio de técnicas morfológicas em microscopia de luz convencional, microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão. O neem demonstrou um efeito claramente dose-dependente nas amostras analisadas. Os ovócitos observados apresentaram, principalmente nos grupos tratados com as maiores concentrações do óleo de neem, sinais evidentes de desorganização citoplasmática, vacuolização celular, irregularidade nuclear e nucleolar, dilatação das cristas e alterações na matriz mitocondrial além de inchaço das cisternas do retículo endoplasmático rugoso. Em todos os grupos analisados, foi observada a presença de microorganismos intracelulares nos ovócitos, reforçando importância da participação de carrapatos na transmissão de patógenos. Tais alterações morfológicas indicam futuros prejuízos no desempenho reprodutivo destes animais e comprovam o potencial do óleo da semente de neem no controle de carrapatos R.
1.2. ABSTRACT
The concern about the harmful effects caused by synthetic pesticides has led to the search for safe and ecological alternatives for pest control. In this context, the neem tree
(Azadirachta indica) stands out due to its repellent properties and effects on various
1.3. INTRODUÇÃO
Atualmente, os carrapatos são alvos de grande preocupação devido à sua natureza parasítica e elevada capacidade de transmitir organismos patogênicos, estando entre os mais importantes vetores de doenças que afetam a pecuária, os humanos e os animais de companhia, além de causarem condições tóxicas severas como paralisia, toxicose, irritação e alergia (OLIVER, 1989; JONGEJAN, UILENBERG, 2004; DANTAS-TORRES, 2010). Entre as espécies envolvidas na transmissão de patógenos aos cães, os carrapatos
Rhipicephalus sanguineus são considerados os mais importantes do ponto de vista veterinário
(DANTAS-TORRES, 2010). Muitas destas doenças por eles transmitidas podem, inclusive, acometer os seres humanos (OYAFUSO et al., 2002).
Em virtude disso, diversos métodos de controle têm sido desenvolvidos para inúmeras espécies de carrapatos, com variadas formulações e tipos de aplicações. Atualmente, o controle de carrapatos pode ser realizado por uma grande variedade de acaricidas sintéticos, que eliminam as infestações e previnem reinfestações durante certo período de tempo (BLAGBURN; DRYDEN, 2009). No entanto, o uso indiscriminado de acaricidas comerciais é um problema emergente, ocasionando seleção de linhagens de carrapatos resistentes, toxicidade aos seres humanos e hospedeiros, além de prejuízos ao meio ambiente (BLAGBURN, DRYDEN, 2009; ROSADO-AGUILAR et al., 2010). Os efeitos adversos dos pesticidas sintéticos e a necessidade por alternativas ecologicamente seguras no controle de pragas têm levado à busca por produtos oriundos de plantas, contexto dentro do qual o neem
(Azadirachta indica A. Juss) se destaca como uma das plantas com mais elevado potencial de
controle (RAIZADA et al., 2001; BRAHMACHARI, 2004).
Em carrapatos, o uso do neem mostrou efeitos significativos no controle de
Amblyomma variegatum (NDUMU et al., 1999), Hyalomma dromedarii (AL-RAJHY et al.,
2003), H. anatolicum excavatum (ABDEL-SHAFY; ZAYED, 2002), Rhipicephalus
BROGLIO-MICHELETTI et al., 2010) e R. sanguineus (DENARDI et al., 2010, 2011, 2012), alterando processos reprodutivos ou mesmo gerando mortalidade.
Entre os inúmeros princípios ativos presentes na espécie A. indica, a azadiractina é considerada como o mais importante e efetivo, presente de forma predominante nas sementes, folhas e outras partes da árvore do neem (SCHMUTTERER, 1990; BRAHMACHARI, 2004). Apresenta um amplo espectro de ação, incluindo desregulação do crescimento, redução do nível de ecdisona, indução de mudanças no desenvolvimento e reprodução, além de prejuízos nos processos de muda (VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004).
A análise morfológica, avaliada a partir de técnicas em microscopia, tem sido particularmente útil em análises toxicológicas, permitindo a observação de aberrações cromossômicas, ocorrência de micronúcleos, anormalidades nucleares, alterações histopatológicas, efeitos genotóxicos e mutagênicos, além de alterações em organelas citoplasmáticas (FONTANETTI et al., 2010). Neste sentido, o uso da morfologia na dinâmica da vitelogênese em fêmeas de ectoparasitas tem sido uma ferramenta de grande importância, já que fornece informações que contribuem para o desenvolvimento de estudos que acessam o potencial citotóxico de agentes químicos nas células germinativas (ROMA et al., 2010b).
1.4. MATERIAL E MÉTODOS
1.4.1. Carrapatos R. sanguineus
Fêmeas e machos em jejum foram obtidos diretamente da colônia mantida em estufa BOD (Biological Oxygen Demand) sob condições controladas (25 ± 1°C, 80% de umidade, com fotoperíodo de 12 horas), no Biotério do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus de Rio Claro/SP, Brasil.
1.4.2. Azadirachta indica (neem)
O óleo de neem foi fornecido pelo Prof. Dr. Moacir Rossi Forim, da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), campus São Carlos/SP, Brasil. Sementes de neem (2,5 kg) foram trituradas em um moinho Tecnal TE 631/2, submetidas a um processo de extração em hexano (5 extrações com duração de 3 dias cada), a fim de se obter o óleo utilizado neste experimento. Em seguida, as sementes passaram por um processo de extração metanólica por meio de um Ultra-Turrax T-20 (3 extrações sequenciais). Após filtração, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, fornecendo um extrato rico em azadiractina, que foi subsequentemente misturado com o óleo previamente obtido a fim de enriquecê-lo com azadiractina. A medida da concentração de azadiractina no extrato bruto do óleo de neem foi realizada a partir dos mesmos procedimentos descritos por Forim et al. (2010). A concentração de 1000 partes por milhão (ppm) de azadiractina no extrato bruto foi determinada, e a partir deste óleo as diluições utilizadas neste experimento foram realizadas.
1.4.3. Procedimentos experimentais
- Preparação das diluições do óleo de neem
concentrações específicas de azadiractina: 200 ppm (20%), 400 ppm (40%) e 600 ppm (60%). As soluções foram misturadas em agitador magnético e aplicadas topicamente nos carrapatos. As diluições foram realizadas diariamente durante o desenvolvimento do experimento, e mantidas em um recipiente protegido da luz, a fim de se evitar alterações em suas propriedades acaricidas.
- Bioensaio
Um total de 60 casais de R. sanguineus foi liberado no interior de câmaras especiais de alimentação no dorso de coelhas brancas da raça Nova Zelândia, sem exposição prévia a infestações de carrapatos, segundo metodologia descrita por Bechara et al. (1995). Cinco coelhas foram utilizadas neste experimento, uma para cada grupo experimental (CI, CII, TI, TII e TIII). Os procedimentos para a aplicação das diluições do neem foram realizados no interior destas câmaras alimentadoras, durante o ingurgitamento das fêmeas.
Cinco grupos experimentais foram estabelecidos: Grupos Controle (CI e CII) e Grupos de Tratamento (TI, TII e TIII). Nos Grupos de Tratamento, as soluções de neem foram aplicadas topicamente com um pincel macio nos carrapatos fixados no dorso das coelhas por três dias, duas vezes ao dia. As aplicações se iniciaram 24 horas após a fixação dos carrapatos nos hospedeiros, nas concentrações de 20% (TI), 40% (TII) e 60% (TIII). Os carrapatos dos Grupos Controle (CI e CII) foram submetidos ao mesmo procedimento, com aplicações de água destilada e solução aquosa de etanol a 10%, respectivamente. Aproximadamente 5 mL de solução foi utilizada em cada aplicação. No quarto dia de infestação, fêmeas semi-ingurgitadas foram coletadas e mantidas sob condições controladas em estufa BOD antes de serem dissecadas para a remoção das amostras. Os carrapatos coletados foram dissecados sob estereomicroscópio Leica EZ4 em placas de Petri contendo solução de tampão fosfato-salino (PBS: NaCl 0.13M, Na2HPO4 0.017M, KH2PO4 0.02M, pH 7.2), para a remoção das amostras
de ovário.
1.4.4. Análise morfológica
- Microscopia de luz convencional (MLC)
Para a análise histológica, o material coletado foi imediatamente fixado em solução de paraformaldeído a 4% por 72 horas e, então, transferido para solução de tampão fosfato de sódio (pH 7.2) por 24 horas. As amostras foram subsequentemente submetidas à desidratação em uma série gradativa de álcool etílico (70, 80, 90 e 95%, por 20 minutos cada), infiltração
overnight em historesina Leica, seguidas de polimerização com historesina Leica adicionada a
um agente polimerizador.
Os blocos de resina contendo o material foram seccionados em micrótomo Leica RM2255 (3µm) e as secções submetidas à coloração com a técnica de hematoxilina-eosina (H-E), para a observação e descrição da morfologia geral do tecido (JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983). As lâminas histológicas obtidas foram montadas em bálsamo do Canadá sintético e o material foi fotografado em fotomicroscópio Leica DM150, equipado com câmera Leica ICC50 HD, por meio do software Leica LAS v.3.8, nas dependências do Laboratório de Histologia, UNESP, Rio Claro, Brasil.
- Microscopia confocal de varredura a laser (MCVL)
- Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Para a análise ultraestrutural, as amostras foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0.1 M (pH 7.2), durante 72 horas. Em seguida, foram realizadas duas lavagens em tampão cacodilato de sódio 0.1M, com duração de 15 minutos cada e, logo depois, foi realizada a pós-fixação em solução de tetróxido de ósmio (OsO4) a 1%, durante
duas horas. As amostras foram novamente lavadas em tampão cacodilato de sódio por duas vezes de 15 minutos e imersas em etanol aquoso a 10% por 15 minutos. O material foi contrastado em solução de acetato de uranila a 1%, dissolvido em álcool 10%, por 24 horas, no escuro, sendo, em seguida, desidratado em uma série gradativa de acetona (de 50 a 100%). Posteriormente, o material foi embebido em resina Epon-Araldite mais acetona, na proporção de 1:1, por 24 horas, incluído em resina pura e levado à estufa por 72 horas, a 60ºC, para polimerização.
1.5. RESULTADOS
A avaliação histológica do ovário de carrapatos R. sanguineus revelou a presença de ovócitos nos estágios I e II, e também na transição entre eles. No entanto, as observações em fluorescência e ultraestrutura apenas permitiram a visualização dos ovócitos em transição do tipo I para o tipo II, o que não afetou a análise dos resultados. As características histológicas e ultraestruturais dos ovócitos em estágio de transição (I/II) foram esquematizadas para cada grupo experimental, conforme demonstrado na Fig.1.
1.5.1. Microscopia de Luz Convencional (MLC)
posteriormente como microorganismos intracelulares a partir das observações em fluorescência e ultraestrutura.
Os indivíduos pertencentes ao grupo CII revelaram as mesmas características observadas no grupo CI. No entanto, nos ovócitos I (Fig. 2C) e II (Fig. 2D) foram observados nucléolos fortemente basófilos, com aparência mais condensada e menos granular.
No grupo TI, os ovócitos do tipo I (Fig. 2E) apresentaram características semelhantes às dos indivíduos controle. Os ovócitos do tipo II (Fig. 2F) também demonstraram morfologia semelhante ao controle. Entretanto, puderam ser observadas finas granulações acidófilas no citoplasma, com coloração rósea clara. Em ambos os ovócitos, microorganismos foram detectados em grande quantidade, geralmente envolvidos por um halo esbranquiçado.
No grupo TII, os ovócitos do tipo I (Fig. 2G) apresentaram poucas variações com relação ao grupo TI. Os ovócitos do tipo II (Fig. 2H), por sua vez, apresentaram alterações mais relevantes. O citoplasma demonstrou regiões não coradas, muito evidentes, embora em pequena quantidade, representando possíveis áreas de vacuolização. O núcleo apresentou morfologia levemente irregular. Foram observados microorganismos em ambos os ovócitos, em grande quantidade, com regiões esbranquiçadas ao seu redor.
No grupo TIII, os ovócitos do tipo I (Fig. 2I) demonstraram áreas citoplasmáticas com características acidófilas que foram visualizadas em quantidade proporcionalmente maior em relação ao resto do citoplasma. Nos ovócitos do tipo II (Fig. 2J), contudo, foram observadas alterações mais intensas. A composição do citoplasma apresentou-se claramente diferente da observada nos indivíduos controle, com evidente desorganização. Regiões de maior acidofilia foram observadas, além de regiões de vacuolização que formaram áreas sem coloração. O envoltório nuclear demonstrou leve irregularidade, além de redução na intensidade de coloração com a hematoxilina. Em muitos ovócitos, foram constatados vacúolos ou halos mais claros no interior dos nucléolos. Em ambos os tipos de ovócitos, grandes grupos de microorganismos foram observados, com regiões visivelmente vacuolizadas ao seu redor, característica não observada em nenhum outro grupo.
1.5.2. Microscopia Confocal de Varredura a Laser (MCVL)
marcou a presença de filamentos de actina. Estas apenas foram marcadas ao redor dos ovócitos, possivelmente pertencendo às células da parede do ducto ovariano ou do pedicelo.
Nos indivíduos do grupo TI (Fig. 3E,F), o citoplasma dos ovócitos foi marcado em menor intensidade pelo iodeto de propídeo e os limites citoplasmáticos foram fortemente marcados pela faloidina, demonstrando irregularidade na superfície do ovócito. Os microorganismos, em geral na periferia celular, foram evidenciados pelo iodeto de propídeo, apresentando forte marcação em vermelho.
Os ovócitos dos indivíduos do grupo TII (Fig. 3G,H) apresentaram semelhança com os do grupo TI. Os limites celulares também se mostraram irregulares, com forte marcação pela faloidina. Em comparação com o grupo TI, uma proporção aparentemente maior de microorganismos, marcados em vermelho, pôde ser visualizada.
Nos ovócitos dos indivíduos do grupo TIII (Fig. 3I,J), as marcações do citoplasma e do núcleo se mantiveram semelhantes às dos grupos TI e TII, bem como a irregularidade do limite celular, fortemente marcada pela faloidina. No entanto, a maior parte das células demonstrou a presença de nucléolos com áreas arredondadas menos marcadas, correspondentes aos vacúolos ou halos encontrados na análise histológica. A presença de microorganismos foi aparentemente semelhante ao grupo TII, sendo maior em alguns casos.
1.5.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
membranas ao seu redor. Elas se encontravam inseridas em uma região completamente eletrolúcida (“halo zone”), na qual diversos corpos multilamelares, formados por círculos concêntricos de membranas, estavam presentes. No citosol também foram visualizados corpos multivesiculares, formados por numerosas estruturas pequenas e arredondadas no interior de uma grande vesícula. A lâmina basal demonstrou eletrondensidade relativamente parecida com a do citosol, embora com aspecto mais granular (Fig. 4C e 5B).
Nos ovócitos dos indivíduos pertencentes ao grupo TI, o citosol demonstrou leve desorganização, com o aparecimento de regiões vacuolizadas e redução aparente na eletrondensidade (Fig. 6A,C-E). Os microorganismos também foram observados, geralmente com grandes espaços eletronlúcidos ao redor da “halo zone”, de maneira semelhante a um processo de vacuolização citoplasmática (Fig. 6B,F).
Nos ovócitos dos indivíduos pertencentes ao grupo TII, por toda a extensão do citosol, muitas regiões de desorganização e vacuolização citoplasmática foram frequentemente evidenciadas, na forma de espaços fortemente eletronlúcidos e irregulares, nos quais não foi possível a observação de organelas (Fig. 7A-C). As organelas não demonstraram uniformidade em suas características. Em alguns casos, cisternas dilatadas do RER foram observadas (Fig. 7D). Além disso, muitos ovócitos apresentaram mitocôndrias visivelmente alteradas, com evidente dilatação dos espaços intermembranosos, especificamente no interior das cristas mitocondriais, além do aumento da eletrondensidade da matriz mitocondrial (Fig. 7E). Grandes regiões de vacuolização e desorganização citoplasmática puderam ser observadas ao redor dos microorganismos, de maneira semelhante ao grupo TI (Fig. 7F).
1.6. DISCUSSÃO
Substâncias com propriedades pesticidas podem ser encontradas em praticamente todas as partes da árvore do neem (Azadirachta indica), embora a maior concentração encontre-se nas sementes (BRAHMACHARI, 2004). Desta forma, insetos e outras pragas de interesse agrícola, médico e veterinário podem ser controlados por meio de repulsão, inibição da alimentação ou mesmo morte (ATAWODI; ATAWODI, 2009), além de prejuízos reprodutivos e no desenvolvimento (VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004). Somado a isso, o óleo extraído das sementes de neem é capaz de revestir o corpo do animal, podendo bloquear as aberturas traqueais e sufocá-lo (BRAHMACHARI, 2004). Os produtos derivados do neem não levam necessariamente os indivíduos à morte, mas causam alterações extremamente sutis que geram danos ao seu sucesso biológico (VIETMEYER, 1992).
Dentro deste contexto, as modificações estruturais observadas nas células do sistema reprodutor podem fornecer importantes informações que porventura não possam ser detectadas a partir de outros métodos de estudo. Isso é particularmente visível em muitos trabalhos que avaliaram os efeitos morfológicos de substâncias com potencial acaricida em carrapatos, especialmente da espécie Rhipicephalus sanguineus, em vista de sua grande importância veterinária. Compostos sintéticos, como o fipronil (OLIVEIRA et al., 2008, 2009) e a permetrina (ROMA et al., 2010a,b, 2011), e naturais, como o óleo de andiroba (VENDRAMINI et al., 2012; ROMA et al., 2013a), os ésteres do ácido ricinoléico do óleo de mamona (ARNOSTI et al., 2011; SAMPIERI et al., 2012) e os extratos foliares de neem (DENARDI et al., 2010, 2011, 2012), causaram alterações estruturais expressivas no sistema reprodutor destes carrapatos, como irregularidade dos ovócitos, vacuolização citoplasmática, alterações nas organelas, danos nucleares e nucleolares, modificações na síntese de vitelo, entre outros.
alterações que inibem a reprodução (VIETMEYER, 1992). Ao se considerar uma aplicação tópica do produto nos carrapatos R. sanguineus, pode-se supor que os agentes tóxicos tenham atravessado seu sistema tegumentar e penetrando na hemolinfa, de onde foram transmitidos aos órgãos internos. Assim como o ovário, também outros órgãos podem ter sido afetados, direta ou indiretamente. Se considerada a grande quantidade de azadiractina nos extratos utilizados, e tendo-se em vista sua importância no âmbito do controle de espécies de artrópodes (SCHMUTTERER, 1990; VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004), pode-se inferir que grande parte dos efeitos aqui encontrados deva-pode-se à ação destas moléculas.
O que se observou, no presente estudo, foi um efeito nitidamente dose-dependente do óleo de neem sobre o sistema reprodutivo de R. sanguineus, comprovado pela utilização de diferentes técnicas em microscopia. Desta forma, os prejuízos morfológicos visualizados em concentrações mais elevadas foram mais evidentes, podendo indicar alterações no futuro desenvolvimento e viabilidade dos embriões. A aplicação de extratos aquosos de folhas de neem em carrapatos R. sanguineus nas concentrações de 10 e 20% também demonstrou evidentes efeitos histológicos dose-dependentes no ovário (DENARDI et al., 2010), embora este fato não tenha sido comprovado em análise histoquímica e ultraestrutural (DENARDI et al., 2011, 2012). A grande quantidade de azadiractina no óleo enriquecido de neem, bem como sua composição química, podem ter sido responsáveis pelas diferenças observadas em relação aos extratos foliares.
De acordo com o aspecto citoplasmático, localização do núcleo, quantidade e constituição dos grânulos de vitelo e a presença do córion, os ovócitos podem ser classificados em cinco tipos (OLIVEIRA et al., 2005; ROMA et al., 2013b). Na maior parte das observações aqui realizadas, os ovócitos foram visualizados nos estágios I, II ou na transição entre eles. Por este motivo, com a finalidade de facilitar o entendimento, estas alterações foram tratadas de forma geral na discussão, de modo que os efeitos do neem sobre os ovócitos como um todo, neste estágio alimentar, pudessem ser avaliados e discutidos. Tais efeitos tendem a ser progressivos, ou seja, se intensificam conforme o ovócito se desenvolve. Este fato fica evidente nos ovócitos do tipo II, cujos efeitos foram, em geral, mais intensos do que no tipo I.
não é claro, considerando-se que tal característica não tenha sido confirmada pelas imagens em fluorescência e ultraestrutura, nas quais apresentou aspecto completamente normal. Nenhuma outra alteração foi observada, e esta característica provavelmente não afetou o desenvolvimento dos ovócitos nestes carrapatos. Desta forma, pode-se sugerir que o uso do álcool etílico diluído a 10% em água não interferiu nos resultados obtidos pelo uso do neem, apenas auxiliando no processo de homogeneização e diluição deste óleo em solução aquosa.
Não ocorreram alterações nas características morfológicas do núcleo dos indivíduos tratados, com exceção do tratamento de maior concentração, em que se observou envoltório nuclear irregular, corroborando os resultados obtidos por Denardi et al. (2010, 2011), para os extratos foliares de neem em R. sanguineus. A irregularidade do envoltório nuclear foi também observada em ovócitos de R. sanguineus tratados com o acaricida sintético permetrina (ROMA et al., 2011), demonstrando que os efeitos aqui observados se assemelham ao de produtos reconhecidamente eficientes no controle de carrapatos.
O tratamento com óleo de neem em R. sanguineus foi responsável pelo aparecimento de regiões vacuolizadas no nucléolo de ovócitos do tipo II, indicativas de processos degenerativos que podem levar à morte da célula. Alterações semelhantes foram observadas em carrapatos R. sanguineus tratados com extratos foliares de neem, nos quais os nucléolos formaram uma massa compacta em forma de anel com um vacúolo central, observados em análise histológica e ultraestrutural, indicando um processo de morte celular (DENARDI et al., 2010, 2011). Tais alterações também foram relatadas em ovócitos de carrapatos R.
sanguineus tratados com permetrina (ROMA et al., 2010b) e óleo de andiroba
(VENDRAMINI et al., 2012), sugerindo a ocorrência de degeneração no material genético destas células, o que poderia afetar seu futuro desenvolvimento.
Estes vacúolos nucleolares foram detectados, na avaliação histológica, apenas nos ovócitos do tipo II dos indivíduos submetidos ao tratamento com maior concentração de óleo de neem. A observação em fluorescência pelo iodeto de propídeo, que permite a visualização dos ácidos nucléicos presentes na célula (SUZUKI et al., 1997), também evidenciou estas alterações. No entanto, em ultraestrutura, os nucléolos dos ovócitos não demonstraram modificações visíveis, sinalizando que estes efeitos estruturais sejam evidentes apenas em ovócitos em estágios mais avançados de desenvolvimento, já que os ovócitos observados em microscopia eletrônica ainda se encontravam em estágios intermediários entre os tipos I e II.
ácido ricinoléico (ARNOSTI et al., 2011), o óleo de andiroba (VENDRAMINI et al., 2012) e os extratos aquosos de neem (DENARDI et al., 2011, 2012). Na avaliação em microscopia confocal, contudo, os indivíduos pertencentes a todos os grupos demonstraram ovócitos com evidente irregularidade, possivelmente por se tratar de uma montagem total. Desta forma, estas características não foram consideradas como alterações resultantes do tratamento.
As preparações em fluorescência também permitiram a avaliação da arquitetura do citoesqueleto das células ovarianas pela faloidina, que se liga aos filamentos de actina (COOPER, 1987). A marcação intensa na periferia dos ovócitos dos indivíduos tratados pode indicar uma possível alteração na composição e presença de elementos do citoesqueleto nestas células, e já foi ultraestruturalmente demonstrada em carrapatos R. sanguineus tratados com extratos aquosos de neem, que apresentaram elementos desorganizados do citoesqueleto, especialmente na concentração de 10% (DENARDI et al., 2012).
Os prejuízos morfológicos observados neste trabalho são fortes indícios de que alguns dos componentes do neem geraram efeitos diretos sobre os ovócitos. Na literatura, existem duas vertentes principais que explicam a possível rota de entrada de compostos químicos, sintéticos e naturais, para o interior destas células. Eles podem atravessar diretamente a parede do ovócito (OLIVEIRA et al., 2009; VENDRAMINI et al., 2012) ou serem transferidos a eles a partir das células do pedicelo (ROMA et al., 2010a, 2011; DENARDI et al., 2010, 2011). No caso dos compostos do óleo de neem, não se sabe ao certo de que forma as substâncias estariam sendo absorvidas. No entanto, sugere-se que, assim como constatado em R.
sanguineus expostos ao fipronil (OLIVEIRA et al., 2009) e ao óleo de andiroba
(VENDRAMINI et al., 2012), a vulnerabilidade dos ovócitos em estágios iniciais de desenvolvimento pode elevar a probabilidade de que os princípios ativos do neem tenham atravessado diretamente sua parede. Possivelmente, a lâmina basal e a membrana plasmática foram atravessadas sem, contudo, sofrerem nenhum efeito prejudicial evidente em microscopia. Nos estágios analisados, ainda não se observa a deposição do córion, membrana que protege os ovos contra choques mecânicos, variações de temperatura e desidratação, além de auxiliar nas trocas gasosas (OLIVEIRA et al., 2008). Sua deposição se inicia nos ovócitos em estágio III e termina no estágio IV do desenvolvimento ovariano (COONS; ALBERTI, 1999), e resulta em uma proteção extra à entrada de substâncias estranhas aos ovócitos (OLIVEIRA et al., 2009).
As regiões de vacuolização, observadas na análise histológica dos ovócitos de R.
sanguineus, foram visualizadas em ultraestrutura na forma de porções completamente
grandes prejuízos na célula como um todo. Estas características mostraram-se mais intensas conforme se elevou a concentração do produto aplicado. Efeitos ultraestruturais semelhantes foram também observados em R. sanguineus expostos ao fipronil (OLIVEIRA et al., 2009), permetrina (ROMA et al., 2010b) e aos extratos foliares de neem (DENARDI et al., 2012). Estas regiões podem se tratar de porções danificadas do citosol ou mesmo regiões nas quais os componentes citoplasmáticos estão sendo degradados ou reciclados por meio de processos autofágicos, a fim de manter a integridade celular e garantir a viabilidade do ovócito (ROMA et al., 2011; DENARDI et al., 2012). De forma descontrolada, tais mecanismos podem futuramente levar à morte celular autofágica, uma forma de morte celular programada morfologicamente distinta da apoptose (LEVINE; YUAN, 2005).
Nos ovócitos de carrapatos R. sanguineus tratados com fipronil (OLIVEIRA et al., 2009) e extratos foliares de neem (DENARDI et al., 2012), as mitocôndrias apresentaram morfologia irregular, com cristas desorganizadas ou ausentes. Alterações mitocondriais também foram observadas nos ovócitos dos indivíduos tratados com o óleo de neem. Estes danos podem, futuramente, levar a prejuízos energéticos capazes de afetar o metabolismo destas células, considerando-se sua grande demanda energética para a produção do vitelo. Este fato, aliado às alterações no retículo endoplasmático rugoso (RER), podem afetar drasticamente a vitelogênese ao longo do desenvolvimento embrionário. As alterações observadas nestas organelas podem, inclusive, ser indicativas de processo de morte celular (OLIVEIRA et al., 2009; DENARDI et al., 2012).
hipótese, já que estas estruturas foram fortemente marcadas pelo iodeto de propídeo, que evidencia a presença de material genético (SUZUKI et al., 1997).
1.7. CONCLUSÃO
1.8. BIBLIOGRAFIA
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IV. Capítulo 2
EFEITOS MORFOLÓGICOS DO ÓLEO DA SEMENTE DE NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS) COM CONCENTRAÇÕES CONHECIDAS DE AZADIRACTINA NAS GLÂNDULAS SALIVARES DE
FÊMEAS SEMI‐INGURGITADAS DE RHIPICEPHALUS SANGUINEUS (ACARI: IXODIDAE).
Morphological effects of neem (Azadirachta indica A. Juss) seed oil with known azadirachtin concentrations on the salivary glands of semi‐engorged Rhipicephalus sanguineus ticks
(Acari: Ixodidae).
REMEDIO, R.N.; NUNES, P.H.; ANHOLETO, L.A.; CAMARGO‐MATHIAS, M.I.
Artigo submetido ao Periódico Ticks and Tick‐borne Diseases SITUAÇÃO: Em análise
2.1. RESUMO
2.2. ABSTRACT
2.3. INTRODUÇÃO
O contato íntimo e prolongado entre os carrapatos ixodídeos e seus hospedeiros é possível graças às secreções das glândulas salivares, órgãos multifuncionais notavelmente versáteis, vitais para o sucesso biológico destes animais (SAUER et al., 1995). As glândulas salivares são estruturas pares, responsáveis pela atividade osmorreguladora durante o período de jejum e pela eliminação de fluidos do sangue ao longo da alimentação, além de produzirem enzimas e inibidores de enzimas, agentes anticoagulantes e antiplaquetários, cemento para o cone de fixação, fatores imunomoduladores, prostaglandinas, agonistas e antagonistas de histamina, bem como toxinas paralisantes (FAWCETT et al., 1986; SAUER et al., 1995; SAUER et al., 2000). Além disso, são sítios de desenvolvimento de alguns microorganismos, o que torna os carrapatos capazes de transmitirem uma grande variedade de doenças (SAUER et al., 1995, 2000).
Entre as espécies envolvidas na transmissão de agentes infecciosos aos cães, R.
sanguineus é, sem dúvida, a mais importante do ponto de vista veterinário
(DANTAS-TORRES, 2010). Estes carrapatos são vetores de importantes patógenos e podem ser encontrados em cães que vivem tanto em áreas urbanas quanto rurais, estando altamente adaptados a viverem em habitações humanas (BLAGBURN, DRYDEN, 2009; DANTAS-TORRES, 2010). Embora os cães sejam seus hospedeiros preferenciais, carrapatos R.
sanguineus podem, ocasionalmente, parasitar uma grande variedade de animais domésticos e
selvagens (DANTAS-TORRES et al., 2006; BLAGBURN, DRYDEN, 2009), tendo sido encontrados, inclusive, em seres humanos (CARPENTER et al., 1990; MANFREDI et al., 1999; USPENSKY, IOFFE-USPENSKY, 2002).
2012). No entanto, tais produtos são tóxicos, causam poluição ambiental e apresentam alto custo (JONJEJAN; UILENBERG, 2004), além de promoverem a seleção de linhagens de carrapatos resistentes (BLAGBURN, DRYDEN, 2009; ROSADO-AGUILAR et al., 2010).
Substâncias obtidas a partir de extratos vegetais, contudo, têm baixo custo, poucos efeitos residuais e baixa incidência de desenvolvimento de resistência (ROSADO-AGUILAR et al., 2010). Neste sentido, o uso das folhas, frutos e sementes do neem (Azadirachta indica) tem se intensificado, em virtude da presença de diversos princípios biologicamente ativos que atuam de forma distinta dos acaricidas sintéticos (VIETMEYER, 1992; ATAWODI, ATAWODI, 2009). A azadiractina é considerada seu princípio ativo mais importante e predominante, apresentando amplo espectro de ação, que inclui alterações no crescimento e na reprodução dos artrópodes (VIETMEYER, 1992; SCHMUTTERER, 1990; BRAHMACHARI, 2004).
Sob diferentes formulações, os extratos de neem demonstraram efeitos expressivos no controle de inúmeras espécies de carrapatos, entre elas Hyalomma anatolicum excavatum (ABDEL-SHAFY; ZAYED, 2002), R. (Boophilus) decoloratus (CHOUDHURY, 2009) e R.
(Boophilus) microplus (SRIVASTAVA et al., 2008; BROGLIO-MICHELETTI et al., 2010).
Além disso, em carrapatos R. sanguineus, os extratos aquosos de folhas de neem demonstraram significativas alterações morfológicas nos ovários (DENARDI et al., 2010, 2011, 2012), singânglio e integumento (REMEDIO et al., 2014).
2.4. MATERIAL E MÉTODOS
2.4.1. Carrapatos R. sanguineus
Fêmeas e machos em jejum foram obtidos diretamente da colônia mantida em estufa BOD (Biological Oxygen Demand) sob condições controladas (25 ± 1°C, 80% de umidade, com fotoperíodo de 12 horas), no Biotério do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus de Rio Claro/SP, Brasil.
2.4.2. Azadirachta indica (neem)
As sementes de neem (2,5 kg) foram trituradas em um moinho Tecnal TE 631/2, submetidas a um processo de extração em hexano (5 extrações com duração de 3 dias cada), a fim de se obter o óleo utilizado neste experimento. Em seguida, as sementes passaram por um processo de extração metanólica por meio de um Ultra-Turrax T-20 (3 extrações sequenciais). Após filtração, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, fornecendo um extrato rico em azadiractina, que foi subsequentemente misturado com o óleo previamente obtido a fim de enriquecê-lo com azadiractina. A medida da concentração de azadiractina no extrato bruto do óleo de neem foi realizada a partir dos mesmos procedimentos descritos por Forim et al. (2010). A concentração de 1000 partes por milhão (ppm) de azadiractina no extrato bruto foi determinada, e a partir deste óleo as diluições utilizadas neste experimento foram realizadas.
2.4.3. Procedimentos experimentais
- Preparação das diluições do óleo de neem
As diluições foram realizadas diariamente durante o desenvolvimento do experimento, e mantidas em um recipiente protegido da luz, a fim de se evitar alterações em suas propriedades acaricidas.
- Bioensaio
Um total de 60 casais de R. sanguineus foi liberado no interior de câmaras especiais de alimentação no dorso de coelhas New Zealand White, sem exposição prévia a infestações de carrapatos, segundo metodologia descrita por Bechara et al. (1995). Cinco coelhas foram utilizadas neste experimento, uma para cada grupo experimental (CI, CII, TI, TII e TIII). Os procedimentos para a aplicação das diluições do neem foram realizados no interior destas câmaras alimentadoras, durante o ingurgitamento das fêmeas.
Cinco grupos experimentais foram estabelecidos: Grupos Controle (CI e CII) e Grupos de Tratamento (TI, TII e TIII). Nos Grupos de Tratamento, as soluções de neem foram aplicadas topicamente com um pincel macio nos carrapatos fixados no dorso das coelhas por três dias, duas vezes ao dia. As aplicações se iniciaram 24 horas após a fixação dos carrapatos nos hospedeiros, nas concentrações de 20% (TI), 40% (TII) e 60% (TIII). Os carrapatos dos Grupos Controle (CI e CII) foram submetidos ao mesmo procedimento, com aplicações de água destilada e solução aquosa de etanol a 10%, respectivamente. Aproximadamente 5 mL de solução foi utilizada em cada aplicação. No quarto dia de infestação, fêmeas semi-ingurgitadas foram coletadas e mantidas sob condições controladas em estufa BOD antes de serem dissecadas para a remoção das amostras. Os carrapatos coletados foram dissecados sob estereomicroscópio Leica EZ4 em placas de Petri contendo solução de tampão fosfato-salino (PBS: NaCl 0.13M, Na2HPO4 0.017M, KH2PO4 0.02M, pH 7.2), para a remoção das amostras
de glândula salivares.
Todos os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animal (CEUA, UNESP, Rio Claro, Brasil), protocolo número 2206, decisão número 021/2012.
2.4.4. Análise morfológica
- Microscopia de luz convencional (MLC)
