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Caracterização de Fumo Inalável de Cigarro
Quanto a Alguns Compostos Orgânicos
Voláteis e Muito Voláteis
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PORTO
FACULDADE DE CIÊNCIASUNIVERSIDADE DO PORTO
Departamento de Química
Q D 1 2 1 Porto, Fevereiro 2008
MARs C 2008
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SOI = 0)
Caracterização de Fumo Inalável de Cigarro
Quanto a Alguns Compostos Orgânicos
Voláteis e Muito Voláteis
Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Para obtenção do grau de Mestre em Química
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- FACULDADE DE CIÊNCIAS L[ * U NIVERSI DADE DO PORTO
■art.
Departamento de Química
À minha mãe Ao meu pai Ao meu irmão
À Professora Doutora Maria Teresa Vasconcelos, minha orientadora, pela atenção demonstrada, incentivo, ensinamentos e todo o apoio dispensados, sem os quais não teria sido possível levar a cabo este trabalho.
Ao Professor Doutor Victor Freitas, meu co-orientador, pelo apoio dado na fase de arranque do trabalho e pela disponibilidade sempre demonstrada.
A Professora Doutora Clara Basto pela troca de ideias e conhecimentos partilhados. Ao Conselho de Prevenção do Tabagismo, presidido pelo Prof. Doutor M. Pais Clemente, o apoio recebido no âmbito de um protocolo estabelecido com a Associação para o Desenvolvimento da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto.
À Dr3 Adelina Vieira o apoio concedido.
Um agradecimento muito especial à Gabriela e à Anabela por todo o interesse que sempre demonstraram pelo meu trabalho, pela amizade, pela troca de conhecimentos e pela enorme e importante ajuda dada na fase final de escrita da tese.
A todos os colegas que passaram no laboratório principalmente ao António, ao Joaquim e ao Rafael que tiveram um papel muito importante no arranque do trabalho e mais recentemente à Ana Paula, à Cristina, ao Luiz Pinto, à Marisa, à Mafalda, à Nazaré, ao Pedro Carvalho e ao Pedro Rodrigues que muito contribuem para o excelente ambiente que se vive no laboratório.
Ao Moisés por estar sempre disponível a ajudar e por todo o apoio.
Aos meus amigos (Ana Isabel, Ana Luísa, Ana Margarida, Andreia, Cátia, Cláudia, Débora, Fred, Gabriela, Isabel, Luís, João, Pedro, Rui, Sónia...) por serem quem são e por todos os momentos que vivemos juntos.
A todos os meus familiares, principalmente à minha mãe, ao meu pai e ao meu irmão por terem permitido que eu chegasse até aqui, pelo incentivo e por serem o meu suporte.
O tabaco é a causa de um número muito elevado de mortes prematuras. Segundo a Organização Mundial de Saúde no ano 2000, a nível mundial, morreram 5 milhões de pessoas com doenças relacionadas como consumo de tabaco, a nível mundial. Em Portugal, devido ao tabaco, morrem cerca de 5 mil pessoas por ano, correspondendo a uma morte a cada duas horas. Durante a combustão do tabaco são produzidas milhares de substâncias, muitas delas tóxicas, que são transportadas até aos pulmões do fumador.
Apesar de existirem métodos padrão para a geração e colheita de fumo inalável em máquinas de fumar (Federal Trade Commission e Organização Internacional de Normalização) e para a determinação de alcatrão, nicotina e monóxido de carbono, não existem métodos padrão conhecidos para análise de outros constituintes do fumo. O principal objectivo deste trabalho foi a implementação de metodologias para determinação de compostos orgânicos gasosos presentes em fumo inalável de cigarro directamente a partir da fase gasosa. De entre a mistura muito complexa existente no fumo de cigarro o estudo incidiu em benzeno e em alguns dos seus derivados alquilados, designadamente tolueno e m/p-xileno (por serem muito nocivos para o Homem e por se dispor de meios analíticos para detecção de compostos orgânicos voláteis em amostras gasosas) e foi extensivo à acetona e 2-butanona.
Começou-se pelo estabelecimento de um método de amostragem a partir de uma máquina de fumar, eficaz e compatível com o método de análise: o fumo era recolhido num saco de gases e daí era amostrado por microextracção para fase sólida (SPME) (e também tubos com Tenax-TA, para comparação) seguido de desadsorção térmica em cromatógrafo gasoso com detecção por espectrometria de massa (GC-MS). Não se recorreu, portanto, a
extracção por solvente, evitando-se a produção de resíduos. A fibra de SPME continha um revestimento de polidimetilsiloxano (PDMS).
Uma comparação de declives das rectas obtidas por calibração externa e por adição de padrão (usando SPME) mostrou que se estava na presença de efeito de matriz, o que implicou que a quantificação dos diferentes compostos fosse realizada pelo método de adição de padrão.
O estudo incidiu sobre cigarros comerciais, com filtro, de uma marca americana, muito difundida na Europa, que será aqui designada por marca A e em cigarros de referência, produzidos na Universidade de Kentucky (Kentucky Tobacco Research & Development Center), designados na origem por 2R4F.
Os níveis de concentração dos compostos estudados obedeceram à seguinte ordem: m/p-xileno < tolueno < benzeno < 2-butanona < acetona, quer nos cigarros de referência 2R4F quer nos de marca A. Nos cigarros de marca A os níveis (e respectivos desvios padrão) foram, em ug/cigarro, de 155 ± 36 para acetona, 4 7 + 1 9 para 2-butanona, 44 + 8 para benzeno, 26 + 8 para tolueno e 9 + 2 para m/p-xileno. No caso de cigarros de referência 2R4F, observaram-se níveis (ug/cigarro) de 172 + 45 para acetona, 4 1 + 4 para 2-butanona, 4 1 + 8 para benzeno, 40 + 4 para tolueno e 8 ± 2 para m/p-xileno.
Não se dispondo de materiais de referência com níveis certificados, procurou-se averiguar a existência de erros sistemáticos recorrendo a um método alternativo de amostragem de analitos que usa um processo de extracção bastante distinto: adsorção dos analitos em Tenax-TA contido num tubo de aço, que é depois sujeito a desadsorção térmica para análise por GC-MSD. Uma comparação dos métodos revelou que os dois procedimentos conduziram a resultados que foram estatisticamente iguais assumindo um nível de significância de 5%, para todos os compostos, com excepção dos níveis de tolueno em cigarros de referência 2R4F cujos resultados foram estatisticamente iguais apenas para um nível de significância de 1 % e dos níveis de benzeno em cigarros de marca A que foram estatisticamente diferentes, embora da mesma ordem de grandeza. De referir ainda que as variâncias associadas às médias não diferem estatisticamente em todos os casos estudados.
Uma comparação dos resultados com outros da literatura, mostrou que os níveis de concentração dos compostos estudados foram da mesma ordem de grandeza em cigarros de diferentes marcas.
Tobacco is responsible for a very high number of premature deaths. According the World Health Organization (WHO) tobacco is currently responsible for 5 million deaths per year. In Portugal it causes about 5 thousand deaths per year (one death in each two hours). During the smoking of cigarettes thousands of substances are produced that go to the smoker lung.
There is a lack of standardized analytical methods for smoke components except for the analysis of tar, nicotine and carbon monoxide and for smoke collection on smoking machines (FTC, ISO). The aim of this work was to implement a method for analysis of organic compounds on mainstream cigarette smoke vapour phase. From the complex cigarette smoke matrix, this work focused fundamentally on benzene, toluene and m/p-xylene because of their harmful potential for Humans and because analytical conditions were available to detect this kind of compounds on gas samples. The method was used afterwards to determine acetone and 2-butanone.
This work started by establishing an effective and compatible sampling method to couple with the analytical method: the mainstream smoke was collected on a gas sample bags. Solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) were the analytical techniques used, without employing solvent extraction. SPME fibers with poly(dimethylsiloxane) (PDMS) were chosen.
The slopes obtained on the external calibration and on the method of standard addition were compared, indicating matrix effects. Therefore, the method of standard addition was used to quantify the different compounds.
The study focused commercial cigarettes, with filter, from one american brand, here defined by brand A. Reference cigarettes 2R4F obtained from the university of Kentucky (Kentucky Tobacco Research & Development Center) were also used.
The results obtained with 2R4F and brand A cigarettes, ranked the compounds concentrations in the follow order: m/p-xylene < toluene < benzene < 2-butanone < acetone. The quantified levels (and standard deviations) in ug/cigarette units were for acetone 155 + 36, for 2-butanone 47 + 19, for benzene 44 + 8, for toluene 26 + 8 and for m/p-xylene 9 + 2, for brand A smoke cigarettes and were for acetone 172 ± 45, for 2-butanone 4 1 + 4 , for benzene 41 + 8, for toluene 40 + 4 and for m/p-xylene 8 + 2 for 2R4F smoke cigarettes.
As there is no reference material with certificated levels, the existence of systematic error was investigated using an alternative method with a different extraction process: adsorption on Tenax-TA following by thermal desorption and GC-MSD analyse.
The analysis of the results obtained by the two different methods shows that there is no significant different at 5% significance level, to all compounds, except for toluene on reference cigarettes 2R4F where the means were no statistical different to 1 % significance level, and for benzene on cigarettes from brand A that were statistical different for which level (5% or 1%). The variances of all results showed no significant differences.
The obtained results are in the same order of magnitude of the ones supported in literature.
Le tabac est responsable d'un nombre très élevé de décès prématures. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), le tabac est actuellement responsable pour 5 millions de décès par an. Au Portugal, il cause environ 5 mille décès par an (un mort dans chaque deux heures). Au cours de la fumée de cigarettes sont produites des millions des substances qui sont transporter au poumon du fumer.
Il manque des méthodes analytiques normalisées pour la fumée, sauf pour l'analyse de la teneur en tar, en nicotine et en monoxyde de carbone et de fumée de tabac sur la collecte des machines (FTC, ISO). L'objectif de ce travail a été d'appliquer une méthode d'analyse des composés organiques dans la fumme inhalé de cigarette a partir de la phase vapeur. Parmi les mélanges très complexes qu'existe dans la fumme du cigarette, ce travail a porté essentiellement sur le benzène, toluène et m/p-xylène en raison de leur potentiel nocif pour l'Homme et parce que les conditions analytiques étaient disponibles pour détecter ce genre de composés sur des échantillons de gaz. La méthode a été utilisée ensuite pour déterminer l'acétone et 2-butanone.
Ce travail a commencé par la mise au point dune méthode d'échantillonnage efficace et compatible avec la méthode d'analyse: les composés de la fumme ont été recueillies sur un sac à gaz et extraits por microextraction en phase solide (SPME), sans employer extraction par solvant, et finallment analysé por chromatographic en phase gazeuse-spectrométrie de masse (CG-MS). Pour le SPME ont été choisis des fibres de poly(dimethylsiloxane) (PDMS).
La comparaison des pents de les charts de calibration externe et pour addition d'étalon on montre un effet matrice. Par conséquent, l'addition d'étalon a été utilisée pour quantifier les différents composés.
L'étude a été porté des cigarettes commerciales, avec filtre, d'une marque américaine, ici définie par référence les cigarettes de marque A, et sur cigarettes fourni pour l'université du Kentucky (Kentucky Tobacco Research & Development Center), défini comme 2R4F.
Les niveaux de concentrations obtenus pour le composés étudies sont classées dans ordre suivant: m/p-xylène < toluène < benzène < 2-butanone < acétone, pour les deux marque de cigarettes. Les niveaux déterminés (et écart type) en unités de ug/cigarette ont été de 155 + 36 pour l'acétone, 47 + 19 pour le 2-butanone, 44 ± 8 pour le benzène, 26 + 8 pour le toluène et 9 ± 2 pour le m/p-xylène pour la marque A; et 172 ± 45 pour l'acétone, 4 1 + 4 pour le 2-butanone, 4 1 + 8 pour le benzène, 40 + 4 pour le toluène et 8 + 2 pour le m/p-xylène pour 2R4F cigarettes.
Comme il n'ya pas de matériaux de référence certifiés avec les niveaux connue, l'existence d'une erreur systématique a été étudiée en utilisant une méthode alternative différent d'un processus d'extraction: l'adsorption sur Tenax TA suivant par désorption thermique et GC-MS analyser.
L'analyse des résultats obtenus par les deux méthodes différentes montre qu'il n'ya pas de différence significative pour un niveau de signification de 5%, pour tous les composés, à l'exception de toluène référence sur les cigarettes 2R4F lorsque les moyens n'étaient statistique différente que por un niveau de signification de 1%, et pour benzène sur les cigarettes de marque A qui ont été statistiquement different. Les écarts de l'ensemble des résultats ne montre pas des différences significatives.
Les résultats obtenus sont dans le même ordre de grandeur de ceux décrit dans la littérature.
Agradecimentos v Resumo vii Abstract ix Résumé xi índice Geral xiii índice de Figuras xvii índice de Tabelas xxi Símbolos e Abreviaturas xxii
1. Introdução 1
1.1. Evolução do conhecimento científico sobre o tabaco 2
1.2. Malefícios do tabaco 3 1.3. O cigarro e seus constituintes 5
1.4. Caracterização do fumo do cigarro 6 1.5. Ingredientes adicionados ao tabaco 8 1.6. Processo de queima do cigarro 9 1.7. Métodos de amostragem e análise defumo de cigarro 11
1.7.1. Padronização do "acto de fumar" para estudar o fumo 14
1.7.2. Importância do uso de cigarros de referência 17
1.8.1. Microextracção para fase sólida (SPME) 18
1.8.1.1. Descrição da técnica 19 1.8.1.2. Processo de absorção/adsorção 23
1.8.1.3. Termodinâmica do processo de partição/adsorção 26
1.8.1.4. Cinética 30 1.8.1.5. A escolha da fibra 32
1.8.1.6. Aplicação de SPME à análise de tabaco 34
1.8.2. Tubos com adsorvente 3 36
1.8.2.1. Valores do Branco 37 1.8.2.2. Volume de amostragem seguro 37
1.8.2.3. Armazenamento de amostras recolhidas 3 38
1.9. Breve descrição da cromatografia gasosa com detector por espectrometria de massa (GC-MS) 39
Bibliografia 43 2. Parte Experimental 49
2.1. Geração do fumo de cigarro 50
2.1.1. Interferências da própria máquina de fumar cigarros 54
2.2. Padrões e cigarros utilizados 55
2.3. Amostragem 56
2.3.1. Recolha da fase de vapor do fumo inalável de cigarro 56 2.3.2. Adsorção / Absorção para fase sólida dos compostos recolhidos 57
2.3.2.1. Microextracção para fase sólida (SPME) 57
2.3.2.2. Tubos com adsorvente 57
2.4. Descontaminação do material utilizado 58
2.4.1. Máquina de fumar 58 2.4.2. Sacos de gases 58 2.4.3. Fibras de SPME 59 2.4.4. Tubos com enchimentos 59 2.4.5. Coluna do cromatógrafo gasoso 59
2.5. Calibração 59
2.5.1. Obtenção de padrões gasosos para calibração 59
2.5.2. Calibração usando fibras de SPME 60
2.5.2.1. Adição de padrão 60 2.5.2.2. Calibração externa 61 2.5.3. Calibração usando tubos com adsorvente 61
2.6. Análise química 62
2.7. Cálculos 64 21 A. Concentrações de padrão adicionadas 64
2.7.2. Parâmetros das rectas de calibração"12 66
2.7.3. Tratamento dos resultados"12 67
2.7.4. Comparação de médias através da aplicação do teste t ' 68
Bibliografia 70 3. Resultados e Discussão 71
3.1. Implementação do método analítico 72
3.1.1. Estabelecimento da quantidade de fumo a recolher 72 3.1.2. Estabilidade do fumo no interior do saco de gases 75 3.1.3. Tempo de exposição necessário para extracção por SPME 77
3.2. Comparação de fibras de SPME com revestimentos de PDMS-DVB e de PDMS 78
3.2.1. Avaliação das características de resposta do método SPME/GC-MS 79
3.2.1.1. Fibra com revestimento de PDMS-DVB 79 3.2.1.2. Fibra com revestimento de PDMS 82 3.2.1.3. Calibração externa vs. adição de padrão 84
3.2.1.4. Repetibilidade dos resultados 87
3.3. Determinação dos níveis de alguns compostos no fumo inalável de cigarro por SPME/GC-MS 87
3.3.1. Cigarros comerciais 87 3.3.2. Cigarros de referência 88
3.4. Utilização de um método de amostragem alternativo 89
3.4.1. Resultados obtidos usando Tenax TA / GC-MSD 90 3.4.2. Comparação dos níveis determinados usando dois métodos de amostragem diferentes.91
3.5. Comparação dos resultados obtidos neste trabalho com outros da literatura 94
Bibliografia 98 Conclusões 101 Anexos 103
índice de Figuras
Figura 1.1. Representação da formação do fumo inalável (mainstream) e do fumo sidestream num cigarro.14.6
Figura 1.2. Representação esquemática de um dispositivo de SPME. (A) Posição com a fibra retraída na agulha; (B) Posição com a fibra exposta. O detalhe mostra as dimensões típicas da secção com revestimento
de 100 pm de espessura 20 Figura 1.3. (A) Vista interna com a fibra exposta e (B) vista com a fibra exposta e o êmbolo travado pelo pino
no centro da fenda em "Z" 20 Figura 1.4. Modo de usar o dispositivo SPME para o processo de extracção e desadsorção do material
extraído para analise cromatográfica 21 Figura 1.5. Forma de operar com SME: (a) extracção directa, (b) extracção a partir do headspace e(c) SPME
usando membrana protectora 22 Figura 1.6. Comparação dos mecanismos de extracção: absorção e adsorção 25
Figura 1.7. Perfis de extracção, usando uma fibra PDMS, de 1 ppm de benzeno em água (A) segundo o teoricamente esperado e sob quatro condições de agitação: (B) 100% de agitação magnética; (C) 75% de
agitação magnética; (D) 50% de agitação magnética e (E) sem agitação.32 31
Figura 1.8. Esquema de um cromatógrafo gasoso 39 Figura 1.9. Representação esquemática do funcionamento de um detector de massa. ' 40
Figura 2.1. (A) Vista geral da máquina Borgwaldt, modelo RM 1/Plus, usada para gerar o fumo do tabaco' e
(B) respectivo esquema 50 Figura 2.2. Imagem do interior da máquina onde é possível observar o êmbolo e a cavidade cilíndrica onde
ele se desloca em movimento de vai e vem, imitando o funcionamento do pulmão humano 51 Figura 2.3. Fotografias onde se vê o anemómetro que permite controlar a velocidade do ar junto da ponta do
cigarro 52 Figura 2.4. Vista parcial da máquina, com o cigarro colocado 53
Figura 2.5. Imagem dos porta filtros existentes na máquina de fumar, (A) sem o filtro colocado, (B) com o filtro colocado e (C) ligados por um tubo de teflon (tal como acontece no interior da máquina defumar) 53
Figura 3.1. Cromatograma referente ao fumo de 6 cigarros recolhido num saco de gases de 2 L onde uma fibra de SPME foi exposta durante 15 minutos e espectro de massa da zona correspondente ao tempo de
retenção do tolueno 73 Figura 3.2. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 0,6 L onde uma
fibra de SPME foi exposta durante 10 minutos, e o espectro de massa da zona correspondente ao tempo de
retenção do tolueno 74 Figura 3.3. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 2 L, que foi de
seguida enchido com diazoto e onde a fibra de SPME foi exposta 10 minutos e espectro de massa da zona
correspondente ao tempo de retenção do tolueno 74 Figura 3.4. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 1 L, onde foi
exposta uma fibra de SPME durante 10 minutos. Na análise cromatográfica, foi usado split com uma razão de
repartição de 5 75 Figura 3.5. Variação das áreas dos picos obtidos por GC/MS em função do tempo, partir defumo de cigarro
armazenado um saco de gases (usando a fibra PDMS) 76 Figura 3.6. Variação das áreas dos picos obtidos por GC/MS em função do tempo de exposição de uma fibra
de PDMS ao fumo de um cigarro (diluído em azoto) armazenado um saco de gases, para (A) acetona,
2-butanona, benzeno e tolueno e (B) numa escala diferente para m/p-xileno 77 Figura 3.7. Comparação dos sinais obtidos na análise do fumo de um cigarro usando duas fibras de SPME
diferentes: PDMS-DVB (a verde) e PDMS (a vermelho) 78 Figura 3.8. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura contida num saco de gases de 1 L constituída pelo fumo de um cigarro 80 Figura 3.9. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura gasosa, contida num saco de gases 2 L, constituída pelo fumo de um cigarro diluído em 1 L
de diazoto 81 Figura 3.10. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura gasosa contida num saco de gases de 5 L, constituída pelo fumo de um cigarro e diluído em
3 L de diazoto 82 Figura 3.11. Rectas obtidas, usando uma fibra de PDMS, por adição de padrão à mistura gasosa contida num
saco de gases de 5 L, constituída pelo fumo de um cigarro, diluído em 3 L de diazoto, para (A) benzeno, (B)
Figura 3.12. Rectas obtidas com a fibra de PDMS por calibração externa, usando um saco de gases de 5 L com 1,8 L de diazoto, para (A) benzeno, (B) tolueno, (C) m/p-xileno, (D) acetona e (E) 2-butanona.
Apresentam-se também os desvios médios associados a cada medição 85 Figura 3.13. Comparação dos níveis observados no fumo inalável de (A) cigarros da marca A e (B) cigarros
de referência Kentucky 2R4F, usando as diferentes técnicas de extracção (Tenax TA e SPME). lncluíram-se os
Tabela 1.1. Efeitos de alguns dos componentes presentes no fumo inalável dos cigarros, na saúde 5
Tabela 1.2. Alguns dos compostos carcinogénicos presentes no fumo do cigarro 8 Tabela 1.3. Parâmetros utilizados na máquina de fumar, referentes às puxadas de ar. ' 16
Tabela 1.4. Revestimentos de SPME comercializados: modo de uso, algumas propriedades e aplicações. ...33
Tabela 2.1. Padrões utilizados, qualidade e marca 56 Tabela 2.2. Características do método usado no GC/MS 62 Tabela 2.3. Parâmetros usados no sistema analítico, para amostras recolhidas em tubos com adsorvente 64
Tabela 3.1. Parâmetros das rectas de calibração obtidas por adição de padrão ao fumo de um cigarro para os
diferentes compostos 84 Tabela 3.2. Parâmetros das rectas de calibração externa obtidos para os diferentes compostos 86
Tabela 3.3. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros de marca A, após extracção por SPME. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP) e do desvio padrão
relativo (DPR) 88 Tabela 3.4. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros 2R4F, após
extracção por SPME. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP) e do desvio padrão relativo
(DPR) 89 Tabela 3.5. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros de marca A,
após adsorção em tubos com Tenax TA. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP) e do desvio
padrão relativo (DPR) 90 Tabela 3.6. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros 2R4F, após
adsorção em tubos com Tenax TA. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP), do desvio
padrão relativo (DPR) 91 Tabela 3.7. Comparação dos resultados obtidos por dois métodos de extracção diferentes 92
Tabela 3.8. Níveis de benzeno, tolueno, m/p-xileno, acetona e 2-butanona medidos por diferentes autores no
Símbolos e Abreviaturas
Símbolos
[A] Concentração do analito na matriz
Aad Concentração de A na fase sólida por unidade de área
b Ordenada na origem
Co Concentração inicial do analito na amostra (antes da extracção)
Ca" Concentração na amostra
C° Concentração do analito na fase orgânica Ca Concentração de analito na matriz, em equilíbrio
Cf Concentração de analito na fase extractora (fibra), em equilíbrio
^-f max Concentração máxima de sítios activos existentes no revestimento
Oh Concentração de analito no headspace, em equilíbrio Da Coeficiente de difusão do analito na amostra
Df Coeficiente de difusão do analito na fibra extractora Dh Coeficiente de difusão do analito no headspace
K Coeficiente de partição
Kad Constante de equilíbrio de adsorção do analito
Kd Constante de equilíbrio de desadsorção do analito
Kfa Constante de distribuição fibra/matriz
KJh Constante de distribuição fibra/'headspace
Kha Constante de distribuição headspacelmaïûz
Lf Espessura do revestimento
Lh Espessura do headspace
Ls Espessura da fase aquosa (amostra)
m Declive da recta
" a n\ nef p 1 parcialA p 1 vapor A r ro fad >\l
n
R Rb [SI Si, T te Vhvs
v seringaNúmero de moles em equilíbrio na amostra aquosa Número de moles em equilíbrio no headspace Número de moles em equilíbrio na fibra Pressão parcial do composto A
Pressão vapor do composto A Coeficiente de correlação
Raio externo do revestimento da fibra Taxa de adorção
Taxa de desadsorção
Raio interno do revestimento da fibra
Constante dos gases perfeitos (0,082057 atm dm3 mol"1 K"') Raio da barra magnética
Concentração de locais não ocupados na superfície da fase sólida Desvio padrão da ordenada na origem
Desvio padrão do declive
Erro associado ao resultado da concentração na amostra Desvio padrão residual da curva de calibração
Temperatura absoluta
Tempo requerido para extrair 95% do quantidade de analito em equilíbrio
Volume da amostra
Volume da fase extractora (fibra) Volume do headspace
Volume de saturação Volume medido na seringa
Resultado da concentração na amostra Acrónimos BTEX COMVs CORESTA COVs CW-DVB D.P.
Benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno Compostos orgânicos muito voláteis
Centre de Cooperation pour les Recherches Scientifiques Relative au Tabac
Compostos orgânicos voláteis Carbowax-divinilbenzeno Desvio padrão
D.P.R. Desvio padrão relativo FTC Federal Trade Commission
GC Cromatógrafo gasoso
GC-MS Cromatografia gasosa acoplada com um espectrómetro de massa
GL Graus de liberdade
HC Health Canada
IARC International Agency for Research on Cancer Int. Conf. Intervalo de confiança
ISO Organização Internacional de Normalização L.D. Limite de detecção
L.Q. Limite de quantificação
MDPH Massachusetts Department of Public Health MPT Matéria particulada total
MSD Detector selectivo de massa
PAHs Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos PDMS Polidimetilsiloxano
PDSM-DVB Polidimetilsiloxano - divinilbenzeno SDT Sistema de desadsorção térmica SIM Monotorização do ião seleccionado
SPE Solid-phase extraction (extracção em fase sólida)
SPME Solid-phase microextraction (microextracção em fase sólida) VAS Volume de amostragem seguro
Alfabeto grego
5 Espessura de uma camada fronteira hipotética sem agitação (durante o processo de SPME)
1. Introdução
7.7. Evolução do conhecimento científico sobre o tabaco
1.2. Malefícios do tabaco
1.3. O cigarro e seus constituintes 1.4. Caracterização do fumo do cigarro 1.5. Ingredientes adicionados ao tabaco 1.6. Processo de queima do cigarro
1.7. Métodos de amostragem e análise defumo de cigarro 1.8. Métodos de recolha e análise usados neste trabalho
1.9. Breve descrição da cromatografia gasosa com detector por espectrometria de massa (GC-MS)
Introdução
1.1. Evolução do conhecimento científico sobre o tabaco
O tabaco é uma planta, originária da América do Sul e pertencente à família das solanáceas das quais existem mais de 50 espécies diferentes. De entre estas, a Nicotina
tabacum é a que suscita maior interesse.
As primeiras publicações científicas sobre o tabaco começaram a aparecer no século XVI. Nessa época, Jean Nicot (1530 - 1600), então embaixador da França em Portugal, estudou e atribuiu propriedades medicinais à planta, que acabou sendo baptizada com o seu nome (Nicotiana).
Apesar disso, o tabaco tornou-se paulatinamente, ao longo do século XVIII, uma planta de consumo profano, visando o prazer e a diversão. Converteu-se então num grande investimento comercial. Nos Estados Unidos, as plantações da Carolina do Norte tornaram-se referência mundial para todos aqueles que tornaram-se interessavam pela produção e comercialização do produto. A vocação comercial da planta apareceu associada ao glamour, à sensualidade.
No século XVIII surgiram na Europa as primeiras publicações que associam o tabaco ao cancro do lábio, boca e mucosa nasal. A Inglaterra e a Alemanha foram os países que mais estudaram o assunto. Ainda no século XIX começou a haver consciência de problemas de saúde crónicos associados ao consumo do tabaco. As primeiras vozes que se manifestavam contra o consumo livre do tabaco foram do movimento proibicionista norte-americano. Com base em estudos epidemiológicos realizados em Inglaterra e nos Estados Unidos da América (EUA) a partir dos anos 50 do século XX, a relação entre o cancro do pulmão e tabagismo foi definitivamente estabelecida. Em 1962, o Governo Britânico decretou que os produtos derivados do tabaco deveriam ter avisos sobre os riscos potenciais. Os EUA tomaram atitude semelhante em 1964. Seguiram-se duas décadas de constatações. O combate frontal ao hábito só arrancou em meados dos anos 80 do século passado. Nessa altura já não havia dúvidas acerca dos malefícios causados pelo tabaco, tendo-se intensificado as políticas públicas de prevenção e combate ao fumo. Nos EUA o consumo foi banido de locais fechados, transportes públicos e lojas. Muitos países proibiram a publicidade incentivando a venda de cigarros.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) criou em 1987 o Dia Mundial sem Tabaco (31 de Maio). Em 2003 aprovou um tratado mundial para a prevenção e controlo do tabagismo (Convenção Quadro) que foi assinado por Portugal em Janeiro de 2004. No âmbito desta Convenção Quadro têm vindo a ser desenvolvidas e implementadas diversas
directivas europeias pelos vários estados membro da União Europeia. À semelhança do que alguns países já fizeram, a partir de Janeiro de 2008 foi introduzida em Portugal uma nova legislação para a prevenção e controlo do tabagismo donde se salientam as normas de proibição ou limitação de fumar nos locais públicos e/ou nos locais de trabalho fechados.
1.2. Malefícios do tabaco
O tabaco é a segunda maior causa de morte no mundo. Segundo OMS o tabaco é responsável pela morte de um em cada 10 adultos (cerca de 5 milhões de mortes cada ano) a nível mundial. Prevê-se que cause cerca de 10 milhões de mortes por ano em 2030.2
Na Europa, o fumo do tabaco é responsável por um milhão e 200 mil mortes anuais, prevendo-se que, em 2020, este número ascenda a dois milhões. Em Portugal, calcula-se que 20 a 26% da população fuma e, entre 1970 e 1995, o consumo do tabaco aumentou mais de 150%, tendo sido o país da União Europeia, onde mais se tinha elevado a percentagem de fumadores.3
Nos países desenvolvidos 25 a 30% da totalidade dos cancros relacionam-se com o tabaco, contribuindo para o desenvolvimento de doenças respiratórias que podem ser graves e mortais, tal como 80% das situações clínicas de doença pulmonar crónica obstrutiva. O tabaco constitui ainda um factor de risco importante de doenças vasculares arteriais, sendo que 20% da mortalidade, por doença coronária, se deve ao tabaco. Os fumadores de mais de um maço de cigarros por dia têm quatro vezes mais enfartes do miocárdio que os não fumadores e estes, quando têm enfartes, têm-nos dez anos mais tarde que os consumidores de tabaco. Devido ao tabaco nascem bebés de baixo peso (filhos de mães fumadoras).3 Um
grande número de estudos epidemiológicos liga o fumo de cigarro a doenças cardiovasculares, cancro do pulmão, bronquite crónica, obstrução pulmonar crónica e efisema.5 Para além disso, um aumento do risco de vir a sofrer de cancro no estômago, na
laringe, no esófago, no pâncreas e no trato urinário foi associado a fumadores.6'7
A Nicotina, além de provocar dependência, tem também vários efeitos hormonais, dependendo do número e frequência de cigarros fumados e dos fumadores criarem ou não tolerância à nicotina. O tabagismo associa-se também à menopausa precoce e a um aumento da osteoporose nas mulheres. Os fumadores têm normalmente um peso corporal em média de 2,7 a 4,5 kg inferior ao dos não fumadores. Isto é consequência da associação do tabagismo a um consumo mais reduzido de alimentos e um gasto energético superior. O
Introdução.
aumento de peso que se produz ao deixar de fumar constitui um problema para muitos ex-fumadores.
No caso dos fumadores passivos, expostos a uma combinação do fumo proveniente da extremidade acesa dos cigarros com o fumo exalado por fumadores, a exposição ao fumo causa doenças, incluindo o cancro do pulmão e doenças cardíacas, podendo agravar a asma nos adultos e provocar irritações na vista, garganta e nariz. Nas crianças origina problemas tais como asma, infecções respiratórias, tosse, pieira, otites médias (infecção do ouvido médio) e síndroma de morte súbita infantil.
Uma pesquisa na literatura existente revela que dos 227 compostos químicos classificados pala International Agency for Research on Cancer (IARC) como pertencentes ao Grupo 2B, ou seja "possíveis carcinogénicos", 48 estão presente no fumo do cigarro inalado por um fumador durante o processo de queima do mesmo cigarro.
Durante a combustão do tabaco são produzidas milhares de substâncias que são transportadas até aos pulmões do fumador. Muitas dessas substâncias vão actuar principalmente sobre o aparelho respiratório, sendo algumas delas absorvidas, passando assim para a corrente sanguínea, a partir da qual actuam sobre o restante organismo. Os compostos do tabaco são classificados pela sua actividade biológica como asfixiantes, irritantes, mutagénicos, carcinogénicos, inibidores de enzimas e farmacologicamente activos. Quem fuma um maço de tabaco diariamente inala cerca de 840 centímetros cúbicos de alcatrão por ano, contém benzopireno. Esta é uma substância que lesiona o material genético das células e produz cancro nos órgãos com quem tem contacto.
Focando constituintes do fumo do tabaco que foram objecto de estudo do presente trabalho, e as suas consequências na saúde, tem-se o benzeno que afecta o desenvolvimento do feto, o sistema cardiovascular, o sistema nervoso e o sistema imunológico, provocando ainda leucemia; o tolueno que afecta o sistema nervoso e o sistema digestivo, os xilenos que além do sistema nervoso, afectam também o sistema respiratório, a acetona que provoca irritação ocular e do tracto respiratório superior, assim como afecção do sistema nervoso central, e a 2-butanona que provoca irritação da pele, olhos e sistema respiratório. São apresentados na Tabela 1.1 efeitos conhecidos na saúde de alguns dos componentes tóxicos do fumo inalável dos cigarros.
Tabela 1.1. Efeitos de alguns dos componentes presentes no fumo inalável dos cigarros, na saúde. 10
Composto Toxicidade
Monóxido de carbono Amoníaco Óxidos de azoto (NOx)
Cianeto de hidrogénio Sulfureto de hidrogénio Acrolina Metanol Piridina Nicotina Fenol Catecol Anilina Hidrazina maleica
Liga-se á hemoglobina inibindo a respiração Irritação das vias respiratórias
Inflamação do pulmão
Inibe o funcionamento normal do pulmão Irritação das vias respiratórias
Inibe o funcionamento normal do pulmão Tóxico quando inalado e ingerido
Irritação das vias respiratórias
Provoca dependência, afecta os sistemas cardiovascular e endócrino
Promotor de tumor em animais de laboratório Carcinogénico em animais de laboratório Dificulta a respiração
Agente mutagénico
1.3. O cigarro e seus constituintes
O componente principal dos cigarros de todas as marcas é, naturalmente, o tabaco. Segundo os dados da Philip Morris (empresa americana responsável pelo fabrico de cigarros de várias marcas distribuídas por todo o mundo), o cigarro típico de mistura americana contém, pelo menos, 90% de tabaco no enchimento. Mas os cigarros contêm, para além do tabaco, uma série de componentes adicionais, tais como o papel de cigarro e filtros, nos quais também são adicionados ingredientes. Os governos de vários países aprovaram normas relacionadas com os ingredientes dos cigarros.
Existem muitas diferenças na composição de cigarros produzidos por diferentes fabricantes. Para essas diferenças contribuem os tipos e quantidades de tabaco utilizados, o ano de colheita desse tabaco, a quantidade e tipo de ingredientes adicionados e materiais não-tabaco utilizados (por exemplo o papel e filtros) e a forma física do cigarro. '
O tabaco é uma planta que inclui cerca de 3800 constituintes, desde pequenas moléculas orgânicas e inorgânicas até biopolímeros. As moléculas mais pequenas
Introdução,
distribuem-se por numerosas classes diferentes de compostos, tais como hidrocarbonetos, terpenos, álcoois, fenóis, ácidos, aldeídos, cetonas, quinonas, nitrilos, compostos sulfúricos, carbohidratos, aminoácidos, alcalóides, esteróis, isoprenois, etc. Os biopolímeros consistem em celulose, hemicelulose, pectina, proteínas e péptidos, ácidos nucleicos, etc. Durante o processo de queima de um cigarro, todos os constituintes do tabaco são sujeitos a temperaturas que podem chegar aos 950°C na presença de diferentes concentrações de oxigénio na zona de queima. '
1.4. Caracterização do fumo do cigarro
O fumo resultante da queima do cigarro é uma complexa mistura química. Estima-se que 4800 constituintes químicos tenham sido já identificados no fumo do cigarro, entre eles encontram-se mais de 100 alcanos, 150 alcenos e 55 hidrocarbonetos alicíclicos.
O fumo do tabaco possui uma composição complexa. Durante a aspiração de ar é gerado um vapor muito concentrado, provavelmente sobressaturado que é puxado ao longo do cigarro, formando o fumo que é aspirado pelo fumador, designado por fumo inalável ou
mainstream em inglês. Por outro lado, o fumo que sai da ponta do cigarro directamente para
a atmosfera é denominado em inglês por sidestream (Figura 1.1).
mainstream
ar
Figura 1.1. Representação da formação do fumo inalável (mainstream) e do fumo sidestream num 14
A composição qualitativa do fumo sidestream e do fumo inalável é muito
semelhante na medida em que são constituídos essencialmente pelos mesmos constituintes, no entanto em termos de composição quantitativa são diferentes. De facto, o fumo
sidestream é gerado segundo condições diferentes do fumo inalável. O fumo sidestream é
gerado a temperaturas que variam entre 200°C e 600°C enquanto que o fumo inalável é gerado a 600-950°C. Além das diferentes temperaturas a que são gerados também diferem no pH, tendo o fumo inalável um pH mais baixo (6,0 6,7) do que o fumo sidestream (6,7 -7,5). Os índices de oxigénio também eles são diferentes, sendo de 16% para o fumo inalável e de 2% para o fumo sidestream} '
Do ponto de vista físico, o fumo do cigarro é constituído por uma fase particulada (ou fase descontínua), constituída por componentes de massa molecular relativamente elevada e pressão de vapor baixa e agregados de moléculas, e por uma fase de vapor (ou fase contínua), constituída por compostos mais voláteis de menor massa molecular. No entanto muitos dos constituintes mais voláteis também aparecem adsorvidos a partículas.
A fase particulada fica em grande parte retida, à temperatura ambiente, pelos chamados "filtros de Cambridge".14'15 Estes filtros são formados por fibras de vidro ligadas
entre si por um aglomerado poliacrílico, que retém 99,9% de todas as partículas que tenham um diâmetro superior a 0,1 um. Geralmente substâncias com massa molecular relativa inferior a 60 tendem a estar, predominantemente, presentes na fase de vapor enquanto que, substâncias com massa molecular relativa superiores a 200 tendem a estar apenas na fase particulada.14 A quantidade de matéria particulada (presente no fumo inalável) que fica nos
filtros de Cambridge, menos água e menos nicotina é definida por alcatrão (tar em inglês). O alcatrão é um composto não muito bem definido porque tem na sua constituição centenas de compostos diferentes. A nicotina, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e nitrosaminas específicas do tabaco são exemplos de constituintes associados principalmente à fase particulada.
A fase gasosa do fumo é a que passa através dos filtros de Cambridge, podendo ser recolhida, por exemplo, em sacos de gases. Esta fase é constituída por pequenas quantidades de hidrogénio, monóxido de carbono, dióxido de carbono, metano e outros hidrocarbonetos assim como certos vapores incluindo vapor de água e cianeto de hidrogénio. Os compostos de massa molecular pequena, como o amoníaco16 e o formaldeído encontram-se
preferencialmente na fase de vapor embora também tenham sido encontrados na fase particulada do fumo.17 É principalmente na fase gasosa que são emitidos os compostos
lntrodução_
neste trabalho. De referir que a OMS em 1989 introduziu uma classificação dos compostos orgânicos com base no valor do respectivo ponto de ebulição.18 Segundo essa definição a
designação de COVs aplica-se aos compostos orgânicos com ponto de ebulição entre 50 e 240 °C, no caso de compostos apoiares, e entre 100 e 260 °C, no caso de compostos polares. Por sua vez, COMVs são todos os compostos orgânicos com ponto e ebulição inferior a 50 °C, no caso de compostos apoiares, e inferior a 100°C, no caso de compostos polares.
Nos anexos 1 e 2 apresentam-se os constituintes principais dos conteúdos da fase gasosa e os principais constituintes da fase particulada do fumo, respectivamente. Em ambos os casos, apresentam-se também as suas concentrações que foram observadas no fumo inalável de cigarros sem filtro.
O desenvolvimento de métodos analíticos cada vez mais sensíveis e reprodutíveis permitiram a Hoffman e Hoffman,19 identificarem 66 compostos com efeitos carcinogénicos
no fumo de cigarro. Desses compostos, 11 são conhecidos como carcinogénicos para o Homem (Grupo 1), 8 são provavelmente carcinogénicos para o Homem (grupo 2A) e os restantes 47 são carcinogénicos para animais que são possivelmente também carcinogénicos em humanos (grupo 2B).9 A Tabela 1.2 apresenta uma selecção desses compostos.
Tabela 1.2. Alguns dos compostos carcinogénicos presentes no fumo do cigarro.
Composto Grupo Composto Grupo
Benzo [ajpireno l NNAL+ 2B
4-Aminobifenil 1,3-Butadieno 2B
2-Naftilamina Acetaldeído 2B
Formaldeído Isopreno 2B
Benzeno Estireno 2B
Oxido de etileno Catecol 2B
Cádmio Níquel 2B NNK** l Cobalto 2B NNN" Chumbo 2B 'NNAL = 4-(metilnitrosamina)-l-(3-piridil)-l-butanol "NNK = 4-(metilnitrosamina)-l-(3-piridil)-l-butanona *NNN = N-nitrosonornicotina
1.5. Ingredientes adicionados ao tabaco
Os cigarros comercializados são fabricados a partir de uma mistura de vários tipos de tabaco e são sujeitos a diferentes processamentos. Durante a mistura e processamento do tabaco são adicionados humidificantes, tais como o glicerol e o propilenoglicol, que minimizam a troca de humidade do produto com o ambiente, além de facilitarem o
processamento do fumo. São também adicionados ingredientes aromáticos para melhorar as características do fumo em termos de sabor e aromas específicos."
Enquanto que o termo "constituinte do tabaco" se refere a uma substância que está naturalmente presente no tabaco, o termo "ingrediente do tabaco" refere-se a uma substância, que foi adicionado ao tabaco durante o processo de fabrico do cigarro."
Quando o cigarro é fumado, quer os constituintes quer os ingredientes podem ser parcialmente destilados, transferindo-se intactos para o fumo ou sofrerem reacções de pirólise. Os produtos da pirólise, por sua vez, podem ser transferidos intactos para o fumo ou reagirem com outros constituintes do fumo, originando compostos secundários. Consequentemente, quando se pretende saber qual a influência dos ingredientes adicionados à composição química do próprio tabaco é necessário saber se são ou não pirolisados durante a queima do cigarro e que produtos de pirólise se formam.13
Ensaios químicos e biológicos têm sido realizados com o objectivo de estudar o efeito dos ingredientes do tabaco.21"24 Estes estudos indicaram que os ingredientes
normalmente usados nos cigarros não alteram a toxicidade do fumo. Para além disso, esses mesmos ingredientes não produzem efeito nos níveis da maior parte dos constituintes do fumo que são conhecidos por provocarem doenças. A única excepção foi o formaldeído, cujos níveis aumentaram na presença de alguns ingredientes. Isto dever-se-á ao facto do formaldeído ter origem em pirólises de açúcares, celulose e outras substâncias polissacáridas (ingredientes adicionados aos cigarros). No entanto, no âmbito da sensibilidade e da especificidade dos bioensaios utilizados (dois ensaios genotóxicos e um ensaio citotóxico), a actividade específica da matéria particulada do fumo do cigarro não foi alterada pela adição dos ingredientes.
1.6. Processo de queima do cigarro
A queima do cigarro é um processo complexo onde muitos tipos de reacções químicas ocorrem em paralelo. Existem duas regiões principais dentro da zona da queima do cigarro: uma zona exotérmica chamada de zona de combustão e uma zona endotérmica chamada de zona de pirólise/destilação. Na zona de combustão, o oxigénio é consumido originando os produtos típicos da combustão (dióxido carbono, monóxido de carbono e água) e libertando o calor que sustenta a queima. Enquanto dura a aspiração de ar através do cigarro ocorrem temperaturas entre os 600 e 950 °C. Imediatamente a jusante da zona de combustão tem lugar a zona de pirólise/destilação onde as temperaturas são da ordem dos
Introdução
-200 a 600 °C e os níveis de oxigénio são relativamente baixos. Aproximadamente um terço dos constituintes do fumo, incluindo nicotina, libertam-se nessa zona. '
O tempo de residência dos compostos na região onde se dá a sua formação é de apenas alguns milissegundos. Enquanto dura a aspiração de ar, o vapor gerado é puxado para fora da região de pirólise/destilação e arrefece muito rapidamente na presença do ar diluído que entra pela linha de queima do papel. Isto leva a que os vapores dos compostos menos voláteis atinjam rapidamente o seu ponto de saturação, ocorrendo condensação quando o vapor arrefece para temperaturas inferiores a 350°C. Forma-se, assim, um aerossol denso, que constitui a fracção particulada.13 Depois de formadas, as partículas passam, em
fracções de segundos, desta temperatura inicial para uma temperatura próxima do ambiente, sendo que, esta queda de temperatura abrupta facilita a formação das partículas. Os núcleos que promovem a condensação (e que se encontram em grande número) podem ser fragmentos microscópicos de matéria orgânica queimada incompletamente, como cinzas, moléculas de elevada massa molecular, moléculas carregadas electricamente, etc. No entanto, nem sempre é necessária a existência destes núcleos de condensação para a formação das partículas. Existem partículas que se formam simplesmente a partir dos vapores em estado de saturação que arrefecem bruscamente.
Os hidrocarbonetos de massa molecular baixa são gerados na região de pirólise/destilação da zona de queima e encontram-se, tal como já foi mencionado, em grande quantidade na fase gasosa do fumo. N-alcanos e alcenos de cadeias longas são gerados a temperatura superior a 700°C. À temperatura de 500°C, formam-se mais de 75 hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos como o benzeno e o tolueno, devido à pirólise de aminoácidos, ácidos gordos, açucares e parafinas. À temperatura de cerca de 700°C formam-se naftalenos. Existem pelo menos 80 naftalenos no fumo do tabaco. A pirólise e reacções pirosintéticas de hidrocarbonetos de cadeias longas, terpenos, fitoesterois como o estigmasterol, parafinas, açucares, aminoácidos, celuloses e reacções envolvendo radicais primários, originam numerosos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH's), tendo sido já identificados cerca de 300 PAH's no fumo do tabaco.
Uma técnica que tem sido usada para tentar estabelecer uma relação entre os componentes do tabaco e os produtos que constituem o fumo é a análise da radioactividade dos produtos presentes no fumo obtido a partir de cigarros que foram dopados com isótopos radioactivos marcadores. Estes estudos permitem calcular a quantidade de constituintes e ingredientes do tabaco que são transferidos para o fumo durante a queima do cigarro bem como a quantidade que sofre decomposição térmica e oxidação durante a transferência.
No estudo realizado por Schmeltz et ai.,25 procederam à adsorção de nicotina
marcada radioactivamente a sílica gel, realizaram a pirólise isotérmica da mistura em atmosfera de azoto em tubos de combustão a várias temperaturas entre os 600 e 900 °C e analisaram, na fase particulada recolhida, os produtos marcados (que deverão ter tido origem na nicotina). Durante a pirólise a nicotina degradou-se em piridinas, o que envolveu simples quebras de ligações e sofreu degradações mais extensas e rearranjos dando origem a quinolinas, arilnitrilos e hidrocarbonetos aromáticos. Neste mesmo estudo foi usada uma máquina de fumar, para fumar cigarros que continham nicotina marcada. Neste caso, foi encontrada uma porção substancial (aproximadamente 42%) de nicotina destilada, sem sofrer qualquer alteração, quer no fumo aspirado quer no fumo libertado directamente na atmosfera. Nestas condições, cerca de 11% da nicotina foi convertida em piridinas e apenas uma pequena fracção se converteu em quinolinas, arilnitrilos e hidrocarbonetos aromáticos. Além disso, no cigarro 12,5% da nicotina oxidou-se totalmente formando dióxido de carbono. Portanto, este estudo mostrou que ocorreu uma degradação térmica da nicotina mais extensa na pirólise da nicotina isolada do que na queima do cigarro.
Nesse trabalho demonstrou-se que os produtos da pirólise da nicotina isolada ou inserida na queima do cigarro são diferentes e que o mesmo acontecerá com outros constituintes do tabaco. Consequentemente, para que os estudos de pirólise produzam resultados semelhantes aos que acontecem na queima do cigarro, o processo deve simular o que ocorre na zona de queima do cigarro quando este é fumado, em termos de velocidade de aquecimento, temperaturas atingidas, níveis de oxigénio e velocidade de gás, tamanho realístico da amostra a ser pirolisada e do tempo de residência dos produtos na região de alta temperatura.
1.7. Métodos de amostragem e análise de fumo de cigarro
Vários métodos têm sido usados para recolher e determinar níveis de diferentes compostos no fumo inalável de cigarros. Métodos usando filtros de Cambridge foram usados para recolher a fase particulada (técnica desenvolvida por Pillsbury et ai. 1969, citado em ) assim como precipitação electrostática.
A concentração de água e nicotina na fase particulada foi determinada por Darral et
ai, usando GC-MS, após extracção com 60 mL de 2-propanol a partir do filtro com
Introdução,
massa total da fase particulada, tendo Chepiga et al.,n usado a mesma técnica. Steven e
Borgerding27 usaram um método semelhante para determinar a nicotina, sendo a fase
particulada extraída com 10 mL de metanol, com agitação durante 30 minutos. Na determinação, por GC, foi usado um detector de emissão atómica.
Radovanovic e Misic28 usaram também uma máquina de fumar equipada com um
filtro de fibra de vidro para recolher a fase particulada. Os componentes da fase particulada foram extraídos num extractor soxhlet durante 10 horas com 250 mL de n-hexano. Os compostos fenólicos foram extraídos e separados por extracção ácido-base, mas de um modo que não é explicitado pelos autores. A fracção do alcatrão constituída por PAH's foi separada por cromatografia em coluna de sílica gel, usando como eluente o n-hexano. As fracções extraídas foram depois analisadas por cromatografia gasosa com detecção por ionização de chama (FID) e captura electrónica (ECD).
Desde há muitos anos que os PAHs do fumo do tabaco constituem objecto de estudo. Sabe-se que os PAHs se encontram principalmente na fase particulada do fumo. A análise de PAHs no fumo de cigarro envolve geralmente extracção com solventes a partir da matéria particulada total (MPT), extracção para fase sólida e pré-concentração antes da análise. Técnicas cromatográficas e espectrométricas são normalmente usadas na análise.
Gmeiner et ai.,30 desenvolveram um método para determinar quantitativamente
PAHs na fase particulada do fumo inalável e aplicaram-no a cigarros de referência Kentucky 1R4F. Os cigarros foram fumados numa máquina segundo as normas ISO e foram adicionados à solução PAHs deuterados como padrões internos antes da análise. O processo envolveu extracção de PAH's com metanol a partir dos filtros, diluição em água, extracção em fase sólida (SPE) numa coluna Ci8 e eluição com ciclohexano, seguindo-se
quantificação por GC-MS. O método permitiu a análise de 17 PAHs numa amostra constituída por fumo de 20 cigarros. O desvio padrão relativo encontrado foi inferior a 10% e os coeficientes de correlação superiores ou iguais a 0,99. Excepto para um composto (dibenzo[a,h]antraceno) as percentagens de recuperação foram superiores a 70%. Este método pode ser também aplicado ao fumo libertado directamente na atmosfera pela ponta do cigarro a arder (sidestream).
Li et ai,29 desenvolveram uma técnica para análise de PAHs em cada aspiração de
ar, a qual permitiu obter informações sobre distribuição dos PAHs no fumo durante o consumo de um cigarro. O processo consistiu numa armadilha de empacotamento constituída por um disco laminar de alumínio, onde foi recolhida a MPT presente no fumo de uma única aspiração. A MPT foi depois pesada e dissolvida numa mistura de tolueno,
hexano e isopropanol na proporção de 5:5:1, contendo 1 pg/mL de cada um dos seguintes PAHs deuterados, naftaleno-d8, fenantreno-dlO, criseno-dl2 e perileno-dl2, que funcionaram como padrões internos. A mistura MPT/solvente foi depois colocada num banho de ultra-sons à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois 1 pL da solução foi injectado no GC-MS e analisada usando o sistema de iões-massa seleccionados (MIS). O método permitiu determinar naftaleno, fenantreno, fluoranteno, pireno e benzo[aJpireno em cigarros de referência Kentucky 1R4F, fumados segundo as normas ISO. As concentrações típicas dos cinco PAHs estudados29 em diferentes marcas de cigarros foram de 2-4 pg,
0,2-0,4 pg, 60-150 ng, 45-140 ng e 9-40 ng para o naftaleno, fenantreno, fluoranteno, pireno e benzo[a]pireno respectivamente, e variaram, com o tipo de tabaco, características do papel do cigarro, tamanho do cigarro, filtro e ventilação.
Os mesmos autores29 também estudaram a influência de diferentes acendedores do
cigarro na concentração de PAHs na primeira aspiração de ar. Utilizaram quatro acendedores diferentes: isqueiro eléctrico, lamparina de butano, um isqueiro de butano convencional e fósforos. Constataram níveis de incerteza associados às determinações maiores quando usaram acendedores manuais. As concentrações de PAHs foram superiores quando foi utilizado o fósforo e o isqueiro de butano convencional. As concentrações obtidas quando foi utilizado o isqueiro eléctrico e a lamparina de butano foram semelhantes. Aparentemente, os efeitos dos acendedores tornam-se mais visíveis à medida que as concentrações dos PAHs são superiores. Isto deve-se ao facto de, quando se utiliza o fósforo ou o isqueiro de butano convencional, uma grande porção dos PAHs detectados no fumo ter origem na chama, quer por contribuição directa da chama, quer por interacção da chama com o tabaco ou compostos produzidos durante a queima do cigarro.
Recentemente, Akpan et al.,b também determinaram PAHs presentes na fase
particulada do fumo inalável de cigarro. A fase particulada foi recolhida em filtros de Cambridge, que é uma técnica eficiente para recolher PAHs menos voláteis, mas não é eficiente na recolha de fracções mais voláteis. Seguia-se depois extracção e purificação dos compostos e análise por HPLC com um detector fluorimétrico (tal como em ).
Compostos com um grupo carbonilo (por exemplo, aldeídos e cetonas) são constituintes da fase de vapor do fumo de cigarro. Têm origem principalmente na volatilização directa e pirólise do cigarro durante a combustão. Alguns dos compostos muito voláteis ou reactivos presentes no fumo de cigarro são de difícil análise directa, tendo sido caracterizados em poucos trabalhos publicados. Envolvem sempre uma derivatização depois da recolha do fumo. Entre os reagentes derivatizantes utilizados destaca-se o
2,4-Introdução,
dinitrofenilhidrazina (DNPH) que origina compostos muito estáveis . Os compostos contendo grupos carbonilo mais abundantes no fumo de cigarro são o acetaldeído, a acetona e o formaldeído.
Houlgate et ai,33 estabeleceram métodos para determinar formaldeído e acetaldeído
no fumo inalável do cigarro gerado por uma máquina de fumar. Os aldeídos foram recolhidos fazendo passar o fumo por uma solução com DNPH em meio ácido, que era posteriormente analisada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Miyake et
ai,34 determinaram níveis de formaldeído, acetona, propanal, 2 -metilpropanal, butanal,
hexanal e octanal após derivatização com tiazolinas, seguindo-se quantificação por cromatografia gasosa com detecção por azoto-fósforo.
Compostos orgânicos aromáticos, tais como o benzeno e o tolueno, já foram também objecto de estudo. Brunnemann et al.,35 e Byrd et ai.,36 fizeram a extracção deste compostos
passando o fumo inalável por armadilhas que continham metanol a muito baixas temperaturas (-78°C), seguindo-se quantificação por GC-MS.
Para determinar benzeno e outros COVs no fumo inalável do cigarro, Darrall et ai,
26 após gerarem o fumo numa máquina de fumar, provida de dois filtros de fibra de vidro
para recolha da fase particulada, recolheram os COVs em três frascos borbulhadores montados em série que continham metanol e eram mantidos a baixas temperaturas (-78°C). O primeiro continha 20 mL do solvente e os restantes apenas 5 mL cada um. Os COVs recolhidos eram depois analisados por GC-MS.
A Health Canada,37 indica como método para recolha de compostos voláteis
presentes no fumo inalável de cigarro, a passagem do fumo por filtros de fibra de vidro (92 mm) seguindo-se a passagem por armadilhas contendo metanol a baixas temperaturas (-70°C). Às soluções obtidas deve ser adicionado padrão interno (benzeno deuterado) e injectadas num GC-MS para quantificação. Este método foi usado por Counts et ai, ' ' para determinar os componentes que constam na regulamentação da Health Canada.
1.7.1. Padronização do "acto de fumar" para estudar o
fumo
Não existem dois fumadores que fumem cigarros do mesmo modo. Por isso, os valores relativos aos teores de alcatrão e nicotina associados às diferentes marcas de cigarros não são indicadores precisos das quantidades de nicotina e alcatrão inaladas por cada fumador de cigarros de determinada marca. Porém, para que se possam obter
resultados comparáveis sobre cigarros de diferentes marcas há a necessidade de se usarem métodos de aspiração de ar padronizados, realizados por máquinas adequadas, em condições laboratoriais bem definidas. Este tipo de metodologias foi introduzido por autoridades reguladoras, designadamente a Comissão Federal de Comércio dos E.U.A. (U.S. Federal Trade Commission - FTC) em cooperação com a Organização Internacional de Normalização (ISO). Tais metodologias permitem evidenciar diferenças relativas de teores de constituintes do fumo de diferentes marcas de cigarros, presumindo que cada cigarro será segurado e fumado do mesmo modo que a máquina o faz.39
Em 1936 a American Tobacco Company começou a usar máquinas de fumai" com condições padronizadas, que tentaram reflectir os hábitos dos fumadores dessa altura. Os níveis médios de nicotina nos cigarros fumados eram de cerca de 2.8 mg/cigarro.19 A FTC
adaptou em 1969 o método padrão de 1936, apenas com pequenas modificações, definindo alcatrão como a fase particulada do fumo menos a quantidade de água e nicotina. A partir daí, as condições padrão da máquina de fumar são as seguintes: uma aspiração de 2 segundos, num total de 35 mL de ar, cada minuto, sendo deixados por fumar 23 mm em cigarros sem filtro e 3 mm a partir do filtro no caso de cigarros com filtro. No Canada e no Reino Unido, as condições padrão ISO de fumar cigarros foram aceites desde 1991. Noutros países Europeus, as condições padrão de fumar cigarros foram desenvolvidas pelo CORESTA (Centre de Cooperation pour les Recherches Scientifiques Relative au Tabac), sendo similares às condições padrão da FTC mas definindo alcatrão como o total de fase particulada menos a quantidade de água.
Por seu lado, os legisladores do Canada, na província de British Columbia (Health
Canada - HC) consideraram que deveriam ser determinadas as concentrações máximas dos
principais componentes nos cigarros. Para tal, estabeleceram os seguintes parâmetros de aspiração de ar: volume de 55 mL e um intervalo entre aspirações de 30 segundos; caso os cigarros possuam furos de ventilação junto ao filtro, estes devem ser tapados. Nestas condições, espera-se atingir um valor aproximado das concentrações máximas possíveis de
i • 14 40 obter nos cigarros. '
Por sua vez, o Massachusetts Department of Public Health (MDPH) defende que melhor do que obter valores de concentração máximos é preferível obter uma estimativa mais realista das concentrações médias no cigarro e propôs os seguintes parâmetros: aspiração de um volume de ar de 45 mL e um intervalo entre aspirações de 30 segundos; devendo ser tapados metade dos buracos de ventilação, simulando o fumador que segura o cigarro entre os dedos essa zona.14'41 Nem a HC nem MDPH alteraram duração da aspiração
Introdução,
de ar estabelecido pelas normas ISO que é de 2,0 segundos. Aumentos no volume da aspiração de ar e diminuição do intervalo entre aspirações conduzem a aumentos na dose de exposição no fumo na fracção inalável. A Tabela 1.3 apresenta os parâmetros defendidos nas principais normas em vigor.
Tabela 1.3. Parâmetros utilizados na máquina de fumar, referentes às puxadas de Bloqueamento Condições Volume (mL) Duração (s) Intervalo (s) da ventilação
(%)
ISO 35 2 60 0
MDPH 45 2 '30 50
HC 55 2 30 100
Apesar de existirem métodos padrão para a geração e colheita de fumo inalável em máquinas de fumar (FTC, ISO) e determinação de alcatrão, nicotina e monóxido de carbono, não existem métodos padrão conhecidos para análise de outros constituintes do fumo.38
Sem métodos analíticos padronizados, torna-se difícil a comparação entre níveis de constituintes do fumo de cigarro determinados por diferentes métodos analíticos.
A influência do modo de fumar cigarros nas concentrações dos compostos do fumo tem sido tratada em diversas publicações. Counts et a/.,17,38 chegaram à conclusão de que,
tal como seria de prever, as quantidades da maioria dos constituintes presentes no fumo do tabaco aumentam tipicamente segundo a ordem ISO < MDPH < HC. Ou seja, as concentrações no fumo aumentam à medida que aumenta o volume da aspiração de ar e há redução da ventilação - maior quantidade de tabaco fumado por aspiração de ar. A concentração de água no fumo aumenta significativamente pela mesma ordem. O aumento de água no fumo poderá afectar a filtração de alguns dos constituintes. O aumento relativo das concentrações é geralmente maior para os constituintes da fase de vapor do fumo do que para os constituintes da fase particulada. Existem alguns constituintes que são excepção como é o caso do fenol e da quinolina, onde 50 a 70 % dos cigarros analisados apresentaram concentrações similares quando foram usados os parâmetros HC e MDPH. No caso do 1-aminoftaleno e do 2-1-aminoftaleno também aproximadamente 50% das determinações
realizadas apresentam valores de concentrações idênticas usando quer os parâmetros HC quer os MDPH.
Os volumes de aspiração de ar maiores e ventilações menores no método HC levam a um aumento do fluxo de ar dentro do cigarro e a um aumento da temperatura, o que terá efeitos na combustão, pirólise e destilação que ocorre dentro do cigarro durante a queima. Assim, quando se alteram os parâmetros usados na máquina de fumar as quantidades relativas dos constituintes que fazem parte da composição do fumo do cigarro poderão também alterar-se.
1.7.2. Importância do uso de cigarros de referência
Devido à complexidade do cigarro (atribuída aos parâmetros do design físico do mesmo, variações nas misturas de tabacos e ingrediente adicionados), a selecção de um cigarro de referência apropriado para ser usado por diferentes investigadores, de modo a fornecer resultados comparáveis tornou-se uma necessidade.
Assim sendo, foram desenvolvidos cigarros de referência, da marca Kentucky, como resultado da cooperação entre a US National Cancer Institue, a Agriculture Research
Service of the US Department of Agriculture e a University of Kentucky Tobacco and Health Research Institute (Lexington, Kentucky). Esses cigarros incorporam as principais
características dos cigarros que foram colocados no mercado desde 1950. Os cigarros de referência servem como um padrão internacional, com vista ao seu uso em trabalhos de investigação.
Chepiga et ai, estudaram a composição do fumo inalável de cigarros de referência Kentucky, tendo analisado 18 constituintes específicos, que foram seleccionados por terem sido identificados como compostos que podem contribuir para os riscos associados ao fumo de cigarro: nicotina (extraída com 2-propanol a partir da fase particulada recolhida em filtro, seguindo-se analise por GC), CO (determinado por espectrofotometria no infravermelho não dispersiva - NDIR), amoníaco (determinado por calorimetria), benzo[a]pireno (analisado por HPLC com detecção por fluorescência), óxidos de azoto (determinados por quimioluminescência), formaldeído, acetaldeido, acetona e 2-propenal (determinados por HPLC com detector por fluorescência depois de derivatização com 2-difenilacetil-l ,3-indadiona-1-hidrazona para formar derivados de azina), cianeto de hidrogénio (adsorvido em hidróxido de sódio, seguida extracção com água e análise por colorimetria), nitrosaminas específicas do tabaco (extracção a partir da fase particulada do fumo com
