COM CONCENTRAÇÕES CONHECIDAS DE AZADIRACTINA NAS GLÂNDULAS SALIVARES DE FÊMEAS SEMI‐INGURGITADAS DE RHIPICEPHALUS SANGUINEUS (ACARI: IXODIDAE). Morphological effects of neem (Azadirachta indica A. Juss) seed oil with known azadirachtin concentrations on the salivary glands of semi‐engorged Rhipicephalus sanguineus ticks (Acari: Ixodidae). REMEDIO, R.N.; NUNES, P.H.; ANHOLETO, L.A.; CAMARGO‐MATHIAS, M.I. Artigo submetido ao Periódico Ticks and Tick‐borne Diseases SITUAÇÃO: Em análise
2.1. RESUMO
O neem (Azadirachta indica) tem se mostrado uma excelente alternativa ao uso de acaricidas sintéticos tradicionais no controle de carrapatos, devido às suas propriedades repelentes e aos seus reconhecidos efeitos sobre a morfologia e fisiologia destes ectoparasitas. Por este motivo, o presente estudo teve como objetivo demonstrar o potencial do óleo de neem no controle de carrapatos Rhipicephalus sanguineus, alvos de grande interesse veterinário devido à sua capacidade de transmitir patógenos aos cães. Para isso, fêmeas semi- ingurgitadas de R. sanguineus foram submetidas ao tratamento com o óleo da semente de neem enriquecido com azadiractina, seu componente principal. Após dissecção, as glândulas salivares foram coletadas e avaliadas por meio de técnicas morfológicas em microscopia de luz convencional, microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão, de forma que pudessem ser estabelecidas relações entre a ação do neem e possíveis prejuízos no desempenho alimentar destes ectoparasitas. O óleo de neem demonstrou um efeito claramente dose-dependente nas amostras analisadas. Os ácinos agranulares (tipo I) e granulares (tipos II e III) exibiram, principalmente nos indivíduos tratados com as maiores concentrações do produto, células com formato irregular, intensa desorganização e vacuolização citoplasmática, dilatação do lúmen das cisternas do retículo endoplasmático rugoso, além de alterações no espaço intermembranoso das mitocôndrias. Estes danos morfológicos podem indicar modificações na fisiologia das glândulas salivares, demonstrando os efeitos prejudiciais dos componentes presentes no óleo de neem sobre os carrapatos. Desta maneira, pode-se sugerir o aparecimento de futuros prejuízos em seu comportamento alimentar, o que pode levar, inclusive, a alterações na vitelogênese a longo prazo. Estes resultados comprovam o potencial do neem como método alternativo para o controle de carrapatos R. sanguineus, com menor custo e prejuízos ambientais minimizados.
2.2. ABSTRACT
Neem (Azadirachta indica) has become an excellent alternative to the use of traditional synthetic acaricides in tick control due to its repellent properties and recognized effects on the morphology and physiology of these ectoparasites. For this reason, this study aimed to demonstrate the potential of neem oil in the control of Rhipicephalus sanguineus ticks, targets of great veterinary interest because of their ability to transmit pathogens to dogs. For this, R. sanguineus semi-engorged females were subjected to treatment with neem seed oil, enriched with azadirachtin, its main component. After dissection, salivary glands were collected and evaluated through morphological techniques in light microscopy, confocal scanning laser microscopy and transmission electron microscopy, so that the relations between neem action and the possible impairment in these ectoparasites feed performance could be established. Neem oil demonstrated a clear dose-dependent effect in the analyzed samples. The agranular (type I) and granular acini (types II and III) showed, particularly in individuals treated with the highest concentrations of the product, cells with irregular shape, intense cytoplasmic disorganization and vacuolation, dilation of rough endoplasmic reticulum lumen, besides alterations in mitochondrial intermembrane space. These morphological damages may indicate modifications in salivary glands physiology, demonstrating the harmful effects of compounds present in neem oil on ticks. Thus, the occurrence of further impairment in their food behavior, which may even lead to long-term changes in vitellogenesis, may be suggested. These results confirm the potential of neem as an alternative method for controlling R. sanguineus ticks, with lower costs and minimized environmental damages.
2.3. INTRODUÇÃO
O contato íntimo e prolongado entre os carrapatos ixodídeos e seus hospedeiros é possível graças às secreções das glândulas salivares, órgãos multifuncionais notavelmente versáteis, vitais para o sucesso biológico destes animais (SAUER et al., 1995). As glândulas salivares são estruturas pares, responsáveis pela atividade osmorreguladora durante o período de jejum e pela eliminação de fluidos do sangue ao longo da alimentação, além de produzirem enzimas e inibidores de enzimas, agentes anticoagulantes e antiplaquetários, cemento para o cone de fixação, fatores imunomoduladores, prostaglandinas, agonistas e antagonistas de histamina, bem como toxinas paralisantes (FAWCETT et al., 1986; SAUER et al., 1995; SAUER et al., 2000). Além disso, são sítios de desenvolvimento de alguns microorganismos, o que torna os carrapatos capazes de transmitirem uma grande variedade de doenças (SAUER et al., 1995, 2000).
Entre as espécies envolvidas na transmissão de agentes infecciosos aos cães, R.
sanguineus é, sem dúvida, a mais importante do ponto de vista veterinário (DANTAS-
TORRES, 2010). Estes carrapatos são vetores de importantes patógenos e podem ser encontrados em cães que vivem tanto em áreas urbanas quanto rurais, estando altamente adaptados a viverem em habitações humanas (BLAGBURN, DRYDEN, 2009; DANTAS- TORRES, 2010). Embora os cães sejam seus hospedeiros preferenciais, carrapatos R.
sanguineus podem, ocasionalmente, parasitar uma grande variedade de animais domésticos e
selvagens (DANTAS-TORRES et al., 2006; BLAGBURN, DRYDEN, 2009), tendo sido encontrados, inclusive, em seres humanos (CARPENTER et al., 1990; MANFREDI et al., 1999; USPENSKY, IOFFE-USPENSKY, 2002).
Por este motivo, é crescente a necessidade de desenvolvimento de novos métodos de controle, que combatam as infestações e controlem o ciclo alimentar e reprodutivo destes animais. No campo da saúde humana e veterinária, o controle de carrapatos é realizado principalmente pelo uso de compostos químicos acaricidas (FLAMINI, 2003; JONJEJAN, UILENBERG, 2004), em geral formulados à base de produtos sintéticos (ALVES et al.,
2012). No entanto, tais produtos são tóxicos, causam poluição ambiental e apresentam alto custo (JONJEJAN; UILENBERG, 2004), além de promoverem a seleção de linhagens de carrapatos resistentes (BLAGBURN, DRYDEN, 2009; ROSADO-AGUILAR et al., 2010).
Substâncias obtidas a partir de extratos vegetais, contudo, têm baixo custo, poucos efeitos residuais e baixa incidência de desenvolvimento de resistência (ROSADO-AGUILAR et al., 2010). Neste sentido, o uso das folhas, frutos e sementes do neem (Azadirachta indica) tem se intensificado, em virtude da presença de diversos princípios biologicamente ativos que atuam de forma distinta dos acaricidas sintéticos (VIETMEYER, 1992; ATAWODI, ATAWODI, 2009). A azadiractina é considerada seu princípio ativo mais importante e predominante, apresentando amplo espectro de ação, que inclui alterações no crescimento e na reprodução dos artrópodes (VIETMEYER, 1992; SCHMUTTERER, 1990; BRAHMACHARI, 2004).
Sob diferentes formulações, os extratos de neem demonstraram efeitos expressivos no controle de inúmeras espécies de carrapatos, entre elas Hyalomma anatolicum excavatum (ABDEL-SHAFY; ZAYED, 2002), R. (Boophilus) decoloratus (CHOUDHURY, 2009) e R.
(Boophilus) microplus (SRIVASTAVA et al., 2008; BROGLIO-MICHELETTI et al., 2010).
Além disso, em carrapatos R. sanguineus, os extratos aquosos de folhas de neem demonstraram significativas alterações morfológicas nos ovários (DENARDI et al., 2010, 2011, 2012), singânglio e integumento (REMEDIO et al., 2014).
Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do óleo extraído das sementes do neem (A. indica), com concentrações conhecidas de azadiractina, sobre a morfologia das glândulas salivares de fêmeas de carrapatos R. sanguineus, por meio do uso de técnicas em microscopia de luz convencional, microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão, a fim de avaliar a possível interferência dos compostos presentes nesta planta no desempenho alimentar destes animais.
2.4. MATERIAL E MÉTODOS 2.4.1. Carrapatos R. sanguineus
Fêmeas e machos em jejum foram obtidos diretamente da colônia mantida em estufa BOD (Biological Oxygen Demand) sob condições controladas (25 ± 1°C, 80% de umidade, com fotoperíodo de 12 horas), no Biotério do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus de Rio Claro/SP, Brasil.
2.4.2. Azadirachta indica (neem)
As sementes de neem (2,5 kg) foram trituradas em um moinho Tecnal TE 631/2, submetidas a um processo de extração em hexano (5 extrações com duração de 3 dias cada), a fim de se obter o óleo utilizado neste experimento. Em seguida, as sementes passaram por um processo de extração metanólica por meio de um Ultra-Turrax T-20 (3 extrações sequenciais). Após filtração, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, fornecendo um extrato rico em azadiractina, que foi subsequentemente misturado com o óleo previamente obtido a fim de enriquecê-lo com azadiractina. A medida da concentração de azadiractina no extrato bruto do óleo de neem foi realizada a partir dos mesmos procedimentos descritos por Forim et al. (2010). A concentração de 1000 partes por milhão (ppm) de azadiractina no extrato bruto foi determinada, e a partir deste óleo as diluições utilizadas neste experimento foram realizadas.
2.4.3. Procedimentos experimentais - Preparação das diluições do óleo de neem
O óleo bruto extraído das sementes de neem foi diluído nas concentrações de 20, 40 e 60% em uma solução aquosa de etanol a 10%, de acordo com a adaptação da metodologia descrita por Ndumu et al. (1999). Portanto, foi possível a obtenção de diluições com concentrações específicas de azadiractina: 200 ppm (20%), 400 ppm (40%) e 600 ppm (60%). As soluções foram misturadas em agitador magnético e aplicadas topicamente nos carrapatos.
As diluições foram realizadas diariamente durante o desenvolvimento do experimento, e mantidas em um recipiente protegido da luz, a fim de se evitar alterações em suas propriedades acaricidas.
- Bioensaio
Um total de 60 casais de R. sanguineus foi liberado no interior de câmaras especiais de alimentação no dorso de coelhas New Zealand White, sem exposição prévia a infestações de carrapatos, segundo metodologia descrita por Bechara et al. (1995). Cinco coelhas foram utilizadas neste experimento, uma para cada grupo experimental (CI, CII, TI, TII e TIII). Os procedimentos para a aplicação das diluições do neem foram realizados no interior destas câmaras alimentadoras, durante o ingurgitamento das fêmeas.
Cinco grupos experimentais foram estabelecidos: Grupos Controle (CI e CII) e Grupos de Tratamento (TI, TII e TIII). Nos Grupos de Tratamento, as soluções de neem foram aplicadas topicamente com um pincel macio nos carrapatos fixados no dorso das coelhas por três dias, duas vezes ao dia. As aplicações se iniciaram 24 horas após a fixação dos carrapatos nos hospedeiros, nas concentrações de 20% (TI), 40% (TII) e 60% (TIII). Os carrapatos dos Grupos Controle (CI e CII) foram submetidos ao mesmo procedimento, com aplicações de água destilada e solução aquosa de etanol a 10%, respectivamente. Aproximadamente 5 mL de solução foi utilizada em cada aplicação. No quarto dia de infestação, fêmeas semi- ingurgitadas foram coletadas e mantidas sob condições controladas em estufa BOD antes de serem dissecadas para a remoção das amostras. Os carrapatos coletados foram dissecados sob estereomicroscópio Leica EZ4 em placas de Petri contendo solução de tampão fosfato-salino (PBS: NaCl 0.13M, Na2HPO4 0.017M, KH2PO4 0.02M, pH 7.2), para a remoção das amostras de glândula salivares.
Todos os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animal (CEUA, UNESP, Rio Claro, Brasil), protocolo número 2206, decisão número 021/2012.
2.4.4. Análise morfológica
- Microscopia de luz convencional (MLC)
Para a análise histológica, o material coletado foi imediatamente fixado em solução de paraformaldeído a 4% por 72 horas e, então, transferido para solução de tampão fosfato de sódio (pH 7.2) por 24 horas. As amostras foram subsequentemente submetidas à desidratação
em uma série gradativa de álcool etílico (70, 80, 90 e 95%, por 20 minutos cada), infiltração
overnight em historesina Leica, seguidas de polimerização com historesina Leica adicionada a
um agente endurecedor.
Os blocos de resina contendo o material foram seccionados em micrótomo Leica RM2255, e as secções submetidas à coloração com a técnica de hematoxilina-eosina (H-E), para a observação e descrição da morfologia geral do tecido (JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983). As lâminas histológicas obtidas foram montadas em bálsamo do Canadá sintético e o material foi fotografado em fotomicroscópio Leica DM150, equipado com câmera Leica ICC50 HD, por meio do software Leica LAS v.3.8, nas dependências do Laboratório de Histologia, UNESP, Rio Claro, Brasil.
- Microscopia confocal de varredura a laser (MCVL)
As amostras coletadas foram imediatamente fixadas em solução de paraformaldeído a 4% por 72 horas, lavadas em PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4) por duas vezes de 5 minutos e, posteriormente, permeabilizadas com Triton-x 0.1% por 20 minutos. Após duas novas lavagens de 5 minutos cada, os materiais foram incubados com solução de “Alexa Fluor 488 Faloidina” durante 30 minutos em temperatura ambiente e em recipiente tampado. As amostras foram novamente lavadas em PBS (duas vezes, com duração de 5 minutos cada), coradas com Iodeto de Propídeo a 10µg/mL durante 30 minutos no escuro, lavadas em PBS por mais duas vezes de 5 minutos e montadas utilizando meio de montagem ProLong® Gold reagent. As imagens dos materiais processados foram obtidas com Microscópio de Varredura Confocal a Laser Leica TCS SP5II e analisadas por meio do software Leica LAS AF.
- Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Para a análise ultraestrutural, as amostras foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0.1 M (pH 7.2), durante 72 horas. Em seguida, foram realizadas duas lavagens em tampão cacodilato de sódio 0.1M, com duração de 15 minutos cada e, logo depois, foi realizada a pós-fixação em solução de tetróxido de ósmio (OsO4) a 1%, durante duas horas. As amostras foram novamente lavadas em tampão cacodilato de sódio por duas vezes de 15 minutos e imersas em etanol aquoso a 10% por 15 minutos. O material foi contrastado em solução de acetato de uranila a 1%, dissolvido em álcool 10%, por 24 horas, no escuro, sendo, em seguida, desidratado em uma série gradativa de acetona (de 50 a 100%). Posteriormente, o material foi embebido em resina Epon-Araldite mais acetona, na proporção
de 1:1, por 24 horas, incluído em resina pura e levado à estufa por 72 horas, a 60ºC, para polimerização.
Secções ultrafinas obtidas em ultra-micrótomo Leica Reichert Supernova foram depositadas sobre grades de cobre e contrastadas em acetato de uranila a 4%, durante 45 minutos, e citrato de chumbo, por 10 minutos (REYNOLDS, 1963). O material foi observado e fotografado em microscópio eletrônico de transmissão Philips CM100 (MET, operando a uma voltagem de aceleração de 80kV) equipado com uma câmera Veleta, por meio do software iTEM (versão 5.2), nas dependências do laboratório de Microscopia Eletrônica, UNESP, Rio Claro, SP, Brasil.
2.5. RESULTADOS
A avaliação histológica das glândulas salivares dos carrapatos R. sanguineus permitiu a observação das características dos ácinos agranulares (tipo I) e granulares (tipo II e III). Para fins didáticos, a descrição dos resultados foi realizada de maneira geral, sem a identificação dos tipos específicos de células que compõem cada ácino.
2.5.1. Microscopia de Luz Convencional (MLC)
No grupo CI, ácinos agranulares (Fig. 1A) foram observados com aspecto tipicamente arredondado e ligeiramente irregular, constituídos por uma célula central e várias células periféricas. A célula central exibiu núcleo arredondado, levemente corado pela hematoxilina em roxo claro e localizado próximo ao centro do ácino, enquanto as periféricas apresentaram núcleos menores e também fracamente corados. Não foi possível a observação dos nucléolos e dos limites celulares. De forma geral, o citoplasma das células periféricas demonstrou forte acidofilia, corando-se em rosa mais intenso pela eosina. Os ácinos granulares do tipo II (Fig. 1B) apresentaram aspecto arredondado, sendo constituídos por células com diferentes grânulos de secreção. Estas granulações demonstraram variações no tamanho, na intensidade de coloração e na afinidade pelos corantes. No entanto, algumas células apresentaram citoplasma acidófilo agranular, com coloração rosa claro. Em geral, os núcleos se coraram fracamente pela hematoxilina, exibindo forma arredondada e tamanhos variados, de acordo com o tipo celular. Não foi possível, contudo, a observação dos nucléolos. Os limites celulares evidenciaram grande adesão entre células adjacentes. Os ácinos granulares do tipo III (Fig. 1C), por sua vez, mostraram morfologia típica, com formato arredondado e células secretoras com diferentes grânulos citoplasmáticos. Tais estruturas exibiram tamanhos variados, além de diferenças nas intensidades de coloração e na afinidade pelos corantes. Entretanto, assim como nos ácinos do tipo II, algumas células não apresentaram granulações, possuindo citoplasma acidófilo, corado em rosa claro pela eosina. Núcleos com aspecto
arredondado e fraca reação com a hematoxilina foram visualizados. Os nucléolos puderam ser observados em algumas células, e os limites celulares evidenciaram grande contato entre células adjacentes.
No grupo CII, os ácinos agranulares (Fig. 1D) não apresentaram diferenças histológicas em relação aos dos indivíduos controle. Também não foram observadas diferenças significativas nos ácinos granulares do tipo II e do tipo III (Fig. 1E,F), quando comparados aos indivíduos do grupo CI.
No grupo TI, também não foram visualizadas diferenças morfológicas nos ácinos do tipo I em relação aos indivíduos controle (Fig. 1G). Os do tipo II (Fig. 1H), por sua vez, demonstraram características gerais semelhantes às do grupo CI e CII, embora tenha sido observada sutil dilatação no espaço intercelular em alguns casos. Os ácinos do tipo III (Fig. 1I) apresentaram forma irregular, com áreas evidentes de vacuolização distribuídas por todo o citoplasma, principalmente nas células que não continham grânulos de secreção.
No grupo TII, os ácinos agranulares (Fig. 1J) demonstraram morfologia típica, sem diferenças em relação ao grupo controle. Os ácinos granulares do tipo II (Fig. 1K) apresentaram morfologia semelhante ao grupo TI, com dilatação do espaço intercelular. Além disso, foi observada vacuolização citoplasmática evidente, particularmente nas células sem grânulos de secreção. Os ácinos do tipo III (Fig. 1L), por sua vez, exibiram forma completamente irregular, com áreas de intensa vacuolização por todo o citoplasma, especialmente ao redor do núcleo das células que não continham grânulos secretores. Também foi observada sutil dilatação no espaço intercelular, assim como nos ácinos do tipo II. Em algumas células secretoras, foi observada aparente fusão ou rompimento dos grânulos de secreção, que perderam a forma tipicamente arredondada e se coraram menos intensamente pela eosina.
No grupo TIII, não foram observadas diferenças morfológicas nos ácinos agranulares (Fig. 1M), em comparação aos dos grupos controle. Nos ácinos granulares do tipo II (Fig. 1N), contudo, a vacuolização citoplasmática foi mais intensa, especialmente nas células sem grânulos de secreção. Além disso, também foi possível visualizar dilatações nos espaços intercelulares, da mesma forma que nos grupos TI e TII. Os ácinos do tipo III (Fig. 1O) apresentaram formato completamente irregular, semelhante ao grupo TII. No entanto, as regiões vacuolizadas foram observadas com maior frequência e intensidade, bem como as dilatações no espaço entre células adjacentes. Nas células secretoras, os grânulos já não puderam mais ser visualizados individualmente, estando aparentemente fundidos ou rompidos
e corados mais fracamente pela eosina, resultando em um citoplasma com aspecto mais homogêneo.
2.5.2. Microscopia Confocal de Varredura a Laser (MCVL)
Nos indivíduos pertencentes ao grupo CI (Fig. 2A,B) o citoplasma das células dos ácinos apresentou coloração avermelhada, em virtude da marcação pelo iodeto de propídeo. Os grânulos de secreção, quando presentes, não apresentaram nenhum tipo de marcação. Na periferia das células, ao redor do lúmen dos ácinos e também dos ductos excretores, foi observada marcação mais intensa em verde pela faloidina, evidenciando a presença de elementos do citoesqueleto e permitindo, desta forma, a observação do aspecto arredondado dos ácinos. Os núcleos apresentaram coloração vermelha variando de acordo com o grau de condensação da cromatina. Não foram observadas diferenças nas células dos ácinos de indivíduos pertencentes ao grupo CII (Fig. 2C,D), em comparação ao grupo CI. Os grupos TI (Fig. 2E,F), TII (Fig. 2G,H) e TIII (Fig. 2I,J) apresentaram padrões semelhantes de marcação pela faloidina, com maior intensidade quando comparados aos grupos controle. Isso permitiu evidenciar o aspecto irregular dos ácinos dos indivíduos submetidos ao tratamento.
2.5.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Não foram observadas diferenças entre os indivíduos pertencentes aos grupos CI e CII. Nos ácinos agranulares (Fig. 3A,B e 4A), uma grande célula central e muitas células periféricas foram identificadas, apoiadas em uma lâmina basal homogênea de eletrondensidade moderada. A célula central exibiu formato irregular, com dobras ou irregularidades no envoltório nuclear, e cromatina finamente granular, com eletrondensidade variável de acordo com o grau de condensação. O citosol apresentou baixa eletrondensidade, contendo grande quantidade de mitocôndrias, em geral relativamente grandes e alongadas, e fortemente eletrondensas. Retículo endoplasmático, regiões de Golgi e ribossomos não puderam ser visualizados. As células periféricas apresentaram núcleo de menor tamanho, em relação ao da célula central. Além disso, exibiram diversos processos citoplasmáticos partindo do corpo da célula e se dobrando inúmeras vezes, formando um labirinto basal em contato com a lâmina basal. O citosol no interior destes processos apresentou mitocôndrias com formas, tamanhos e eletrondensidades semelhantes àquelas da célula central. Os ácinos granulares (tipo II e tipo III) apresentaram formato arredondado e regular. Neles, vários tipos celulares puderam ser visualizados, com grânulos de secreção característicos, de acordo com o estado fisiológico dos carrapatos analisados. O núcleo exibiu, em geral, envoltório nuclear
irregular, cromatina granular com eletrondensidade baixa e um nucléolo também granular, arredondado e fortemente eletrondenso (Fig. 3C e 4B). Nas células ativas, não foi possível observar heterocromatina, apenas a eucromatina, descondensada. Os grânulos de secreção demonstraram grande variedade de características, dependendo do tipo celular: formato