Atividade antioxidante e antiproliferativa de extratos de folhas de Plukenetia volubilis L. (EUPHORBIACEAE)

(1)

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

ANA KARINA DE LIMA NASCIMENTO

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE FOLHAS DE Plukenetia volubilis L. (EUPHORBIACEAE)

(2)

Ana Karina de Lima Nascimento Página 2

ANA KARINA DE LIMA NASCIMENTO

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE FOLHAS DE Plukenetia volubilis L. (EUPHORBIACEAE)

Orientadora: Prof. Katia Castanho Scortecci Co-Orientador: Prof. Hugo Alexandre Rocha

NATAL 2013

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ANA KARINA DE LIMA NASCIMENTO

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE FOLHAS DE Plukenetia volubitis L. (EUPHORBTACEAE)

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-graduação

em

Bioquímica

da Universidade Federal

do

Rio Grande do

Norte

como

requisito parcial

para

obtenção

do título de

Mestre

em Bioquímlca.

Aprovado em: 1 810312013

Profa. Dra.

Departamen

BANCA EXAMINADORA

Íe de Oliveira Rocha nto de Bioquímica - UFRN

Co-orientador

Yara Alves Cursino dos Santos de Biociências - USP

Prof. Dr. Va

e Parasitologia - UFRN lbio

Exa Departamento de Mi

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DEDICATÓRIA

Dedico esta obra a minha família, em especial a minha mãe Maria Nazaré de Lima, por todo amor, dedicação e principalmente por ser meu maior exemplo de garra e perseverança. Ao meu namorado João Batista Nóbrega pela paciência e amor. Sem o apoio de vocês teria a batalha teria sido

muito mais árdua.

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AGRADECIMENTOS

À Deus por me conceder paciência e sabedoria para conclusão deste trabalho, a ele devo todas as vitórias alcançadas.

À minha família por todo apoio e confiança, em especial a minha mãe Nazaré Lima por todo seu esforço, pelo apoio e por ser esse

exemplo de mulher batalhadora que me incentiva a lutar pelos meus objetivos. Ao meu pai Luís Antônio, pela confiança e orgulho

depositados em mim, apesar de não transparecer. A minha vozinha (in memoriam) que mesmo não estando presente entre nós, tenho certeza que de onde estiver continua intercedendo pelas

minhas vitórias.

Ao meu namorado João Nóbrega, pelo apoio incondicional, pela paciência e principalmente por permanecer do meu lado nos momentos mais difíceis do mestrado, sempre me encorajando e fazendo com que eu acreditasse na minha capacidade. Sem seu apoio tenho certeza que a batalha teria sido muito mais árdua!

À minha orientadora a Prof. Dr. Kátia Castanho que mesmo sem me conhecer me concedeu a oportunidade de fazer parte do seu

grupo de pesquisa. Obrigada Kátia por ter depositado em mim confiança e credibilidade.

Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre Rocha, por ter me recebido de portas abertas em seu laboratório epela ajuda incondicional na

realização deste projeto.

Ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte por oferecer as condições

necessárias para o desenvolvimento deste trabalho.

À secretária da pós-graduação em Bioquímica Margarita Alexandre Mavromatis por sempre ser prestativa, pelo seu

exemplo de competência e organização.

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Aos integrantes do Grupo de Plantas do LBMG, em especial

“Helenas” (Rsrs), amigas que espero levar para o resto da minha vida. À Cris, por compartilhar comigo os momentos de alegrias e também os de estresse durante todo o mestrado, o que seria de mim se não tivesse você pra dividir as lamentações heim amiga? (rsrs). À Amanda, por todos os conselhos, pelas conversas e peloseu

jeito alegre de ser que nos contagia, obrigada friend!! À Cecília, minha companheira desde a graduação, obrigada por sempre está

disposta a me ajudar, não só a mim, mas a todos do grupo, sei que você tem um coração enorme e te admiro por isso, espero poder

sempre contar com sua amizade. À Kellya, pelos momentos de descontração, por nos fazer rir até mesmo no fim de um dia de trabalho cansativo no laboratório. À Renata, por nos transmitir

calma com seu jeito paciente de ser. À Ingrid, a última

sobrevivente do trio das “Jéssicas” (rs) pelas ajudas nos

experimentos.As demais “Jessicas” também, Jéssica Vitória e Nayana que apesar de não fazerem mais parte do grupo, me ajudaram no período das extrações. Aos demais integrantes, Isabel, Nathalia, Sara, Nildiane e Gabriel. Á Naldo e Valeska, que

não fazem mais parte do grupo, mas que me ajudaram muito no início da minha vida acadêmica, principalmente Valeska com quem aprendi os primeiros passos no laboratório, obrigada pela

sua paciência em ensinar.

Ao pessoal do Biopol, por toda ajuda cedida na realização deste trabalho, tenho muito a agradecer a todos vocês, seja aos que estiveram diretamente me acompanhando nos experimentos ou aqueles que simplesmente estiveram dispostos a esclareceralgumas

dúvidas, fica aqui minha eterna gratidão. A Raniere por me acompanhar nos experimentos com células. A Rafael pela ajuda

nos testes antioxidantes. À Ruth, Dayane, Karol, Moacir e Cinthia pelos favores na cultura de células. À Jailma uma pessoa

que não mede esforços pra ajudar o próximo. E aos demais integrantes do Biopol: Daniel, Max, Vinícus, Rony, Sara, Letícia,

Mariana, Joana, Monique, Almino, Pablo, Arthur e Marília por sempre me receberem tão bem no laboratório. Desculpa se esqueci

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sucesso de um trabalho em equipe está na união, e isso vocês tem de sobra!

À Nednaldo que apesar de pegar no meu pélogo quando comecei os experimentos no Biopol, com seu jeito metódico,

semprecobrandopra eu pesquisasse e lêsse milhares deartigos. Na época confesso que minha vontade era fugir toda vez que o

encontrava nos corredores do CB ou do departamento de Bioquímica (rsrs), mas hoje sou grata por toda cobrança, e reconheço que isso me fez amadurecer bastante na pesquisa.

Obrigada Ned!

À turma do mestrado por dividir comigo os momentos que julgo

terem sido os mais “tensos” (períododas disciplinas). À Richele, minha companheira dos seminários em dupla, pelo seu exemplo de

determinação e pela amizade construída, espero que perdure por muito tempo. À Daniel Chaves pelos seus jargões que alegravam a turma (Sucesso!). À Heleni por adoçar nossas vidas e por nos fazer

engordar um pouquinho com seus dotes culinários. À Cris pelos milagrosos bolos de cenoura que amolece corações (rsrs). À Larissa

e Ivanice por compartilhar as alegrias, angústias e até os choros (rs). À Fernanda pela sua tranquilidade que nos contagia. À

Patrícia por ser um exemplo de didática, competência e de elegância (rs). À Tafarel, Thiago Barros, Thiago Costa, Hugo, Anderson e Raphael Russi, por todos os momentos de estudo e de

descontração. Enfim a todos da turma do mestrado em Bioquímica (2011).

Aos professores do departamento de Bioquímica por todos os conhecimentos transmitidos.

Á professora Silvana Zucolotto do Departamento de Farmácia (UFRN) pela colaboração na realização dos experimentos de

triagem fitoquímica. E à sua aluna Júlia, por ter se

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Aosprofessores da banca de qualificação (Matheus Pedrosa, Tatjana Keesen e Silvana Zucolotto) pelas sugestões que contribuíram enormemente para conclusão deste trabalho.

À minha amiga de infância Anyelle Palhares, pela ajuda com as regras da ABNT. Obrigada amiga, sei que apesar da distância posso contar sempre com você, saiba que a recíproca é verdadeira!

Aos amigos Kesinho, Pablo, Luciana e Cecília por todo apoio desde a graduação. Pessoas que sempre depositaram em mim confiança

e isso foi muito importante nessa trajetória!

Aos meus compadres Glícia e João Paulo pela amizade, confiança e por dividirem comigo momentos felizes.

À minha prima-irmã Ana Catarina por sempre me apoiar e por entender minha ausência quando tinha que me dedicar ao

mestrado.

Às minhas afilhadas Ana Beatriz, Maria Clara e Maria Vitória que mesmo sem entender nada, me dão forças pra continuar!

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Ana Karina de Lima Nascimento Página 8 “O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada. Caminhando e semeando, no fim terás o que colher.”

(11)

RESUMO

Plukenetia volubilis, conhecida popularmente como sacha incha ou amêndoa

lopo, é uma planta oleaginosa e trepadeira pertecente a família Euphorbiaceae. Suas sementes apresentam alto valor nutritivo e suas folhas são utilizadas pela população amazônica para tratar doenças de pele, contudo essa ação não é comprovada cientificamente. Dentro deste contexto, no presente trabalho foi realizada uma prospecção química e biológica de diferentes extratos obtidos das folhas de P. volubilis: extrato aquoso (EA), metanólito (EM), etanólico (EE),

clorofórmico (EC) e hexânico (EH). A triagem fitoquímica foi realizada por meio de reações químicas de identificação e análise por cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando diferentes eluentes e reveladores. Como parte das análises de constituição química dos extratos, foram realizadas dosagens de compostos fenólicos, açúcares totais e proteínas. Em relação às atividades biológicas foi avaliada a capacidade antioxidante dos extratos e seus efeitos sob células tumorais e normais. Com os resultados obtidos foi possível detectar por meio das reações químicas a presença de compostos fenólicos, flavonóides, saponinas e alcalóides. Por meio da análise de CCD foi possível verificar a presença de compostos com estruturas de terpenos, polifenóis e flavonóides. O extrato metanólico (EM) apresentou uma banda de coloração verde e Rf 0,65 similar ao padrão de flavonóide canferol. Com as metodologias

de dosagem química foi observada uma elevada quantidade de açúcares totais nos extratos de P. volubilis. Os testes para avaliação da atividade antioxidante

revelaram que todos os extratos apresentam capacidade antioxidante. No teste de capacidade antioxidante total (expresso como equivalente em ácido ascórbico, EEA/g), os extratos apresentaram valores que variaram entre 59,31 a 97,76 EAA/g. Para o teste de DPPH os valores de sequestro variaram de 88,3% a 62,8%. O teste de viabilidade celular, verificado por meio da redução do composto MTT possibilitou observar que os extratos foram capazes de diminuir a viabilidade das células cancerígenas HeLa e A549, sendo mais eficientes para linhagem HeLa. Os extratos EM e EH (250 µg/mL) apresentaram redução da proliferação de HeLa para 54,3 e 48,5%, respectivamente. Enquanto que os extratos EH e EA induziram de forma significativa a proliferação de fibroblastos normais 3T3, cerca de 70% a mais que o controle. Resultado semelhante foi observado em macrófagos Raw, onde foi verificado que a proliferação dessas células tratadas com os extratos EM, EC e EA foi a duas vezes mais que o controle. Nenhum efeito foi observado nas células CHO quando tratadas com os extratos. Outra abordagem utilizada foi a de citometria de fluxo de modo a avaliar marcadores de morte celular em células HeLa quando expostas aos extratos de P. volubilis. Os resultados deste

ensaio mostraram que os extratos induziram a morte celular via apoptose. Portanto, esses resultados sugerem que os extratos das folhas de P. volubilis

são potenciais alvos para serem utilizados futuramente no desenvolvimento de fármacos com ação antioxidante, proliferativa para células normais e antitumoral.

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ABSTRACT

Plukenetia volubilis (or sacha inchi) is an oleaginous plant from Euphorbiaceae

family. Seeds have a high nutritional value and its leaves are used to treat skin diseases by Amazonian population. However, this procedure does not have any scientific base yet. Considering this, the aim of this work was to made chemical and biological analysis using different leaf plant extracts: aqueous extract (EA), metanol (EM), ethanol (EE), chloroform (CE) and hexane (EH). The phytochemical screening was done using specific chemical reactions and analysis by thin layer chromatography (TLC). It was also measured the composition phenols, sugars and proteins. The biological activities as antioxidants and its effects on tumor and normal cells were also analyzed. The results showed the presence of phenos, flavonoids, saponins and alkaloids. By TLC analysis, it was observed the presence of terpenes, flavonoids and polyphenols. The methanol extract (EM) showed a green band and Rf 0.65 that was similar to the flavonoid kaempferol pattern. It was also detected high concentration of sugars. The antioxidant assays showed that all extracts had an antioxidant activity. The CAT assay that is expressed as equivalent ascorbic acid (EEA/g), it was observed that the extracts showed values ranging from 59.31 to 97.76 EAA/g. Furthermore, the DPPH assay values rangedfrom 62.8% to 88.3%. The cell viability assay showed that the extracts were able to reduce viability from cancer cells as HeLa and A549. It was verified that the better results were obtained for HeLa lineage. The extracts EM and EH (250µg/mL concentration used) were able to reduce the proliferation from HeLa cell suspension to 54.3 and 48.5%, respectively. On the other hand, the extracts EH and EA were able to induced cell proliferation on normal fibroblasts 3T3 cells, this proliferation was about 70% higher than the control. A similar result was observed for macrophages Raw, where the proliferation from these cells that were treated with EM, EC or EA extracts were two times more than the control. It was not observed any effect on CHO cells. In order to known which was the pathway for the cell death in HeLa cells, it was done flow cytometry. The results showed that extracts induce cell death via apoptosis. Therefore, these results suggest that leaf extracts from Plukenetia volubilis may be a potential targets for

the future use as a medicine with antioxidant, antitumor and proliferative.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio de antioxidantes (AOX) e espécies reativas de oxigênio (ROS)... 29 Figura 2. Moléculas que bloqueiam ou suprimem os múltiplos estágios da carcinogênese... 32 Figura 3. Plukenetia volubilis sob condições de cultivo... 35 Figura 4. Esquema representativo das análises realizadas com extratos de

Plukenetia volubilis.... 38 Figura 5. Comparação da coloração do extrato alocoólico foliar de Plukenetia

volubis com e sem adição de solução de cloreto

férrico... 45

Figura 6. Comparação da coloração do extrato aquoso foliar de Plukenetia volubis com e sem adição de gelatina... 46 Figura 7. Resultado do teste de espuma com extrato aquoso foliar de

Plukenetia volubilis... 46 Figura 8. Comparação da coloração do extrato alcoólico foliar de Plukenetia

volubis com e sem adição de HCL e

magnésio... 47 Figura 9. Comparação da coloração do extrato com ácido sulfurico foliar de

Plukenetia volubis com e sem adição dos

reagentes... 47 Figura 10. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie

Plukenetia volubilis... 48 Figura 11. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie

(14)

Figura 14. CCD do extrato MeOH da espécie Plukenetia volubilis em

comparação com as agliconas flavonoídicas canferol, apigenina, glicosil-crisina e luteolina... 51 Figura 15. CCD do extrato MeOH da espécie Plukenetia volubilis em

comparação com o padrão canferol... 52 Figura 16. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie

Plukenetia volubilis.... 52 Figura 17. Atividade antioxidante dos extratos foliares de Plukenetia volubilis

medida pelo ensaio da capacidade antioxidante total (CAT).... 55 Figura 18. Atividade antioxidante dos extratos foliares de Plukenetia volubilis

medida pelo ensaio de sequestro do radical DPPH... 56 Figura 19. Viabilidade celular de diferentes linhagens tratadas com extratos de

Plukenetia volubilis.... 59 Figura 20. Viabilidade de células Raw tratadas com extratos de Plukenetia volubilis... 59 Figura 21. Morfologia de células HeLa tratadas com extratos de P.volubilis...61

(15)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Resultado das reações de identificação...45 Tabela 2: Resultado das análises por CCD de extratos de P. volubilis...53 Tabela 3. Porcentagem relativa dos compostos químicos dosados com os extratos de Plukenetia volubilis... 54

Tabela 4.Correlação de compostos fenólicos e açúcares dos extratos de

Plukenetia volubilis com atividade antioxidante total (CAT) e atividade

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LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS AOX Antioxidante

AP-1 Proteína ativadora 1

BHA ButiladoHidroxianisol

BHT Butil-hidroxitolueno

CAT Capacidade Antioxidante Total

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CF Compostos Fenólicos

DAPI 4 ',6-diamidino-2-fenilindol

DMEM Meio de cultura Eagle modificado Dulbecco

DMSO Dimetilsufóxido

DPPH 2,2’-difenil-1-picrilhidrazilo

EA Extrato Aquoso das folhas de Plukenetia volubilis EC Extrato Clorofórmico das folhas de Plukenetia volubilis EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EE Extrato Etanólico das folhas de Plukenetia volubilis EEA Equivalente de ácido ascórbico

EGCG Epigalocatequina Galato

EH Extrato Hexano das folhas de Plukenetia volubilis EM Extrato Metanólico das folhas de Plukenetia volubilis ERN Espécies Reativas de Nitrogênio

EROS Espécies Reativas de Oxigênio

FITC Isocianato de fluoresceína

MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio

NBT Nitroazul de tetrazólio

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OH- Radical hidroxila

OMS Organização Mundial de Saúde

PBS Tampão fostato salino

PI Iodeto de propídeo

PI3K Fosfatidilinositol3-quinase

PKC Proteína Quinase K

SOD Sódio Peróxido Dismutase

TCA Ácido tricloroacético

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

(18)

SUMÁRIO

1INTRODUÇÃO 19

1.1PLANTASMEDICINAISEETNOBOTÂNICA–BREVEHISTÓRICO 19

1.2FAMÍLIAEUPHORBIACEAE 23

1.2.1Espécie Plukenetia volubilis 25

1.3METABÓLITOSSECUNDÁRIOSEATIVIDADES BIOLÓGICAS 26

1.4RADICAIS LIVRES,ESTRESSEOXIDATIVOEDESORDENS CELULARES 28

1.5CÂNCER 31

2OBJETIVOS 34

3MATERIAISEMÉTODOS 35

3.1MATERIALVEGETAL 35

3.2TRIAGEMFITOQUÍMICA 35

3.2.1Reações de Identificação 35

3.2.1.1 Pesquisa de compostos fenólicos 36

3.2.1.2 Pesquisa de favonoides 36

3.2.1.3 Pesquisa de taninos 36

3.2.1.4 Pesquisa de saponinas 37

3.2.1.5 Pesquisa de alcaloide 37

3.3PREPARAÇÃOEFRACIONAMENTODOSEXTRATOS 37

3.4ANÁLISEPORCROMATOGRAFIAEMCAMADADELGADA 38

3.5COMPOSIÇÃOQUÍMICA 39

3.5.1Dosagem de açucares 39

3.5.2Dosagem de Proteínas 39

3.5.3 Dosagem de Compostos Fenólicos totais 39

3.6 ATIVIDADES BIOLÓGICAS 39

(19)

3.6.1.1 Determinação da atividade antioxidante total (CAT) 39

3.6.1.2 Atividade sequestradora de radical hidroxila 40

3.6.1.3 Atividade de quelação de íons metais 40

3.6.1.4 Teste do sequestro de íons superóxido 41

3.6.1.5 Teste do Poder Redutor 41

3.6.1.6 Atividade sequestradora de radicais livres DPPH 41

3.6.2 Atividade antiproliferativa 42

3.6.2.1 Teste de Viabilidade Celular – MTT 42

3.6.2.2Análise morfológica das células 43

3.6.2.4 Citometria de fluxo 43

3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA 44

4 RESULTADOS 45

4.1 TRIAGEM FITOQUÍMICA 45

4.1.1 Reações de identificação 45

4.2ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) 47

4.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA 52

4.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS 54

4.4.1 Avaliação da Atividade Antioxidante 54

4.4.1.1 Capacidade Antioxidante Total (CAT) 54

4.4.1.2 Sequestro do Radical DPPH 55

4.4.2 Avaliação da Atividade Antiproliferativa 57

4.4.2.1 Avaliação da Viabilidade de células expostas aos extratos 57

4.4.2.2 Avaliação das Alterações Morfológicas de células HeLa 60

4.4.2.3 Citometria de Fluxo 61

5 DISCUSSÃO 63

6 CONCLUSÕES 71

(20)

1. INTRODUÇÃO

1.1. PLANTAS MEDICINAIS E ETNOBOTÂNICA – BREVE HISTÓRICO

O histórico da utilização das plantas medicinais pela população humana data desde as antigas civilizações. Os povos Egípcios, Gregos e Romanos foram os primeiros a acumular os conhecimentos referentes a esta utilização dos vegetais, e essa cultura é mantida até os dias de hoje (ABOELSOUD, 2010; JI; LI; ZHANG, 2009). Além disso, os indígenas também contribuíram de forma significativa com os conhecimentos populares provenientes da exploração das ervas medicinais. O conhecimento tradicional indígena sobre as plantas foi transmitido através de várias gerações desde seu primeiro relato, que data entre 3500 a.C. e 800 a.C. (AYYANAR; IGNACIMUTHU, 2005; IGNACIMUTHU; AYYANAR; SIVARAMAN2006; SAHU; DHAL; MOHANTY, 2010). Dessa forma, percebe-se que a utilização de ervas na medicina caracteriza uma tradição bastante antiga, e isso ocorre principalmente nos países em desenvolvimento. Segundo Sahu (2010) tal fato ocorre devido ao nível de pobreza dos países subdesenvolvidos, bem como a falta de acesso à medicina moderna. No entanto, de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) em torno de 65 a 80 % da população de todo o mundo dependem essencialmente das plantas para tratamento de diversas doenças (HARVEY, 2008). Com isso, os investimentos em pesquisas e na comercialização nesta área têm movimentado mundialmente US$ 21,7 bilhões por ano. No Brasil, esse dado foi estimado em 270 milhões para o ano 2000, correspondendo a 15,9% do mercado brasileiro de medicamentos (CARVALHO, 2008).

(21)

em estruturas químicas já estabelecidas e sintetizados por grandes laboratórios mundiais. Contudo, a competição entre as companhias farmacêuticas para encontrar novos tipos de medicamentos, levou ao declínio desse sistema de fabricação. Assim, na década de 1970 os conhecimentos sobre os benefícios da utilização terapêutica das plantas foram reintroduzidos na população, principalmente entre os americanos que buscavam cuidados de saúde alternativos. No entanto, foi somente nos anos de 1990 que se deu início a era Biossintética, onde cerca de 80% de todos os medicamentos comercializados começaram a ser obtidos de raízes, cascas e folhas de plantas (CRAKER; GARDNER, 2006; LAM, 2007).

Todavia, o mercado de produtos naturais ainda apresentava limitações e por esse motivo nesse período houve um declínio no interesse por parte das indústrias farmacêuticas em realizar pesquisas para o descobrimento de novos princípios ativos de origem natural, isso porque encontrar um produto natural promissor para o tratamento de qualquer doença era um desafio, que envolvia gastos dispendiosos de tempo e dinheiro. Além de existirem alguns fatores limitantes, como por exemplo, a disponibilidade de quantidades da substância pura necessária para atender a demanda do mercado e tornar o produto um medicamento comercializado. Essa demanda pode chegar a centenas de milhares de quilograma do composto por ano, o que implicaria em sérios problemas ambientais (MCCHESNEY et al., 2007). Contudo, nessa mesma

(22)

caracterização destes compostos tornaram-se mais viáveis em menor tempo (LAM, 2007; LI; VEDERAS, 2009; MCCHESNEY et al., 2007). A era

biossíntetica também trouxe consigo o advento de ferramentas modernas nas áreas de Química e Biologia, em especial os avanços em Química Combinatória e Biologia Molecular. Estas novas ferramentas possibilitaram uma melhor compreensão dos efeitos biológicos dos compostos naturais no corpo humano, além de fornecer metodologias eficazes que tornaram possível a construção de bibliotecas dessas substâncias em laboratório, garantindo a reprodutibilidade da substância natural (HARVEY, 2008). Além disso, a utilização de ferramentas de genômica, proteômica, metabolômica e química combinatória representa um novo caminho para pôr em prática os conhecimentos acumulados durante centenas de anos na prática médica (BALUNAS; KINGHORN, 2005; CRAVOTTO et al., 2010; HARVEY, 2008;JI; LI;

ZHANG,2009; LAM, 2007).

É perceptível que a demanda por medicamentos a base de plantas vem crescendo mundialmente, entre os anos 1981e 2006, onde 1.184 novos fámacos foram registrados, dos quais 28% eram produtos naturais ou seus derivados (NEWMAN; CRAGG, 2007; WINK, 2012). Em 2001-2002 aproximadamente um quarto dos medicamentos de todo o mundo foram obtidos de origem natural, destes 60% dos compostos utilizados no tratamento do câncer e 75% dos fármacos utilizados para doenças infecciosas possuem como principal fonte compostos naturais de origem vegetal ou animal (BALUNAS; KINGHORN, 2005; MCCHESNEY et al., 2007). Porém, 12% das

plantas comercializadas para fins terapêuticos no mercado ocidental não apresentam estudos científicos publicados que comprovem suas propriedades medicinais, e cerca de uma a cada duzentas dessas plantas possuem compostos tóxicos ou alergênicos (ALVIANO; ALVIANO, 2009; CRAVOTTO et al., 2010). Portanto, para que ocorra a devida comprovação cientifica em

(23)

Além das novas tecnologias abordadas anteriormente, existe um campo de estudo que apresenta papel imprescindível em pesquisas científicas sobre a utilização das plantas com potenciais farmacológicos, trata-se da etnobotânica. Essa ciência apresenta caráter interdisciplinar, integrando os diversos conhecimentos populares a respeito das plantas e aliando os fatores culturais e ambientais (SHARMA; KUMAR, 2011). Desta forma, a etnobotânica abrange principalmente as subáreas das ciências naturais e sociais, contribuindo de maneira eficaz na busca por recursos naturais de utilização humana, com destaque para utilização na saúde. Os conhecimentos obtidos com a etnobotânicos fornecem dados importantes que servem como embasamento para desenvolvimento de pesquisas relacionadas às atividades farmacológicas de determinados vegetais, além de contribuir com os conhecimentos sobre a preservação destes recursos. Portanto, o passo inicial para uma pesquisa neste âmbito deve ser fundamentado nos conhecimentos populares advindos da pesquisa etnobotânica (IGNACIMUTHU; AYYANAR; SIVARAMAN, 2006; OLIVEIRA et al., 2009; SHARMA; KUMAR, 2011; SRIPATHI; SANKARI, 2010).

Alguns dados provenientes de pesquisas científicas e/ou estudos etnobotânicos têm dado subsídio para a utilização de algumas espécies de vegetais com fins terapêuticos. Eis alguns exemplos: espécies da família Anacardiaceae, tanto seus frutos, folhas e caule, são utilizados pela população da Amazônia contra doenças tropicais, dores de estômago e como antidiarreicos. A família Piperaceae por sua vez, apresenta um grande potencial anti-inflamatório, sendo seus extratos também muito utilizados na medicina popular (LIZCANO et al., 2010).

Diversos medicamentos comercializados na indústria farmacêutica de todo o mundo são obtidos a partir de compostos isolados de alguma espécie vegetal. A espécie Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) é talvez umas das espécies

de plantas mais estudadas quanto o potencial terapêutico, sendo amplamente utilizada para tratamento de distúrbios de memória, como a doença de Alzheimer. Atualmente a população faz uso tanto do seu extrato quanto de medicamentos comercializados a base de compostos obtidos a partir dessa espécie (QUINN et al., 2004). Outra espécie que tem valor importante do ponto

de vista terapêutico é a espécie Hypericum perforatum L. (Hyperaceae),

(24)

estudadas com relação a sua utilização na medicina, ela é utilizada para o tratamento de formas leves e moderada de depressão (BACH-ROJECKY, 2004). Diante desses aspectos e da biodiversidade de compostos naturais presentes na biosfera, torna-se evidente que a pesquisa por produtos de origem natural é ainda um campo vasto que ainda precisa ser explorado (MCCHESNEY et al., 2007).

1.2. FAMÍLIA EUPHORBIACEAE – GÊNERO PLUKENETIA sp

A família Euphorbiaceae constitui uma das maiores famílias de plantas com flores, com cerca de 300 gêneros e 8.000 espécies. Encontra-se distribuída principalmente em países tropicais e subtropicais, em vários tipos de vegetação e habitat, apresentando papel importante para economia local, como a mamona e o pinhão manso, que são utilizadas para a produção de óleo vegetal e biodiesel, a Manihot esculenta (macaxeira) de valor agronômico e

nutricional, e diversas outras que são aplicadas com fins medicinais, para tratamento de diversas patologias. As atividades mais comuns são potencial antimicrobiano, antifúngico, anti-inflamatório, antinociceptivo, antitumoral, contra doenças de pele entre outros efeitos farmacológicos (MWINE; DAMME; VAN, 2011; SAMY; GOPALAKRISHNAKONE, 2008; SECCO et al., 2012).

As espécies desta família são conhecidas pela ampla diversidade química de seus constituintes (SHI et al., 2008). Compostos como os diterpenos são

encontrados na maioria de seus gêneros. Outros constituintes bioativos foram isolados a partir de extratos de plantas do gênero Euphorbia, dentre eles

encontram-se os sesquiterpenos, cerebrosídeos, gliceróis, flavonoidese esteroides, compostos que estão diretamente relacionados a maioria das funções biológicas desempenhadas por extratos de plantas em organimos vivos (LLANES-CORONEL et al., 2010; MWINE; DAMME; VAN, 2011; SHI et al., 2008). No entanto, devido a esta vasta diversidade de constituintes e a

(25)

stricto, Pandaceae, Phyllanthaceae, Picrodendraceae, e Putranjivaceae

(MWINE; DAMME; VAN, 2011; SECCO et al., 2012).

Na literatura existem diversos relatos de espécies pertencentes à essa família que apresentam variadas atividades biológicas, por exemplo, o extrato obtido da casca do caule de Bridelia scleroneura apresenta propriedade

antinociceptiva e anti-inflamatória (THÉOPHILE et al., 2006), extratos aquosos

e metanólicos de Acalypha fruticosa possuem atividades antioxidantes e sua

utilização como precursor na síntese de drogas anti-neoplásicas vem sendo avaliada, já que em pesquisas anteriores foi apresentada uma boa atividade antiproliferativa contra linhagens de células tumorais (RAJKUMAR; GUHA; KUMAR, 2010). Muitas vezes o látex produzido pelas Euphorbiaceaes é extraído e utilizado com fim terapêutico, principalmente na cura de doenças de pele e no processo de cicatrização de feridas, neste âmbito o gênero Euphorbia

apresenta diversas espécies que são utilizadas para esses fins, tais como a E.

thymifolia, E. nerifolia e E. nivulia, entre outros gêneros e espécies, como o

Croton banplandianum que é aplicado contra sarnas e micoses (TRIPATHI;

SRIVASTAVA, 2010). Porém, devido a complexidade na constituição e a abrangência de quantidade de espécies pertecentes a família Euphorbiaceae, atualmente ainda existem gêneros e espécies que são pouco explorados do ponto de vista científico, um exemplo é o gênero Plukenetia.

O gênero Plukenetia é representado por dezenove espécies que se

caracterizam por serem trepadeiras, lianas ou raramente ervas perene, comum a distribuição pantropical, sendo assim encontradas pricipalmente em florestas tropicais úmidas. O gênero abrange membros da tribo Plukenetieae que apresentam ovário com quatro carpelos, e incluem as sinonimias

Tetracarpidium e Pterococcus (GILLESPIE 1993, 2007; RAMIREZ; GORDILLO;

DURÁN, 2000). Espécies do gênero Plukenetia não são endêmicas no Brasil,

mas apresentam distribuição geográfica na região Norte, nos estado de Roraima, Amapá, Pará, Amazonas, Acre e Rondônia, no Nordeste, no estado da Bahia, Centro-Oeste, no Mato Grosso e Sudeste, nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro (CORDEIRO; SECCO, 2012). Na literatura existem poucos relatos quanto à caracterização química e biológica de espécies pertencentes a esse gênero, contudo, espécies como Plukenetia

(26)

e Plukenetia volubilis endêmicas do sul da Nigéria e Amazônia,

respectivamente, são utilizadas pela população nativa na medicina popular e como fonte de alimentos, para obtenção de óleos comestíveis e de farinha (AKINTAYO; BAYER, 2002; AMAEZE et al., 2011; GUILLÉN et al., 2003).

Portanto, a pesquisa com espécies pertencentes ao gênero em questão se caracteriza de grande importância na elucidação de seus constituintes químicos e na comprovação da utilização popular com fins medicinais.

1.2.1. Plukenetia volubilis

Plukenetia volubilis é uma planta oleaginosa, trepadeira, pertecente a

família Euphorbiaceae, endêmica da floresta tropical de altas altitudes, com centro de origem na Amazônia Peruana, estendendo sua ocorrência a Amazônia Colombiana, Venezualena e Brasileira, cresce em regiões com 200 a 1500 m de altitude e é conhecida popularmente como sacha incha, amendoim inca ou amêndoa lopo (BORDIGNON et al., 2012; CORDEIRO; SECCO, 2012;

GUILLÉN et al., 2003;HAMAKER et al., 1992). Possui frutos tetralobulares e

sementes em forma lenticular, que apresentam em sua composição grande quantidade de óleo, vitaminas A e E, proteínas, além de alto teor de ômega-3, 6 e 9, ácidos graxos essenciais ao metabolismo humano (GUILLÉN et al.,

2003; FOLLEGATTI-ROMERO et al., 2009; PRADO et al., 2011). De acordo

com Huamàn et al. (2008) esses elevados teores de ácidos graxos

poliinsaturados são responsáveis por atuar na redução dos níveis de triglicerídeos pos prandial em adultos. Tem sido consumida por índios do Peru e acredita-se que tenha sido cultivada por pré-incas e incas, já que foram encontradas representações desta planta e de seus frutos em vasos e túmulos incas, daí a explicação para seu nome popular (GUILLÉN et al., 2003;

KRIVANKOVA et al., 2007). Estudos de caracterização do óleo produzido pelas

sementes de Plukenetia volubilis indicaram que seu valor nutritivo é

comparável ao da soja, sendo assim de grande importância nutricional na dieta (FOLLEGATTI-ROMEROet al., 2009; GUILLÉN et al., 2003; HAMAKER et al.,

1992; PRADO et al., 2011).

Além disso, o cultivo de Plukenetia volubilis representa alto potencial

(27)

apresenta boas propriedades nutracêuticas, e também vêm sendo utilizado na indústria de cosméticos. No Brasil, esse azeite é obtido de forma artesanal, a partir de sementes comercializadas por sites na internet (CÉSPEDES, 2006; BORDIGNON et al., 2012). Nativos da Amazônia consomem tanto as sementes

como suas folhas torradas como fonte de alimentação e dados etnobotânicos apontam para utilização das folhas no tratamento de doenças de pele, no entanto não exite nenhuma comprovação científica para esta utilização popular (GUILLÉN et al., 2003). Portanto, apesar da composição e propriedades de

sementes de Plukenetia volubilis serem relativamente bem conhecidas,

informações acerca do uso tradicional de suas folhas, ainda encontram-se precárias, e desta forma faz-se necessários estudos mais aprofundados sobre sua composição química e ação farmacológica.

1.3. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E ATIVIDADES BIOLÓGICAS

Metabólitos secundários são compostos orgânicos com estrutura química bastante diversificada o que lhe conferem uma gama de atividades biológicas desempenhadas em organismos biológicos. Diversas classes de metabólitos já foram identificadas em frutas, vegetais e grãos, porém grande parte destes compostos mantem-se não identificados e mais estudos são necessários nesta área, tendo em vista os conhecimentos a cerca dos benefícios fornecidos por esta classe de substâncias, principalmente na diminuição dos riscos de desenvolvimentos de diversos tipos de câncer e de doenças crônicas (LIU, 2003, 2004). Metabólitos secundários de plantas são representados, principalmente por: alcaloides, terpenóides, glicosídeos e fenóis (EDEOGA; OKWU; MBAEBIE, 2005).

Tais substâncias possuem como papel biológico nos vegetais a defesa contra ataques de herbívoros, escassez de água, ou a qualquer outro tipo de estresse biótico ou abiótico. Compostos ou agentes físicos que tenham a capacidade de desencadear esse tipo de resposta em organismos vivos, resultando no acúmulo de metabólitos, são denominados elicitores (VASCONSUELO; BOLAND, 2007).

(28)

fase do desenvolvimento da planta, composição do meio (presença de hormônios de crescimento) e condições de luminosidade. Alguns autores afirmam que a fase de crescimento exponencial é o melhor momento para síntese de metabólitos, pois é quando a maquinaria enzimática atinge maior pico de atividade. Hormônios como auxina e ácido jasmônico também atuam juntamente com os elicitores para induzir a produção de metabólitos secundários em vegetais (VASCONSUELO, 2003; VASCONSUELO; BOLAND, 2007). Assim, é importante ressaltar que preparações a base de plantas possuem centenas de componentes químicos e sua composição varia em função de diversos fatores ambientais, como luminosidade, temperatura, salinidade, disponibilidade de água, métodos de coleta, entre outros. Os procedimentos de extração utilizados farmaceuticamente envolvem a separação de compostos bioativos dos componentes inativos ou inertes por meio de solventes específicos. Esses solventes se difundem no material vegetal e solubilizam compostos com polaridade similar (TIWARI et al., 2011;

VASCONSUELO; BOLAND, 2007).

As variações que interferem na quantidade e qualidade dos metabólitos secundários extraídos são basicamente: tipo e tempo de extração, temperatura e natureza, concentração e polaridade do solvente (TIWARI et al., 2011).

Sendo assim, o método de preparação de extratos vegetais também pode interferir diretamente na eficácia de sua atividade biológica, de acordo com os compostos que foram extraídos, portanto, a padronização desses procedimentos é de grande importância, a fim de se obter produtos terapêuticamente ativos, sem componentes indesejáveis (VASCONSUELO; BOLAND, 2007; TIWARI et al., 2011).

Os recentes avanços ocorridos nos processos de isolamento, purificação e elucidação da estrutura de substâncias naturais tornou possível estabelecer estratégias apropriadas para a análise da qualidade, bem como o processo de normalização das preparações vegetais, a fim de manter a homogeneidade e a qualidade dos compostos extraídos de plantas. Com isso, a partir de extrações eficientes de compostos ativos ocorre a viabilização de testes para atividades biológicas e futuros desenvolvimento de fármacos (HUIE, 2002; NCUBE et al.,

(29)

Diversas evidências sugerem que os benefícios dos metabólitos secundários ou fitonutrientes nos organismos sejam ocasionados pela sua capacidade em inibir danos oxidativos causados por espécies reativas, como os radicais livres (LIU, 2004). Atualmente sabe-se que o estresse oxidativo está envolvido na etiologia de uma gama de doenças crônicas, dessa forma os fitonutrientes são substâncias que podem agir na prevenção e tratamento de diversas enfermidades, como câncer e doenças inflamatórias (SINGH; BHAT; SINGH, 2003). Além disso, as plantas consistem em boa fonte para o desenvolvimento de fármacos, atualmente existem diversos medicamentos derivados de espécies vegetais que são comercializados pela indústria farmacêutica, como exemplos pode-se citar a colchicina e o taxol, ambos utilizados no tratamento do câncer e isolados das plantas Colchium autumnale

e Taxus brevifolia, respectivamente (RAO; RAVISHANKAR, 2002).

1.4. RADICAIS LIVRES, ESTRESSE OXIDATIVO E DESORDENS CELULARES.

Atualmente existe uma grande preocupação em se encontrar compostos naturais que desempenhem atividade antioxidante, tendo em vista que diversas doenças são causadas pela toxicidade de componentes químicos capazes de gerar espécies reativas, chamados de compostos pró-oxidantes. Dentre esses compostos econtram-se os radicais livres, que são definidos como todas as moléculas ou átomos comum ou mais elétrons desemparelhados, sendo geralmente instáveis e altamente reativos. Esses são principalmente derivados do metabolismo do oxigênio (Espécies reativas de oxigênio, EROS) e nitrogênio (Espécies reativas de nitrogênio, ERN) (YASHIKAWA; NAITO;KONDO apud ALVIANO; ALVIANO, 2009; DEVASAGAYAM et al.,

(30)

dentre outras (ALVIANO; ALVIANO 2009; SOMOGYI, 2007). Em células normais existe um equilíbrio entre a quantidade de pro-oxidantes e antioxidantes (Figura 1), no entanto, esse equilíbrio pode ser deslocado no sentido dos pró-oxidantes, desencadeando um processo denominado estresse oxidativo, que é causado basicamente por dois mecanismos: a diminuição da concentração de antioxidantes ou pelo aumento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Figura 1).

Figura 1. Desequilíbrio na produção de antioxidantes (AOX) e espécies reativas de oxigênio (EROS). As células são normalmente capazes de balancear a produção de oxidantes e antioxidantes para manter o equilíbrio redox (Adaptado de Scandalios, 2005).

Entretanto, os radicais livres também desempenham papéis benéficos aos organismos, eles são essenciais na estabilização da homeostase redox, além de atuarem como modulador em certas vias de transdução de sinal (DEVASAGAYAM et al., 2004; SOMOGYI, 2007). É importante ressaltar que

nem todos os compostos reativos que causam danos são radicais livres, o peróxido de hidrogênio, por exemplo, não apresenta elétrons desemparelhados em sua última camada eletrônica, contudo, é considerada uma espécia reativa por fazer parte do metabolismo do oxigênio molecular e desta forma está envolvido na reação de formação do radical hidroxila (OH-), que é considerada a espécie reativa de oxigênio mais danosa aos sistemas biológicos (ANDRADE-JUNIOR et al., 2005).

(31)

de substratos orgânicos (Figura 1). Estes podem ser sintetizados pelo próprio organismo (antioxidantes endógenos), ou podem ser consumidos (antioxidantes exógenos). Deste modo, os organismos desenvolveram diferentes sistemas antioxidantes, que conferem proteção contra os danos causados por radicais livres. Estes sistemas consistem de antioxidantes enzimáticos abrangendo, por exemplo, a catalase, a sódio peróxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase e glutationa redutase; e os mecanismos não enzimáticos, representados principalmente por vitaminas (A e C), por carotenoides, alcaloides e por compostos polifenóis, como flavonoides e outros. No entanto, muitas vezes esses sistemas não são suficientes para proteção integral contra estresse oxidativo, sendo necessária a suplementação dos antioxidantes exógenos, principalmente através da alimentação (DEVASAGAYAM et al., 2004; SOMOGYI, 2007).

Com isto, torna-se cada vez mais crescente o interesse sobre os antioxidantes de origem natural, tendo em vista os diversos fatores negativos atribuídos aos antioxidantes sintéticos, um exemplo é o caso do butiladohidroxianisol (BHA) e do butil-hidroxitolueno (BHT), antioxidantes exógenos adicionados a alimentos que atuam inibindo ou atrasando a iniciação ou propagação da reação oxidativa, e que atualmente são suspeitos de serem carcinogênicos para animais (GUO et al., 2011). Por outro lado, percebe-se

que a eficácia antioxidante de um determinado composto pode ser demonstrada em um sistema e pode não atuar sobre outro e até mesmo causar danos. Como é o caso do composto BHA, que atua inibindo a peroxidação lipídica, porém não é capaz de proteger contra o estresse oxidativo a molécula de DNA e proteínas, estando inclusive associado a propenção de danos oxidativos ao DNA que apresentam como consequência o desenvolvimento de cânceres, principalmente de estômago (ARUOMA, 2003; GUO et al., 2011).

(32)

1.5. CÂNCER

O câncer é uma das principais causas de morte em todo mundo. Recentes relatos apontam para a ocorrência de cerca de dez milhões de novos casos por ano, e a organização mundial de saúde estima que em 2030 ocorra 27 milhões de casos incidentes da doença, com cerca de 17 milhões de mortes (WHO, 2011). Trata-se de um problema de saúde mundial que afeta tanto países desenvolvidos como subdesenvolvidos. O câncer resulta de múltiplos estágios e mecanismos de carcinogênese, que envolvem processos mutagênicos, morte celular e mecanismos epigenéticos, durante três etapas distintas, que são: iniciação, promoção e progressão (Figura 2) (KARIKAS, 2011; THANGAPAZHAM et al., 2006).

A iniciação é um resultado de mutações que ocorrem no DNA da célula, trata-se de um processo rápido e irreparável, que pode ser causado devido à absorção inicial de um agente cancerígeno e subsequente dano genotóxico estável causado pela sua ativação metabólica (THANGAPAZHAM et al.,

2006).Outras causas de início do câncer incluem estresse oxidativo, inflamação crônica e desequilíbrio hormonal (LEE; SURH, 2005; SURH,2003). No estágio de promoção as células iniciadas ou pré-transformadas sofrem mudanças para formar células pré-neoplásicas. Esse processo não é rápido como o da iniciação e pode ser reversível, envolve mecanismos inflamatórios e vias de transdução de sinais, tais como serina treonina quinase, Akt quinase/proteína quinase B, proteína ativadora 1 (AP-1), fator nuclear kappa B (NF-kappa B), proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), receptor andrógeno e as vias Raf/Ras. A fase de progressão, último estágio da trasformação neoplásica, é marcada por hipóxia induzindo fator de crescimento endotelial (VEGF) em células tumorais e expressão de metaloproteínases nas células endoteliais, levando a angiogênese, invasão do tumor e potencial metastásico (CROSS; CLAESSON-WELSH, 2001;LEE; SURH, 2005; THANGAPAZHAM et al., 2006).

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de prevenir, impedir ou reverter uma doença. De acordo com esses autores, os agentes quimiopreventivos podem ser classificados em duas categorias: os bloqueadores e os supressores (LEE; SURH, 2005; LEE; BODE; DONG, 2011; THANGAPAZHAM et al., 2006). Os agentes bloqueadores previnem que

substâncias carcinogênicas entrem em contato com sítios alvo nas células, impedindo a ativação metabólica e subsequente interação com macromoléculas alvos, como DNA, RNA e proteínas. Já os agentes supressores, inibem a transformação maligna de células iniciadas, evitando que essas células avancem para os estágios de promoção e progressão (Figura 2) (LEE; SURH, 2005; SURH, 2003).

Figura 2. Moléculas que bloqueiam ou suprimem os múltiplos estágios da carcinogênese. Carcinogênese é iniciada com a transformação da célula normal em uma célula cancerígena (célula iniciada). Estas células sofrem uma promoção de tumores em células pré-neoplásicas, que evoluem para células neoplásicas. (Adaptado de Surh, 2003).

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como a proteína quinase K (PKC) e a fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K), que são alvos moleculares importante de moléculas quimiopreventivas (KARIKAS, 2011; SURH, 2003).

Metabólitos secundários de plantas são conhecidos por serem bons agentes quimiopreventivos contra o câncer (ISSA; VOLATE; WARGOVICH, 2006; YANG et al., 2010). Moléculas como resveratrol, epigalocatequina galato

(EGCG), 6-gingerol e miricetina já foram descritos para atuarem modulando várias vias de sinais de transdução que culminam na indução de apoptose em células cancerígenas e inibição da proliferação do câncer (LEE; BODE; DONG, 2011). Dados como esses sugerem que a identificação dos mecanismos de ação dessas moléculas, baseados nos alvos moleculares já descritos, torna-se importante para o desenvolvimento de novos fármacos no tratamento do câncer. Por fim, a triagem de novos compostos vegetais promissores que promovam saúde e previnam doenças, faz-se necessário no âmbito de encontrar novas terapias que aliadas as já existentes possam aprimorar o tratamento de doenças, como o câncer.

Baseado no que foi exposto até então, e tendo em vista a escassez de trabalhos científicos que deêm subsídeo a utilização da espécie Plukenetia

volubilis na medicina popular e na alimentação, principalmente entre os nativos

(35)

2. OBJETIVOS

2.1. GERAL

O presente trabalho tem como objetivo verificar as atividades antioxidante e antiproliferativa de diferentes extratos obtidos a partir das folhas de Plukenetia volubilis.

2.2. ESPECÍFICOS

 Obter os extratos de folhas da planta Plukenetia volubilis utilizando

diferentes solventes de caráter polar e apolar;

 Realizar uma triagem fitoquímica das folhas de Plukenetia volubilis por

meio de reações químicas de identificação e Cromatografia em Camada Delgada (CCD);

 Determinar o teor de açúcares, proteínas e compostos fenólicos;

 Analisar o potencial antioxidante dos extratos, utilizando os seguintes testes: Capacidade antioxidante total (CAT), sequestro do radical hidroxila, quelação de íons metais, sequestro de íons superóxido, poder redutor e sequestro do radical DPPH;

 Verificar a atividade antiproliferativa dos extratos por meio do ensaio MTT;

 Analisar a morfologia de células HeLa tratadas com extratos de

Plukenetia volubilis;

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. MATERIAL VEGETAL

A espécie Plukenetia volubilis (Figura 3) foi cultivada em vasos

contendo terra vegetal e areia (1:1, p/p). Deste material foram coletadas as folhas frescas de plantas com cinco-seis meses de cultivo para preparação dos extratos. Uma amostra do material foi indentificada pelo botânico Dr. Jomar Jardim e depositada no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Nortecom o número 10854. A espécie foi cultivada na cidade de Parnamirim/RN (-05° 47 '42'' 35° 12'34'').

Figura 3. Plukenetia volubilis sob condições de cultivo.

3.2. TRIAGEM FITOQUÍMICA

3.2.1. Reações de identificação

As reações de identificação para triagem fitoquímica foram realizadas por métodos clássicos, segundo Wagner et al.(1996); Matos(1997); Simões,

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Para detecção de compostos fenólicos e flavonoides foram pesados 5 gramas de folhas frescas de Plukentia volubilis e adicionado 50 mL de etanol

70%. O extrato foi aquecido em chapa aquecedora e após atingir fervura foi deixado sob aquecimento por 10 minutos. Posteriormente o extrato foi filtrado e utilizado para as reações de indetificação.

3.2.1.1. Pesquisa de Compostos fenólicos

Uma alíquota de 2 mL do extrato alcoólico foi transferida para um tubo de ensaio, ao qual foram adicionadas 2 gotas de solução etanólica de cloreto férrico a 2,5%. O cloreto férrico atua como agente oxidante, oxidando as hidroxilas fenólicas e resultando em substâncias coradas (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.2.1.2. Pesquisa de Flavonoides

A presença de flavonóides foi analisada por meio da reação de Schinoda ou Cianidina. Assim, o extrato etanólico (2 mL) foi transferido para uma cápsula de porcelana e evaporado a extrato seco em banho-maria (50 °C). Posteriormente, foram adicionados 0,2 mL de clorofórmio para eliminação da clorofila e o resíduo foi redissolvido em 1 mL de etanol 70%. O extrato foi então transferido para um tubo de ensaio e 1 mL de HCL concentrado foi adicionado e em seguida adicionou-se 200 mg de magnésio em pó. A reação foi identificada através do desenvolvimento de coloração laranja a vermelha caracterizando assim a presença de compostos contendo um núcleo α -benzopirona (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.2.1.3. Pesquisa de Taninos

Para identificação do metabólito tanino foi preparado um extrato aquoso das folhas de Plukenetia volubilis por decocção. A reação para detecção de

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3.2.1.4. Pesquisa de Saponinas

A presença de saponinas foi analisada utilizando extrato aquoso das folhas de Plukenetia volubilis. Para a reação de identificação, 2 mL do extrato

foi transferido para um tubo de ensaio e adicionado 4 mL de água destilada. O tubo foi agitado verticalmente e vigorosamente durante 1 minuto. Após agitação, foi observado o aparecimento de espuma persistente. O teste de formação de espuma se baseia nas características físico-químicas do metabólito tanino, que apresenta a propriedade de diminuição da tensão superficial e formação de espuma persistente (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.2.1.5. Pesquisa de Alcalóides

Para pesquisa de alcaloides 2 gramas de folhas de Plukenetia volubilis

foram pesadas e adicionado 20 mL de ácido sulfúrico 10%. O extrato foi aquecido em uma chapa aquecedora e deixado sob fervura por 5 minutos. Após resfriamento o extrato foi filtrado e misturado em uma placa de vidro duas gotas para cada um dos reagentes utilizados, que foram: Hager, Bertrand, Mayer, Wagner e Drangedorff. As reações positivas possibilitam observar a formação de precipitado amarelo, branco e alaranjado, devido a característicados alcaloides de insolubilidadepor apresentarem conjugados na forma de sal com ácidos orgânicos e aminas livres (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.3. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS

Para a preparação dos diferentes extratos foram utilizadas 300 gramas de folhas frescas (dados prévios obtidos pelo grupo indicaram que folhas frescas apresentam melhor resultado quanto a atividade antioxidante e teor de compostos fenólicos quando comparados com as folhas secas) que foram trituradas manualmente e divididas em parte iguais para extração dos compostos com diferentes solventes de caráter polar e apolar, seguindo a proporção de 1:10 (p/v). Os solventes utilizados foram: metanol (MeOH), etanol (EtOH), clorofórmio, hexano, e água.

(39)

mesa agitadora a 50 rpm por aproximadamente 24h. Em seguida os extratos foram filtrados, em papel filtro whatman nº 1 e colocados para secar em rotavapor a 40 °C. Os extratos obtidos foram pesados e ressuspendidos em DMSO (Dimetilsufóxido) (CRQ/Nuclear) para uma concentração final de 10 mg/mL, solução estoque, e posteriormente foram submetidos as diferentes análises (Figura 4).

Figura 4: Esquema representativo das análises realizadas com os extratos de Plukenetia

volubilis. Os extratos foram submetidos a análises químicas e biológicas.

3.4. ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

A análise por CCD foi realizada usando como adsorvente cromatoplacas de alumínio de gel de sílica 60 F254. Como fases móveis foram escolhidas sistemas eluentes específicos, de acordo com os metabólitos secundários de interesse, sendo adaptados de acordo com o resultado obtido. O volume de extratos depositados em cada ponto da placa foram os mesmos para cada análise.

Foram selecionadasas seguintes fases móveis, Sistema I: acetato de etila (AcOEt):Ácido fórmico:Água:MeOH (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), Sistema II:tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5, v/v/v) e Sistema III: Diclorometano (CH2Cl2): MeOH (9:1, v/v). Após desenvolvimento da cromatografia com as duas fases móveis, a CCD foi analisada primeirantena luz UV no comprimento de onda de 254 nm.

EXTRATOS

ANÁLISES

QUÍMICAS

CCD’s

DOSAGENS:

ÁÇÚCAR PROTEÍNAS COMPOSTOS FENÓLICOS

ATIVIDADES

BIOLÓGICAS

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Neste processo foram utilizados quatro tipo de reveladores: Vanilina Sulfúrica, como revelador universal; Cloreto Férrico para a detecção de compostos fenólicos; Reagente Natural A 0,5 % (difenilboriloxietilamina), específico para flavonóides, observação sob luz ultravioleta em 254 nm e 366 nm; e Reagente de Drangendorf, para pesquisa de alcaloides.

A análise por CCD foi realizada usando como padrões amostras autênticas de canferol, apigenina, isorientina, luteolina e quercetina (Sigma®). Esses experimentos foram realizados no laboratório da Prof. Dr. Silvana Zucolotto, no departamento de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

3.5. COMPOSIÇÃO QUÍMICA

3.5.1. Dosagem de Açúcares totais

Os açúcares totais foram estimados pelo método do fenol/ácido súlfurico, usando galactose como padrão, sendo as leituras realizadas a 490 nm (DUBOIS et al., 1956).

3.5.2. Dosagem de Proteínas

O teor total de proteínas foi estimado pelo método de Bradford, utilizando a proteína albumina de soro bovino (Sigma) como padrão. As leituras foram realizadas a 595 nm (BRADFORD, 1976).

3.5.3. Dosagem de Compostos Fenólicos totais

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3.6. ATIVIDADES BIOLÓGICAS

3.6.1. Atividade Antioxidante

3.6.1.1. Determinação da atividade antioxidante total (CAT)

O ensaio é baseado na redução de Molibdênio+6 para Molibdênio+5 pelos extratos de Plukenetia volubilis e subsequente formação de um

complexo verde fosfato / Mo+5 em pH ácido (PRIETO, PINEDA, AGUILAR, 1999). Os tubos contendo os extratos nas concentrações de 100 e 250 µg/mL e a solução reagente (Ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sódio 28 mM e molibdato de amônio 4 mM) foram incubados a 95 °C por 90 min. Após o resfriamento dos tubos a temperatura ambiente, foi realizada leitura a absorbância de 695nm no espectofotômetro (FEMTO) e os resultados comparados com um branco. A capacidade antioxidante foi expressa em equivalentes de ácido ascórbico (EEA/g).

3.6.1.2. Atividade sequestradora de radical hidroxila

A atividade sequestradora de radical hidroxila foi investigada através da reação de Fenton (Fe2 +_+H

2O2→Fe3 ++ OH- + OH∙). Os resultados são expressos como porcentagem de inibição. Os extratos nas concentrações de 100 µg/mL e 250 µg/mL foram adicionados em 3mL de tampão fosfato (150 mM pH 7,4) e incubados com FeSO4.7H2O (10mM), saliciliato de sódio (2mM) e H2O2 (200 µL) a 37 °C por 1h. A reação foi detectada por monitoramento da absorbância a 510 nm. Os resultados foram comparados com um branco que foi preparado substituindo-se o H2O2 por tampão fosfato.

3.6.1.3. Atividade de quelação de íons metais

A capacidade de quelação de íons ferrosos pelos extratos de

Plukenetia volubilis foi investigada de acordo com métodos anteriormente

descritos (DECKER; WELCH, 1990) com algumas modificações (WANG

et al., 2008). Resumidamente, a solução contendo os extratos nas

(42)

os resultados comparados com um branco. A capacidade da amostra teste em quelar o íon ferroso foi calculada de acordo com a seguinte equação:

Habilidade de quelação (%) = ((A0– A1)/A0) x 100

Onde: A0 e A1 representam soluções com e sem a amostra teste, respectivamente.

3.6.1.4. Teste do sequestro de íons superóxido

O ensaio é baseado na capacidade dos extratos em inibir a redução fotoquímica do tetrazólio (NBT) no sistema de riboflavina-luz-NBT (DASGUPTA; DE, 2004). Onde, para cada 3 mL da solução reagente contendo tampão fosfato 50 mM (pH 7,8), metionina 13 mM, riboflavina 2 µM, EDTA 100µM e NBT 75 µM foram adicionados a solução de 1 mL dosextratos nas concentrações de 100 e 250 µg/mL. A produção do azul de formazana foi verificada pelo monitoramento através da absorbância a 560 nm após 10 minutos de iluminação com lâmpada fluorescente. Toda reação foi realizadadentro de câmara dissipadora de luz. Para o branco, foram utilizados tubos idênticos contendo os reagentes que foram mantidos no escuro.

3.6.1.5. Teste do Poder Redutor

O poder redutor das amostras foi quantificado conforme métodos anteriormente descritos (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006; WANG et al.,

2008). Resumidamente, 4 mL da solução contendo diferentes concentrações dos extratos (100 e 250 µg/mL) em tampão fosfato (0,2 M, pH 6,6), foi incubado com ferricianeto de potássio (1%) a 50 °C por 20 min. A reação foi finalizada pela adiçãoda solução de ácido tricloroacético (TCA) a 10%. A solução foi, então, misturada com água destilada e cloreto férrico (0,1% w/v) e a absorbância foi medida em espectrofotômetro a 700 nm.

3.6.1.6. Atividade sequestradora de radicais livres DPPH

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Resumidamente, aos extratos na concentração final de 100 e 250 µg/mL, foi acrescentado 1,5 mL de metanol e posteriormente adicionado 1 mL da solução metanólica de DPPH (Fluka) a 0,1 mM. Em seguida, a absorbância foi medida em 517 nm. A atividade de sequestro do radical (%) foi calculada pela seguinte equação:

Atividade sequestradora (%) = (1 - A1/A0) x 100%

Onde A0 é a absorbância do controle, e A1 é a absorbância das amostras.

3.6.2. Atividade antiproliferativa

3.6.2.1. Teste de Viabilidade Celular – MTT

Foi analisada a capacidade de células tratadas com extratos de

Plukenetia volubilis em reduzir o composto MTT (brometo de

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) a sais de formazan, a redução é realizada por desidrogenases mitocondriais de células com mitocôndrias íntegras. A redução do composto MTT a formazan foi verificada por espectrofotometria e foi considerada diretamente proporcional a atividade mitocondrial e viabilidade celular. As células de linhagens cancerígenas HeLa e A549, câncer de cólo de útero e pulmão, respectivamente e células não tumorais, fibroblastos 3T3, células de ovério de hamster CHO e macrófagos Raw foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com 7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM). Para o ensaio, as células foram colocadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 103 células/poço e permitido aderir

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cuidadosamente misturado, após 15 minutos de agitação em mesa agitadora a absorbância foi lida 562 nm usando o leitor de ELISA (Biotec µQuant). Como controle foram utilizados células tumorais e normais não tratadas, sendo cultivadas somente na presença do meio DMEM, o valor obtido com o controle foi considerado como 100% de proliferação. A porcentagem de proliferação celular foi calculada pela seguinte fórmula:

% de proliferação celular = Abs. da amostra 570 nm x 100 Abs. do controle 570 nm

3.6.2.2. Análise morfológica das células

Para visualização das alterações morfológicas de núcleo celular foi realizado o método de coloração DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol)descrito por Rabelo et al. (2012). Células HeLa foram plaqueadas em lâminas circulares

em placas de 24 poços (35.55 × 104_{cels/poço). Após 45 min a 37° C, meio} DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino foi adicionado numa atmosfera humidificada com 5% de CO2, para um volume final de 1mL por 24 h. Decorrido este tempo, o meio foi removido e as células foram mantidas em meio sem soro por mais 24h. O tratamento foi realizado durante 48 h com 250 µg/mL dos extratos (o tempo e a concentração foram determinados de acordo com os resultados do ensaio MTT). Após o tratamento, as células foram lavadas com tampão fosfato gelado (PBS), fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos e permeabilizadas com triton 0,1% por cerca de 20 minutos. Subsequentemente, as células foram novamente lavadas com PBS e incubadas com DAPI a uma concentração de 1 mg/mL durante 30 min, protegida da luz e a temperatura ambiente. As células foram visualizadas por microscopia de fluorescência (microscópio de fluorescência Olympus BX41), utilizando os filtros de fluorescência de 330-380 nm.

3.6.2.3. Citometria de fluxo