1 . Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de Pernambuc o , Rec ife, PE. 2 . Departamento de Medic ina Tro pic al e Labo rató rio de Imuno pato lo gia Keizo -Asami da Universidade Federal de Pernambuc o , Rec ife, PE. 3 . Cirurgia Pediátric a do Ho spital da Restauraç ão da Universidade Estadual de Pernambuc o , Rec ife, PE. 4 . Fac uldade de Medic ina da Universidade Federal de Pernambuc o , Rec ife, PE.
Financ iamento : Co nselho Nac io nal de Pesquisa – CNPq
Ender eço par a co r r espo ndência: Dra. Célia Maria Mac hado B arbo sa de Castro . Labo rató rio de Imuno pato lo gia Keizo -Asami ( LIKA) UFPE. Campus Universitário , 5 0 6 7 0 -4 2 0 Rec ife, PE.
Tel: 5 5 8 1 2 1 2 6 -8 4 8 6 , Fax: 5 5 8 1 2 1 2 6 -8 4 8 5 e-mail: c c astro @ lika.ufpe.br
Rec ebido para public aç ão em 2 3 /9 /2 0 0 5 Ac eito em 1 0 /8 /2 0 0 6
Fagocitose e viabilidade monocitária de pacientes com
esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica submetidos
à esplenectomia e ao auto-implante esplênico
Phagocytes rate and cellular viability of the monocytes in patients with
hepatosplenic schistosomiasis mansoni who underwent splenectomy
and auto-implantation of spleen tissue
Carlos Teixeira Brandt
1, Célia Maria Machado Barbosa de Castro
2,
Stella Maria Lisboa de Lavor
3e Francisco Machado Manhães de Castro
4RESUMO
Esquistossomose mansônic a persiste c omo problema médic o-soc ial no nordeste brasileiro. Em c rianç as, o tratamento c irúrgic o inc lui esplenec tomia e auto-implante esplênic o. Este proc edimento reduz a septic emia pós-esplenec tomia. O objetivo deste estudo fo i analisar a taxa de fago c ito se e viab ilidade de fagó c ito s mo no nuc lear es em po r tado r es de esquisto sso mo se hepatoesplênic a, submetidos à c irurgia, de 1 9 9 1 a 2 0 0 1 . Dos 2 2 indivíduos analisados, 1 1 eram portadores de esquistossomose hepatoesplênic a, submetidos à esplenec tomia e auto-implante esplênic o ( Grupo estudo) e 1 1 eram sadios ( Grupo Controle) . Os grupos tinham média de idades similar e proc ediam da mesma zona endêmic a ( Timbaúba-PE) . Não se evidenc iou diferenç a na taxa de fagoc itose c omparando-se o grupo c ontrole ( 3 6 ,1 % ± 4 ,9 % ) e o grupo estudo ( 3 3 ,5 % ± 5 ,7 % ) , p= 0 ,2 7 7 3 . Todavia, a viabilidade dos fagóc itos após estímulo c om lipopolissac arídio foi maior ( 9 4 % ) no grupo c ontrole, quando c omparado ao grupo estudo ( 6 5 % ) , p< 0 ,0 0 1 . Pode-se c onc luir que a esplenose assegura funç ão fagoc itária normal em monóc itos, entretanto, os fagóc itos possuem menor viabilidade frente a um estímulo noc ivo e duradouro.
Palavr as- chaves: Esquistossomose hepatoesplênic a. Esplenec tomia. Esplenose. Monóc ito. Fagoc itose.
ABSTRACT
Mansonic schistosomiasis remains a medical-social issue in Northeastern Brazil. In children, surgical treatment includes splenectomy and spleen autoimplantation. This proc edure reduc es post-splenec tomy sepsis. The aim of this study was to analyze the phagoc yte rate and the c ellular viability of monoc ytes in patients with hepatosplenic sc histosomiasis, who underwent splenec tomy and spleen autoimplantation from 1 9 9 1 to 2 0 0 1 . Of the 2 2 individuals analyzed, 1 1 were patients who underwent splenec tomy and spleen autoimplantation ( Study group) and 1 1 were healthy individuals from the same region ( Control group) . Both groups presented similar mean age. No differenc e was found in the phagoc yte rate between the c ontrol group ( 3 6 .1 %± 4 .9 %) and study group ( 3 3 .5 %± 5 .7 %) . However, phagoc yte viability after stimulation with lipopolysac c haride was higher ( 9 4 %) in c ontrol group, when c ompared to the study group ( 6 5 %) , p< 0 .0 0 1 . It is possible to hypothesize that monoc ytes from the study group patients presented a reduc ed response to the mic roorganism c hallenge, in the fac e of a harmful and long-lasting stimulus.
A esquistossomose mansônic a persiste c omo problema médic o-soc ial no Nordeste do B rasil. O emprego, em larga e sc ala, da q uimio te r apia e mo dific aç õ e s amb ie ntais são fato res de reduç ão das fo rmas graves da do enç a. Mas, o estabelec imento de novos foc os de transmissão mantém a parasitose em expansão nessa região2 1 2.
No gr upo pe diá tr ic o a fo r m a he pa to e splê nic a po de determinar hipertensão porta ( HP) , sangramento digestivo, hiperesplenismo e hipodesenvolvimento. A maioria destes pac ientes é tratada c linic amente, porém alguns requerem esplenec tomia, ligadura da veia gástric a esquerda, assoc iada ao auto-implante de tec ido esplênic o, no omento maior7.
O b a ç o a s s um e im po r ta n te s fun ç õ e s de de fe s a do hospedeiro. Como um filtro c aptura e apresenta antígenos a um grande número de c élulas T e B que residem ou c irc ulam no sistema linfóide. A c omplic aç ão mais temida, em c rianç as, é a septic emia fulminante pó s-esplenec to mia ( SFPE) c uj a m o r ta lida de a tin ge 5 0 - 7 5 % do s pa c ie n te s1 6. Ta l fa to é atribuído à defic iênc ia da atividade fagoc ític a mononuc lear2 6. Do ponto de vista imunológic o o baç o é o maior órgão linfó ide do o r ganismo e o pr inc ipal lo c al das r e spo stas imunes a antígenos originados no sangue. Ele é também a maior fonte de imunoglobulina G ( IgG) , imunoglobulina M ( IgM)1 3, e o maior loc al de produç ão de fatores envolvidos no proc esso fagoc ític o de bac térias enc apsuladas tais c omo: opsoninas, tuftsina3 4 e properdina2 6. Assim, a esplenec tomia im plic a e m de fic iê nc ia da atividade das c é lulas m o no -m a c r o fá gic a s , q ue s ã o r e s po n s á ve is pe la a de r ê n c ia a s bac térias, seguida de fagoc itose e destruiç ão das mesmas, mediada pela geraç ão de produtos mic robic idas1 9 3 2 3 3.
O a u to - i m p l a n te e s p l ê n i c o a p r e s e n ta e fi c á c i a n a manutenç ão da funç ão imunitária esplênic a nesses pac ientes e sq uisto sso m ó tic o s q ue r e q ue r e m e sple ne c to m ia to ta l, de s ta c a n do - s e a m a n u te n ç ã o de a s p e c to s fu n c i o n a i s das c é lulas m o no - m ac r o fágic as do b aç o o r iginal se ndo responsável, portanto, por diminuir os risc os de SFPE7 1 6 1 8 2 0. Vário s auto res refo rç am o benefíc io do auto -implante esplênic o na funç ão da respo sta imuno ló gic a6 7 1 6 2 4 3 0. No entanto, ainda são c ontroversos os estudos sobre quais as funç ões espec ífic as exerc idas pelo baç o original não podem se r assum idas, de fo r m a ple na, pe lo s fr agm e nto s auto -implantados1 9 1 0 2 2.
A esplenec tomia foi c onsiderada durante várias déc adas, c omo uma c irurgia benigna, e o baç o c omo um órgão sem fun ç ã o pr e c is a . En tr e ta n to , a o b s e r va ç ã o da SFPE te m e stim ulado pe sq uisas vo ltadas par a a funç ão e splê nic a, pr inc ipalm e nte im uno ló gic a e as c o nse q üê nc ias da sua retirada1 7 1 9 2 1 2 3 2 6.
O auto-implante esplênic o em bolsa, no omento maior, te m sido r e c o me ndado c o mo a fo r ma mais ac e itáve l de preservar a funç ão do baç o quando a esplenec tomia total é inevitável1 6 3 2 3 3. No B rasil, vário s autores têm dado suporte c ie n tí fic o à im p o r tâ n c ia da fu n ç ã o do a u to - im p la n te e splê nic o . Esse s tr ab alho s de mo nstr am o s b e ne fíc io s da funç ão imunológic a esplênic a6 7 9 2 3 2 4 2 5.
O presente estudo tem o propósito de avaliar os benefíc ios do r e m ane sc e nte e splê nic o auto - im plantado no gr ande omento, em pac ientes c om esquistossomose hepatoesplênic a submetidas a esplenec to mia c o m auto -implante de tec ido e splê nic o , atr avé s da análise de aspe c to s func io nais das c élulas mono-mac rofágic as c omo determinaç ão da taxa de fagoc itose e análise da viabilidade c elular após estimulaç ão c ontinuada, c onstituindo aspec tos ainda não reportados na literatura mundial atual.
PACIENTES E MÉTODOS
Desenho do estudo e seleção de pacientes. Trata-se de um estudo de c ampo, prospec tivo analític o, tipo c orte transversal, onde os voluntários foram inc luídos de forma aleatória; sendo o objeto de estudo, os monóc itos isolados do sangue periféric o e trabalhados in vitro.
Os 2 2 vo lun tá r io s e r a m pr o ve n ie n te s da Cida de de Ti m b a ú b a , n a zo n a d a m a ta d e P e r n a m b u c o . Fo r a m c onstituídos dois grupos: Grupo 1 : Grupo c ontrole ( GC) – c o nstituído po r 1 1 a do le sc e nte s e a dulto s j o ve ns, se m e s q u i s to s s o m o s e , a te s ta d o p o r Ka to - Ka tz n e ga ti vo e Grupo 2 : auto-implante esplênic o ( AI) – c onstituído por 1 1 adolesc entes e adultos jovens, portadores de EHE c onfirmada por parasitológic o de fezes ( Kato-Katz positivo), identific aç ão de fib r o se de Symme r s na ultr a-so no gr afia e q ue fo r am admitidos e operados no Serviç o de Cirurgia Geral da Crianç a, do Hospital das Clínic as, do Centro de Ciênc ias da Saúde, da Universidade Federal de Pernambuc o, no período de 1 9 9 1 a 2 0 0 1 . Todos os pac ientes deste grupo foram submetidos à esplenec tomia, ligadura da veia gástric a esquerda e auto-implante de tec ido esplênic o no grande omento.
No grupo c ontrole, foram 5 ( 4 5 % ) indivíduos do sexo masc ulino e 6 ( 5 5 % ) do sexo feminino. A idade variou de 1 4 a 2 3 anos, c om mediana de 1 6 .0 . No grupo auto-implante, foram 4 ( 3 6 % ) indivíduos do sexo masc ulino e 7 ( 6 4 % ) do sexo feminino. A idade variou de 1 4 a 2 3 anos, c om mediana de 1 5 , 2 . Os pac ientes tinham à époc a da c irurgia, idades variando entre 9 e 1 8 anos, c om mediana de 1 2 ,9 anos. A c onfirmaç ão do auto-implante esplênic o foi feita através da c intilografia c om c aptaç ão do radiofármac o em 1 0 0 % dos c asos. Não houve desenvolvimento de SFPE em nenhum dos pac ientes operados.
Foram exc luídos pac ientes c om diagnóstic o c línic o e/ou laboratorial de doenç a hepátic a, ingestão abusiva de álc ool, antec edentes de hepatite ou de doenç a hematológic a além da utilizaç ão de imuno supresso res o u imuno estimulantes durante o período de estudo.
foram adic ionados 1 0 mL de histopaque ( 1 0 7 7 -SIGMA) , sendo então c entrifugados por 3 0 minutos a 4 5 0 x g ( 2 º a 8 ºC) .
O plasma foi aspirado e a c amada formada pelas c élulas mononuc leares do sangue periféric o foi c oletada e transferida para outro tubo. Assim, neste último tubo foram adic ionados 1 5 mL RPMI 1 6 4 0 , e em seguida, realizou-se c entrifugaç ão po r 1 0 m in uto s n a s m e s m a s c o n diç õ e s a n te r io r e s . O so br enadante fo i aspir ado e despr ezado . Po ster io r mente, duas novas lavagens do sedimento foram realizadas c om RPMI 1 6 4 0 , c entrifugando-se por 5 min de c ada vez. O sobrenadante fo i despr ezado e o sedimento fo i r essuspendido em 2 ml de meio de c ultura RPMI 1 6 4 0 c o mpleto , c o ntendo so ro fe tal b o vino a 3 % e antib ió tic o s ( pe nic ilina 1 0 0 U/mL e estreptomic ina 1 0 0 mc g/mL) .
Ao final, realizou-se contagem das células em câmara de Neubauer colocando-se a suspensão de células e o corante azul tripan na concentração de 0,3% e diluído de 1:10. A concentração celular foi então ajustada em todos os experimentos para 1 x 106 c élulas/mL. Apó s a r ec uper aç ão das c élulas, essas fo r am ressuspendidas em RPMI 1640 completo, contadas e distribuídas na proporção de 106 células/mL. Para os dois ensaios os monócitos foram obtidos após o tempo de adesão das células de uma hora e terminado esse tempo, realizou-se lavagem do poço ou da lâmina de vidro com meio de cultura RPMI, para retirada das células não aderentes restando apenas monócitos.
Avaliação da taxa de fago cito se. Para se avaliar a taxa de fago c ito se, fo ram utilizado s fungo s Sac c haromyc es sp. Os fungo s fo r am lavado s tr ê s ve ze s c o m so luç ão salina balanc eada de Hanks ( HB SS) . Em seguida, 1 08 fungos/mL foram misturados em suspensão, c ontendo 1 06 c élulas/mL de meio RPMI 1 6 4 0 .
As c élulas mononuc leares e os fungos foram distribuídos em lâminas para mic rosc opia óptic a e inc ubadas 3 7 ºC, em atmosfera úmida, por um período de uma hora. Após esse período, as lâminas foram lavadas c om HBSS ( c om retiradas da s c é lula s m o n o n uc le a r e s n ã o a de r e n te s ) , s e c a da s a temperatura ambiente e c oradas c om Diff-Quic k set ( Baxter Dade, Dudinen, Switzerland) . A leitura foi feita em microscópio óptic o, c om aumento de 1 .0 0 0 vezes. A taxa de fagoc itose foi obtida em perc entual, através da c ontagem de monóc itos que fagoc itaram o fungo, em um total de 2 0 0 c élulas.
Avaliação da viabilidade celular. Para avaliaç ão da via b ilida de c e lula r, utiliza r a m - se m o nó c ito s q ue fo r a m c oloc ados em plac as tipo Falc onTM, c om seis poç os de 3 5 mm de diâmetro c ada, e dispensados 2 mL da suspensão c om 1 06 c é lula s /m L e m m e io de c ultur a RPMI 1 6 4 0 c o m ple to . Esperou-se o tempo de uma hora para adesão das c élulas e terminado esse tempo, realizou-se lavagem do poç o c om meio de c ultur a RPMI par a r etir ada de c élulas não ader entes. Deixando-se por mais uma hora na inc ubadora a 3 7 ºC e 5 % de CO2 para estabilizaç ão das mesmas. Em seguida, dois poç os fo ram preparado s para c ada indivíduo . Um po ç o em que foram adic ionadas c élulas em meio de c ultura RPMI, no total de 2 x 1 06 c élulas/mL ( c ontrole) e no outro poç o, c élulas em meio de c ultura RPMI, 2 x1 06 c élulas/mL, sendo 1 ,8 mL
de meio RPMI e 2 0 0 mc L de lipopolissac arídio de Esc heric hia c o li, 0 5 5 : B 5 , Difc o - De tr o it/USA, e m s o luç ã o s a lin a n a c onc entraç ão de 1 0 mc g/mL, perfazendo um total de 2 mL por po ç o ( m o nó c ito s tr atado s) . Po ste r io r m e nte , as c é lulas fic aram em inc ubadora nas mesmas c ondiç ões para iníc io do ensaio.
O MTT ( 3 -[ 4 ,5 -dimethylthiazol-2 yl] -2 ,5 -diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue) é o sal tetrazolium que, após clivagem por desidrogenases mitocondriais de células, torna-se insolúvel em água pela formação de cristais de formazan e solúveis em solventes orgânicos. Apenas as enzimas de células vivas causam esta conversão.
Em meio de cultura com células, após adição de dimetil sulfóxido ( DMSO-solvente orgânic o) , o MTT c onvertido em formanzan é solubilizado e pode ser lido por espectrofotometria em função desta conversão. Esta reação pode ser expressa em percentual de células vivas de acordo com a absorvância e obtém-se então, o percentual da viabilidade celular. Para isso, após completar o período de 18 horas, a placa de cultura de células foi retirada da estufa e o sobrenadante de cada poço foi desprezado. Em seguida, a monocamada de células de cada poço, foi lavada com 1mL de tampão fosfato a temperatura ambiente ( PBS a 0,01M pH 7,02) e colocou-se na camada de células 550mcL de PBS e 55mcL da solução de MTT ( 5mg/mL) . O conteúdo dos poços foi homogeneizado e a placa foi envolvida com papel alumínio ( para proteger da luz) . A placa foi incubada pelo período de 4 horas em estufa nas mesmas condições e decorrido o tempo de 4 horas foram acrescentados 200mcL de PBS e 200mcL de DMSO ( SIGMA) . Em seguida, a camada de células foi raspada de cada poço da plac a por um sc rape. Terminada esta etapa, o material foi transferido para tubos Eppendorfs, envoltos em papel alumínio e agitados em vórtex para, em seguida, serem efetuadas as leituras do material de cada poço, em espectrofotômetro, utilizando-se um comprimento de onda de 570nm.
Os r e s ulta do s fo r a m e x pr e s s o s e m pe r c e n tua is de viab ilidade do s po ç o s c o ntr o le s e do s po ç o s de c é lulas estimuladas c om lipopolissac arídio de E. c oli 0 5 5 :B 5 ( LPS) . Para verific aç ão de diferenç a entre médias dos grupos, utilizou-se o teste t de Student para amostras independentes, análise de variânc ia ( ANOVA) e o teste de Tukey-Kramer c aso a ANOVA revelasse diferenç a signific ante. Ac eitou-se p < 0 ,0 5 para rejeiç ão da hipótese de nulidade.
O e studo o b e de c e u ao s pr inc ípio s da de c lar aç ão de Helsinque e foi aprovado pela Comissão de Étic a em Pesquisa do Centr o de Ciênc ias da Saúde da UFPE. Os vo luntár io s assinaram o termo de c onsentimento livre e esc larec ido.
RESULTADOS
Viabilidade celular ao 3 [ 4 ,5 dimethylthiazol 2 yl] -2 , 5 - diphe nylte tr a z o lium br o mide thia z o lyl blue . O ensaio foi subdividido em 4 grupos: o grupo c ontrole, c ujas c élulas dos indivíduos não foram tratadas c om LPS ( GC) , o gr upo c o ntr o le c uj as c é lulas fo r am tr atadas c o m o LPS ( GCLPS) , o grupo dos pac ientes c om auto-implante e c om c é lulas se m tr atam e nto c o m o LPS ( AI ) e o gr upo do s pac ientes c om auto-implante e c ujas c élulas foram tratadas c o m o LP S ( AI LP S ) . Os va l o r e s d a s l e i tu r a s d o e s p e c tr o fo tô m e tr o , d a d o s e m a b s o r vâ n c i a , fo r a m tr a n s fo r m a d o s e m p e r c e n tu a i s d e c é l u l a s vi á ve i s e representados pelas médias ± desvios padrão do perc entual de viabilidade c elular.
Co mparando -se dentro de um mesmo grupo , o grupo c o ntr o le o b te ve a m é dia de va lo r e s de a b so r vâ nc ia de 1 7 1 ,8 ± 2 ,9 e 1 0 0 % de viabilidade c elular. Após estimulaç ão c o m o LPS ( GCLPS) , a m é dia fo i de 1 8 4 , 4 ± 3 8 , 4 e a viabilidade c elular foi 9 3 % . O teste aplic ado foi a análise de
variânc ia ( ANOVA) e para situar a diferenç a entre as médias a plic o u- s e o te s te de Tuk e y- Kr a m e r pa r a um p< 0 , 0 5 . Comparando-se o GC c om o GCLPS não houve diferenç a entre os dois grupos, p> 0 ,0 5 ( Figura 2 ) .
De n tr o do gr upo do s a uto - im pla n ta do s , n o AI s e m tr a ta m e n to c o m o LPS, a m é dia fo i 2 0 1 , 5 ± 3 3 , 7 e a viab ilidade c e lular fo i 9 6 % . Apó s tr atame nto c o m o LPS ( AILPS) foi de 2 3 4 ,0 ± 4 3 ,5 e a viabilidade c elular foi 6 5 % . Não houve diferenç a entre os grupos, p> 0 ,0 5 . Não havendo também diferenç a entre o grupo de auto-implantados c om e sem LPS ( Figura 2 ) .
No entanto, em c omparaç ões efetuadas entre os diferentes gr upo s ( GC e AI c o m o u sem tr atamento c o m o LPS) , o perc entual da viabilidade dos monóc itos foi diferente entre os grupos GCLPS e AILPS, a diferenç a das médias foi igual a 4 9 ,5 5 e o p< 0 ,0 5 evidenc iando uma diferenç a signific ante, apó s e stím ulo po r te m po pr o lo ngado c o m LPS so b r e a viabilidade c elular ( Figura 2 ) .
A taxa de fago c ito se fo i expressa pela média ± desvio padrão do perc entual. Não ho uve diferenç a entre o GC e AI, teste t de Student, p= 0 ,2 7 7 .
Figur a 1 - Taxa de fago cito se em mo nó cito s.
Grupo controle com células sem tratamento com LPS ou tratadas com LPS, respectivamente: GC e GCLPS. Grupo auto-implante com células não tratadas com LPS ou tratadas com LPS, respectivamente: AI e AILPS. As absorvâncias foram transformadas e representados pelas médias ± desvios padrão do percentual de viabilidade celular. * As d i fe r e n ç a s d e te r m i n a d a s p e l o te s te d e ANOVA e te s te d e Tu k e y- Kr a m e r, c o m p < 0 , 0 5 .
Figur a 2 - Per centual de viabilidade celular do s difer entes gr upo s.
%1 0 0
8 0
6 0
4 0
2 0
0
3 6 ,0 9
3 3 ,5 4
Grupos
GC
AI
Grupos
9 6
*
6 5
GC
GCLPS
AI
AILPS
%1 2 0
1 0 0
9 3
1 0 0
8 0
6 0
4 0
2 0
DISCUSSÃO
A SFPE é c ausada na maioria dos c asos por pneumoc oc os, c ujos polissac arídeos da c ápsula são c onsiderados antígenos do tipo 2 c élulas T independentes. É c onhec ido que a inic iaç ão da resposta imune depende da presenç a de tec ido esplênic o, em partic ular do c ompartimento func ional marginal de c élulas B. Assim sendo, a memória IgM das c élulas B requerem tec ido esplênic o para sua geraç ão e ou sobrevida, e são responsáveis pela proteç ão c ontra bac térias enc apsuladas1 4.
Muito embora o auto-implante de tec ido esplênic o esteja sendo realizado numa tentativa de restaurar a funç ão imune normal do baç o, ainda é bastante c ontroversa na literatura mundial atual a c apac idade deste tec ido auto-transplantado em inic iar uma reaç ão primária humoral aos antígenos TI-2 , e assim prevenir c ontra SFPE.
No presente estudo, os pacientes que constituíram o grupo dos pacientes esplenectomizados e que receberam auto-implante esplênico foram também submetidos a profilaxia contra SFPE, e a incidência desta foi nula. Estudos anteriores demonstram que a regeneração do tecido esplênico auto-implantado se faz melhor em indivíduos jovens do que mais velhos1 1. Portanto, a faixa etária incluída no presente estudo parece reproduzir a época de melhor regeneração do tecido auto-implantado permitindo a análise das funções imunes de forma mais fidedigna.
A esplenec tomia assoc iada ao auto-implante de tec ido esplênico no grande omento, também é citada em trabalhos anteriores sugerindo ser este local de implante escolhido o mais apropriado, em função da rica vascularização e da abundância de células inflamatórias, fatores de crescimento e citocinas, e pelo fato do sangue venoso desta estrutura drenar para a veia porta, assim como o sangue proveniente do baço. A confecção da bolsa omental acrescenta ainda, a vantagem de colocar as duas faces do baço em contato com o folheto omental4 5.
Com relaç ão à massa de tec ido esplênic o implantado, no presente estudo , implanto u-se fragmento s de 2 x 2 c m do pó lo s upe r io r do b a ç o c o m m a s s a e s plê n ic a to ta l de aproximadamente 1 0 0 g, próximo ao peso normal do baço para o grupo etário inc luído no estudo. Outros autores, porém, advogam que não há uma c orrelaç ão direta entre o peso da massa esplênica implantada e a massa regenerada, não havendo também diferenç a na quantidade de tec ido regenerado nem no fluxo sangüíneo por grama de tec ido esplênic o, quando o baç o é implantado parc ialmente ( 5 0 % ) ou por inteiro. O fluxo sangüíneo da esplenose, para estes mesmos autores, situa-se em torno de 1 5 % dos valores c ontrole2 3.
Alé m da q ua n tida de a de q ua da de te c ido e s plê n ic o implantado o estudo de fagócitos é importante no sentido de que com a retirada do baço, quantidade enorme destas células são retiradas do hospedeiro e, portanto a resposta às bactérias é prejudicada8. No caso do auto-implante, estes irão manter uma certa quantidade destas células. Os fagócitos mononucleares exibem mudanças físicas e bioquímicas, incluindo aumento do tamanho, conteúdo protéico, atividade de enzimas lisossômicas, fagocitose, produção de ânion superóxido e atividade tumoricida.
A fagocitose desenvolvida por estas células é o início do conjunto das atividades biológicas de toda a resposta imunológica, que é constituída por várias etapas tais como: aderência ao substrato, quimiotaxia, ingestão de partíc ulas inertes e produç ão de superóxido5.
Na presente análise, a taxa de fago c ito se estudada fo i semelhante entre os dois grupos, c ontrole e auto-implantados, sugerindo que este parâmetro func ional se manteve dentro dos padrões de normalidade c omo oc orreria c om indivíduos c om o baç o original. Este dado vem a c onc ordar c om vários autores que avaliaram a c apac idade fagoc ític a dos pac ientes auto-implantados. Em 1 9 9 0 , Shokouh-Amiri e c ols2 7 estudaram e xpe r ime ntalme nte o pape l da e sple ne c to mia c o m auto -implante esplênic o em relaç ão a funç ão fagoc itária no sangue periféric o , e o bservaram que a esplenec to mia diminuía a c apac idade fagoc ític a e que a mesma se normalizava após o auto-implante esplênic o2 7.
Ainda apresentando resultados concordantes com o presente estudo , em 1 9 9 4 , Heuneking e c o ls1 1 analisaram a maio r inc idê nc ia de r e ge ne r aç ão do te c ido e splê nic o e m se r e s humanos, através de estudo clínico retrospectivo. Os autores analisaram 2 1 pacientes entre 1 0 e 1 7 anos que receberam auto-implante esplênico após esplenectomia, comparando-os com indivíduos apenas esplenectomizados da mesma faixa etária. E analisaram a taxa de fagocitose para pneumococo in vitro. Os resultados demonstraram a plena eficácia do tecido esplênico auto-implantado1 1.
O papel do baç o autotransplantado na proteç ão c ontra bactérias encapsuladas ainda é melhor estudado do que em relação as bactérias não encapsuladas. O ensaio realizado por Thalamer e cols3 1, em 1 9 8 6 , trata-se do clearance de bactérias Gram-negativas não encapsuladas e que os autores constataram uma grave disfunção em autotransplantados quando comparados c o m b aç o s no r mais, e xe r c e ndo ape nas 2 % da atividade microbicida do grupo controle. A razão deste feito, especulada pe lo s auto r e s par e c e se r o tam anho lim itado da m assa transplantada e/ou ainda, redução de funções imunes específicas nos pacientes esplenectomizados. A vacinação contra E. coli aumentou a eficiência da atividade macrofágica de ambos os grupos estudados3 1.
esplênic o, os ratos, divididos em grupos c ontrole e auto-implantados, foram sacrificados e uma suspensão de células esplênicas foram expostas a S. aureus. Observaram que as células do tecido esplênico auto-implantado fagocitaram menos bactérias ao longo de 60 minutos. Constataram ainda, que o aumento da fagocitose seria feito de forma mais lenta em relação ao grupo controle e apenas atingiria sua atividade plena cerca de 60 minutos além do tempo que levaria o tecido esplênico normal para atingir o platô de sua capacidade fagocitária máxima.
Os auto r e s c o nc luír am, po r tanto , q ue o te c ido auto -implantado em modelo animal c ontém menos fagóc itos e estes parec em apresentar menor índic e de fagoc itose por c élula2 9. Tem sido admitido limitaç ões ao remanesc ente esplênic o em c umprir seu papel na resposta imunitária em seus vários níveis2 8 2 9. Porém, existem ensaios c ujos autores c onc luíram que o te c ido e splê nic o auto -implantado po de c o ntr ib uir sinérgic a ou isoladamente, em fases diferentes da resposta imune, para que o monóc ito tenha uma atividade mic robic ida p r ó x i m a a o n o r m a l a tr a vé s da s fu n ç õ e s i m u n e s q u e c ontinuam se proc essando no tec ido auto-implantado3 1 5.
Tem sido demonstrado que a aderênc ia dos mac rófagos de ratos esplenec tomizados é diminuída, c ontudo o auto-im plante e splê nic o r e staur ar ia e sta atividade func io nal. Entretanto, B randt e c ols5 c onstataram que se c omparando pac ientes implantados e esplenec tomizados sem auto-implante, o índic e de aderênc ia de monóc itos foi semelhante ao grupo de indivíduos sadios. Sendo possível inferir que a esplenec tomia seguida ou não de auto-implante esplênic o não interfere nesta propriedade das c élulas monoc ític as5.
Ou tr o a s p e c to d a i m u n i d a d e e m p a c i e n te s a u to -implantados avaliados no presente estudo foi a viabilidade c elular de monóc itos do sangue periféric o. Para isto, utilizou-se o ensaio do MTT.
Na literatura, não há relatos de estudos de viabilidade celular de monócitos em pacientes esplenectomizados com auto-implante de tecido esplênico. Em nosso estudo, avaliou-se a viabilidade celular de monócitos do sangue periférico em pacientes auto-implantados com e sem estímulo do LPS bem como a viabilidade de monócitos do sangue de indivíduos normais com e sem estímulo do LPS. Constatou-se que, quando comparados os pacientes auto-implantados c ujas c élulas não foram expostas ao LPS c om indivíduos sadios também sem exposição de suas células ao LPS não houve diferença nestes grupos. No entanto, diferença houve quando se comparou as células dos pacientes auto-implantados com as do grupo controle expostas à estimulação prolongada com o LPS, pelo período de 22 horas.
Verific ou-se que, após este tempo de estímulo, no grupo c ontrole houve uma mortalidade das c élulas de 7 % apenas, enquanto no grupo de auto-implantados, a mortalidade das c élulas foi de 3 1 % . Tal diferenç a é signific ante e sugere que fagó c ito s mo no nuc lear es do s pac ientes auto -implantado s podem ter menor viabilidade frente a um estímulo noc ivo e de longa duraç ão, mas c ertamente terá uma maior viabilidade das c élulas do que aqueles pac ientes apenas esplenec tomizados sem nenhum tec ido esplênic o auto-implantado.
Em relaç ão à viabilidade c elular de monóc itos do sangue periféric o, estimulados c om LPS, perc ebe-se que os pac ientes s ub m e tido s à e s p le n e c to m ia e a uto - im p la n te q ua n do e stim ula do s pe lo LPS po r 2 2 ho r a s a pr e se nta r a m um a viabilidade c elular menor que os pac ientes do grupo c ontrole so b o me smo e stímulo . Po de -se infe r ir, po r tanto , q ue a mortalidade de monóc itos dos pac ientes que rec eberam auto-implante frente a um estímulo noc ivo e prolongado é maior do que em indivíduos normais e que, portanto, a resposta imune assumida pelo tec ido esplênic o auto-implantado pode não ser assumida em sua forma plena e desta forma o auto-implante , iso ladame nte , po de não ser c apaz de pr evenir c ontra SFPE sem medidas c línic as profilátic as adic ionais.
Corroborando com o presente estudo, em estudo anterior, Brandt e cols4 analisando a atividade microbicida de monócitos tratados com acetato miristato de forbol ( PMA) ou com PMA e tuftsina, avaliaram a liberaç ão do radic al superóxido, em pac ientes esplenec tomizados c om auto-implante esplênic o e observaram que nestes pacientes a atividade microbicida foi apenas satisfatória na fase inicial. As células poderiam não ter capacidade de produzir superóxido em quantidade crescente e sufic iente para uma resposta do hospedeiro c ompleta, de destruição dos microorganismos. Os mesmos autores avaliaram em outro estudo, a liberação de TNF-
α
por monócitos do sangue pe r ifé r ic o c ultivado s, in vitr o , e stim ulado s c o m PMA e observaram que os resultados não diferiram entre os grupos c ontrole, implantados e esplenec tomizados sem auto-implante5.Finalmente, no presente estudo , po de-se supo r que o tec ido esplênic o auto-implantado pode auxiliar na prevenç ão c ontra SFPE, assegurando funç ões mono-mac rofágic as antes exerc idas pelo baç o original, c omo a c apac idade de fagoc itar. Todavia, a viabilidade c elular dos monóc itos nos pac ientes auto -implantado s, fr ente a estímulo no c ivo e pr o lo ngado enc ontra-se defic iente. Isso pode sugerir que monóc itos de pac ientes esplenec to mizado s c o m auto -implante são mais sensíveis frente a um estímulo, por exemplo, o LPS que é um a e ndo to xina lib e r a da no c r e s c im e nto o u m o r te de enterobac térias. O estudo apresentado tenta fundamentar a hipótese de que o auto-implante esplênic o pode influenc iar de fo r m a p o s itiva e m a lgum a s fun ç õ e s do s fa gó c ito s mononuc leares.
Os resultados obtidos c omparando-se indivíduos saudáveis c o m pac ie nte s e sq uisto sso m ó tic o s j o ve ns sub m e tido s à esplenec tomia, ligadura de veia gástric a esquerda e auto-implante esplênic o no grande o mento permitem c o nc luir q ue : Os m o n ó c ito s n o s a n gue pe r ifé r ic o de pa c ie n te s esplenec tomizados c om auto-implante esplênic o têm atividade fagoc ític a semelhante ao de pac ientes sadios; Os fagóc itos mo no nuc le are s do s pac ie nte s auto -implantado s po ssue m menor viabilidade frente à estimulaç ão noc iva e prolongada.
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