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Estratégias de inibição, mecanismos moleculares e interações intermoleculares em complexos macromoleculares

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(1)
(2)

ȱ

MÁRIO

ȱ

TYAGO

ȱ

MURAKAMI

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

Estratégias

ȱ

de

ȱ

Inibição,

ȱ

Mecanismos

ȱ

Moleculares

ȱ

e

ȱ

Interações

ȱ

Intermoleculares

ȱ

em

ȱ

Complexos

ȱ

Macromoleculares

ȱ

ȱ

ȱ

Tese

ȱ

Apresentada

ȱ

ao

ȱ

Programa

ȱ

de

ȱ

Biofísica

ȱ

Molecular,

ȱ

Departamento

ȱ

de

ȱ

Física,

ȱ

Instituto

ȱ

de

ȱ

Biociências,

ȱ

Letras

ȱ

e

ȱ

Ciências

ȱ

Exatas,

ȱ

Universidade

ȱ

Estadual

ȱ

Paulista

ȱ

Júlio

ȱ

Mesquita

ȱ

Filho,

ȱ

para

ȱ

Obtenção

ȱ

do

ȱ

Título

ȱ

de

ȱ

Doutor

ȱ

em

ȱ

Biofísica

ȱ

Molecular,

ȱ

Área

ȱ

de

ȱ

Concentração

ȱ

em

ȱ

Cristalografia

ȱ

de

ȱ

Macromoléculas.

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

Orientador:

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Raghuvir

ȱ

Krishnaswamy

ȱ

Arni

ȱ

ȱ

Fomento:

ȱ

FAPESP

ȱ

ȱ

SMOLBNet

ȱ

ȱ

CEPID

ȱ

ȱ

CAPES

ȱ

ȱ

ȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱȱ

ȱ

ȱ

ȱ

São

ȱ

José

ȱ

do

ȱ

Rio

ȱ

Preto

ȱ

ȱ

SP

ȱ

(3)

Murakami, Mário Tyago.

Estratégia de inibição, mecanismos moleculares e interações

intermoleculares em complexos macromoleculares / Mário Tyago

Murakami. – São José do Rio Preto : [s.n.], 2006

152 f. : il. ; 30 cm.

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni

Co-orientador (se houver): Roy Edward Larson

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas

1. Cristalografia de Raios X. 2. Proteínas. 3. Mecanismos de ação 4.

Coagulação sangüínea. 5. Membranas biológicas. I. Arni, Raghuvir

Krishnaswamy. II. Larson, Roy Edward.

III. Universidade Estadual

Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Doutor.

(4)

MÁRIO

ȱ

TYAGO

ȱ

MURAKAMI

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

Estratégias

ȱ

de

ȱ

Inibição,

ȱ

Mecanismos

ȱ

Moleculares

ȱ

e

ȱ

Interações

ȱ

Intermoleculares

ȱ

em

ȱ

Complexos

ȱ

Macromoleculares

ȱ

ȱ

Tese

ȱ

Apresentada

ȱ

ao

ȱ

Programa

ȱ

de

ȱ

Biofísica

ȱ

Molecular,

ȱ

Departamento

ȱ

de

ȱ

Física,

ȱ

Instituto

ȱ

de

ȱ

Biociências,

ȱ

Letras

ȱ

e

ȱ

Ciências

ȱ

Exatas,

ȱ

Universidade

ȱ

Estadual

ȱ

Paulista

ȱ

Júlio

ȱ

Mesquita

ȱ

Filho,

ȱ

para

ȱ

Obtenção

ȱ

do

ȱ

Título

ȱ

de

ȱ

Doutor

ȱ

em

ȱ

Biofísica

ȱ

Molecular,

ȱ

Área

ȱ

de

ȱ

Concentração

ȱ

em

ȱ

Cristalografia

ȱ

de

ȱ

Macromoléculas.

ȱ

ȱ

ȱ

TESE

ȱ

PARA

ȱ

OBTENÇÃO

ȱ

DO

ȱ

TÍTULO

ȱ

DE

ȱ

DOUTOR

ȱ

ȱ

ȱ

COMISSÃO

ȱ

JULGADORA:

ȱ

ȱ

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Raghuvir

ȱ

Krishnaswamy

ȱ

Arni

ȱ

(Orientador)

ȱ

Departamento

ȱ

de

ȱ

Física

ȱȬȱ

IBILCE/UNESP

ȱ

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Antônio

ȱ

Carlos

ȱ

Martins

ȱ

Camargo

ȱ

CAT/CEPID

ȱ

ȱ

Instituto

ȱ

Butantan

ȱ

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Nilson

ȱ

Ivo

ȱ

Tonin

ȱ

Zanchin

ȱ

Laboratório

ȱ

Nacional

ȱ

de

ȱ

Luz

ȱ

Síncrotron

ȱ

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Beatriz

ȱ

Gómez

ȱ

Guimarães

ȱ

Laboratório

ȱ

Nacional

ȱ

de

ȱ

Luz

ȱ

Síncrotron

ȱ

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Roberto

ȱ

da

ȱ

Silva

ȱ

Departamento

ȱ

de

ȱ

Química

ȱ

ȱ

IBILCE/UNESP

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

(5)

DADOS

ȱ

CURRICULARES

ȱ

MÁRIO

ȱ

TYAGO

ȱ

MURAKAMI

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

O

ȱ

autor

ȱ

desse

ȱ

trabalho,

ȱ

Mário

ȱ

Tyago

ȱ

Murakami,

ȱ

nasceu

ȱ

em

ȱ

Taquarituba

ȱ

(SP),

ȱ

no

ȱ

ano

ȱ

de

ȱ

1981

ȱ

e

ȱ

realizou

ȱ

seus

ȱ

estudos

ȱ

pré

Ȭ

universitários

ȱ

em

ȱ

diversas

ȱ

escolas

ȱ

durante

ȱ

sua

ȱ

adolescência,

ȱ

onde

ȱ

teve

ȱ

participação

ȱ

destacada

ȱ

na

ȱ

Olimpíada

ȱ

Regional

ȱ

de

ȱ

Matemática

ȱ

realizada

ȱ

na

ȱ

UNESP

ȱȬȱ

Campus

ȱ

Bauru

ȱ

e

ȱ

na

ȱ

Olimpíada

ȱ

de

ȱ

Matemática

ȱ

das

ȱ

Escolas

ȱ

Adventistas.

ȱ

No

ȱ

ano

ȱ

de

ȱ

1999,

ȱ

iniciou

ȱ

seu

ȱ

curso

ȱ

universitário

ȱ

de

ȱ

Engenharia

ȱ

de

ȱ

Alimentos

ȱ

na

ȱ

UNESP

ȱȬȱ

Campus

ȱ

São

ȱ

José

ȱ

do

ȱ

Rio

ȱ

Preto

ȱ

e

ȱ

no

ȱ

mesmo

ȱ

ano

ȱ

começou

ȱ

seu

ȱ

estágio

ȱ

científico

ȱ

na

ȱ

área

ȱ

de

ȱ

bioquímica

ȱ

e

ȱ

cristalografia

ȱ

de

ȱ

macromoléculas

ȱ

com

ȱ

bolsa

ȱ

FAPESP

ȱ

sob

ȱ

orientação

ȱ

do

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Raghuvir

ȱ

Krishnaswamy

ȱ

Arni

ȱ

onde

ȱ

publicou

ȱ

cinco

ȱ

artigos

ȱ

científicos

ȱ

Qualis

ȱ

A

,

ȱ

incluindo

ȱ

um

ȱ

artigo

ȱ

de

ȱ

revisão

ȱ

sobre

ȱ

fosfolipases

ȱ

A

2

.

ȱ

Durante

ȱ

a

ȱ

graduação,

ȱ

realizou

ȱ

diversos

ȱ

cursos

ȱ

de

ȱ

aprimoramento

ȱ

em

ȱ

expressão

ȱ

gênica,

ȱ

purificação

ȱ

e

ȱ

sequenciamento

ȱ

químico

ȱ

de

ȱ

proteínas.

ȱ

Participou,

ȱ

também,

ȱ

do

ȱ

concorrido

ȱ

Curso

ȱ

de

ȱ

Verão

ȱ

do

ȱ

Laboratório

ȱ

Nacional

ȱ

de

ȱ

Luz

ȱ

Síncrotron

ȱ

(Campinas

Ȭ

SP)

ȱ

no

ȱ

ano

ȱ

de

ȱ

2002

ȱ

e

ȱ

em

ȱ

2004

ȱ

iniciou

ȱ

seu

ȱ

curso

ȱ

de

ȱ

Doutorado

ȱ

Direto

ȱ

com

ȱ

bolsa

ȱ

FAPESP

ȱ

na

ȱ

área

ȱ

de

ȱ

Biofísica

ȱ

Molecular

ȱ

com

ȱ

concentração

ȱ

em

ȱ

Cristalografia

ȱ

de

ȱ

Macromoléculas,

ȱ

o

ȱ

qual

ȱ

resultou

ȱ

17

ȱ

manuscritos

ȱ

científicos

ȱ

e

ȱ

o

ȱ

ȱ

lugar

ȱ

no

ȱ

X

ȱ

Prêmio

ȱ

Jovem

ȱ

Talento

ȱ

em

ȱ

Ciências

ȱ

da

ȱ

Vida

ȱ

ocorrido

ȱ

na

ȱ

XXXV

ȱ

Reunião

ȱ

Anual

ȱ

da

ȱ

Sociedade

ȱ

Brasileira

ȱ

de

ȱ

Bioquímica

ȱ

e

ȱ

Biologia

ȱ

Molecular,

ȱ

Águas

ȱ

de

ȱ

Lindóia

ȱ

(2006).

ȱ

Um

ȱ

dos

ȱ

trabalhos

ȱ

apresentados

ȱ

na

ȱ

tese

ȱ

também

ȱ

foi

ȱ

escolhido

ȱ

como

ȱ

Six

ȱ

Top

ȱ

Choices

ȱ

no

ȱ

congresso

ȱ

anual

ȱ

de

ȱ

2005

ȱ

da

ȱ

American

ȱ

Crystallographic

ȱ

Association

ȱ

com

ȱ

scholarship

ȱ

award

.

ȱ

No

ȱ

doutorado,

ȱ

também,

ȱ

realizou

ȱ

um

ȱ

doutorado

ȱ

sanduíche

ȱ

no

ȱ

European

ȱ

Molecular

ȱ

Biology

ȱ

Laboratory

ȱ

/

ȱ

Deutsches

ȱ

Elektronen

Ȭ

Synchrotron

ȱ

e

ȱ

na

ȱ

Universidade

ȱ

de

ȱ

Hamburgo

ȱ Ȭȱ

Alemanha,

ȱ

onde

ȱ

pode

ȱ

trabalhar

ȱ

intensamente

ȱ

com

ȱ

técnicas

ȱ

de

ȱ

automação

ȱ

no

ȱ

crescimento

ȱ

de

ȱ

cristais

ȱ

de

ȱ

proteínas

ȱ

e

ȱ

radiação

ȱ

síncrotron.

ȱ

Atualmente,

ȱ

está

ȱ

aprofundando

ȱ

em

ȱ

técnicas

ȱ

de

ȱ

“docking”

ȱ

de

ȱ

complexos

ȱ

macromoleculares

ȱ

e

ȱ

dinâmica

ȱ

molecular.

ȱ

(6)

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

Dedico

ȱ

esse

ȱ

trabalho,

ȱ

ȱ

A

ȱ

todos

ȱ

os

ȱ

cientistas

ȱ

que

ȱ

sonham

ȱ

descobrir

ȱ

a

ȱ

origem

ȱ

da

ȱ

vida,

ȱ

a

ȱ

cura

ȱ

de

ȱ

doenças,

ȱ

por

ȱ

fim,

ȱ

descobrir

ȱ

fenômenos

ȱ

na

ȱ

sua

ȱ

essência

ȱ

a

ȱ

nível

ȱ

molecular

ȱ

e

ȱ

prático,

ȱ

mas

ȱ

que,

ȱ

apesar

ȱ

de

ȱ

muitos

ȱ

desses

ȱ

“problemas”

ȱ

aparentarem

ȱ

não

ȱ

ter

ȱ

solução

ȱ

aos

ȱ

nossos

ȱ

olhos,

ȱ

têm,

ȱ

por

ȱ

sua

ȱ

vez,

ȱ

sobre

ȱ

árduo

ȱ

e

ȱ

intenso

ȱ

trabalho,

ȱ

sua

ȱ

contribuição

ȱ

para

ȱ

sociedade.

ȱ

(7)

AGRADECIMENTOS

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

ȱ

A

ȱ

minha

ȱ

gratidão

ȱ

a

ȱ

todos

ȱ

que

ȱ

me

ȱ

apoiaram

ȱ

e

ȱ

incentivaram

ȱ

o

ȱ

meu

ȱ

crescimento

ȱ

pessoal

ȱ

e

ȱ

profissional.

ȱ

ȱ

ȱ

Agradeço,

ȱ

especialmente,

ȱ

ao

ȱ

Prof.

ȱ

Dr.

ȱ

Raghuvir

ȱ

Krishnaswamy

ȱ

Arni

ȱ

pela

ȱ

confiança

ȱ

e

ȱ

severidade

ȱ

que

ȱ

me

ȱ

proporcionaram

ȱ

um

ȱ

excelente

ȱ

crescimento

ȱ

e

ȱ

amadurecimento

ȱ

científico.

ȱ

ȱ

ȱ

Agradeço,

ȱ

especialmente,

ȱ

aos

ȱ

meus

ȱ

familiares,

ȱ

minha

ȱ

mãe

ȱ

que

ȱ

sempre

ȱ

esteve

ȱ

ao

ȱ

meu

ȱ

lado

ȱ

nos

ȱ

momentos

ȱ

mais

ȱ

difíceis

ȱ

da

ȱ

minha

ȱ

vida

ȱ

e

ȱ

ao

ȱ

Primo

ȱ

que

ȱ

foi,

ȱ

sem

ȱ

dúvidas,

ȱ

o

ȱ

grande

ȱ

responsável

ȱ

por

ȱ

tudo

ȱ

que

ȱ

alcancei

ȱ

até

ȱ

hoje.

ȱ

Minha

ȱ

eterna

ȱ

gratidão.

ȱ

ȱ

ȱ

Agradeço

ȱ

à

ȱ

Letícia

ȱ

e

ȱ

sua

ȱ

família

ȱ

que,

ȱ

também,

ȱ

foram

ȱ

muito

ȱ

importantes

ȱ

nessa

ȱ

fase

ȱ

final

ȱ

do

ȱ

meu

ȱ

doutoramento.

ȱ

ȱ

ȱ

Aos

ȱ

queridos

ȱ

amigos

ȱ

de

ȱ

Laboratório,

ȱ

em

ȱ

especial

ȱ

Magno,

ȱ

companheiro

ȱ

para

ȱ

todos

ȱ

os

ȱ

momentos,

ȱ

Karine,

ȱ

Flávia

ȱ

e

ȱ

Daniella.

ȱ

ȱ

ȱ

A

ȱ

todos

ȱ

docentes

ȱ

do

ȱ

departamento

ȱ

que

ȱ

sempre

ȱ

foram

ȱ

muito

ȱ

amistosos

ȱ

e

ȱ

prestativos,

ȱ

em

ȱ

especial

ȱ

Jorge

ȱ

Chahine,

ȱ

responsável

ȱ

pelo

ȱ

meu

ȱ

ingresso

ȱ

no

ȱ

Departamento

ȱ

de

ȱ

Física

ȱ

e

ȱ

o

ȱ

João

ȱ

Ruggiero,

ȱ

sempre

ȱ

muito

ȱ

simpático

ȱ

e

ȱ

amigável.

ȱ

ȱ

ȱ

Agradeço,

ȱ

também,

ȱ

aos

ȱ

colegas

ȱ

do

ȱ

Departamento,

ȱ

em

ȱ

especial

ȱ

ao

ȱ

Paulinho

ȱ

e

ȱ

Barbosa,

ȱ

uma

ȱ

dupla

ȱ

da

ȱ

pesada

ȱ

que

ȱ

sempre

ȱ

foram

ȱ

muito

ȱ

prestativos.

ȱȱ

ȱ

ȱ

A

ȱ

todos

ȱ

colaboradores

ȱ

que

ȱ

fizeram

ȱ

parte

ȱ

desse

ȱ

trabalho,

ȱ

em

ȱ

especial

ȱ

Denise

ȱ

Tambourgi

ȱ

pelas

ȱ

amostras

ȱ

de

ȱ

esfingomielinase

ȱ

D

ȱ

e

ȱ

valiosa

ȱ

discussão,

ȱ

Paulo

ȱ

Melo

ȱ

pelas

ȱ

grandes

ȱ

dicas

ȱ

sobre

ȱ

suramina,

ȱ

Richard

ȱ

Ward

ȱ

pela

ȱ

histórica

ȱ

colaboração,

ȱ

Christian

ȱ

Betzel

ȱ

pela

ȱ

orientação

ȱ

no

ȱ

exterior

ȱ

e

ȱ

Adélia

ȱ

Cintra

ȱ

pelas

ȱ

infinitas

ȱ

amostras

ȱ

fornecidas.

ȱ

ȱ

ȱ

À

ȱ

Fundação

ȱ

de

ȱ

Amparo

ȱ

à

ȱ

Pesquisa

ȱ

do

ȱ

Estado

ȱ

de

ȱ

São

ȱ

Paulo

ȱ

(FAPESP)

ȱ

pelo

ȱ

auxílio

ȱ

financeiro

ȱ

na

ȱ

execução

ȱ

desse

ȱ

trabalho

ȱ

e

ȱ

a

ȱ

CAPES

ȱ

pelo

ȱ

fomento

ȱ

no

ȱ

doutorado

ȱ

sanduíche

ȱ

na

ȱ

Universidade

ȱ

de

ȱ

Hamburgo

ȱ

/

ȱ

EMBL

ȱ

em

ȱ

Hamburgo

ȱ

na

ȱ

Alemanha.

ȱ

ȱ

(8)

ABREVIATURAS

ȱ

C1

Ȭ

INH

ȱ

ȱ

inibidor

ȱ

C1

ȱ

de

ȱ

esterase

ȱ

CVX

ȱȬȱ

convulxina

ȱ

EMBL-DESY –

European Molecular Biology Laboratory / Deutsches

Elektronen-Synchrotron

ȱ

LNLS

ȱ

ȱ

Laboratório

ȱ

Nacional

ȱ

de

ȱ

Luz

ȱ

Síncrotron

ȱ

FIIa

ȱ

ȱ

fator

ȱ

II

ȱ

ativado

ȱȱ

FVa

ȱ

ȱ

fator

ȱ

V

ȱ

ativado

ȱ

FVIIa

ȱ

ȱ

fator

ȱ

VII

ȱ

ativado

ȱ

FIX

ȱ

ȱ

fator

ȱ

IX

ȱ

zimogênio

ȱ

FX

ȱ

ȱ

fator

ȱ

X

ȱ

zimogênio

ȱ

FXa

ȱ

ȱ

fator

ȱ

X

ȱ

ativado

ȱ

FXIa

ȱ

ȱ

fator

ȱ

XI

ȱ

ativado

ȱ

FXIIa

ȱ

ȱ

fator

ȱ

XII

ȱ

ativado

ȱ

FXIII

ȱ

ȱ

fator

ȱ

XIII

ȱ

FXIIIa

ȱ

ȱ

fator

ȱ

XIII

ȱ

ativado

ȱ

HMWK

ȱ

ȱ

cininogênio

ȱ

de

ȱ

alto

ȱ

peso

ȱ

molecular

ȱ

KDR

ȱ

ȱ

kinase

ȱ

domain

Ȭ

containing

ȱ

receptor

ȱ

NAPc2

ȱ

ȱ

proteína

ȱ

anticoagulante

ȱ

da

ȱ

saliva

ȱ

do

ȱ

verme

ȱ

hematófago

ȱ

Ancylostoma

ȱ

caninium

ȱ

c2

ȱ

NAP5

ȱȬȱ

proteína

ȱ

anticoagulante

ȱ

da

ȱ

saliva

ȱ

do

ȱ

verme

ȱ

hematófago

ȱ

Ancylostoma

ȱ

caninium

ȱ5

ȱ

NAPs

ȱ

ȱ

Proteínas

ȱ

anticoagulantes

ȱ

de

ȱ

nematóidesȱ

PAI

ȱ

ȱ

inibidor

ȱ

de

ȱ

ativador

ȱ

do

ȱ

plasminogênio

ȱ

PC

ȱ

ȱ

proteína

ȱ

C

ȱ

PL

ȱ

ȱ

fosfolídios

ȱ

PLA

2

ȱ

ȱ

fosfolipase

ȱ

A

2

Selectide

ȱ

ȱ

nova

ȱ

classe

ȱ

de

ȱ

inibidor

ȱ

de

ȱ

fator

ȱ

Xa

ȱȱ

TF

ȱ

ȱ

fator

ȱ

tissular

ȱ

TFPI

ȱ

ȱ

inibidor

ȱ

da

ȱ

via

ȱ

do

ȱ

fator

ȱ

tissular

ȱ

t

Ȭ

PA

ȱ

ȱ

ativador

ȱ

do

ȱ

plasminogênio

ȱ

tipo

Ȭ

tissular

ȱ

TSV

Ȭ

PA

ȱ

ȱ

ativador

ȱ

de

ȱ

plasminogênio

ȱ

do

ȱ

veneno

ȱ

de

ȱ

Trimeresurus

ȱ

stejnegeri

ȱ

u

Ȭ

PA

ȱ

ȱ

ativador

ȱ

do

ȱ

plasmingênio

ȱ

tipo

Ȭ

uroquinase

ȱ

(9)

ȱ

LISTA

ȱ

DE

ȱ

FIGURAS

ȱ

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

1:

ȱ

Esquema

ȱ

da

ȱ

cascata

ȱ

de

ȱ

coagulação

ȱ

sangüínea.

ȱ

Desencadeamento

ȱ

pela

ȱ

via

ȱ

extrínseca

ȱ

(vermelho),

ȱ

via

ȱ

intrínseca

ȱ

(azul),

ȱ

via

ȱ

alternativa

ȱ

(verde).

ȱ

Atividade

ȱ

proteolítica

ȱ

da

ȱ

trombina

ȱ

(roxo);

ȱ

proteólise

ȱ

(preto);

ȱ

sistema

ȱ

fibrinolítico

ȱ

(marrom)

ȱ

e

ȱ

inibição

ȱ

pela

ȱ

proteína

ȱ

C

ȱ

(preto

ȱ

tracejado).

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

2:

ȱ

Esquema

ȱ

da

ȱ

inibição

ȱ

da

ȱ

via

ȱ

extrínseca

ȱ

da

ȱ

coagulação

ȱ

sangüínea

ȱ

pela

ȱ

NAPc2.

ȱ

Neste

ȱ

modelo

ȱ

FXa

ȱ

(verde)

ȱ

é

ȱ

inibido

ȱ

por

ȱ

NAPc2

ȱ

(azul)

ȱ

e

ȱ

posteriormente

ȱ

forma

ȱ

um

ȱ

complexo

ȱ

quaternário

ȱ

com

ȱ

TF

ȱ

e

ȱ

FVIIa.

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

3:

ȱ

Via

ȱ

anticoagulante

ȱ

da

ȱ

proteína

ȱ

C.

ȱ

Acima:

ȱ

via

ȱ

alternativa

ȱ

iniciada

ȱ

por

ȱ

protac®.

ȱ

Abaixo:

ȱ

via

ȱ

fisiológica

ȱ

iniciada

ȱ

pelo

ȱ

complexo

ȱ

FIIa/Trombomodulina.

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

4:

ȱ

Sobreposição

ȱ

das

ȱ

estruturas

ȱ

de

ȱ

CVX

ȱ

(cinza)

ȱ

sobre

ȱ

a

ȱ

botrocetin

ȱ

(azul)

ȱ

complexada

ȱ

com

ȱ

fator

ȱ

von

ȱ

Willebrand

ȱ

(laranja).

ȱ

As

ȱ

diferenças

ȱ

estruturas

ȱ

no

ȱ

sítio

ȱ

de

ȱ

interação

ȱ

com

ȱ

fator

ȱ

von

ȱ

Willebrand

ȱ

está

ȱ

evidenciado

ȱ

em

ȱ

vermelho.

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

5:

ȱ

Modelo

ȱ

mosaico

ȱ

fluido

ȱ

de

ȱ

membranas

ȱ

biológicas.

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

6:

ȱ

Representação

ȱ

esquemática

ȱ

de

ȱ

um

ȱ

fosfolipídio

ȱ

(esquerda)

ȱ

e

ȱ

um

ȱ

esfingolipídio

ȱ

(direita).

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

7:

ȱ

Modo

ȱ

proposto

ȱ

de

ȱ

interação

ȱ

de

ȱ

Lys49

ȱ

PLA

2

ȱ

(verde)

ȱ

com

ȱ

receptor

ȱ

KDR

ȱ

(superfície

ȱ

eletrostática)

ȱ

da

ȱ

angiogênese.

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

8:

ȱ

Representação

ȱ

esquemática

ȱ

da

ȱ

estrutura

ȱ

de

ȱ

uma

ȱ

xilanase

ȱ

G/11

ȱ

com

ȱ

setas

ȱ

indicando

ȱ

os

ȱ

resíduos

ȱ

relevantes

ȱ

para

ȱ

a

ȱ

atividade

ȱ

catalítica.

ȱ

ȱ

Figura

ȱ

9:

ȱ

Cristal

ȱ

de

ȱ

proteína

ȱ

irradiado

ȱ

com

ȱ

luz

ȱ

branca

ȱ

(esquerda,

ȱ

acima)

ȱ

e

ȱ

luz

ȱ

ultravioleta

ȱ

a

ȱ

280

ȱ

nm

ȱ

(direita,

ȱ

acima).

ȱ

Cristal

ȱ

de

ȱ

sal

ȱ

irradiado

ȱ

com

ȱ

luz

ȱ

branca

ȱ

(esquerda

ȱ

abaixo)

ȱ

e

ȱ

luz

ȱ

ultravioleta

ȱ

(direita,

ȱ

abaixo).

ȱ

(10)

RESUMO

ȱ

ȱ

O

ȱ

presente

ȱ

trabalho

ȱ

aborda

ȱ

alguns

ȱ

aspectos

ȱ

de

ȱ

processos

ȱ

biológicos

ȱ

essenciais

ȱ

à

ȱ

vida,

ȱ

como

ȱ

o

ȱ

sistema

ȱ

hemostático,

ȱ

integridade

ȱ

de

ȱ

membranas

ȱ

biológicas

ȱ

e

ȱ

a

ȱ

termoestabilidade

ȱ

de

ȱ

proteínas.

ȱ

Ferramentas

ȱ

cristalográficas

ȱ

combinadas

ȱ

com

ȱ

estudos

ȱ

in

ȱ

silico

ȱ

e

ȱ

caracterizações

ȱ

bioquímicas

ȱ

e

ȱ

espectroscópicas

ȱ

permitiram

ȱ

acessar

ȱ

informações

ȱ

a

ȱ

nível

ȱ

molecular

ȱ

dos

ȱ

mecanismos

ȱ

e

ȱ

vias

ȱ

de

ȱ

ativação

ȱ

ou

ȱ

inibição

ȱ

desses

ȱ

processos

ȱ

biológicos.

ȱ

Baseado

ȱ

em

ȱ

estudos

ȱ

com

ȱ

toxinas

ȱ

isoladas

ȱ

de

ȱ

vermes,

ȱ

serpentes,

ȱ

carrapatos,

ȱ

sanguessugas,

ȱ

aranhas

ȱ

e

ȱ

outros

ȱ

animais

ȱ

peçonhentos

ȱ

foi

ȱ

caracterizada

ȱ

uma

ȱ

nova

ȱ

molécula

ȱ

anti

Ȭ

dermonecrótica

ȱ

no

ȱ

tratamento

ȱ

de

ȱ

acidentes

ȱ

ofídicos,

ȱ

que

ȱ

não

ȱ

apresenta

ȱ

efeitos

ȱ

tóxicos

ȱ

secundários

ȱ

e

ȱ

revelou

ȱ

um

ȱ

papel

ȱ

chave

ȱ

do

ȱ

sítio

ȱ

ativo

ȱ

nominal

ȱ

no

ȱ

enigmático

ȱ

mecanismo

ȱ

de

ȱ

ação

ȱ

das

ȱ

Lys49

ȱ

fosfolipases

ȱ

A

2

.

ȱ

Estudos

ȱ

com

ȱ

as

ȱ

proteínas

ȱ

anticoagulantes

ȱ

do

ȱ

verme

ȱ

hematófago

ȱ

Ancylostoma

ȱ

caninum

ȱ

NAPc2

ȱ

e

ȱ

NAP5

ȱ

demonstraram

ȱ

um

ȱ

novo

ȱ

sítio

ȱ

do

ȱ

fator

ȱ

Xa,

ȱ

que

ȱ

é

ȱ

importante

ȱ

para

ȱ

o

ȱ

reconhecimento

ȱ

de

ȱ

substratos

ȱ

macromoleculares

ȱ

e

ȱ

inibição,

ȱ

que

ȱ

serve

ȱ

como

ȱ

uma

ȱ

nova

ȱ

plataforma

ȱ

para

ȱ

o

ȱ

desenho

ȱ

de

ȱ

drogas.

ȱ

Outra

ȱ

toxina

ȱ

hemostaticamente

ȱ

ativa

ȱ

estudada

ȱ

foi

ȱ

protac

“

,

ȱ

que

ȱ

tem

ȱ

habilidade

ȱ

de

ȱ

ativar

ȱ

a

ȱ

proteína

ȱ

C

ȱ

por

ȱ

uma

ȱ

via

ȱ

alternativa,

ȱ

independente

ȱ

do

ȱ

cofator

ȱ

fisiológico

ȱ

trombomodulina,

ȱ

onde

ȱ

o

ȱ

perfil

ȱ

eletrostático

ȱ

(básico)

ȱ

em

ȱ

torno

ȱ

do

ȱ

sítio

ȱ

ativo

ȱ

e

ȱ

o

ȱ

posicionamento

ȱ

estratégico

ȱ

dos

ȱ

três

ȱ

grupos

ȱ

de

ȱ

carboidratos

ȱ

na

ȱ

região

ȱ

interfacial

ȱ

são

ȱ

essenciais

ȱ

no

ȱ

reconhecimento,

ȱ

interação

ȱ

e

ȱ

ativação

ȱ

da

ȱ

proteína

ȱ

C.

ȱ

Além

ȱ

disso,

ȱ

foi

ȱ

determinada

ȱ

a

ȱ

primeira

ȱ

estrutura

ȱ

tridimensional

ȱ

a

ȱ

resolução

ȱ

de

ȱ

1.75

ȱ

Å

ȱ

usando

ȱ

o

ȱ

método

ȱ

“quick

ȱ

cryo

Ȭ

soaking”

ȱ

de

ȱ

uma

ȱ

enzima

ȱ

pertencente

ȱ

à

ȱ

família

ȱ

das

ȱ

esfingomielinases

ȱ

D,

ȱ

somente

ȱ

encontradas

ȱ

no

ȱ

veneno

ȱ

de

ȱ

aranhas

ȱ

do

ȱ

gênero

ȱ

Loxosceles

ȱ

e

ȱ

algumas

ȱ

bactérias

ȱ

patogênicas

ȱ

do

ȱ

gênero

ȱ

Corynebacterium

.

ȱ

Baseados

ȱ

nesses

ȱ

resultados

ȱ

e

ȱ

com

ȱ

estudos

ȱ

comparativos

ȱ

com

ȱ

fosfolipase

ȱ

D

ȱ

e

ȱ

DNase

ȱ

I,

ȱ

foi

ȱ

proposto

ȱ

o

ȱ

mecanismo

ȱ

de

ȱ

ação

ȱ

da

ȱ

enzima,

ȱ

o

ȱ

qual

ȱ

foi

ȱ

posteriormente

ȱ

confirmado

ȱ

por

ȱ

estudos

ȱ

de

ȱ

mutação

ȱ

sítio

Ȭ

dirigida.

ȱȱ

ȱ

ȱ

Palavras

Ȭ

chave:

ȱ

Difração

ȱ

de

ȱ

raios

ȱ

X,

ȱ

processos

ȱ

biológicos,

ȱ

mecanismos

ȱ

de

ȱ

ação

ȱ

e

ȱ

inibição.

ȱ

(11)

ȱ

ABSTRACT

ȱ

ȱ

ȱ

This

ȱ

work

ȱ

presents

ȱ

some

ȱ

features

ȱ

of

ȱ

essential

ȱ

biological

ȱ

processes

ȱ

such

ȱ

as

ȱ

the

ȱ

haemostatic

ȱ

system,

ȱ

integrity

ȱ

of

ȱ

biological

ȱ

membranes

ȱ

and

ȱ

thermostability

ȱ

of

ȱ

proteins.

ȱ

Crystallographic,

ȱ

spectroscopic

ȱ

and

ȱ

in

ȱ

silico

ȱ

tools

ȱ

have

ȱ

been

ȱ

used

ȱ

to

ȱ

obtain

ȱ

information

ȱ

at

ȱ

the

ȱ

molecular

ȱ

level

ȱ

of

ȱ

macromolecular

ȱ

complexes,

ȱ

action

ȱ

mechanisms

ȱ

and

ȱ

inhibition

ȱ

pathways.

ȱ

Worms,

ȱ

snakes,

ȱ

ticks,

ȱ

leeches

ȱ

and

ȱ

spiders

ȱ

produce

ȱ

a

ȱ

variety

ȱ

of

ȱ

proteins,

ȱ

which

ȱ

interfere

ȱ

in

ȱ

the

ȱ

regulation

ȱ

of

ȱ

these

ȱ

systems.

ȱ

Different

ȱ

toxins

ȱ

isolated

ȱ

from

ȱ

these

ȱ

organisms

ȱ

were

ȱ

characterized

ȱ

providing

ȱ

necessary

ȱ

information

ȱ

for

ȱ

the

ȱ

development

ȱ

of

ȱ

a

ȱ

new

ȱ

anti

Ȭ

myonecrotic

ȱ

molecule

ȱ

and

ȱ

reveal

ȱ

a

ȱ

new

ȱ

factor

ȱ

Xa

ȱ

exosite

ȱ

that

ȱ

is

ȱ

important

ȱ

for

ȱ

macromolecular

ȱ

substrates

ȱ

recognition

ȱ

and

ȱ

inhibition.

ȱ

The

ȱ

first

ȱ

crystal

ȱ

structure

ȱ

of

ȱ

a

ȱ

member

ȱ

of

ȱ

the

ȱ

sphingomyelinases

ȱ

D

ȱ

family

ȱ

was

ȱ

determined

ȱ

by

ȱ

the

ȱ

‘quick

ȱ

cryo

Ȭ

soaking’

ȱ

technique

ȱ

and

ȱ

the

ȱ

catalytic

ȱ

mechanism

ȱ

was

ȱ

proposed,

ȱ

which

ȱ

involves

ȱ

a

ȱ

magnesium

Ȭ

binding

ȱ

site

ȱ

and

ȱ

two

ȱ

catalytic

ȱ

histidines.

ȱ

An

ȱ

alternative

ȱ

activation

ȱ

of

ȱ

the

ȱ

protein

ȱ

C

ȱ

pathway

ȱ

that

ȱ

does

ȱ

not

ȱ

require

ȱ

thrombomodulin

ȱ

was

ȱ

structurally

ȱ

characterized

ȱ

and

ȱ

revealed

ȱ

the

ȱ

dual

ȱ

role

ȱ

of

ȱ

the

ȱ

elestrotatic

ȱ

surface

ȱ

charge

ȱ

around

ȱ

the

ȱ

active

ȱ

site

ȱ

and

ȱ

the

ȱ

three

ȱ

strategically

ȱ

positioned

ȱ

carbohydrate

ȱ

moieties

ȱ

in

ȱ

the

ȱ

approach,

ȱ

recognition

ȱ

and

ȱ

activation

ȱ

of

ȱ

protein

ȱ

C.

ȱ

ȱ

ȱ

Keywords:

ȱ

X

Ȭ

ray

ȱ

diffraction,

ȱ

biological

ȱ

processes,

ȱ

action

ȱ

mechanisms

ȱ

and

ȱ

inhibition.

ȱ

ȱ

(12)

SUMÁRIO

ȱ

ȱ

1)

ȱ

Overview...1

ȱ

ȱ

2)

ȱ

Sistemas

ȱ

Abordados...2

ȱ

a.

ȱ

Hemostasia...3

ȱ

i.

ȱ

NAPs...5

ȱ

I.

ȱ

MS1:

ȱ

Intermolecularȱ

Interactionsȱ

andȱ

Characterizationȱ

ofȱ

theȱ

NovelȱFactorȱXaȱExositeȱInvolvedȱinȱMacromolecularȱRecognitionȱ

andȱ

Inhibition:ȱ

Crystalȱ

Structureȱ

ofȱ

Humanȱ

GlaȬDomainlessȱ

FactorȱXaȱcomplexedȱwithȱtheȱAnticoagulantȱProteinȱNAPc2ȱfromȱ

theȱHematophagousȱNematodeȱAncylostomaȱcaninum…………..6

ȱ

ii.

ȱ

Serino

ȱ

Proteases

ȱ

de

ȱ

Veneno

ȱ

de

ȱ

Serpentes...15

ȱ

I.

ȱ

MS2:

ȱ

Purification,ȱ

Characterizationȱ

andȱ

Crystallizationȱ

ofȱ

JararacussinȬI,ȱ

FibrinogenȬClottingȱ

Enzymeȱ

Isolatedȱ

fromȱ

theȱ

VenomȱofȱBothropsȱjararacussu……….…16

ȱ

II.

ȱ

MS3:

ȱ

Crystallizationȱ

andȱ

Preliminaryȱ

XȬrayȱ

Crystallographicȱ

Studiesȱ

ofȱ

protac

“

Commercialȱ

Proteinȱ

activatorȱ

isolatedȱ

fromȱAgkistrodonȱcontortrixȱcontortrixȱvenom………...22

ȱ

III.

ȱ

MS4:

ȱ

ThrombomodulinȬindependentȱ

Activationȱ

ofȱ

Proteinȱ

andȱ

Specificityȱ

ofȱ

Hemostaticallyȱ

Activeȱ

Snakeȱ

Venomȱ

Serineȱ

Proteases:ȱCrystalȱStructuresȱofȱNativeȱandȱInhibitedȱAgkistrodonȱ

contortrixȱcontortrixȱProteinȱCȱActivator………..25

ȱ

iii.

ȱ

Convulxina...32

ȱ

I.

ȱ

MS5:ȱ

Initialȱ

structuralȱ

analysisȱofȱ

naȱ

D

4

E

CȬtypeȱlectinȱfromȱ

theȱ

venomȱofȱCrotalusȱdurissusȱterrificus…………..………...33

ȱ

II.

ȱ

MS6:

ȱ

Crystalȱ

Structureȱ

ofȱ

theȱ

Plateletȱ

Activatorȱ

Convulxin,ȱ

DisulfideȬlinkedȱ

D

4

E

4ȱCyclicȱTetramerȱfromȱtheȱVenomȱofȱCrotalusȱ

durissusȱterrificus……….36

ȱ

b.

ȱ

Disrupção

ȱ

de

ȱ

Membranas

ȱ

Biológicas...41

ȱ

i.

ȱ

Esfingomielinases

ȱ

D...42

ȱ

I.

ȱ

MS7:

ȱ

Crystallizationȱ

andȱ

Preliminaryȱ

Crystallographicȱ

Analysisȱ

ofȱ

SMaseȱ

I,ȱ

Sphingomyelinaseȱ

fromȱ

Loxoscelesȱ

laetaȱ

Spiderȱ

Venom……….………43

ȱ

II.

ȱ

MS8:

ȱ

Structuralȱ

Basisȱ

forȱ

Metalȱ

Ionȱ

Coordinationȱ

andȱ

theȱ

CatalyticȱMechanismȱofȱSphingomyelinasesȱD………...…46

ȱ

III.

ȱ

MS9:

ȱ

Structuralȱ

Insightsȱ

intoȱ

theȱ

Catalyticȱ

Mechanismȱ

ofȱ

Sphingomyelinasesȱ

andȱ

Evolutionaryȱ

Relationshipȱ

toȱ

Glycerophosphodiesterȱphosphodiesterases………...….53

ȱ

(13)

II.

ȱ

MS12:

ȱ

Isolation,ȱ

Characterizationȱ

andȱ

Biologicalȱ

Activityȱ

ofȱ

Acidicȱ

Phospholipaseȱ

A2ȱ

Isoformsȱ

fromȱ

Bothropsȱ

jararacussuȱ

Snakeȱvenom

ȱ

………...……79

ȱ

III.

ȱ

MS13:

ȱ

Crystallizationȱ

andȱ

HighȬResolutionȱ

XȬrayȱ

Diffractionȱ

Dataȱ

Collectionȱ

ofȱ

anȱ

Asp49ȱ

PLA2ȱ

fromȱ

Bothropsȱ

jararacussuȱ

VenomȱBothȱinȱtheȱPresenceȱandȱAbsenceȱofȱCa

2+

ȱIons………….88

ȱ

IV.

ȱ

MS14:ȱCrystallizationȱandȱPreliminaryȱXȬrayȱDiffractionȱAnalysisȱ

ofȱ

Suramin,ȱ

Highlyȱ

Chargedȱ

Polysulfonatedȱ

Naphthylurea,ȱ

ComplexedȱwithȱaȱMyotoxicȱPLA2ȱfromȱB.ȱasperȱVenom……….91

ȱ

V.

ȱ

MS15:

ȱ

Crystalȱ

Structureȱ

ofȱ

anȱ

Acidicȱ

Plateletȱ

Aggregationȱ

Inhibitorȱ

andȱ

Hypotensiveȱ

Phospholipaseȱ

A2ȱ

inȱ

theȱ

Monomericȱ

andȱ

Dimericȱ

States:ȱ

Insightsȱ

intoȱ

itsȱ

Oligomericȱ

State……….………...94

ȱ

VI.

ȱ

MS16:

ȱ

Inhibitionȱ

ofȱ

Myotoxicȱ

Activityȱ

ofȱ

Bothropsȱ

asperȱ

MyotoxinȱIIȱbyȱtheȱAntiȬtrypanosomalȱDrugȱSuramin………..102

ȱ

VII.

ȱ

MS17:

ȱ

Insightsȱ

intoȱ

Metalȱ

Ionȱ

Bindingȱ

inȱ

Phospholipasesȱ

A2:ȱ

Ultraȱ

HighȬResolutionȱ

Crystalȱ

Structuresȱ

ofȱ

anȱ

Acidicȱ

PhospholipasesȱA2ȱinȱtheȱCa

2+

ȱfreeȱandȱboundȱstates..……..…113

ȱ

VIII.

ȱ

MS18:ȱ

Structureȱ

ofȱ

Myotoxinȱ

II,ȱ

Catalyticallyȱ

Inactiveȱ

Lys49ȱ

Phospholipaseȱ

A2ȱ

Homologueȱ

fromȱ

Atropoidesȱ

nummiferȱ

Venom………...……120

ȱ

IX.

ȱ

MS19:ȱ

Interfacialȱ

Surfaceȱ

Chargeȱ

andȱ

Freeȱ

Accessibilityȱ

toȱ

theȱ

PutativeȱActiveȱSiteȱareȱessentialȱRequirementsȱforȱtheȱActivityȱofȱ

Lys49ȱPhospholipasesȱA2ȱHomologues………124

ȱ

c.

ȱ

Termoestabilidade

ȱ

de

ȱ

Proteínas...134

ȱ

I.

ȱ

MS20:

ȱ

Crystallizationȱ

andȱ

Preliminaryȱ

XȬrayȱ

Crystallographicȱ

Studiesȱ

foȱ

theȱ

Mesophilicȱ

Xylanaseȱ

fromȱ

Bacillusȱ

subtilisȱ

1A1………....135

ȱ

II.

ȱ

MS21:ȱCorrelationȱ

ofȱ

Temperatureȱ

InducedȱConformationȱ

Changeȱ

withȱ

Optimumȱ

Catalyticȱ

Activityȱ

inȱ

theȱ

Recombinantȱ

G/11ȱ

XylanaseȱAȱfromȱBacillusȱsubtilisȱStrainȱ168ȱ(1A1)………...…137

ȱ

ȱ

3)

ȱ

Significância

ȱ

Bio

Ȭ

Funcional

ȱ

dos

ȱ

Resultados...143

ȱ

ȱ

4)

ȱ

Referências

ȱ

Bibliográficas...144

ȱ

ȱ

5)

ȱ

Adendos...145

ȱ

ȱ

(14)

1)

ȱ

Overview

ȱ

ȱ

A

ȱ

genômica

ȱ

no

ȱ

início

ȱ

dos

ȱ

anos

ȱ

90

ȱ

recebeu

ȱ

grandes

ȱ

incentivos

ȱ

sendo

ȱ

a

ȱ

promessa

ȱ

de

ȱ

cura

ȱ

de

ȱ

diversas

ȱ

moléstias

ȱ

congênitas

ȱ

e

ȱ

adquiridas.

ȱ

Porém,

ȱ

após

ȱ

a

ȱ

corrida

ȱ

do

ȱ

mapeamento

ȱ

do

ȱ

genoma

ȱ

humano,

ȱ

as

ȱ

perguntas

ȱ

a

ȱ

serem

ȱ

respondidas

ȱ

continuaram

ȱ

sem

ȱ

solução

ȱ

e

ȱ

serviram

ȱ

como

ȱ

berço

ȱ

para

ȱ

a

ȱ

proteômica,

ȱ

isto

ȱ

é,

ȱ

o

ȱ

estudo

ȱ

das

ȱ

moléculas

ȱ

que

ȱ

expressam

ȱ

as

ȱ

informações

ȱ

contidas

ȱ

no

ȱ

material

ȱ

genético,

ȱ

as

ȱ

proteínas.

ȱ

As

ȱ

proteínas

ȱ

na

ȱ

natureza

ȱ

estão

ȱ

destinadas,

ȱ

através

ȱ

de

ȱ

uma

ȱ

pressão

ȱ

seletiva,

ȱ

a

ȱ

exercer

ȱ

funções

ȱ

específicas

ȱ

numa

ȱ

enorme

ȱ

gama

ȱ

de

ȱ

bioprocessos

ȱ

e

ȱ

suas

ȱ

propriedades

ȱ

funcionais

ȱ

dependem

ȱ

de

ȱ

suas

ȱ

estruturas

ȱ

tridimensionais.

ȱ

Com

ȱ

a

ȱ

técnica

ȱ

do

ȱ

DNA

ȱ

recombinante,

ȱ

o

ȱ

número

ȱ

de

ȱ

seqüências

ȱ

protéicas

ȱ

aumentou

ȱ

exponencialmente

ȱ

e

ȱ

permitiu

ȱ

um

ȱ

grande

ȱ

avanço

ȱ

nos

ȱ

estudos

ȱ

estruturais

ȱ

de

ȱ

proteínas.

ȱ

Atualmente,

ȱ

mais

ȱ

de

ȱ

40.000

ȱ

estruturas

ȱ

protéicas

ȱ

foram

ȱ

determinadas

ȱ

principalmente

ȱ

por

ȱ

métodos

ȱ

cristalográficos,

ȱ

que

ȱ

teve

ȱ

um

ȱ

incrível

ȱ

avanço

ȱ

tecnológico

ȱ

e

ȱ

metodológico,

ȱ

principalmente

ȱ

nos

ȱ

últimos

ȱ

dez

ȱ

anos,

ȱ

que

ȱ

impulsionou

ȱ

a

ȱ

biologia

ȱ

estrutural.

ȱ

Hoje

ȱ

estamos

ȱ

em

ȱ

mais

ȱ

uma

ȱ

nova

ȱ

fase

ȱ

na

ȱ

ciência,

ȱ

onde

ȱ

não

ȱ

basta

ȱ

estudar

ȱ

estas

ȱ

biomoléculas

ȱ

de

ȱ

forma

ȱ

isolada,

ȱ

mas

ȱ

sim

ȱ

inserida

ȱ

no

ȱ

seu

ȱ

sistema

ȱ

biológico

ȱ

(

systems

ȱ

biology

)

ȱ

o

ȱ

que

ȱ

requer

ȱ

uma

ȱ

grande

ȱ

interatividade

ȱ

entre

ȱ

pesquisadores

ȱ

e

ȱ

a

ȱ

palavra

ȱ

chave

ȱ

é

ȱ

a

ȱ

multi

Ȭ

disciplinaridade.

ȱ

Nesta

ȱ

tese,

ȱ

três

ȱ

sistemas

ȱ

biológicos

ȱ

foram

ȱ

abordados,

ȱ

o

ȱ

hemostático,

ȱ

a

ȱ

integridade

ȱ

de

ȱ

membranas

ȱ

biológicas

ȱ

e

ȱ

a

ȱ

termoestabilidade

ȱ

de

ȱ

proteínas,

ȱ

por

ȱ

métodos

ȱ

cristalográficos,

ȱ

in

ȱ

silico

,

ȱ

bioquímicos

ȱ

e

ȱ

fisiológicos

ȱ

utilizando

ȱ

infra

Ȭ

estrutura

ȱ

e

ȱ

colaboração

ȱ

intelectual

ȱ

de

ȱ

diversos

ȱ

grupos

ȱ

de

ȱ

pesquisa

ȱ

da

ȱ

USP/RB,

ȱ

USP/SC,

ȱ

Centro

ȱ

de

ȱ

Toxinologia

ȱ

Aplicada

ȱ

ȱ

CEPID,

ȱ

SMOLBNet,

ȱ

Instituto

ȱ

Butantan

ȱ

e

ȱ

LNLS.

ȱ

ȱ

Referências

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