MÉTODOS SOROLÓGICOS INTERAÇÃO GENO-ANTICORPO. Curso de Ciências Biológicas Disciplina: Imunologia Profa. Dra. Wilma A.

(1)

M

É

_É

TODOS

_TODOS

SOROL

Ó

_Ó

GICOS

_GICOS

INTERA

Ç

_Ç

ÃO

_ÃO

ANT

Í

GENO

-

ANTICORPO

Curso de Ciências Biol

ó

gicas

Disciplina:

Imunologia

Profa. Dra. Wilma A.

(2)

Termos usados na prática para designar as

interações antígeno-anticorpo

•

• SOROLOGIASOROLOGIA

• Reação in vitro do antígeno e do anticorpo sorológico (métodos sorológicos)

•

• INTERAINTERAÇÇÃO ANTÃO ANTÍÍGENOGENO- -ANTICORPO

ANTICORPO

• 1) precipitação (se o antígeno é solúvel),

• 2) aglutinação (se o antígeno é particulado) e

• 3) ativação de complemento

Antígeno deve ser multivalente e os anticorpos com pelo menos dois pontos de ligação com o antígeno: ligação cruzada entre os anticorpos e os antígenos “cross-linking”.

(3)

TESTES LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS

SOROLÓGICOS (in vitro)

• Aglutinação • Imunodifusão

• Imunoeletroforese

• Fixação de complemento

• Métodos imunoquímicos e físico-químicos • Métodos imunoenzimáticos • Radioimunoensaio • Técnicas imunoistoquímicas • Imunofluorescência • Imunoblotting • Citometria de Fluxo

(4)

1) IMUNODIFUSÃO

• ⇒

Reação antígeno-anticorpo e

precipitação

• ⇒

Antígenos solúveis.

• ⇒

É realizado em um meio semi-sólido (gel)

como o ágar ou agarose.

• ⇒

A precipitação ótima e máxima ocorre na

zona de equivalência.

• ⇒

Precipitação sub ótima ocorre com excesso

de anticorpo

(prozona)

ou com excesso de

(5)

1) IMUNODIFUSÃO

• Dois tipos:

• 1) Simples: anticorpo é fixo e o antígeno

se move

• 2) Dupla: antígeno e anticorpo se movem

(radial ou linearmente)

• Aplicação:

quantificação de proteínas do

(6)

Imunodifusão Radial Dupla

• O método

• ⇒

Em uma camada de agarose que

recobre uma lâmina de vidro são feitos

orifícios. Em um orifício é adicionado

antígeno e em outro o soro. A lâmina é

incubada por 24/48 horas (37ºC).

• ⇒

Observa-se a linha de precipitação

(7)

(8)

Placa de Petri

com agarose para

teste de

imunodifusão

(9)

2) IMUNOELETROFORESE

• ⇒ A imunoeletroforese combina difusão por separação

eletroforética com a precipitação imune de proteínas.

• ⇒ Identifica e quantifica proteínas individuais

presentes no soro, urina ou outro fluído biológico.

• Ex: o soro ou urina ou fluído conterão os antígenos a

serem analisados pelo anticorpo.

(10)

(11)

3) AGLUTINAÇÃO

• ⇒

São técnicas semiquantitativas.

• ⇒

Antígenos

particulados e insolúveis

(bactérias ou eritrócitos) ou partículas inertes

cobertas com antígenos.

• ⇒

A reação é detectada apenas

visualmente pela

aglutinação

(formação de

grumos).

• ⇒

Bom grau de sensibilidade, maior que o

(12)

(13)

• Método

• ⇒

Adiciona-se em um tubo o soro teste e o

antígeno particulado (bactérias; hemácias ou

látex adsorvidos com antígenos). Incuba-se até

a formação de aglutinação.

• ⇒

Quando ocorrer aglutinação as

partículas sedimentam formando um "tapete"

no fundo do tubo.

⇒

A aglutinação das partículas indica a

presença de anticorpos específicos para o

antígeno.

(14)

Aglutinação

3) AGLUTINAÇÃO

Reação de

(15)

(16)

(17)

Hemaglutinação Teste de Coombs

(18)

4- TÉCNICAS

IMUNOISTOQUÍMICAS

4. 1)

Imunofluorescência

(19)

1) IMUNOFLUORESCÊNCIA

• ⇒ É uma técnica citoquímica ou histoquímica para

localização ou detecção de antígenos em tecidos ou células.

» 1) Antígeno

» 2) Anticorpo marcado (é conjugado com

compostos fluorescentes - fluorocomos).

» 3) A reação é observada em microscópio de

fluorescência.

• ⇒ Os antígenos fluorescentes podem ser detectados em

(20)

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Aplicação

• Detecção de células, imunoglobulinas,

complemento, microrganismos,

cromossomos, células neoplásicas,

hormônios, enzimas, parasitas,

(21)

FLUORESCÊNCIA

O que é a fluorescência ?

Comprimento de onda luminosa gerado pela

excitação dos

fluorocromos

, após atingir a

absorção máxima da luz ultra violeta.

Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior

comprimento de onda Fluoresceína λ = 530 nm Luz ultravioleta incidente de menor comprimento de onda e maior energia

Fluorocromo CO₂H O O H λ = 480 nm absorção da luz

(22)

Compostos Fluorescentes

Fluorocromos

• fluoresceína

(isocianato

de fluoresceína – FITC:

produz cor verde no

campo de onda de 517

nm).

• Rodamina

(tetrametil

rodamina - produz cor

vermelha entre 550 a

580 nm).

(23)

Proteína: ácido glutâmico descarboxilase (GAG) sobre células beta das ilhotas de Langerhans no pâncreas (cor

verde).

(24)

(25)

(26)

• Exame de Leishmaniose Visceral Canina

• Preparo das lâminas:

promastigotas;

• Anticorpo Primário:

soro do cão a ser testado;

• Anticorpo Secundário:

anti-IgG de cão

conjugado ao isotiocianato de fluoresceína;

• Ponto de Corte: ≥ 1:40

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

•Técnica utilizada pelo Centro de Pesquisas René

Rachou/FIOCRUZ de Belo Horizonte, MG e adaptada por Oliveira et al. (2005).

(27)

4.2 -Imunoistoquímicos

enzimáticos

• ⇒

Localização de antígenos nos tecidos.

• ⇒

Anticorpos ligados a enzimas.

• ⇒

Princípios semelhantes ao da fluorescência,

mas com visualização em microscópio de luz

branca comum.

• ⇒

Enzimas conjugadas aos anticorpos:

(28)

• ⇒ Substrato cromogênico da enzima.

• ⇒ Após a incubação do tecido com o anticorpo marcado com a

enzima, é adicionado o substrato.

• ⇒ Na reação da enzima com o substrato produz uma cor que é

detectada através do microscópio.

• Método Direto: Anticorpo primário é marcado com a enzima. • Método indireto: Anticorpo secundário (anti-IgG contra o

anticorpo primário) é marcado com a enzima.

4.2 -Imunoistoquímicos

enzimáticos (cont.)

(29)

Antígeno de Leishmania Complexo (ABC) Peroxidase

(Vectstain ABC Kit; Vector Laboratory)

Substrato – New Red

(New Red Substrate Kit; Vector Laboratory)

Anticorpo Primário

IgG de cão – anti-Leishmania (Soro de cão)

Detecção do parasito intacto

Segundo Tafuri et al. (2004) adaptado por Starke-Buzetti et al. (2006)

Anticorpo Secundário biotinilado anti - IgG de coelho

(30)

(31)

Resultados de

alguns exames

(32)

5- MÉTODOS QUANTITATIVOS

ENZIMÁTICOS

• IMUNOENSAIOS ENZIMÁTICOS

(“ENZYME-LINKED

• IMMUNOSORBENT ASSAY”-ELISA)

• Técnicas quantitativas para detecção

de antígenos, haptenos ou anticorpos

presentes em soluções, no sangue, fluídos

corpóreos e outros.

(33)

ELISA

• ⇒ 1) Quando o anticorpo for

quantificado, o antígeno deve ser adsorvido a uma fase sólida (placa de poliestireno ou placas de ELISA).

• ⇒ 2) O anticorpo é marcado

enzimaticamente (fosfatase alcalina ou peroxidase) e

adicionado para encubar com o antígeno (conjugado).

• ⇒ 3) Em seguida o substrato

cromogênico da enzima é

adicionado e na reação positiva ocorre a liberação de cor que é medida em aparelho de

(34)

ELISA

• Interpretação

• ⇒

A intensidade da cor

desenvolvida pelo substrato

é proporcional à

quantidade de anticorpos

(específicos para o

antígeno) presentes no soro.

A intensidade pode ser

analisada por um

colorímetro (leitor-ELISA),

permitindo uma análise

(35)

(36)

ELISA

• O método pode ser direto ou indireto.

• Direto: anticorpo primário marcado enzimaticamente. • Indireto: Uso conjugado - anti-IgG ( anticorpo

secundário marcado) contra o anticorpo primário.

• Outros Métodos

• Competitivo • Sandwiche

• Aplicações

• Inúmeras

(37)

ELISA DIRETO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A { { { { { { { { { { { { B { { { { { { { { { { { { C { { { { { { { { { { { { D { { { { { { { { { { { { E { { { { { { { { { { { { F { { { { { { { { { { { { G { { { { { { { { { { { { H { { { { { { { { { { { { LEITOR DE ELISA Antígeno Solução bloquedora Anticorpo marcado 1 2 3 4 5 Anticorpo primário é marcado

(38)

ELISA INDIRETO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A { { { { { { { { { { { { B { { { { { { { { { { { { C { { { { { { { { { { { { D { { { { { { { { { { { { E { { { { { { { { { { { { F { { { { { { { { { { { { G { { { { { { { { { { { { H { { { { { { { { { { { { LEITOR DE ELISA Antígeno Solução bloquedora Anticorpo sérico Anti-Anticorpo marcado 1 2 3 4 5 6 Anticorpo secundário é marcado

(39)

(40)

(41)

ELISA SANDUÍCHE DIRETO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A { { { { { { { { { { { { B { { { { { { { { { { { { C { { { { { { { { { { { { D { { { { { { { { { { { { E { { { { { { { { { { { { F { { { { { { { { { { { { G { { { { { { { { { { { { H { { { { { { { { { { { { Antígeno Solução bloquedora Anticorpo Anti-Anticorp marcado LEITOR DE ELISA 1 2 3 4 5 6

(42)

6- WESTERN-BLOT

(“IMMUNOBLOT”)

• O método

• ⇒ Permite identificar um antígeno em uma mistura complexa de

proteínas.

•

Etapas do método

• ⇒ A primeira etapa envolve uma eletroforese do extrato

protéico, separando as proteínas (antígenos) por massa molecular e/ou carga elétrica.

• ⇒ A segunda etapa é a transferência das proteínas para

uma membrana imobilizante (nitrocelulose).

• ⇒ Esta etapa é realizada pela justaposição da membrana

com o gel e passagem de corrente elétrica, quando as proteínas são transferidas do gel para a membrana.

(43)

6- WESTERN-BLOT

(“IMMUNOBLOT”)

• Etapas do Método (cont.)

• ⇒ A terceira etapa compreende a reação das bandas

antigênicas (proteínas) com o anticorpo primário específico não marcado, o anticorpo secundário marcado

enzimaticamente ou radioativamente.

• ⇒ A reação é visualizada por cor (enzimática) ou em

emulsão fotográfica (radioativa)

• Interpretação

• ⇒ A visualização de uma "banda" permite determinar a

presença de anticorpos específicos para um antígeno do extrato protéico.

(44)

Western Blotting Gel membrana de transferência papel filtro preenchimento tela de suporte tela de suporte

Gel/ membrana/ filtro

Tampão ( +) ( - ) Separação e detecção de proteínas • Identificação de Ac específico Ac radiomarcado ou

(45)

6- WESTERN-BLOT

(“IMMUNOBLOT”)

(46)

Western

Blotting

• Eletroforese de proteínas • Diferença de tamanho (PM) • Mobilidade da proteína • Detecção Ag ou Ac

(47)

(48)

8- CITOMETRIA DE FLUXO

(49)

PRINCÍPIOS BÁSICOS DE

CITOMETRIA DE FLUXO

CITO METRIA FLUXO

Célula Medida Movimento

(50)

SISTEMA

FLUIDO

(movimento de partículas em sistema fluido)

SISTEMA

ÓPTICO

(gera e coleta sinais de luz)

SISTEMA ELETRÔNICO

(converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos para o computador)

CITÔMETRO DE FLUXO

(51)

FOCO DO LASER FOCO DO LASER

CÂMARA DE FLUXO

SISTEMA FLUIDO

luz ultravioleta Registra a fluorescência emitida

células são contadas e separadas de acordo com a intensidade da

fluorescência que reflete a densidade do antígeno

(52)

8- CITOMETRIA DE FLUXO

Método celular

• Princípio:

• Identifica antígenos na superfície de células e estas

podem ser identificadas e contadas individualmente.

• Células são identificadas por anticorpos marcados

pela fluorescência.

• As células são colocadas em tubos e em seguida

passam por uma corrente de fluxo de radiação laser.

• Através de computador especial, os sinais e as

características das células são captados e registrados (tamanho, granulosidade, fluorescência).

(53)

CD4

CD8

CD20

Aplicações:

¾ Determinar o tipo e número de células sanguíneas brancas

¾ distinguir e isolar populações celulares

¾ estudar a distribuição de células

¾ciclo da célula (DNA corado), diferenciação, maturação celular

¾apoptose

¾atividades secretoras (citocinas no interior das células) )

¾diagnóstico de doenças

Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes

HIV , Leucemias

(54)

Citometria de Fluxo

¾ Separação de células ativadas por fluorescência

¾ Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)

¾ Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente

CD 4 CD 8

CD 125 CD 147

(55)

8- CITOMETRIA DE FLUXO

Fluorocromos

• FL1:

isotiocianato de fluoresceína - FITC,

emissão de luz visível no comprimento de onda

de 530 ± 30 nm, que corresponde à luz

verde

.

• FL2:

ficoeritrina – PE: emissão de luz visível no

comprimento de onda de 585 ± 26 nm, o que

corresponde à luz

laranja

.

• FL3:

peridina-clorofila: emissão de luz visível

acima de 630 nm, o que corresponde à luz

vermelha

.

(56)

¾ Tamanho

¾ Granulosidade

¾ Fluorescência

(57)

8- CITOMETRIA DE FLUXO

Aparelho

Citômetro de Fluxo ou FACS (

fluorescent-activated cell sorter) fonte de excitação: lâmpada

de argônio ® raio laser (488 nm)

Características detectadas: tamanho da célula, granulosidade e fluorescência emitida.

(58)

Gráficos de Citometria de Fluxo

- Gráfico de tamanho x granulosidade (FSC x SSC): seleção da

população a ser analisada (linfócitos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos). - Gráfico de fluorescência

(FL1 x FL2): avaliação de características das células.

(59)

DISPERSÃO

POLIMORFONUCLEARES LINFÓCITOS MONÓCITOS DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS BLASTOS VOLUME (FS ) VOLUME (FS ) GRANULOSIDADE (SS) GRANULOSIDADE (SS)

(60)

Citometria de Fluxo

Células Sanguíneas

(61)

Visão dos dados coletados

Side

Scatter

Forward Light Scatter

0 200 400 600 800 1000 0 200 4 00 600 800 1000 CD3 FITC CD4 PE 0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 •DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2

(62)

Anticorpos Monoclonais

por hoje é só!!!! Obrigada!!!!!!