0 MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ CENTRO DE PESQUISAS RENÉ RACHOU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICO E DE
RESISTÊNCIA/SUSCEPTIBILIDADE AO ÓXIDO NÍTRICO EM PORTADORES DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA
DA TERRA INDÍGENA XAKRIABÁ, MINAS GERAIS, BRASIL.
por
Raquel Carvalho Gontijo
Belo Horizonte Fevereiro de 2013
II MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ CENTRO DE PESQUISAS RENÉ RACHOU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICO E DE
RESISTÊNCIA/SUSCEPTIBILIDADE AO ÓXIDO NÍTRICO EM PORTADORES DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA DA TERRA INDÍGENA
XAKRIABÁ, MINAS GERAIS, BRASIL.
por
Raquel Carvalho Gontijo
Belo Horizonte Fevereiro de 2013
Dissertação apresentada com vistas à obtenção do Título de Mestre em Ciências na área de concentração Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientação: Dra. Célia Maria Ferreira Gontijo Co-orientação: Dra. Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal
III Catalogação-na-fonte
Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR
Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975 G641a
2013
Gontijo, Raquel Carvalho.
Avaliação do perfil imunológico e de
resistência/susceptibilidade ao óxido nítrico em
portadores de leishmaniose cutânea na Terra
Indígena Xakriabá, Minas Gerais, Brasil / Raquel
Carvalho Gontijo. – Belo Horizonte, 2013.
xviii, 78 f.: il.; 210 x 297mm. Bibliografia: f.: 88 - 96
Dissertação (Mestrado) – Dissertação para obtenção do título de Mestre em Ciências pelo Programa de Pós - Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.
1.
Leishmaniose
Cutânea/imunologia
2.
Leishmania braziliensis/parasitologia 3. Óxido
Nítrico/análise I. Título. II. Gontijo, Célia Maria
Ferreira (Orientação). III. Pascoal, Vanessa
Peruhype Magalhães
IV
Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz Centro de Pesquisas René Rachou
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
“Avaliação do perfil imunológico e de resistência/susceptibilidade ao óxido nítrico em portadores de leishmaniose cutânea da Terra Indígena Xakriabá, Minas Gerais, Brasil”
por
Raquel Carvalho Gontijo
Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Dra. Célia Maria Ferreira Gontijo (Presidente) Prof. Dr. Márcio Sobreira Silva Araújo
Prof. Dra. Denise da Silveira Lemos Giunchetti Suplentes: Dra. Fernanda Freire Campos Nunes
V
Dedico este trabalho à minha mãe, que esteve presente em todos os momentos da minha vida, com todo seu apoio, dedicação e amor incondicional.
VI
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela oportunidade de realizar este trabalho e principalmente por me amparar nessa jornada e me fortalecer para que eu chegasse até aqui.
Às agências de fomento que financiaram este trabalho: FAPEMIG, CNPq, FIOCRUZ e Comunidade Européia.
Ao Centro de Pesquisas René Rachou, pela infraestrutura e apoio logístico.
À Biblioteca do CPqRR em prover acesso gratuito local e remoto à informação técnico-científica em saúde custeada com recursos públicos federais, integrante do rol de referências dessa dissertação, também pela catalogação e normalização da mesma.
À Dra. Célia Maria Ferreira Gontijo, pela orientação sábia, pelo exemplo de profissional e por todos os ensinamentos que me foram passados ao longo desses anos. Muito obrigada por contribuir para o meu crescimento.
À Dra. Vanessa Peruhype, por compartilhar seus conhecimentos, pela sua amizade, dedicação e paciência, e principalmente por me motivar e acreditar em mim em todos os momentos.
Aos amigos do Lalei pela convivência harmoniosa e divertida de todos os dias e pela troca de conhecimentos. Vocês foram essenciais nessa caminhada.
Á Dra. Patrícia Quaresma pela amizade e companheirismo e pela colaboração durante a realização do projeto.
À Dra. Elizabeth Moreno pela colaboração no estudo epidemiológico e pela sua disposição e profissionalismo.
À Dra. Andréa Teixeira por colaborar com seus conhecimentos durante a implantação e o desenvolvimento do projeto
Ao Ms. Matheus Fernandes pelo seu apoio e por toda ajuda dispensada durante a realização deste projeto.
À Dra. Denise Lemos pela disponibilidade e pela imensa colaboração na execução deste trabalho.
VII À Agna Guimarães por toda disposição, dedicação e pela participação fundamental durante a execução dos experimentos.
Aos colaboradores do LBDM, por disponibilizarem seu tempo e espaço durante a execução deste trabalho.
À Ana Carolina Campi pela disponibilidade e prontidão.
À equipe de saúde de São João das Missões e da FUNASA, por todas as contribuições e por permitir a realização deste trabalho.
À população indígena Xakriabá, por nos receber com carinho, espero que possamos ter contribuído para melhoria das condições de vida e saúde na reserva.
Aos meus avós que continuam presentes em meu coração. Vocês também fizeram parte dessa conquista.
Aos meus sogros, Helton e Expedita, por ser minha segunda família.
À todos os meus amigos que tornaram essa jornada mais amena e agradável.
Ao meu pai pelo socorro nas horas difíceis e pelo apoio constante.
À minha mãe por permitir que esse sonho se tornasse real. Por tudo que fez por mim, dedicando sua vida em favor da minha, muito obrigada por me proporcionar mais essa vitória.
Ao André por todo carinho e atenção, por estar presente em todos os momentos, pela cumplicidade e compreensão nas horas difíceis, e por me fazer acreditar nos meus sonhos. Sem você nada disso seria possível.
VIII
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ... XI LISTA DE TABELAS ... XIV LISTA DE ABREVIATURAS ... XV RESUMO ... XVII ABSTRACT ... XVIII 1 INTRODUÇÃO ... 20 2 OBJETIVOS ... 22 2.1 Objetivo geral: ... 22 2.2 Objetivos específicos: ... 22 3 REVISÃO DA LITERATURA ... 24 3.1 As leishmanioses ... 24 3.2 Leishmaniose Tegumentar ... 25 3.2.1 Manifestações clínicas da LT ... 27 3.2.4 Diagnóstico e tratamento da LT ... 29 3.2.2 Aspectos imunológicos da LT ... 30 3.2.3 O óxido nítrico e a LT... 32 4 MÉTODOS ... 35 4.1 Área de estudo ... 35 4.2 Procedimentos éticos ... 37
4.3 Caracterização da população avaliada ... 37
4.3.1 Critérios de inclusão ... 40
4.3.2 Critérios de exclusão ... 40
4.4 Tratamento dos pacientes diagnosticados com LCL ... 40
4.5 Caracterização do perfil de expressão do marcador de superfície CD23 por monócitos e das citocinas IFN-γ e IL-4 por subpopulações de linfócitos T... 44
4.5.1 Obtenção de formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis e marcação com Isoticianato de fluoresceína (FITC) ... 44
4.5.2 Ensaio de fagocitose de formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis por monócitos do sangue periférico ... 45
4.5.2.1 Avaliação do perfil de expressão do marcador de superfície celular CD23 em monócitos do sangue periférico ... 46
4.5.2.2 Aquisição e análise in vitro da capacidade fagocítica e expressão do marcador CD23 por monócitos do sangue periférico ... 47
4.5.2.3 Avaliação do perfil de expressão das citocinas IFN-
γγγγ
e IL-4 intracelulares em subpopulações de linfócitos T do sangue periférico ... 494.5.2.4 Aquisição e análise pós-estimulação in vitro de citocinas intracelulares em subpopulações de linfócitos T do sangue periférico ... 50
4.6 Avaliação do perfil de produção de óxido nítrico intracelular por monócitos ... 51
IX 4.6.2 Avaliação dos níveis de óxido nítrico intracelular em monócitos do sangue periférico, após estimulação in vitro com antígenos solúveis de L. (V.) braziliensis
... 52
4.6.3 Aquisição e análise do perfil de produção de óxido nítrico intracelular em monócitos do sangue periférico ... 54
4.7 Quantificação dos níveis séricos de IgE total ... 55
4.7.1 Níveis séricos de IgE total ... 55
4.8 Identificação do perfil de resistência/susceptibilidade de isolados de L. (V.) braziliensis ao óxido nítrico ... 56
4.8.1 Identificação de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes/susceptíveis ao óxido nítrico através do método do MTT ... 56
4.9 Análise Estatística ... 57
4.9.1 Caracterização do perfil de expressão do marcador de superfície CD23 por monócitos, das citocinas IFN-γ e IL-4 por linfócitos e do perfil de produção de NO por monócitos ... 57
4.9.2 Quantificação dos níveis séricos de IgE total ... 57
4.10 Análise do perfil panorâmico de biomarcadores ... 58
4.11 Identificação do perfil de resistência/susptibilidade de isolados de L. (V.) braziliensis ao óxido nitrico ... 58
4.11.1 Determinação de IC50 ... 58
4.11.2 Cálculo do percentual de inibição da viabilidade... 59
5 RESULTADOS ... 60
5.1 Avaliação do perfil de expressão do marcador de superfície celular CD23 por monócitos do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+) e portadores de LCL, considerando o tempo de evolução da lesão na presença ou ausência de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis ... 60
5.2 Avaliação do perfil de expressão intracelular das citocinas IFN-γ e IL-4 por linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+) e portadores de LCL, considerando o tempo de evolução da lesão na presença ou ausência de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis ... 61
5.2.1 Avaliação do perfil de expressão intracelular das citocinas IFN-γ e IL-4 por linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ do sangue periférico de indivíduos NI, TM+ e portadores de LCL, divididos por tempo de evolução da lesão, na presença ou ausência de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis ... 61
5.3 Avaliação dos níveis de óxido nítrico intracelular em monócitos do sangue periférico de indivíduos Não Infectados (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+) e portadores de LCL, considerando o tempo de evolução da lesão, na presença ou ausência de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis ... 63
5.3.1 Avaliação dos níveis de óxido nítrico intracelular em monócitos do sangue periférico de indivíduos NI, TM+ e portadores de LCL, divididos por tempo de evolução da lesão, na presença ou ausência de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis ... 63
X 5.4 Análise do perfil panorâmico de biomarcadores imunológicos em indivíduos não infectados (NI), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL), considerando o tempo de evolução da lesão
... 65
5.5 Análise de correlação entre a expressão do marcador de superfície CD23, citocinas IFN-
γ
e IL-4 e os níveis de óxido nítrico intracelular em indivíduos não infectados (NI), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL), considerando o tempo de evolução da lesão ... 675.6 Dosagem dos níveis séricos de IgE total em indivíduos não infectados (CT), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) ... 67
5.7 Identificação de cepas de L. (V.) braziliensis resistentes/susceptíveis ao óxido nítrico ... 68
6 DISCUSSÃO ... 71
7 CONCLUSÕES ... 83
8 ANEXOS ... 84
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Formas promastigotas de Leishmania sp.(A), Formas amastigotas de
Leishmania sp.(B) (Fonte: Manual de vigilância da LTA/MS 2007)... 24
Figura 2: Distribuição geográfica das principais espécies causadoras da LT no Brasil
(Fonte: SVS/MS 2007) ... 26
Figura 3: Manifestações clínicas da LT: (A) Forma localizada única; (B) Forma
disseminada; (C) Forma difusa; (D) Forma mucosa. Fonte: Manual de Vigilância da LTA/MS 2007. ... 28
Figura 4: Lesão de paciente portador de leishmaniose cutânea atípica em placa da Terra
Indígena Xakriabá... 29
Figura 5: Síntese de NO a partir da L-arginina. (Fonte: DAFF, 2010). ... 33
Figura 6: Localização geográfica do município de São João das Missões, Minas Gerais,
Brasil (Fonte IBGE 2005)... 35
Figura 7: Distribuição anual de casos de LT na Terra Indígena Xakriabá no período de
2001 a 2007. ... 36
Figura 8: Desenho esquemático ilustrando os procedimentos realizados para
classificação da população avaliada pelo estudo. ... 38
Figura 9: Esquema de tratamento utilizado nos portadores de LCL da Terra Indígena
Xakriabá... 41
Figura 10: Seleção e marcação de formas promastigotas de Leishmania (V.)
braziliensis. (A) representa o perfil das formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis, selecionadas na janela “gate” em gráfico de distribuição pontual de tamanho versus granulosidade. (B) representa a intensidade média de fluorescência apresentada pelos parasitos após a marcação com FITC em gráfico de histograma. ... 45
Figura 11: Análise do perfil de fagocitose de leishmanias-FITC por monócitos do
sangue periférico por citometria de fluxo. (A) representa o perfil celular da população de monócitos, selecionada na janela “gate” de monócitos em gráfico de fluorescência-3 (CD14-PerCP) em função da granulosidade. (B) representa o perfil de análise da população de monócitos na ausência de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis em gráfico de fluorescência-1 (FL-1) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP). (C) representa o perfil de análise da população de monócitos na presença de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis marcadas com FITC, indicando no quadrante duplo positivo (Q2) o percentual de monócitos que fagocitaram o parasito-FITC em gráfico de fluorescência-1 (FITC) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP). ... 48
Figura 12: Análise da expressão de CD23 por monócitos do sangue periférico por
citometria de fluxo. (A) representa o perfil celular da população de monócitos, selecionada na janela “gate” monócitos em gráfico de densidade de fluorescência-3 (CD14-PerCP) em função da granulosidade. (B) representa o perfil de análise da população de monócitos positivos para o marcados de superfície CD23 no quadrante
XII duplo positivo (Q2) em gráfico de densidade de fluorescência-2 (CD23-PE) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP). ... 48
Figura 13: Análise do perfil de expressão de citocinas por linfócitos T do sangue
periférico por citometria de fluxo. (A) representa o perfil celular da população de linfócitos totais, selecionada na janela “gate” linfócitos totais em gráfico de tamanho versus granulosidade. (B) representa o perfil de análise da população de linfócitos TCD8+ positivos para citocina IFN-γγγγ no quadrante duplo positivo (Q2) em gráfico de fluorescência-2 (IFN-γγγγ -PE) versus fluorescência-3 (CD8-PerCP). ... 51 Figura 14: Oxidação do DAF-2DA para uma forma fluorescente DAF-2T através da ação de esterases na presença de NO (Fonte: SCHACHNIK, 2008) ... 53
Figura 15: Análise do perfil de produção de NO por monócitos do sangue periférico
por citometria de fluxo. (A) representa o perfil celular da população de monócitos, selecionada na janela “gate” monócitos em gráfico de granulosidade em função da fluorescência-3 (CD14-PerCP). (B) representa o perfil de análise da população de monócitos na ausência do reagente DAF-2DA em gráfico de fluorescência-1 (FL-1) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP). (C) representa o perfil de análise da população de monócitos produtores de NO (DAF-2T+) no quadrante duplo positivo (Q2) em gráfico de fluorescência-1 (DAF-2T) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP). ... 55
Figura 16: Avaliação do perfil de expressão da molécula de ativação CD23 por
monócitos do sangue periférico de indivíduos dos grupos Não Infectado (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+), Clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60). Os resultados estão apresentados como percentual de monócitos CD14+CD23+ em formato de gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos Não Infectado (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+), Clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60) estão representadas pelas letras a, c, b, d, h. Já as diferenças estatisticamente significativas entre as culturas na ausência (CC) ou presença (LEISH) de formas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis estão representadas por asterisco (*). ... 61
Figura 17: Avaliação do perfil de expressão das citocinas IFN-γγγγ e IL-4 por linfócitos T CD4+ do sangue periférico de indivíduos dos grupos controle (CT), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+), Clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60). Os resultados estão apresentados como percentual de linfócitos T CD4+citocinas+ em gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos controle (CT), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+), clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60) estão representadas pelas letras a, b, d . Já as diferenças estatisticamente significativas entre as culturas na ausência (CC) ou presença (LEISH) de formas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis estão representadas por asterisco (*). ... 62
Figura 18: Avaliação do perfil de expressão das citocinas IFN-γγγγ e IL-4 por linfócitos T CD8+ do sangue periférico de indivíduos dos grupos Não Infectado (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+) Clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60). Os resultados estão apresentados como
XIII percentual de linfócitos T CD8+citocinas+ em gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. Não houve diferença estatística entre os grupos avaliados. ... 63
Figura 19: Avaliação dos níveis de NO intracelular em monócitos do sangue periférico
de indivíduos dos grupos Não Infectado (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+), Clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60). Os resultados estão apresentados como percentual de células CD14+ DAF-2T+ em gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos Não Infectado (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+) e clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60) estão representadas pelas letras b, c, d. Já as diferenças estatisticamente significativas entre a cultura controle (CC) e a cultura estimulada com antígeno solúvel de L. (V.) braziliensis (LEISH) estão representadas por asterisco (*). ... 64
Figura 20: Comparação das assinaturas de biomarcadores após estímulo com L. (V.)
braziliensis ou antígeno solúvel de L. (V.) braziliensis. (A, B, C, D e E) Frequência de alto produtores dos grupos Não Infectado (NI), Teste de Montenegro Positivo sem Lesão (TM+), Clínico (LCL), Clínico Lesão Recente (LCL<60) e Clínico Lesão Tardia (LCL>60), respectivamente. A análise comparativa foi realizada utilizando a curva ascendente de biomarcadores do grupo controle como referência. Situações em que as frequências de observações se localizaram em lados opostos do percentil 50 foram consideradas como diferenças relevantes. ... 66
Figura 21: Dosagem dos níveis séricos de IgE total nos diferentes grupos avaliados. O
gráfico A corresponde à curva padrão e o gráfico B às concentrações de IgE total (ng/mL) no grupo NI, TM+ e LCL. As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos estão demonstradas pelas letras a e b. ... 68
Figura 22: Médias das absorbâncias referentes à avaliação do comportamento de
isolados de L (V.). braziliensis provenientes de pacientes responsivos (C) e refratários (FT) ao tratamento com Glucantime® expostos a concentrações variadas de NaNO2, por
MTT. Diferença estatisticamente significativa foi observada entre os grupos C e FT na concentração de 512 mM. ... 69
Figura 23: Desenho esquemático ilustrando a participação do mecanismo de ativação
de monócitos e produção de NO via IFN-γγγγ, IL-4 e CD23 no estabelecimento e desenvolvimento da forma clínica cutânea localizada. ... 77
Figura 24: Desenho esquemático ilustrando a participação do mecanismo de ativação
de monócitos e produção de NO via IFN-γγγγ, IL-4 e CD23 no controle e resistência à infecção por L. (V.) braziliensis ... 79
XIV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Espécies de Leishmania encontradas no homem... 25
Tabela 2: População avaliada classificada segundo o tempo de evolução da lesão ... 39
Tabela 3: Caracterização da população do estudo imunológico ... 39
Tabela 4: Classificação da população avaliada no estudo de resistência/susceptibilidade
ao NO. ... 43
Tabela 5: Anticorpos utilizados para avaliação do perfil de expressão do marcador de
superfície celular CD23 por monócitos. ... 47
Tabela 6: Anticorpos utilizados para avaliação do perfil de citocinas intracelulares.... 50
Tabela 7: Percentual de viabilidade dos isolados de L. (V.) braziliensis de pacientes
responsivos e refratários ao tratamento com Glucantime® expostos a diferentes concentrações de NaNO2. ... 70
XV
LISTA DE ABREVIATURAS
µg Micrograma
µL Microlitro
AG Aminoguanidina
ANOVA Análises de Variâncias
BFA Brefeldina A
C3 Terceiro Componente do Complemento
CC Cultura Controle
CD Cluster of differentiation
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2 Dióxido de Carbono
CPqRR Centro de Pesquisa René Rachou DAF-2DA Diacetato de 4,5-diaminofluoresceína DAF-2T Triazolofluoresceína
DNA Ácido Desoxirribonucléico
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
FAPEMIG Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
FITC Isocianato de Fluoresceína
FL Fluorescência
FLS Facs Lysing Solution
FSC Tamanho celular
FUNAI Fundação Nacional do Índio FUNASA Fundação Nacional de Saúde
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IDRM Intradermorreação de Montenegro
IFN Interferon
IL Interleucina
IMF Intensidade Média de Fluorescência iNOS Enzima Óxido Nítrico Sintase Induzida
LCD Leishmaniose Cutânea Difusa
LCL Leishmaniose Cutânea Localizada
XVI
LMC Leishmaniose Mucocutânea
LPS Lipopolissacarídeo
LSA Antígeno Solúvel de Leishmania (V.) braziliensis
LT Leishmaniose Tegumentar LV Leishmaniose Visceral MFF Solução Fixadora MG Miligrama mL Mililitro mM Mili Molar
mRNA RNA mensageiro
MS Ministério da Saúde
NK Natural Killer
NO Óxido Nítrico
OMS Organização Mundial de Saúde
PBS Tampão Fosfato Salino
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PE Ficoeritrina
PerCP Proteína Clorofila Piridinina
pH Potencial Hidrogeniônico
RNA Ácido Ribonucléico
RPM Rotação por minuto
SFB Soro Fetal Bovino
SSC Granulosidade celular
TLR Toll Like Receptor
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais WHO World Health Organization
XVII
RESUMO
Infecções causadas por Leishmania (Viannia) braziliensis apresentam manifestações clínicas diversas e a leishmaniose cutânea localizada (LCL) é a forma clínica mais comum. Na Terra Indígena Xakriabá, localizada no norte de Minas Gerais, 212 casos autóctones de LCL foram registrados no período de 2001 a 2007. O grande número de casos e as particularidades da área reforçam o interesse de investigar aspectos da resposta imune do hospedeiro em relação à infecção. O óxido nítrico (NO) é um potente agente citotóxico presente na resposta imune anti-Leishmania. Na LCL, um dos mecanismos de produção de NO envolve a ligação de IgE ao receptor CD23 de macrófagos num microambiente de citocinas IFN-γ ou IL-4. Apesar do papel crucial do NO no curso da infecção, tem sido relatada a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação dessa molécula. Assim, os objetivos do presente trabalho foram avaliar por citometria de fluxo, o perfil de expressão do marcador de ativação CD23 e de produção de NO intracelular por monócitos e o perfil de expressão das citocinas IFN-γ e IL-4 por linfócitos T do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI, n=10), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+, n=13) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL, n=17), considerando o tempo de evolução da lesão (LCL<60 dias, n=7; LCL>60 dias, n=10). Foi feita também a dosagem dos níveis séricos de IgE dos indivíduos participantes. Além disso, investigou-se a possível preinvestigou-sença de L. (V.) braziliensis resistentes/susceptíveis ao NO em isolados de pacientes responsivos (C, n=5) e refratários ao tratamento (FT, n=5) com Glucantime®. Para o estudo imunológico foram realizadas culturas de leucócitos do sangue periférico na ausência (CC) ou presença de formas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis (LEISH) ou na presença de antígeno solúvel de L. (V.) braziliensis. A dosagem dos níveis séricos de IgE foi feita utilizando-se kit específico baseado na técnica ELISA sanduíche. Para identificação do perfil de resistência dos isolados foram feitos ensaios de viabilidade utilizando-se a técnica do MTT. Os resultados obtidos com o estudo imunológico mostram que o grupo LCL apresentou maior expressão de CD23 e maior produção de NO por monócitos em relação aos grupos TM+ e NI, além de menor expressão de IFN-γ e IL-4 por linfócitos T CD4+ em relação ao grupo TM+
. Por outro lado, o grupo TM+ apresentou aumento relevante no percentual de alto produtores das citocinas avaliadas, NO e CD23 quando comparado ao grupo NI. Ao dividirmos o grupo LCL por tempo de lesão, observamos no grupo LCL<60 grande frequência de alto produtores de IL-4, NO e CD23, indicando um perfil misto de ativação/modulação da imunidade inata. Os níveis séricos de IgE total foram menores no grupo LCL quando comparado aos grupos NI e TM+, havendo redução do grupo TM+ em relação ao grupo NI. Além disso, dos 10 isolados testados, 8 foram resistentes à ação do NO, sendo que, os 2 sensíveis foram provenientes de indivíduos responsivos ao tratamento com Glucantime®. Diante disso, foi possível inferir que outras fontes celulares, além dos linfócitos T, podem estar envolvidas na produção de citocinas no grupo LCL e que no grupo TM+ há forte indício da participação do mecanismo de ativação de monócitos e indução de NO investigado neste estudo, favorecendo o controle da infecção, impedindo assim, o aparecimento de lesões. Além disso, a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação do NO corrobora com achados de outros autores e pode estar diretamente relacionada com a resistência à ação do Glucantime®.
XVIII
ABSTRACT
Infections caused by Leishmania (Viannia) braziliensis presents many clinical manifestations and localized cutaneous leishmaniasis (LCL) is the most common clinical form. At the Xakriabá Indigenous Land, located in the northern Minas Gerais, 212 autochtone cases of LCL was reported during the period of 2001 to 2007. The elevated number of cases and particularities of the area reinforces the interest to investigate aspects of the host immune response in relation with infection. Nitric oxide (NO) it’s a potent cytotoxical agent present in the anti-Leishmania immune response. In LCL, one of many mechanisms of NO production involves the IgE bind to the macrophages CD23 receptor in a cytokines IFN-γ or IL-4 microenvironment. Despite the crucial role of NO in the infection course, has been related the existence of Leishmania (Viannia) braziliensis isolates resistant to NO action. Thus, the aims of this study was evaluate, by flow cytometry, the expression profile of CD23 activation marker and NO production by monocytes, and the expression profile of cytokines IFN-γ and IL-4 by T lymphocytes subpopulations of peripheral blood of noninfected individuals (NI, n=10), Positive Montenegro Skin Test without lesion (TM+, n=13) and patients with Localized Cutaneous Leishmaniasis (LCL, n=17), considering the evolution time of the lesion (LCL<60 days, n=7; LCL>60 days, n=10). Was made too, the seric IgE levels dosage in the participants. Besides this, was investigated the possible presence of the resistant/susceptible L. (V.) braziliensis isolates from responsive (C, n=5) and refractory (FT, n=5) patients to treatment with Glucantime®. For the immunological study, was realized leucocytes cultures of peripheral blood in the absence (CC) or presence of live L. (V.) braziliensis promastigotes/L. (V.) braziliensis soluble antigen (LEISH). The dosage of seric IgE levels was made using a specific kit based on sandwich ELISA technique. For the resistant/susceptible profile investigation, viability assays was made using the MTT technique. The obtained results with immunological study show that the LCL group present higher CD23 expression and higher NO production by monocytes in relation with TM+ e NI groups, besides lower expression of IFN-γ e IL-4 by CD4+ T lymphocytes when compared to TM+
group. On the other side, TM+ group presents relevant increase in the percentage of higher producers of evaluated cytokines, NO and CD23 when compared with NI group.
Dividing LCL group for lesion evolution time, was observed in LCL<60 increase frequency of higher producers of IL-4, NO and CD23, indicating a mixed profile of activation/modulation of the innate immunity. The total IgE seric levels was lower in the LCL group when compared to the NI and TM+ groups, with a reduction of TM+ in relation with NI group. Besides this, of 10 isolates tested, 8 was resistant to NO action and the 2 sensible was obtained from individuals that was responsible to the treatment with Glucantime®. In front this, was possible to infer that other cellular sources, besides T lymphocytes, could be involved in the cytokine production in LCL group and in the TM+ group there is a strong possibility for the participation of monocytes activation and induction mechanism and NO induction investigated in this study, favoring the infection control, preventing the occurrence of skin lesions. Besides this, the existence of NO resistant L. (V.) braziliensis isolates, corroborates with other authors findings and could be directly related with Glucantime® treatment resistance.
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1 INTRODUÇÃO
No Brasil, assim como em outros países do Novo Mundo, a Leishmaniose Tegumentar (LT) constitui um problema de saúde pública (Ministério da Saúde, 2010). Dados epidemiológicos da FUNASA demonstram que, no Brasil, a LT representa a segunda doença tropical de maior prevalência, sendo as regiões norte e nordeste as principais áreas endêmicas. Além disso, a LT está inserida no grupo das 13 Doenças Tropicais Negligenciadas (DTN) e é classificada na categoria de “doenças emergentes e sem controle” (Lindoso & Lindoso, 2009).
A importância da LT como problema de saúde pública reside não apenas na sua elevada incidência, mas também no risco da ocorrência da forma clínica mucocutânea de difícil tratamento e que pode produzir deformidades (Leifso et al., 2007).
A ocorrência de focos de leishmaniose tegumentar em tribos indígenas no Brasil tem sido pouco estudada. Os primeiros relatos sobre sua ocorrência datam das décadas de 50-60 e referem-se a estudos em tribos do estado do Mato Grosso (Forattini & dos Santos, 1956; de Carneri et al. 1963).
O estilo de vida dos povos indígenas e as condições sociais a que estão submetidos, má nutrição, falta de higiene e saneamento, convívio estreito com animais no ambiente doméstico e peridomiciliar, favorecem a transmissão de diversas parasitoses (Pena, 2004), dentre elas a LT. Dessa forma, trata-se de uma oportunidade rara estudar aspectos diversos relacionados à LT em povos indígenas.
Alguns trabalhos anteriores têm chamado a atenção para a importância dos padrões de resposta imune na LT. Os estudos têm demonstrado que o estabelecimento e a evolução das lesões causadas por infecções por Leishmania (Viannia) braziliensis que caracterizam as diferentes formas clínicas da LT são altamente dependentes da imunidade celular (Pirmez et al., 1993; Da-Cruz et al., 1994; Coutinho et al., 1996; Baratta-Masini et al., 2007).
Vários trabalhos sugerem que a resposta imune celular do tipo 1, caracterizada pela produção de IFN-γ, tenha um papel protetor na LT. Em modelo murino, IFN-γ tem mostrado uma ação simultânea com outra citocina derivada de macrófagos, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), ativando a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS ou NOS2) para produzir o óxido nítrico (NO) resultando na morte do parasito intracelular (Liew et al., 1990; Bogdan et al., 2000).
21 Em 1995, Vouldoukis e colaboradores demonstraram que a ligação de IgE ao seu receptor de baixa afinidade FcεRII /CD23 em macrófagos humanos é forte e induz a produção de NO, após a ativação com IL-4 ou IFN-γ, restringindo assim o crescimento de Leishmania major.
Outros trabalhos demonstram que o NO tem sido fundamental para o controle de infecção por Leishmania spp. (Giudice et al., 2007). Apesar do papel fundamental do NO no controle da doença, a resistência do parasito a essa molécula tem sido descrita (Giudice et al., 2007). Dessa forma, é possível estabelecer correlação positiva entre a gravidade da doença e o isolamento de cepas resistentes (Fang, 1997). Porém a resistência do parasito à ação do óxido nítrico ainda não está totalmente esclarecida.
No presente trabalho, a Terra Indígena Xakriabá foi escolhida para o estudo, principalmente em função do interesse dos próprios índios, manifestado em reuniões prévias com membros de nossa equipe, representantes da Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) e das instituições municipais. Outro fator crucial para a escolha da localidade foram os casos autóctones de LT registrados a partir de 2001. Até o ano de 2007 foram identificados 212 casos entre os habitantes da reserva (MS/FUNASA, 2008).
Por não existirem estudos prévios na Terra Indígena Xakriabá, a única estratégia de controle atualmente adotada é o diagnóstico dos casos suspeitos e tratamento dos doentes. O estudo da resposta imune, através da avaliação do perfil de ativação celular, da produção de citocinas envolvidas na ativação de macrófagos e indução de NO e da produção de óxido nítrico intracelular, e, associados à avaliação do perfil de resistência/susceptibilidade ao NO, irão caracterizar possíveis biomarcadores indicadores de estabelecimento/manutenção e controle/cura da infecção.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral:
Avaliar o perfil imunológico e de resistência/susceptibilidade ao óxido nítrico em portadores de leishmaniose cutânea localizada da Terra Indígena Xakriabá, Minas Gerais, Brasil.
2.2 Objetivos específicos:
1) Caracterizar o perfil de expressão do marcador de superfície CD23 por monócitos e das citocinas IFN-γ e IL-4, por subpopulações de linfócitos T do sangue periférico de indivíduos não infectados (CT), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL), considerando o tempo de evolução da lesão;
2) Avaliar o perfil de produção de óxido nítrico intracelular por monócitos do sangue periférico de indivíduos não infectados, Teste de Montenegro positivo sem lesão e portadores de leishmaniose cutânea localizada, considerando o tempo de evolução da lesão;
3) Avaliar o perfil panorâmico dos biomarcadores imunológicos NO, CD23, IFN-γ e IL-4 em indivíduos não infectados, Teste de Montenegro positivo sem lesão e portadores de leishmaniose cutânea localizada, considerando o tempo de evolução da lesão;
4) Correlacionar o perfil de expressão do marcador de superfície CD23, das citocinas IFN-γ e IL-4, bem como, o perfil de produção de óxido nítrico em indivíduos não infectados, Teste de Montenegro positivo sem lesão e portadores de leishmaniose cutânea localizada, considerando o tempo de evolução da lesão;
5) Dosar níveis séricos de IgE total em amostras de indivíduos não infectados, Teste de Montenegro positivo sem lesão e portadores de leishmaniose cutânea localizada
23 6) Identificar o perfil de resistência/susptibilidade de isolados de L. (V.) braziliensis ao óxido nítrico e associar com cura e falha ao tratamento com Glucantime®.
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3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 As leishmanioses
No Novo Mundo as leishmanioses são um grupo de doenças de caráter zoonótico causadas por parasitos da família Trypanosomatidae, gênero Leishmania (Ross 1903), transmitidos ao homem e outros mamíferos domésticos e silvestres pela picada de fêmeas de insetos dípteros conhecidos como flebotomíneos (Psychodidae: Phlebotominae).
Os protozoários do gênero Leishmania apresentam duas formas principais: uma promastigota flagelada, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e outra amastigota sem flagelo livre, observada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados (Figura 1). As amastigotas são intracelulares obrigatórias principalmente das células do sistema mononuclear fagocitário (SMF) (Ministério da Saúde, 2007).
Figura 1: Formas promastigotas de Leishmania sp.(A), Formas amastigotas de Leishmania sp.(B) (Fonte: Manual de vigilância da LTA/MS 2007).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) as Leishmanioses afetam 98 países ou territórios em 5 continentes (Europa, Ásia, América, África e Oceania), com uma incidência de 2 milhões de casos ao ano (0,5 milhoes de leishmaniose visceral e 1,5 milhoes de leishmaniose cutânea) (WHO, 2010). No Brasil, o Ministério da Saúde relata uma incidência de 28.000 casos ao ano.
No Novo mundo, as Leishmanioses apresentam duas principais formas clínicas no homem, a Leishmaniose Visceral (LV) e a Leishmaniose Tegumentar (LT), com um amplo espectro de manifestações. Nas leishmanioses, a forma clínica é altamente dependente da espécie de Leishmania envolvida e do status imunológico do hospedeiro. Assim, existem as espécies dermotrópicas, que acometem pele e mucosas e as espécies viscerotrópicas, que possuem afinidade pelo tecido linfóide e órgãos como fígado e baço (Tabela 1).
25 Tabela 1: Espécies de Leishmania encontradas no homem.
Subgênero L. (Leishmania) L. (Leishmania) L. (Viannia) L. (Viannia)
Velho Mundo L. donovani
L. infantum L. major L. tropica L. killicki L. aethiopica L. infantum
Novo Mundo L. infantum L. infantum
L. mexicana L. pifanoi L. venezuelensis L. garnhami L. amazonensis L. braziliensis L. guyanensis L. panamensis L. shawi L. naiffi L. lainsoni L. lindenbergi L. peruviana L. colombiensis L. braziliensis L. panamensis
Principal tropismo Viscerotrópica Dermotrópica Dermotrópica Mucotrópica
Fonte: WHO Technical Report Series- Control of the leishmaniasis, 2010.
3.2 Leishmaniose Tegumentar
A Leishmaniose Tegumentar é uma doença parasitária que acomete pele e mucosas. É primariamente uma infecção zoonótica, afetando outros animais que não o homem, o qual pode ser envolvido secundariamente. No Novo Mundo, existem 15 espécies de Leishmania causadoras da LT divididas em dois subgêneros: Leishmania e Viannia (Tabela 1).
A LT distribui-se amplamente no continente americano, estendendo-se desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina, com exceção do Uruguai e do Chile. De acordo com o Ministério da Saúde, no Brasil tem sido encontrada em todos os estados (Figura 2), tendo sua expansão iniciada a partir da década de 80 (Ministério da Saúde, 2006).
26 O processo de expansão da LT tem modificado os padrões de transmissão da doença, antes associada apenas a trabalhadores rurais ou habitantes de áreas próximas à mata. Atualmente, a ocorrência da LT tem sido relatada também em áreas periurbanas e regiões desmatadas (Shimabukuro et al., 2010).
No Brasil, a LT é uma doença com diversidade de agentes, de reservatórios e de vetores que apresenta diferentes padrões de transmissão e um conhecimento ainda limitado sobre alguns aspectos, o que a torna de difícil controle. Até o momento, sete espécies do gênero Leishmania foram identificadas no Brasil como causadoras de LT. Seis dessas espécies pertencem ao subgênero Viannia e apenas uma pertence ao subgênero Leishmania. As espécies mais importantes são Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) amazonensis, ambas amplamente distribuídas no território nacional e a L. (V.) guyanensis, que ocorre na região Norte. As outras espécies, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi e L. (V.) lindenberg contribuem para um número menor de notificações e são restritas aos estados do Norte e Nordeste como mostrado na Figura 2.
Figura 2: Distribuição geográfica das principais espécies causadoras da LT no Brasil (Fonte: SVS/MS 2007)
27 3.2.1 Manifestações clínicas da LT
Muito tem sido estudado a respeito das relações parasito-hospedeiro na LT, principalmente a resposta imune dos hospedeiros. Este foco na imunidade remete ao importante papel desempenhado pelo sistema imune no curso da infecção. Contudo, vale ressaltar que diversos fatores, em conjunto, irão determinar o complexo espectro de manifestações clínicas da doença.
Além da espécie de Leishmania envolvida, há alguns fatores intrínsecos ao hospedeiro, como status imunológico, presença de co-morbidades, má nutrição e predisposição genética, que podem torná-lo mais susceptível à ação do parasito e agravar os sintomas da doença.
A LT possui um amplo espectro de manifestações clínicas, sendo a forma cutânea (LC), a mais comum. Na forma cutânea localizada a lesão é, geralmente, caracterizada pelas bordas altas e o fundo granuloso, sendo na maioria das vezes indolor (Figura 3A). Há também a forma cutânea disseminada (Figura 3B) caracterizada por lesões ulceradas pequenas, muitas vezes acneiformes, distribuídas por todo o corpo do indivíduo. Na LC, a imunidade celular é preservada, o que pode ser verificado através da positividade ao teste de Intradermorreação de Montenegro (IDRM). Esta resposta celular específica, bem modulada, mas com predominância de citocinas do tipo 1, reflete a tendência à cura espontânea e boa resposta ao tratamento.
Na LC, sabe-se que a incapacidade de montar uma resposta imune celular eficaz está associada à evolução clínica da doença e, muitas vezes a falhas terapêuticas. Em pacientes imunocomprometidos a LC pode apresentar quadros clínicos atípicos, com tendência à disseminação e má resposta aos esquemas quimioterápicos usuais (Ministério da saúde, 2006). A leishmaniose difusa (Figura 3C) é considerada forma rara da LC e se encontra distribuída em alguns países das Américas, África e Ásia. Essa forma clínica é caracterizada por maciço comprometimento dérmico e natureza crônica. Isso ocorre devido à ausência de resposta imune celular efetiva contra o parasito, que se multiplica sem controle, aumentando o número de lesões e expandindo sua distribuição na superfície corporal. Na forma difusa, o teste cutâneo de Montenegro é caracteristicamente negativo, devido à ausência de resposta inflamatória do hospedeiro.
Ao contrário da leishmaniose difusa, a leishmaniose mucosa (LM) é caracterizada pela exacerbação da resposta celular anti-Leishmania, com escassez de
28 parasitos e IDRM positiva. O principal agente etiológico da LM é a L. braziliensis, e o comprometimento das mucosas é, na maioria das vezes, secundário às lesões de pele (Figura 3D). Essa forma acomete a mucosa e cartilagem nasofaríngeas e na maioria das áreas endêmicas, 1 a 10% de infecções cutâneas localizadas resultam na forma mucosa num período de um a cinco anos após a cura das lesões cutâneas (Marsden, 1986).
A
B
C
D
Figura 3: Manifestações clínicas da LT: (A) Forma localizada única; (B) Forma disseminada; (C) Forma difusa; (D) Forma mucosa. Fonte: Manual de Vigilância da LTA/MS 2007.
Além destas manifestações clínicas da LT, alguns trabalhos (Lescure et al., 2002; Guimarães et al., 2009; Baptista et al., 2009) relatam casos de leishmaniose cutânea que não se enquadram em nenhuma das formas clínicas bem caracterizadas da doença, cuja denominação adotada tem sido LT atípica (Figura 4). A presença de lesões incomuns e não da úlcera típica caracteriza esta forma na qual os pacientes podem ser portadores de lesões verrucosas, crostosas, vegetativas e até mesmo lesões lupóides (Freire et al., 2011).
29 Figura 4: Lesão de paciente portador de leishmaniose cutânea atípica em placa da Terra Indígena Xakriabá.
Além disso, é importante ressaltar que cerca de 10% dos indivíduos residentes em área endêmica apresentam teste de hipersensibilidade tardia a antígeno de Leishmania positivo e não desenvolvem a doença, caracterizando uma forma subclínica de LTA (Follador et al, 2002). Corroborando com este estudo, em inquérito epidemiológico realizado na Terra Indígena Xakriabá em 2008 por nosso grupo, foi verificada uma prevalência de 19,2% de indivíduos que apresentaram Teste de Montenegro positivo sem a presença de lesões ou cicatrizes condizentes com LT (Freire, 2011).
3.2.4 Diagnóstico e tratamento da LT
O diagnóstico laboratorial da LT pode ser parasitológico, imunológico ou molecular. O diagnóstico parasitológico baseia-se na pesquisa de parasitos em esfregaços de lesões, culturas (in vitro) de fragmentos de biópsias de lesão ou aspirados de lesão cutânea. O diagnóstico imunológico pode ser feito de forma indireta, através da mensuração da resposta imune celular com a injeção intradérmica de antígenos do parasito (intradermorreação de Montenegro - IDRM), que deve ser lida em 48 a 72 horas, sendo consideradas positivas as reações com área de enduração maior ou igual a 5mm. O diagnóstico imunológico por sorologia é mais utilizado no diagnóstico da forma visceral, uma vez que a LT produz baixa titulação de anticorpos. Já o diagnóstico molecular, consiste na detecção do DNA do parasito através de métodos baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
30 O tratamento da LT reside na utilização de quimioterápicos. Há mais de 50 anos o antimonial pentavalente tem sido administrado, e é a droga de primeira escolha, preconizada pelo Ministério da Saúde (Ouellette, 2004).
A OMS e o Ministério da Saúde recomendam para o tratamento da LT 20mg de antimônio pentavalente/Kg durante 20 dias, no caso da forma cutânea e difusa, ou durante 30 dias para a forma mucosa, podendo-se repetir o tratamento caso haja falha terapêutica (Ministério da Saúde, 2007).
O mecanismo de ação do antimônio ainda não é totalmente conhecido. Acredita-se que a droga atue nas formas amastigotas do parasito, inibindo a atividade glicolítica e a via oxidativa de ácidos graxos (Berman, 1988). A principal limitação desse medicamento, que produz efeitos adversos potencialmente graves e fatais, é a toxicidade (Sampaio et al. 1997, Oliveira et al. 2005), impedindo sua administração em pacientes com doenças pré-existentes, além de exigir monitoramento cuidadoso de diversas funções orgânicas (Herwaldt & Bermam, 1992).
Há drogas alternativas como stibugluconato de pentamidina e anfotericina B, utilizadas nas formas rebeldes ao tratamento convencional e quando há contra-indicação ao uso do antimonial. Há também a anfotericina B em sua forma lipossomal, que reduz bastante os efeitos colaterais, porém seu custo é mais elevado (Ouellette, 2004).
Outra droga tem sido bastante estudada, por ser a única de via oral, a miltefosina. Tal medicamento se mostrou eficaz no tratamento da LV e alguns casos de LT já foram tratados (Sundar, 2002).
Vale enfatizar que mesmo com o tratamento adequado a ocorrência de recidivas e/ou comprometimento mucoso é freqüente, sendo de 2% nos casos tratados e ao redor de 10% nos casos não tratados (Basano & Camargo, 2004).
3.2.2 Aspectos imunológicos da LT
A resposta imune celular tem papel importante na patogênese da leishmaniose tegumentar. Segundo alguns autores, formas promastigotas de Leishmania spp. ligam-se a receptores específicos em macrófagos e são internalizadas por um processo denominado fagocitose (Mosser & Rosenthal, 1993). A interação inicial dessas promastigotas com macrófagos é fundamental para o estabelecimento da infecção no hospedeiro (Rosenthal et al. 1996).
31 Após a internalização dos parasitos via fagocitose, há transformação da forma promastigota em amastigota, capaz de sobreviver no interior dos macrófagos. Dessa forma, o macrófago parasitado servirá como célula apresentadora de antígeno e produzirá citocinas para atrair e ativar outras células do sistema imune.
Na leishmaniose cutânea e na leishmaniose mucosa, uma intensa resposta do tipo 1, com alta produção de IFN-γ e TNF-α é observada. Esse tipo de resposta inflamatória, apesar de estar associada ao controle da infecção, se não modulada, pode levar ao dano tecidual. Essa ativação de células do tipo 1 é observada em todas as formas clínicas da infecção causada por Leishmania braziliensis como também por outras espécies como a L. guyanensis e L. amazonensis (Convit et al, 1993).
Por outro lado, a diminuição da resposta inflamatória, com aumento das citocinas reguladoras, como a IL-10, por exemplo, favorece a disseminação e a multiplicação do parasito.
Alguns indivíduos são capazes de montar a resposta à infecção sem desenvolver a doença aparente. Follador e colaboradores (2002) comparou a resposta imune de indivíduos sem história de doença e com Teste de Montenegro positivo, com a resposta de indivíduos com leishmaniose cutânea. Os resultados obtidos demonstraram que os indivíduos Teste de Montenegro positivo têm resposta tipo 1 em níveis bem menores que aqueles com LC, sugerindo que a resposta tipo 1 modulada pode ser suficiente para proteger contra o estabelecimento e desenvolvimento da infecção evitando ocomprometimento tecidual.
Uma vez que a Leishmania é um parasito intracelular obrigatório do sistema mononuclear fagocitário, o principal mecanismo de defesa do organismo é a produção de IFN-γ, necessária para ativação de macrófagos e síntese de derivados do oxigênio, como óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) (Carvalho et al., 2005).
Alguns estudos em camundongos C57BL-6, demonstraram que a resposta do tipo 1, associada à produção de IL-2, IFN-γ e TNF-α, está relacionada à resistência do indivíduo ao patógeno e consequentemente à cura espontânea da lesão, enquanto a resposta tipo 2, caracterizada pela produção de IL-4 e IL-5 em camundongos BALB/c, está associada à susceptibilidade à infecção (Scott et al., 1988). Entretanto, o paradigma Th1 versus Th2 não explica a patogênese das formas clínicas da leishmaniose tegumentar causadas pela L. (V.) braziliensis. Em contraste com a observação que na leishmaniose cutânea difusa existe uma ativação de células do tipo 2 ( Bomfim et al, 1996), pacientes infectados com L. (V.) braziliensis produzem grandes quantidades de
32 citocinas pró-inflamatórias, que a despeito de controlar a multiplicação do parasito, não impedem o desenvolvimento da lesão (Bacellar et al, 2011).
Apesar do importante papel da IL-4 na resposta Th2, inibindo a produção de importantes citocinas ativadoras de macrófagos, tem sido avaliado o papel dessa citocina no contexto da resposta inflamatória. O aumento de iNOS e consequente produção de óxido nítrico foi relatada por alguns autores após o tratamento de macrófagos com IL-4 (Vouldoukis et al., 1995; Paul-Eugène et al., 1995). Além disso, em estudo realizado por Mossalayi e colaboradores (1999), foi demonstrado que um pico na produção de IL-4 nos momentos iniciais da infecção, coincide com os níveis de IFN-γ, e se mantém até a cura, sugerindo que há sinergia entre essas duas citocinas e participação de ambas na ativação de macrófagos.
De acordo com alguns autores, a LC tende à cura espontânea (Goto & Lindoso 2010). Dessa forma, tem sido evidenciado que culturas de células de pacientes apresentando cura espontânea das lesões produzem mais IFN-γ que pacientes com lesão ativa (Carvalho et al. 1995). Já na cura clínica, após tratamento específico, observa-se maior produção de IFN-γ por linfócitos T CD4+
, T CD8+ e células NK que ativam macrófagos. Estas células produzem TNF-α que em sinergia com o IFN-γ induzem ativação de iNOS e produção de NO, agente citotóxico responsável pela destruição das formas amastigotas e eliminação do parasito. Assim, acredita-se que o grau de resistência dos parasitos aos mecanismos leishmanicidas dos macrófagos esteja diretamente relacionado com a severidade das lesões na LT (Giudice et al. 2007).
3.2.3 O óxido nítrico e a LT
O óxido nítrico (NO) é um radical livre gasoso com um curto espaço de meia-vida biológica (Santoro et al., 2001). O NO constitui uma das menores e mais simples moléculas biossintetisadas e está presente em quase todos os sistemas do organismo (Morris & Billiar, 1994).
O NO tornou-se uma das substâncias mais amplamente estudadas por causa de seu papel paradoxal importante em várias funções biológicas (Lampiao et al., 2006). Em 1992, foi selecionado pela revista "Science" como a "Molécula do ano" (Strianese et al., 2010). Isto refletiu a importância crucial desta molécula em uma variedade de processos biológicos.
O óxido nítrico é gerado a partir da oxidação do nitrogênio guanido-terminal da L-arginina por uma enzima dependente de NADPH, a óxido nítrico sintase
33 (NOS)(Voudoulkis et al.; 1995). O NO é sintetizado por duas isoformas distintas dessa enzima a NOS induzível (iNOS, NOS II), e a NOS expressa constitutivamente (NOS-3, ecNOS, NOS III) (Nathan & Xie, 1994).
Todas as NO sintases catalizam a reação mostrada abaixo (Figura 5):
Figura 5: Síntese de NO a partir da L-arginina. (Fonte: DAFF, 2010).
A enzima NOS catalisa a síntese do NO em dois ciclos distintos, produzindo a N-hidroxi-L-arginina como produto intermediário e a L-citrulina como subproduto. Os dois ciclos consomem uma molécula de oxigênio (O2) e necessitam da participação de
elétrons exógenos que são fornecidos pela nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH). A atividade da NOS também é influenciada pelos co-fatores flavina adenina dinucleotídeo (FAD), flavina mononucleotídeo (FMN) e a tetrahidrobiopterina (BH4) (Gorren & Mayer, 2007).
A síntese do NO pode ser inibida por análogos da L-arginina como a NG-monometil-L-arginina (L-NMMA), N-imino-etil-L-ornitina (L-NIO), amino-L-arginina (L-AA), nitro-L-amino-L-arginina (L-NA) e o metil éster correspondente, o NG-nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME). Esses inibidores atuam de forma competitiva sobre as três isoformas da NOS. Além desses inibidores, a aminoguanidina (AG) também é capaz de inibir a NOS apresentando relativa seletividade para a iNOS (Uchida et al., 2007).
O NO está envolvido em diversos processos fisiológicos e patológicos. Sua importância biológica é representada pela capacidade de atuar como um importante segundo-mensageiro, ativando ou inibindo moléculas-alvo envolvidas em diferentes
34 processos como regulação do tônus vascular, controle imunológico e neurotransmissão (Rathel et al., 2003; Barreto et al., 2005).
O óxido nítrico tem sido descrito como um potente agente citotóxico e citostático na resposta imune celular, capaz de limitar o crescimento de vários microorganismos intracelulares (Arturo et al., 2010).
Na LT, o NO é produzido após ativação dos macrófagos por citocinas inflamatórias IFN-γ e TNF-α (Goldman et al., 2001). Além disso, Vouldoukis e colaboradores (1995), demonstraram que a ligação de IgE ao seu receptor de baixa afinidade FcεRII /CD23 em macrófagos humanos é forte e induz a produção de NO, restringindo o crescimento de Leishmania major. Tem sido descrito que níveis séricos de IgE e a expressão do CD23 estão aumentados na leishmaniose cutânea, e monócitos/macrófagos humanos expressam FcεRII/CD23 após a ativação com IFN-γ ou IL-4 (Sousa-Atta et al., 2002; Delespesse et al., 1991).
Apesar do poder de citotoxicidade do NO a Leishmania utiliza de alguns mecanismos de escape. Uma vez fagocitado pelo macrófago, o parasito consegue induzir a produção de TGF-β, citocina capaz de bloquear a produção de NO (Green et al., 1994). Além disso, a Leishmania utiliza a arginina como nutriente. Essa arginina é convertida em ornitina pela arginase, enzima presente no parasito que compete com a iNOS pelo substrato, diminuindo assim a síntese de NO (Iniesta et al., 2002; Roberts et al. 2004).
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4 MÉTODOS
4.1 Área de estudo
A Terra Indígena Xakriabá está localizada no município de São João das Missões (14°53’01’’ de latitude Sul e 44°05’26’’ de longitude Oeste), na região norte do Estado de Minas Gerais (Figura 6).
Figura 6: Localização geográfica do município de São João das Missões, Minas Gerais, Brasil (Fonte IBGE 2005).
O clima tende a ser quente e seco, com chuvas de verão e o tipo de vegetação predominante é o cerrado com áreas mescladas de caatinga ao centro-oeste (IBGE, 2006). A reserva possui aproximadamente 8.380 indígenas, agrupados em 20 aldeias (FUNASA, 2010) (Figura 7).
Nas últimas décadas, entretanto, o espaço social ocupado pelos Xakriabá vem sofrendo um rápido processo de transformação demográfica, política, cultural, ecológica e econômica. Ritmos, dinâmicas e referências distintas contribuem para novas formas de articulação sócio-política e de organização ecológico-econômica dessa população (Diniz et al, 2006).
36 A principal atividade econômica dos Xakriabá é a agricultura, cultivada de modo tradicional e voltada para a subsistência da família. Há na reserva grande precariedade de suas condições de vida diante de uma produção alimentar insuficiente, da crescente escassez de recursos hídricos, esgotamento das terras cultiváveis e carência de serviços básicos (Clementino & Monte-Mór, 2006).
As condições de saneamento dos Xakriabá são bastante precárias, fazendo aumentar a incidência de verminoses e outras parasitoses. Além disso, a atuação da FUNASA na reserva é recente. As equipes de saúde foram contratadas a partir de 2000 e as intervenções sanitárias foram iniciadas efetivamente em 2001 (Pena & Heller, 2008).
A reserva indígena foi selecionada para o estudo devido ao grande número de casos de LT registrados nos últimos anos. No período compreendido entre 2001 e 2007 foram registrados 212 casos. O gráfico abaixo mostra a distribuição destes casos por ano (Figura 7): 0 10 20 30 40 50 60 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 N º d e c a s o s d e L T Anos
Figura 7: Distribuição anual de casos de LT na Terra Indígena Xakriabá no período de 2001 a 2007.
Um amplo estudo da epidemiologia da LT na reserva Xakriabá está sendo realizado por diferentes equipes do Centro de Pesquisas René Rachou, com o auxílio de diversos colaboradores externos. O estudo aborda aspectos da fauna flebotomínica e de pequenos mamíferos, bem como a identificação de espécies de Leishmania que infectam umanos, flebotomíneos e animais silvestres, sinantrópicos e domésticos. Além disso, o estudo em humanos aborda aspectos epidemiológicos, clínicos, imunológicos e
37 moleculares, na busca do diagnóstico, tratamento e acompanhamento dos casos identificados e determinação de biomarcadores de monitoração das diferentes formas clínicas da doença. O objetivo final deste grande projeto é produzir conhecimentos necessários a adequação dos serviços de saúde na perspectiva de promover a implementação de medidas preventivas e de controle adequadas a realidade local.
4.2 Procedimentos éticos
O trabalho foi realizado em concordância com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde do Ministério da Saúde, que regulamenta a pesquisa em seres humanos, mediante aprovação do Comitê de Ética do Centro de Pesquisas René Rachou (CEPSH/CPqRR - Protocolo nº 021/2007), da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP – Processo nº 25000.037372/2008-88) e autorização para ingresso em terra indígena fornecida pela FUNAI (Processo nº 2098/08).
Todos os casos detectados na reserva no decorrer do estudo receberam assistência adequada, com diagnóstico e tratamento, independente de terem sido alocados para os propósitos da presente investigação.
A participação no estudo foi condicionada à assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido pelos participantes ou seus responsáveis legais, no caso de menores de 18 anos.
4.3 Caracterização da população avaliada
Inicialmente foi realizada IDRM em todos participantes do estudo no local de domicílio. Posteriormente, os indivíduos foram convocados a comparecer ao Posto de Saúde mais próximo, 48 horas após a realização do inóculo, para leitura do teste e realização de exame clínico e, se necessário, aspirado/biópsia da lesão pelo médico responsável.
Dessa forma, foram considerados i) casos clínicos (leishmaniose cutânea localizada - LCL), pacientes com lesão característica associada à confirmação parasitológica (exame direto ou cultivo de aspirado/biópsia da lesão ou reação em cadeia da polimerase - PCR positivos) e imunológica (IDRM); ii) indivíduos Teste de Montenegro positivo (TM+), aqueles com IDRM positiva na ausência de lesões ou cicatrizes; iii) indivíduos não infectados (NI), aqueles que não apresentaram sinais sugestivos de LT e IDRM negativa (Figura 8). Em seguida, os resultados foram
38 encaminhados para o setor médico responsável, onde os casos detectados receberam tratamento e acompanhamento adequados.
Figura 8: Desenho esquemático ilustrando os procedimentos realizados para classificação da população avaliada pelo estudo.
Os pacientes do grupo clínico (LCL) foram separados em dois subgrupos de acordo com o tempo de evolução da lesão para análises comparativas posteriores. Foram consideradas lesões recentes aquelas com tempo de evolução de até 60 dias (LCL<60 n = 7), e tardias, aquelas com tempo superior a 60 dias (LCL>60 n=10). A separação foi feita de acordo com critérios estabelecidos por nosso grupo, tendo em vista que não há um padrão para classificar o tempo de evolução da lesão (Tabela 2).
39 Tabela 2: População avaliada classificada segundo o tempo de evolução da lesão
ID TL Classificação 333 2 LCL < 60 430 1 LCL < 60 416 2 LCL < 60 412 2 LCL < 60 301 1 LCL < 60 377 1 LCL < 60 387 1 LCL < 60 316 24 LCL > 60 314 3 LCL > 60 344 4 LCL > 60 339 12 LCL > 60 320 3 LCL > 60 66 12 LCL > 60 338 12 LCL > 60 373 12 LCL > 60 376 4 LCL > 60 380 3 LCL > 60
ID: identificação de paciente; TL: tempo de evolução da lesão (meses); LCL: Leishmaniose Cutânea Localizada
A tabela abaixo mostra as características gerais dos grupos avaliados no estudo imunológico (Tabela 3).
Tabela 3: Caracterização da população do estudo imunológico
GRUPO FE SEXO NL TL
Clínico – LCL (n=17) 7-45 10M – 7F 1-9 1-24
Teste de Montenegro positivo sem lesão – TM+ (n=13)
13-63 6M-7F - -
Controle – CT (n=10) 14-52 3M-7F - -
