Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

Não foram observadas diferenças entre os ovócitos dos indivíduos pertencentes aos grupos CI e CII. Os ovócitos observados demonstraram formato arredondado a elíptico, sem irregularidades na membrana plasmática, bem como no formato e tamanho do núcleo. Um a dois nucléolos foram observados, com aspecto granulado e eletrondenso. A cromatina geralmente foi observada de forma descondensada (Fig. 4A,D e 5A). Ao redor do núcleo, vários corpos eletrondensos, correspondentes às partículas basófilas observadas no citoplasma perinuclear em MLC, puderam ser observados (Fig. 4B). As mitocôndrias exibiram formato alongado, com matriz mitocondrial mais eletrondensa em comparação com o citoplasma, membranas interna e externa evidenciando o espaço intermembranoso, e cristas alongadas transversalmente em relação à organela (Fig. 4E e 5D,E). Em alguns ovócitos foi possível a visualização das cisternas do retículo endoplasmático rugoso (RER), bem preservadas e íntegras. Em algumas regiões do citosol, foi possível a visualização de estruturas arredondadas a ovaladas, maiores que as mitocôndrias e com eletrondensidade variável, identificadas como microorganismos intracelulares (Fig. 4F e 5C,F). Estas estruturas apresentaram uma mancha fortemente eletrondensa em seu interior, além de muitas

membranas ao seu redor. Elas se encontravam inseridas em uma região completamente eletrolúcida (“halo zone”), na qual diversos corpos multilamelares, formados por círculos concêntricos de membranas, estavam presentes. No citosol também foram visualizados corpos multivesiculares, formados por numerosas estruturas pequenas e arredondadas no interior de uma grande vesícula. A lâmina basal demonstrou eletrondensidade relativamente parecida com a do citosol, embora com aspecto mais granular (Fig. 4C e 5B).

Nos ovócitos dos indivíduos pertencentes ao grupo TI, o citosol demonstrou leve desorganização, com o aparecimento de regiões vacuolizadas e redução aparente na eletrondensidade (Fig. 6A,C-E). Os microorganismos também foram observados, geralmente com grandes espaços eletronlúcidos ao redor da “halo zone”, de maneira semelhante a um processo de vacuolização citoplasmática (Fig. 6B,F).

Nos ovócitos dos indivíduos pertencentes ao grupo TII, por toda a extensão do citosol, muitas regiões de desorganização e vacuolização citoplasmática foram frequentemente evidenciadas, na forma de espaços fortemente eletronlúcidos e irregulares, nos quais não foi possível a observação de organelas (Fig. 7A-C). As organelas não demonstraram uniformidade em suas características. Em alguns casos, cisternas dilatadas do RER foram observadas (Fig. 7D). Além disso, muitos ovócitos apresentaram mitocôndrias visivelmente alteradas, com evidente dilatação dos espaços intermembranosos, especificamente no interior das cristas mitocondriais, além do aumento da eletrondensidade da matriz mitocondrial (Fig. 7E). Grandes regiões de vacuolização e desorganização citoplasmática puderam ser observadas ao redor dos microorganismos, de maneira semelhante ao grupo TI (Fig. 7F).

Os efeitos mais expressivos foram observados no grupo TIII. Em alguns casos, núcleos com evidente irregularidade no envoltório nuclear puderam ser visualizados (Fig. 8A). Não foi observada a presença de nucléolos fragmentados ou com vacúolos conforme visualizado em MLC e MCVL. Muitas regiões de desorganização e vacuolização citoplasmática, visualizadas como porções não uniformes fortemente eletrolúcidas, foram evidenciadas em toda a extensão do citosol, de maneira semelhante ao grupo TII (Fig. 8B). Na maioria das vezes, dilatações evidentes nas cisternas do RER foram visualizadas (Fig. 8F), além de mitocôndrias com matriz fortemente eletrondensa e grandes dilatações no espaço intermembranoso das cristas mitocondriais (Fig. 8G,H). Foram encontrados grupos de três ou mais microorganismos intracelulares dispersos pelo citosol, da mesma forma que observado em MLC e MCVL. Ao seu redor, intensa vacuolização pôde ser observada (Fig. 8C-E).

1.6. DISCUSSÃO

Substâncias com propriedades pesticidas podem ser encontradas em praticamente todas as partes da árvore do neem (Azadirachta indica), embora a maior concentração encontre-se nas sementes (BRAHMACHARI, 2004). Desta forma, insetos e outras pragas de interesse agrícola, médico e veterinário podem ser controlados por meio de repulsão, inibição da alimentação ou mesmo morte (ATAWODI; ATAWODI, 2009), além de prejuízos reprodutivos e no desenvolvimento (VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004). Somado a isso, o óleo extraído das sementes de neem é capaz de revestir o corpo do animal, podendo bloquear as aberturas traqueais e sufocá-lo (BRAHMACHARI, 2004). Os produtos derivados do neem não levam necessariamente os indivíduos à morte, mas causam alterações extremamente sutis que geram danos ao seu sucesso biológico (VIETMEYER, 1992).

Dentro deste contexto, as modificações estruturais observadas nas células do sistema reprodutor podem fornecer importantes informações que porventura não possam ser detectadas a partir de outros métodos de estudo. Isso é particularmente visível em muitos trabalhos que avaliaram os efeitos morfológicos de substâncias com potencial acaricida em carrapatos, especialmente da espécie Rhipicephalus sanguineus, em vista de sua grande importância veterinária. Compostos sintéticos, como o fipronil (OLIVEIRA et al., 2008, 2009) e a permetrina (ROMA et al., 2010a,b, 2011), e naturais, como o óleo de andiroba (VENDRAMINI et al., 2012; ROMA et al., 2013a), os ésteres do ácido ricinoléico do óleo de mamona (ARNOSTI et al., 2011; SAMPIERI et al., 2012) e os extratos foliares de neem (DENARDI et al., 2010, 2011, 2012), causaram alterações estruturais expressivas no sistema reprodutor destes carrapatos, como irregularidade dos ovócitos, vacuolização citoplasmática, alterações nas organelas, danos nucleares e nucleolares, modificações na síntese de vitelo, entre outros.

Os princípios ativos do neem são absorvidos pelo corpo dos insetos e outros organismos como se fossem hormônios, em virtude de sua semelhança estrutural a estes compostos químicos, bloqueando o sistema endócrino e, desta forma, resultando em

alterações que inibem a reprodução (VIETMEYER, 1992). Ao se considerar uma aplicação tópica do produto nos carrapatos R. sanguineus, pode-se supor que os agentes tóxicos tenham atravessado seu sistema tegumentar e penetrando na hemolinfa, de onde foram transmitidos aos órgãos internos. Assim como o ovário, também outros órgãos podem ter sido afetados, direta ou indiretamente. Se considerada a grande quantidade de azadiractina nos extratos utilizados, e tendo-se em vista sua importância no âmbito do controle de espécies de artrópodes (SCHMUTTERER, 1990; VIETMEYER, 1992; BRAHMACHARI, 2004), pode- se inferir que grande parte dos efeitos aqui encontrados deva-se à ação destas moléculas.

O que se observou, no presente estudo, foi um efeito nitidamente dose-dependente do óleo de neem sobre o sistema reprodutivo de R. sanguineus, comprovado pela utilização de diferentes técnicas em microscopia. Desta forma, os prejuízos morfológicos visualizados em concentrações mais elevadas foram mais evidentes, podendo indicar alterações no futuro desenvolvimento e viabilidade dos embriões. A aplicação de extratos aquosos de folhas de neem em carrapatos R. sanguineus nas concentrações de 10 e 20% também demonstrou evidentes efeitos histológicos dose-dependentes no ovário (DENARDI et al., 2010), embora este fato não tenha sido comprovado em análise histoquímica e ultraestrutural (DENARDI et al., 2011, 2012). A grande quantidade de azadiractina no óleo enriquecido de neem, bem como sua composição química, podem ter sido responsáveis pelas diferenças observadas em relação aos extratos foliares.

De acordo com o aspecto citoplasmático, localização do núcleo, quantidade e constituição dos grânulos de vitelo e a presença do córion, os ovócitos podem ser classificados em cinco tipos (OLIVEIRA et al., 2005; ROMA et al., 2013b). Na maior parte das observações aqui realizadas, os ovócitos foram visualizados nos estágios I, II ou na transição entre eles. Por este motivo, com a finalidade de facilitar o entendimento, estas alterações foram tratadas de forma geral na discussão, de modo que os efeitos do neem sobre os ovócitos como um todo, neste estágio alimentar, pudessem ser avaliados e discutidos. Tais efeitos tendem a ser progressivos, ou seja, se intensificam conforme o ovócito se desenvolve. Este fato fica evidente nos ovócitos do tipo II, cujos efeitos foram, em geral, mais intensos do que no tipo I.

Os indivíduos pertencentes a ambos os grupos controle não apresentaram diferenças significativas entre si, e demonstraram morfologia correspondente às informações já anteriormente descritas para a espécie (OLIVEIRA et al., 2005; ROMA et al., 2013b). A análise histológica revelou, no entanto, diferenças nas características do nucléolo nos indivíduos submetidos ao etanol aquoso a 10%. O significado funcional desta mudança ainda

não é claro, considerando-se que tal característica não tenha sido confirmada pelas imagens em fluorescência e ultraestrutura, nas quais apresentou aspecto completamente normal. Nenhuma outra alteração foi observada, e esta característica provavelmente não afetou o desenvolvimento dos ovócitos nestes carrapatos. Desta forma, pode-se sugerir que o uso do álcool etílico diluído a 10% em água não interferiu nos resultados obtidos pelo uso do neem, apenas auxiliando no processo de homogeneização e diluição deste óleo em solução aquosa.

Não ocorreram alterações nas características morfológicas do núcleo dos indivíduos tratados, com exceção do tratamento de maior concentração, em que se observou envoltório nuclear irregular, corroborando os resultados obtidos por Denardi et al. (2010, 2011), para os extratos foliares de neem em R. sanguineus. A irregularidade do envoltório nuclear foi também observada em ovócitos de R. sanguineus tratados com o acaricida sintético permetrina (ROMA et al., 2011), demonstrando que os efeitos aqui observados se assemelham ao de produtos reconhecidamente eficientes no controle de carrapatos.

O tratamento com óleo de neem em R. sanguineus foi responsável pelo aparecimento de regiões vacuolizadas no nucléolo de ovócitos do tipo II, indicativas de processos degenerativos que podem levar à morte da célula. Alterações semelhantes foram observadas em carrapatos R. sanguineus tratados com extratos foliares de neem, nos quais os nucléolos formaram uma massa compacta em forma de anel com um vacúolo central, observados em análise histológica e ultraestrutural, indicando um processo de morte celular (DENARDI et al., 2010, 2011). Tais alterações também foram relatadas em ovócitos de carrapatos R.

sanguineus tratados com permetrina (ROMA et al., 2010b) e óleo de andiroba

(VENDRAMINI et al., 2012), sugerindo a ocorrência de degeneração no material genético destas células, o que poderia afetar seu futuro desenvolvimento.

Estes vacúolos nucleolares foram detectados, na avaliação histológica, apenas nos ovócitos do tipo II dos indivíduos submetidos ao tratamento com maior concentração de óleo de neem. A observação em fluorescência pelo iodeto de propídeo, que permite a visualização dos ácidos nucléicos presentes na célula (SUZUKI et al., 1997), também evidenciou estas alterações. No entanto, em ultraestrutura, os nucléolos dos ovócitos não demonstraram modificações visíveis, sinalizando que estes efeitos estruturais sejam evidentes apenas em ovócitos em estágios mais avançados de desenvolvimento, já que os ovócitos observados em microscopia eletrônica ainda se encontravam em estágios intermediários entre os tipos I e II.

Em geral, os ovócitos de R. sanguineus tratados com óleo de neem não demonstraram alterações na sua forma quando avaliados histológica e ultraestruturalmente, diferentemente do que foi observado em experimentos com outros compostos naturais, como os ésteres do

ácido ricinoléico (ARNOSTI et al., 2011), o óleo de andiroba (VENDRAMINI et al., 2012) e os extratos aquosos de neem (DENARDI et al., 2011, 2012). Na avaliação em microscopia confocal, contudo, os indivíduos pertencentes a todos os grupos demonstraram ovócitos com evidente irregularidade, possivelmente por se tratar de uma montagem total. Desta forma, estas características não foram consideradas como alterações resultantes do tratamento.

As preparações em fluorescência também permitiram a avaliação da arquitetura do citoesqueleto das células ovarianas pela faloidina, que se liga aos filamentos de actina (COOPER, 1987). A marcação intensa na periferia dos ovócitos dos indivíduos tratados pode indicar uma possível alteração na composição e presença de elementos do citoesqueleto nestas células, e já foi ultraestruturalmente demonstrada em carrapatos R. sanguineus tratados com extratos aquosos de neem, que apresentaram elementos desorganizados do citoesqueleto, especialmente na concentração de 10% (DENARDI et al., 2012).

Os prejuízos morfológicos observados neste trabalho são fortes indícios de que alguns dos componentes do neem geraram efeitos diretos sobre os ovócitos. Na literatura, existem duas vertentes principais que explicam a possível rota de entrada de compostos químicos, sintéticos e naturais, para o interior destas células. Eles podem atravessar diretamente a parede do ovócito (OLIVEIRA et al., 2009; VENDRAMINI et al., 2012) ou serem transferidos a eles a partir das células do pedicelo (ROMA et al., 2010a, 2011; DENARDI et al., 2010, 2011). No caso dos compostos do óleo de neem, não se sabe ao certo de que forma as substâncias estariam sendo absorvidas. No entanto, sugere-se que, assim como constatado em R.

sanguineus expostos ao fipronil (OLIVEIRA et al., 2009) e ao óleo de andiroba

(VENDRAMINI et al., 2012), a vulnerabilidade dos ovócitos em estágios iniciais de desenvolvimento pode elevar a probabilidade de que os princípios ativos do neem tenham atravessado diretamente sua parede. Possivelmente, a lâmina basal e a membrana plasmática foram atravessadas sem, contudo, sofrerem nenhum efeito prejudicial evidente em microscopia. Nos estágios analisados, ainda não se observa a deposição do córion, membrana que protege os ovos contra choques mecânicos, variações de temperatura e desidratação, além de auxiliar nas trocas gasosas (OLIVEIRA et al., 2008). Sua deposição se inicia nos ovócitos em estágio III e termina no estágio IV do desenvolvimento ovariano (COONS; ALBERTI, 1999), e resulta em uma proteção extra à entrada de substâncias estranhas aos ovócitos (OLIVEIRA et al., 2009).

As regiões de vacuolização, observadas na análise histológica dos ovócitos de R.

sanguineus, foram visualizadas em ultraestrutura na forma de porções completamente

grandes prejuízos na célula como um todo. Estas características mostraram-se mais intensas conforme se elevou a concentração do produto aplicado. Efeitos ultraestruturais semelhantes foram também observados em R. sanguineus expostos ao fipronil (OLIVEIRA et al., 2009), permetrina (ROMA et al., 2010b) e aos extratos foliares de neem (DENARDI et al., 2012). Estas regiões podem se tratar de porções danificadas do citosol ou mesmo regiões nas quais os componentes citoplasmáticos estão sendo degradados ou reciclados por meio de processos autofágicos, a fim de manter a integridade celular e garantir a viabilidade do ovócito (ROMA et al., 2011; DENARDI et al., 2012). De forma descontrolada, tais mecanismos podem futuramente levar à morte celular autofágica, uma forma de morte celular programada morfologicamente distinta da apoptose (LEVINE; YUAN, 2005).

Nos ovócitos de carrapatos R. sanguineus tratados com fipronil (OLIVEIRA et al., 2009) e extratos foliares de neem (DENARDI et al., 2012), as mitocôndrias apresentaram morfologia irregular, com cristas desorganizadas ou ausentes. Alterações mitocondriais também foram observadas nos ovócitos dos indivíduos tratados com o óleo de neem. Estes danos podem, futuramente, levar a prejuízos energéticos capazes de afetar o metabolismo destas células, considerando-se sua grande demanda energética para a produção do vitelo. Este fato, aliado às alterações no retículo endoplasmático rugoso (RER), podem afetar drasticamente a vitelogênese ao longo do desenvolvimento embrionário. As alterações observadas nestas organelas podem, inclusive, ser indicativas de processo de morte celular (OLIVEIRA et al., 2009; DENARDI et al., 2012).

Nos túbulos de Malpighi e glândulas salivares de carrapatos R. sanguineus naturalmente infectados, bactérias da espécie Rickettsia rhipicephali foram identificadas e demonstradas em análise ultraestrutural, apresentando parede celular tri ou quadrilaminar, com um halo eletronlúcido (“halo zone”) ao seu redor, além de citoplasma com ribossomos dispersos de modo variável, imersos em uma substância finamente granular e amorfa (HAYES; BURGDORFER, 1979). Santos et al. (2002), demonstraram as características morfológicas das bactérias da espécie R. conorii em glândulas salivares de R. sanguineus, denominando de espaço periplásmico o chamado halo eletronlúcido. Internamente, foi observado material eletrondenso consistente com a cromatina procariótica. Estas características ultraestruturais são muito semelhantes àquelas observadas no presente estudo, permitindo, assim, a sugestão de que os microorganismos observados possam ser bactérias intracelulares. Neste caso, a mancha eletrondensa em seu interior pode ser correspondente ao seu material genético disperso pelo citoplasma. As imagens em fluorescência reforçam esta

hipótese, já que estas estruturas foram fortemente marcadas pelo iodeto de propídeo, que evidencia a presença de material genético (SUZUKI et al., 1997).

Nos indivíduos tratados com o óleo de neem, o que se observou foi a ocorrência gradativamente mais intensa destas supostas bactérias, geralmente em grandes grupos e apresentando um halo eletronlúcido ao seu redor. Neste caso, os componentes do neem, por prejudicarem e sensibilizarem os ovócitos, podem tê-los tornado mais susceptíveis ao desenvolvimento microbiano. Provavelmente, em indivíduos sadios, o metabolismo celular seja capaz de controlar o desenvolvimento e reprodução destes microorganismos, e este mecanismo de controle pode estar prejudicado nos ovócitos de indivíduos tratados. No tratamento de maior concentração, inclusive, a presença de grandes grupos de bactérias corrobora esta hipótese. As porções eletrolúcidas ao seu redor, por sua vez, reforçam a ocorrência de degeneração citoplasmática nesta região, mais intensa conforme o volume destes microorganismos se eleva. De qualquer forma, sua presença não interferiu no aparecimento dos prejuízos causados pelo neem, já que eles foram observados em regiões distantes e não foram detectados nos indivíduos controle, também infectados.

1.7. CONCLUSÃO

A metodologia realizada neste trabalho aproximou os resultados obtidos de uma aplicação prática do neem em campo. Somado a isso, o uso de carrapatos em estágios intermediários de alimentação elevou a susceptibilidade de suas células reprodutivas aos compostos utilizados, visto que ainda não se encontravam protegidas pelo córion. Assim, uma aplicação progressiva e que se inicie aos primeiros sinais de infestação tende a ser mais eficiente no controle desta espécie. Os componentes do neem, em especial a azadiractina, interferiram diretamente no metabolismo e morfologia dos ovócitos, com efeitos mais expressivos em concentrações mais elevadas do composto. Estas alterações demonstraram que o tratamento pode comprometer a viabilidade dos embriões, contribuindo para o controle reprodutivo de R. sanguineus, de forma menos prejudicial ao meio ambiente e mais segura aos hospedeiros.

1.8. BIBLIOGRAFIA

ABDEL-SHAFY, S.; ZAYED, A.A. In vitro acaricidal effect of plant extract of neem seed oil (Azadirachta indica) on egg, immature, and adult stages of Hyalomma anatolicum excavatum (Ixodoidea: Ixodidae). Veterinary Parasitology, v.106, p.89-96, 2002.

AL-RAJHY, D.H.; ALAHMED, A.M.; HUSSEIN, H.I.; KHEIR, S.L. Acaricidal effects of cardiac glycosides, azadirachtin and neem oil against the camel tick, Hyalomma dromedarii (Acari: Ixodidae). Pest Management Science, v.59, p.1250-1254, 2003.

ARNOSTI, A.; BRIENZA, P.D.; FURQUIM, K.C.S.; CHIERICE, G.O.; BECHARA, G.H.; CALLIGARIS, I.B.; CAMARGO-MATHIAS, M.I. Effects of ricinoleic acid esters from castor oil of Ricinus communis on the vitellogenesis of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae) ticks. Experimental Parasitology, v.127, n.2, p.575-580, 2011.

ATAWODI, S.E.; ATAWODI, J.C. Azadirachta indica (neem): a plant of multiple biological and pharmacological activities. Phytochemistry Reviews, v.8, p.601-620, 2009.

BECHARA, G.H.; SZABÓ, M.P.J.; FERREIRA, B.R.; GARCIA, M.V. Rhipicephalus

sanguineus tick in Brazil: feeding and reproductive aspects under laboratorial conditions.

Brazilian Journal of Veterinary Parasitology, v.4, n.2, p.61-66, 1995.

BLAGBURN, B.L.; DRYDEN, M.W. Biology, treatment and control of flea and tick infestations. Veterinary Clinics of North America: Small Animals Practice, v.39, p.1173- 1200, 2009.

BRAHMACHARI, G. Neem – An omnipotent plant: a retrospection. Chemistry and

BROGLIO-MICHELETTI, S.M.F.; DIAS, N.S.; VALENTE, E.C.N.; SOUZA, L.A.; LOPES, D.O.P.; SANTOS, J.M. Ação do extrato e óleo de nim no controle de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) em laboratório. Revista

Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.19, n.1, p.44-48, 2010.

CHOUDHURY, M.K. Toxicity of neem seed oil against the larvae of Boophilus decoloratus, a one-host tick in cattle. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, v.5, p.562-563, 2009.

COONS, L.B., ALBERTI, G. The acari-ticks. In: Harrison, F.W., Foelix, R. (Ed.):

Microscopic Anatomy of Invertebrates. Chelicerate Arthropoda, Wiley-Liss, NewYork,

1999, pp. 267-514.

COOPER, J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. Journal of Cell Biology, v.105, p.1473-1478, 1987.

DANTAS-TORRES, F. Biology and ecology of the Brown dog tick, Rhipicephalus

sanguineus. Parasites & Vectors, v.3, n.26, p.1-11, 2010.

DENARDI, S.E.; BECHARA, G.H.; OLIVEIRA, P.R.; CAMARGO-MATHIAS, M.I.

Azadirachta indica A. Juss (neem) induced morphological changes on oocytes of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae) tick females. Experimental

Parasitology, v.126, p.462-470, 2010.

DENARDI, S.E.; BECHARA, G.H.; OLIVEIRA, P.R.; CAMARGO-MATHIAS, M.I. Inhibitory action of neem aqueous extract (Azadirachta indica A. Juss) on the vitellogenesis of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae) ticks. Microscopy Research

and Technique, v.74, p.889-899, 2011.

DENARDI, S.E.; BECHARA, G.H.; OLIVEIRA, P.R.; CAMARGO-MATHIAS, M.I. Ultrastructural analysis of the oocytes of female Rhipicephalus sanguineus (Latreille,1806) (Acari: Ixodidae) tick subjected to the action of Azadirachta indica A. Juss (neem).

FONTANETTI, C.S.; CHRISTOFOLETTI, C.A.; PINHEIRO, T.G.; SOUZA, T.S.; PEDRO- ESCHER, J. Microscopy as a tool in toxicological evaluations. In: MÉNDEZ-VILAS, A.; DÍAZ, J. (Ed.). Microscopy: Science, technology, applications and education. Badajoz: Formatex, p.1002-1007, 2010.

FORIM, M.R.; SILVA, M.F.G.F.; CASS, Q.B.; FERNANDES, J.B.; VIEIRA, P.C. Simultaneous quantification of azadirachtin and 3-tigloylazadirachtol in Brazilian seeds and oil of Azadirachta indica: application to quality control and marketing. Analytical Methods, v.2, p.860-869, 2010.

HAYES, S.F.; BURGDORFER, W. Ultrastructure of Rickettsia rhipicephali, a new membr of the spotted fever group Rickettsiae in tissues of the host vector Rhipicephalus sanguineus.

Journal of Bacteriology, v.137, n.1, p.605-613, 1979.

JONGEJAN, F.; UILENBERG, G. The global importance of ticks. Parasitology, v.129, p.S3- S14, 2004.

JUNQUEIRA, L.C.U.; JUNQUEIRA, L.M.M.S. Técnicas Básicas de Citologia e Histologia. São Paulo: Editora Santos, 1983.

LEVINE, B.; YUAN, J. Autophagy in cell death: an innocent convict? The Journal of

Clinical Investigation, v.115, p.2679-2688, 2005.

NDUMU, P.A.; GEORGE, J.B.D.; CHOUDHURY, M.K. Toxicity of neem seed oil (Azadirachta indica) against the larvae of Amblyomma variegatum a three-host tick in cattle.

Phytotherapy Research, v.13, p.532-534, 1999.

OLIVEIRA, P.R.; BECHARA, G.H.; DENARDI, S.E.; NUNES, E.T.; CAMARGO- MATHIAS, M.I. Morphological characterization of the ovary and oocytes vitellogenesis of