UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS CURSO DE AGRONOMIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP

INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS

CURSO DE AGRONOMIA

INFLUÊNCIA DA ADUBAÇÃO NITROGENADA E DA

INOCULAÇÃO COM AZOSPIRILLUM NA QUALIDADE DA

ALFACE AMERICANA CV. LUCY BROWN

RENATO RODRIGO VEIGA MELEGARI

SINOP - MT

Julho – 2016

INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS

CURSO DE AGRONOMIA

INFLUÊNCIA DA ADUBAÇÃO NITROGENADA E DA

INOCULAÇÃO COM AZOSPIRILLUM NA QUALIDADE DA

ALFACE AMERICANA CV. LUCY BROWN

RENATO RODRIGO VEIGA MELEGARI

ORIENTADOR: MARCIO ROGGIA ZANUZO

Projeto do trabalho de

conclusão de curso (TCC),

apresentado ao Curso de

Agronomia

do

ICCA/CUS/UFMT

-

Campus de Sinop, como

parte das exigências para a

obtenção

do

Grau

de

Bacharel em Agronomia.

SINOP - MT

Julho – 2016

DEDICATÓRIA

Dedico esta conquista ao meu pai João Luiz Melegari, minha mãe Sônia da Veiga Melegari e minha irmã Keila Veiga Melegari pelo apoio, incentivo ao longo dessa caminhada, pois sem eles jamais teria chegado até aqui.

espiritual nos momentos de ansiedade e incertezas.

Aos meus pais João Luiz Melegari e Sonia da Veiga Melegari, verdadeiros alicerces da minha vida e grandes responsáveis pela minha formação. A vocês todo o meu amor e admiração.

Aos meus avós paterno João Melegari (in memoriam) e Júlieta Pazian Melegari (in memoriam) pelo amor, carinho, apoio e dedicação;

Aos meus avós materno Durval Garcia da Veiga (in memoriam) e Rosalina Gepes da Veiga pelo amor, apoio, carinho e lição de vida;

A minha irmã Keila Veiga Melegari pelo carinho, apoio, partilha e disponibilidade para me ajudar no que precisei;

A todos os parentes pelo apoio e carinho;

A minha namorada Isabel Cristina Cansanção Soares “amorzinho”, anjo de minha vida, companheira para toda hora, o meu carinho, respeito e admiração. A você, o meu amor.

Agradeço também à Universidade Federal de Mato Grosso, pelas oportunidades de enriquecimento profissional e pessoal e pelo ensino de qualidade.

Ao Prof. Dr. Marcio Zanuzo pela oportunidade, orientação, compreensão, dedicação, confiança, amizade, profissionalismo e incentivo no desenvolvimento deste projeto. Aos amigos Gabriel Pelozo, Ricardo Antônio De Toni, Anderson Barzotto, Jaqueline Bezerra da Silva, Ana Paula Sousa Zaiatz, Julia Donato, Alan Bergamo, Igor Cavalheiro Binsfeld, Fabricio Moraga, Airton Sulzbacher, Fernando Marcato, Luciano Félix, Matheus Serafim Passos, Rafael Serafim, Lucas Passos, Eder Melegari Veiga, Fernando Caniato Basiliche, Wellington Nunes, Valmir Ferrarine, Eduardo Megier, Marlon Scapini, Maciel Gavinescki, Letícia Costa, Angélica Lara de Medeiros, Marianna Borges Vendramel, Victor Bianchini de Aquino, Atarcílio Francisco Alves, Diogo Braulino, Fábio Barros, Jardel Coratto e tantos outros pela amizade, ajuda, confiança, compreensão e pela contribuição nos trabalhos de campo e de laboratório. Finalmente, a todos que de alguma forma passaram pela minha vida e contribuíram para a construção de quem sou hoje, de todo meu coração, muito obrigado!

SUMÁRIO

1

INTRODUÇÃO ... 10

2

OBJETIVOS ... 12

2.1

Objetivo Geral ... 12

2.2

Objetivo Específico... 12

3

REFERENCIAL TEÓRICO ... 13

3.1

Lactuca sativa L. aspectos gerais ... 13

3.2

Clima e tipos de alface para cultivo ... 13

3.3

Adubação mineral e nitrogenada em alface ... 14

3.4

Fertilizantes nitrogenados ... 15

3.5

Nitrogênio ... 16

3.5.1

Absorção de nitrogênio pelas plantas ... 17

3.5.2

Aspectos fisiológicos da absorção e assimilação do nitrato e do

amônio ... 17

3.5.3

Nitrato ... 18

3.5.4

Amônio ... 18

3.6

Fixação biológica de nitrogênio ... 19

3.7

Inoculantes agrícolas ... 20

3.7.1

Gênero azospirillum e suas associações com as plantas ... 22

3.7.2

Colonização ... 23

3.7.3

Produção de fitormônios ... 24

3.7.4

Principas fatores que afetam a sobrevivência e o crescimento da

população de bactérias associativas endofíticas ... 24

3.7.5

Aspectos qualitativos gênero azospirillum ... 25

4

MATERIAL E MÉTODOS ... 26

4.1

Localização e classificação climática e pluviométrica da área

experimental ... 26

4.2

Caracterização do solo ... 26

4.3

Preparo do solo ... 26

4.4

Delineamento experimental ... 27

4.5

Material vegetal, implantação e condução do experimento ... 27

4.6

Adubação de cobertura ... 27

4.7

Colheita ... 28

4.8

Variáveis analisadas ... 28

4.8.1

Teor de clorofila na folha ... 28

4.8.2

Colorimetria da folha ... 29

4.9

Análise estatística ... 30

5

RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 31

6

CONCLUSÕES ... 34

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência técnica da aplicação de Azospirillum em combinação com as doses de nitrogênio na cultura da alface e sua influência nos parâmetros qualitativos. O delineamento experimental utilizado foi o DIC em esquema fatorial 2X4 com 4 repetições. Os tratamentos constituíram de 2 modos de inoculação (com azospirillum e controle) além de 4 doses de nitrogênio (50, 100, 150 e 200 kg.ha-¹). Foram avaliados a colorometria da folha com iluminante D65 no sistema L*a*b, a saturação ou chroma, ângulo Hue, além do teor de clorofila. Os resultados mostraram que não houve efeito significativo tanto para o modo, dose e a interação entre ambos. Para a variável L* o menor e maior valor foram de 58,06 e 58,50 respectivamente em plantas inoculadas e sem inoculação. Já para a dose de nitrogênio, o maior valor foi observado na dose de 50kg.ha-1 _{e o menor na dose 200kg.ha}-1 _{com valores de}

59,12 e 57,37 respectivamente. Para a variável a* o menor e maior valor foram de 11,00 e -10,81 respectivamente em plantas inoculadas e sem inoculação. Já para a dose de nitrogênio, o maior valor foi observado na dose de 100 kg.ha-1 _{e o menor na dose 200 kg.ha}-1 _{com valores de}

-10,50 e -11,25 respectivamente. A variável b* o menor e maior valor foram de 22,00 e 22,56 respectivamente em plantas inoculadas e sem inoculação. Em relação a dose de nitrogênio, o valor para dose 50 e 150 kg.ha-1 _{foram iguais e o menor foi na dose 100 kg.ha}-1 _{com valores de}

22,75 e 21,62 respectivamente. Em relação a saturação (Chroma) o menor e maior valor foram de 24,69 e 25,31 respectivamente em plantas inoculadas e sem inoculação. Já para a dose de nitrogênio, observou-se o maior valor na dose de 150 kg.ha-1 _{e o menor na dose 50 kg.ha}-1 _com

valores de 25,25 e 22,50 respectivamente. Na variável Hue os valores foram iguais 116,82° e 116,82° respectivamente em plantas inoculadas e sem inoculação. Já para a dose de nitrogênio, o maior valor foi observado na dose de 200 kg.ha-1 _{e o menor na dose 50 kg.ha}-1 _{com valores de}

117,63 e 116 respectivamente. A variável Clorofila o menor e maior valor foram de 20,69 mg.g -1 _{e 21,31 mg.g}-1 _{respectivamente em plantas inoculadas e sem inoculação, para a dose de}

nitrogênio, o maior valor foi observado na dose de 200 kg.ha-1 _{e o menor na dose 150 kg.ha}-1

com valores de 22,75 e 19,12 respectivamente. A inoculação de Azospirillum associada a adubação nitrogenada não alterou os aspectos qualitativos da coloração da folha e também em relação ao teor de clorofila.

Palavras Chave: Lactuca sativa L., adubação nitrogenada, nitrogênio, inoculação, fixação

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the technical efficiency of Azospirillum application in iceberg lettuce cv. Lucy brown combined with nitrogen levels and its influence on qualitative parameters. The experimental design was DIC in factorial arrangement 2X4 with 4 repetitions. The treatments consisted of 2 modes (Inoculated and control) as well as four nitrogen rates (50, 100, 150 and 200 kg ha-¹). It was evaluated the leaf colorimetry with illuminant D65 in the L * a * b, saturation or chroma, Hue angle, besides the chlorophyll content. The results showed no significant different to mode, dose and the interaction between them. For the variable L * the lowest and highest value were 58.06 and 58.50 respectively to inoculated plants control. For nitrogen ratio, the highest value was observed at a dose of 50kg.ha-1 and the lowest in 200kg.ha-1 dose with 59.12 values and 57.37 respectively. For variable a* the lowest and highest value were -11.00 and -10.81 respectively inoculated plants and control. To nitrogen dose, the highest value was observed at the dose of 100 kg ha-1 and the lowest on the dose of 200 kg.ha-1 with -10.50 and -11.25 values respectively. The variable b * the lowest and highest value were 22.00 and 22.56 respectively inoculated plants without inoculation. Regarding nitrogen dose, the dose value for 50 and 150 kg ha-1 were equal and the lowest was in dose 100 kg.ha-1 with 22,75 and 21,62 values respectively. For relative saturation (Chroma) the lowest and highest value were 24.69 and 25.31 respectively in inoculated plants and control. To nitrogen dose was observed the highest dose of 150 kg ha-1 and the lowest dose at 50 kg ha-1 with 25,25 and 22,50 respectively. In variable Hue values were equal to 116.82 ° and 116.82 ° respectively inoculated plants without inoculation. As for the dose of nitrogen, the highest value was observed at the dose of 200 kg ha-1 and the lowest dose at 50 kg ha-1 with 117.63 values and 116 respectively. For Chlorophyll content the lowest and highest value were 20.69 mg g-1 and 21.31 mg g-1 respectively in inoculated plants and control and nitrogen dose, the highest value was observed at a dose of 200 kg.ha-1 and the lowest dose 150 kg.ha-1 with values of 22.75 and 19.12 respectively. Azospirillum Inoculation associated with nitrogen fertilization did not alter the qualitative aspects of the sheet color and also in relation to the chlorophyll content in iceberg lettuce cv. Lucy brown.

Keywords: Lactuca sativa L., nitrogen fertilization,, inoculation, byological fixation, diazotrophic bacterium, azospirillum, phythormone, colometric method, chlorophyll.

1

INTRODUÇÃO

A alface é uma hortaliça conhecida mundialmente e consumida principalmente in natura, por ter inúmeras variedades de folhas, formas, tamanho, textura e cores além da importância na alimentação dos seres humanos. Uma planta de alface pesa em torno de 350 g, onde aproximadamente: 56 kcal, 95,80% de água, 2,3% de hidratos de carbono, 1,20% de proteínas, 0,20% de gorduras, 0,50% de sais minerais (13,3 mg de potássio, 147,0 mg de fósforo, 133,0 mg de cálcio e 3,85 mg de sódio, magnésio e ferro); contém ainda vitamina A (245 UI), vitaminas de complexo B (B1 – 0,31 mg e B2 – 0,66 mg) e C (35,0 mg), as folhas mais externas da alface e de coloração mais escura, contém 30 vezes mais vitaminas A, do que as folhas internas (FRANCO, 1987).

No Brasil, o consumo médio de hortaliças no país está em torno de 27,08 kg/pessoa/ano, a produção nacional da alface em 2011 foi estimada em 1,276 milhões de toneladas de acordo com Anuário de Hortaliças (2013), ficando em 3° lugar na comercialização nacional de hortaliças do subgrupo folha, flor e haste com 79 mil toneladas, ficando atrás de repolho (240 mil.ton-1_{) e couve-flor (85 mil.ton-}1_{) segundo}

23 principais Centrais de Abastecimento Brasileiras (CEASAS) (CARVALHO; KIST; POLL, 2013).

As mudanças de pigmentação são muito importantes para a qualidade e/ou aspecto da apresentação do produto. As perdas da clorofila em folhosa constituem um fator de grande importância na qualidade final do produto durante o período em que estão expostos na prateleira (SUINAGA; BOITEUX; CABRAL & RODRIGUES, 2003).

A alface responde muito bem a adubação nitrogenada, apresentando maiores rendimentos, produção mais uniforme e maior valor comercial (LEDO et al., 2000; SANTOS et al., 2008). A resposta quadrática à aplicação de nitrogênio vem sendo demonstrada por vários autores, (ALVARENGA,1999; ALVARENGA et al., 2000; RESENDE et al., 2005), ficando evidenciada a queda na produção a partir de uma determinada dose. Existem controvérsias sobres as dosagens que proporcionam maiores produções principalmente devido as diferentes condições ambientais em que as cultivares foram avaliadas. Também as modernas cultivares vem sendo selecionadas para ambientes determinados, e têm apresentado respostas cada vez mais específicas a doses de nutrientes (ALBUQUERQUE et al., 2008).

Em contrapartida os altos preços dos fertilizantes nitrogenados e a maior preocupação com a melhoria da qualidade ambiental e do solo, tem obrigado os agricultores a buscarem alternativas que otimizem a produtividade e a sustentabilidade

11

dos ecossistemas. Neste contexto o uso da inoculação com bactérias diazotróficas endofíticas do gênero Azospirillum sp. também conhecidas como bactérias associativas promotoras de crescimento de plantas cujas formam simbiose com seus hospedeiros tem se mostrado uma das alternativas mais promissoras para melhoria da qualidade física, química e biológica do solo, pois quando feito o correto manejo desta alternativa pode-se resultar em maior produtividade e qualidade do produto final além de diminuir os custos de produção com o uso de fertilizantes nitrogenados e agregar maior sustentabilidade ao ecossistema.

Essas bactérias podem atuar no crescimento das plantas mediante a produção de fitormônios que estimulam o crescimento das plantas (auxinas, giberelinas e citocianinas) as quais propiciam melhor desenvolvimento radicular (OKON et al., 1997).

Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência técnica da aplicação de Azospirillum em função das doses de nitrogênio na cultura da alface e sua influência nos aspectos qualitativos.

2

OBJETIVOS

2.1

Objetivo Geral

Avaliar a influência das doses de nitrogênio e inoculação de Azospirillum nos parâmetros qualitativos da alface americana.

2.2

Objetivo Específico

 Avaliar o teor de clorofila em folhas de alface.

13

3

REFERENCIAL TEÓRICO

3.1

Lactuca sativa L. aspectos gerais

A alface pertencente ao Reino Plantae, Classe Magnoliopsida, Ordem Asterales, Família Asteraceae, Gênero Lactuca e Espécie Lactuca sativa, o provável cento de origem é o oeste da Ásia e sul da Europa, trazida para o Brasil em 1647 com a vinda dos portugueses (WIKISPECIES, 2006). Ainda hoje 12 espécies silvestres trazidas nesta época, ainda pode ser encontrada em regiões de clima temperado, na Europa mediterrânea e na Ásia Ocidental, esta espécie vegetal já era utilizada como planta medicinal há 4500 a.c. como hortaliça é registrada a sua utilização desde 2500 a.C. (GOTO et al., 1998; WITAKER et al., 1974).

A alface (Lactuca sativa L.) é considerada a mais importante hortaliça folhosa, sendo consumida pela maioria dos brasileiros (GOTO et al., 2002). Sendo o componente básico de saladas, tanto em nível comercial e doméstico (MORETTI et al., 2006). É a 6ª hortaliça em importância econômica e 8ª em termos de volume produzido, e sua forma predominante de comercialização é in natura (SOARES et al., 2006). Entre os materiais disponíveis comercialmente a alface americana tem o maior potencial de pós-colheita em relação a outros tipos, o que tem facilitado o transporte, o manuseio e a distribuição a longas distâncias (DECOTEAU et al., 1995).

3.2

Clima e tipos de alface para cultivo

Filgueira (2003) relata que as condições climáticas nas quais a muda é produzida tem efeito direto no comportamento da planta adulta, e salienta que originalmente a alface é uma cultura típica de outono-inverno no centro-sul, e ao longo dos anos melhoristas desenvolveram cultivares adaptados, durante a primavera e verão, com resistência ao pendoamento precoce, com isso possibilitou o cultivo durante o ano todo, a diversidade de cultivares de alface disponível no mercado resulta de melhoramentos genéticos visando atender as necessidades do mercado consumidor, como características das folhas, resistência da planta ao pendoamento precoce, tolerância ao calor e ao mosaico dourado bem como a capacidade destas se reunirem ou não para formar uma cabeça repolhuda ou não é essas características vão ser utilizadas para distribuir essas cultivares em seis grupos distintos, sendo eles:

GRUPO 1- REPOLHUDA-CRESPA: no Brasil elas são conhecidas popularmente como alfaces americanas. Apresentam folhas crespas, consistentes, nervuras bem destacadas, coloração verde-esbranquiçadas com folhas imbricadas

formando uma cabeça grande e compacta semelhante ao repolho. Resistem bem a pós-colheita e ao transporte e são ideais para o preparo de sanduíches. Ex: Grandes Lagos, Raider, Raider Plus e Laurel, Rafaela, Mesa, Salinas, Calmar, Amélia Lorca e Lucy Brown.

GRUPO 2- REPOLHUDA-MANTEIGA: apresentam folhas lisas, muito delicadas, “amanteigadas”, de coloração verde clara formando uma cabeça repolhuda bem compacta. Ex: White Boston, Sem Rival, Aurélia, Áurea, Brasil 303, Carolina e Elisa Glória, dentre outras; sendo que a cultivar White Boston já foi considerada padrão de excelência em alface, porém com a mudança nos hábitos de consumo dos brasileiros ela acabou sendo substituída por outras variedades.

GRUPO 3- TIPO SOLTA- LISA: possuem folhas macias,lisas e soltas, não formando uma cabeça. EX: Babá de Verão, Monalisa, Luisa e Regina.

GRUPO 4- TIPO SOLTA-CRESPA: suas folhas são consistentes, soltas e crespas, com coloração verde ou roxa, não formam cabeça, mas sim uma roseta de folhas. Ex: Grand Rapids, Slow Bolting, Verônica, Vera, Marisa e Vanessa.

GRUPO 5- TIPO ROMANA: apresentam folhas alongadas, consistentes com nervuras claras e protuberantes, formando cabeças fofas. Ex: Paris, Island Cos, Gallega de inverno e Romana Balão.

GRUPO 6- TIPO MIMOSA: As folhas são delicadas e com aspecto arrepiado. Ex: Salad Bowl e Greenbowl.

Segundo Conti (1994), o comprimento do dia não é problema para o cultivo de alface de verão brasileiro, pois as cultivares européias importadas já estão adaptadas a dias mais longos do que os que ocorrem no país de origem, observou que a expansão da cultura está ocorrendo para as áreas de latitudes menores e, consequentemente, o fotoperíodo não é obstáculo em condição de menores latitudes, verifica-se o aumento da temperatura no período do verão, havendo necessidade de se escolher áreas de elevadas altitudes.

3.3

Adubação mineral e nitrogenada em alface

As plantas, de modo geral, respondem bem a adubação nitrogenada, porém deve-se tomar cuidado para não fazer aplicações excessivas com fertilizantes contendo N para que não ocorra o desequilíbrio da relação C/N, pois quando a relação C/N de N é baixa a planta vai vegetar, mediante ao consumo de luxo proporcionado pelas doses excessivas, provocando redução da produtividade da cultura e aumentando os custos de produção. Entretanto, essa afirmativa se mostra verdadeira

15

apenas dentro de certos limites, pois nem sempre o crescimento de parte aérea é sinônimo de aumento de produtividade (GUIMARÃES et al., 2003)

Segundo Larcher et al. (2004) o aumento da área foliar se mostra benéfico para a produção até que o índice de área foliar apresente a máxima eficiência entre a interceptação da luz e conversão em reservas para crescimento, acima deste patamar, ocorre o efeito auto sombreamento diminuindo a eficiência fotossintética das folhas inferiores sendo assim se torna necessário o conhecimento técnico a respeito da disponibilidade do nutriente no solo, das exigências nutricionais da cultura e do estado nutricional da cultura de interesse. Conhecimento este, imprescindível para a realização de um bom programa de adubação nitrogenada, de modo a fornecer para a cultura o elemento na quantidade e proporções adequadas.

E no caso da adubação mineral do alface, recomenda-se : 40kg de N.ha-¹, 200 a 400 kg de P2O5.ha-1 e de 50 a 150kg.ha-1 de K2O além de 1kg de boro/há sendo

estes valores referentes adubação mineral de plantio ou implantação, no caso da adubação de cobertura são recomendados aplicar de 60 a 90 kg.ha-1 _{de N devendo}

este ser parcelado em (3 vezes) e cada parcela aplicada aos 15, 30 e 45 dias após a germinação ou 7, 14 e 21 dias após o transplante das mudas, pra que se possa aumentar a eficiência da adubação nitrogenada (IAC, 2012).

3.4

Fertilizantes nitrogenados

Os fertilizantes nitrogenados são produzidos principalmente usando combustíveis fosseis, não renováveis, apresentando alto custo de produção e aquisição, alta solubilidade e se encontram sujeitos a perdas por volatilização da ureia, desnitrificação, erosão e lixiviação pela água da chuva ou de irrigação, além de apresentar baixa eficiência e alto potencial poluidor (MALAVOLTA et al., 2006). Contudo, a adubação nitrogenada se apresenta como uma das principais formas de fornecer nitrogênio para as plantas.

Segundo Sousa et al. (2004), dentre os adubos nitrogenados os que mais se destacam em função do seu teor de N são: Amônia Anidra – apresenta-se como um gás à temperatura ordinária, liquefazendo-se quando comprimido. Apresenta 82% de nitrogênio, sendo o adubo nitrogenado mais concentrado que se conhece.

URÉIA - CO(NH2)2 – apresenta 45% de nitrogênio solúvel em água e alta

hidroscopicidade, razão pela qual ela é revestida com material protetor para diminuir a hidroscopicidade. No solo ela é convertida em amônia (NH3) gasosa e nitrato (NO3).

NITRATO de AMÔNIA – NH4NO3– com 33,5% de nitrogênio solúvel em água,

metade na forma nítrica e metade na forma amoniacal.

NITROCÁLCIO – NH4NO3 + calcário – é uma mistura de nitrato de amônia com

calcário, apresentando 27% de nitrogênio, 14 a 16% de cálcio e 1,2 a 1,8% de magnésio.

SULFONITRATO de AMÔNIO – NH4NO3+ (NH4)2SO4– Apresenta 26% de

nitrogênio (N) e também 15% de enxofre (S).

SULFATO de AMÔMIO – (NH4)2SO4 – apresenta 21% de N e 23% de enxofre

solúvel em água.

NITRATO de SÓDIO (Salitre do Chile) – NaNO3 –apresenta 16% de nitrogênio.

Sendo proveniente de jazidas chilenas.

DIFOSFATO de AMÔNIO (DAP) – (NH4)2HPO4– apresenta 16% de nitrogênio

(N) e 38% a 40% de fósforo (P2O5) e ainda de 4% a 6% de fósforo (P2O5) solúvel em

solução neutra de citrato de amônio.

NITRATO de SÓDIO e POTÁSSIO ou SALITRE DUPLO POTÁSSIO – NaNO3+ KNO3–apresenta 15% de nitrogênio (N) e 14 % de potássio (K2O), solúvel

em água.

NITRATO de POTÁSSIO – KNO3 –Apresenta 13% de nitrogênio (N) e 44% de

potássio (K2O), solúvel em água.

MONOFOSFATO de AMÔNIO (MAP) - NH4H2PO- apresenta 10% de nitrogênio

(N) e 44 a 46% de fósforo (P2O5), além 2 a 5% de fósforo (P2O5) solúvel em solução

neutra de citrato de amônio.

3.5

Nitrogênio

O nitrogênio faz parte de vários compostos das plantas, destaca-se os ácidos nucleicos, aminoácidos e clorofilas. As principais reações bioquímicas nas plantas e microrganismos está envolvido o nitrogênio, com isso o torna um dos elementos absorvido em grandes quantidades pelas plantas cultivadas. O nitrogênio tem grande versatilidade nas reações de oxirredução e está em vários estados de oxidação como NO3-, como isso importante nos ciclos biogeoquímicos e nos metabolismos das

plantas. Cerca de 25% do gasto energético dos vegetais está envolvida várias reações na redução de nitrato á amônio e depois incorporação do N nas formas orgânicas nas plantas (EPSTEIN et al., 2006).

Com o domínio de processos industriais, o nitrogênio pode ser convertido da atmosfera em forma de amônia, com isso foi possível a fabricação dos fertilizantes

17

nitrogenados sintéticos, que vem sendo utilizado na agricultura. O processo de converter o N, envolve o gasto de bastante energia, por isso o N é considerado o elemento mais oneroso entre os nutrientes (MOSIER; GALLOWAY, 2005).

3.5.1 Absorção de nitrogênio pelas plantas

As fontes para absorção de nitrogênio pelas raízes são consideradas NO3- e

NH4+ (GOH; HAYNES, 1978). As plantas podem variar nas suas formas de adaptações

em relação a duas fontes de nitrogênio, apesar de NH4+ ser a fonte de nitrogênio

preferida, uma vez que o seu metabolismo requer menor gasto metabólico do que quando se utiliza o NO3-, mas apenas algumas espécies realmente têm bom

desempenho, quando NH4+ é fornecido como única fonte de nitrogênio a maioria das

espécies agrícolas, por vezes, desenvolve graves sintomas tóxicos por NH4+

(RIDEOUT et al., 1994).

O efeito das diferentes fontes de N nas hortaliças vem mostrando maior eficiência no crescimento e produção, quando as fontes nítricas são utilizadas sob condições de hidroponia (RAHAYU et al., 2005). Nos tecidos fotossintetizantes, NH4+

pode dissociar o transporte de elétrons a partir de fotofosforilação (PELTIER; THIBAULT, 1983). Essa é considerada uma provável explicação para as taxas fotossintéticas reduzidas para os tomateiros com NH4+ em vez de NO3-.

Em campo aberto a úreia é a fonte mais utilizada no Brasil. Walch-Liu et al. (2000) observou maior acúmulo de matéria seca da planta e produção de frutos, quando supridas com NO3- em relação às plantas supridas com NH4+, enquanto que

Silva et al. (2003), avaliando diferentes taxas e formas de nitrogênio no tomateiro, verificou que as fontes não afetam de forma significativa a produção.

3.5.2 Aspectos fisiológicos da absorção e assimilação do nitrato e do

amônio

O nitrato é absorvido pelo processo ativo secundário, via simporte, contra o potencial, contra o potencial eletroquímico, com transporte simultâneo de H+ _{e NO}

3

-para dentro das células, numa relação de 2:1, sendo o custo energético -para esta absorção de 2 moles de ATP para cada mol de NO3- absorvido (IMSANDE;

TOURAINE, 1994). Já na absorção do amônio, ocorre pela via uniporte, o processo é passivo e, ao contrário da absorção do nitrato, o amônio fica prontamente disponível para ser incoporado, sem gasto energético. Mas a taxa de absorção do nitrogênio vai

depender da expressão dos transportadores específicos e formas absorvidas e da disponibilidade de nitrogênio exógeno.

A absorção pela planta a incorporação do nitrogênio inorgânico ocorre através da forma orgânica pelos processos assimilatórios. Através dos processos de absorção e assimilação que são altamente sincronizados, embora, concentrações elevadas, a absorção do amônio e do nitrato podem exceder a capacidade da planta em assimilar esses íons (FORDE; CLARKSON, 1999). E com relação ao nitrato, o equilíbrio entre esses processos pode ser mais bem estabelecido, pois os altos níveis absorvidos podem se acumular no vacúolo ou translocados pelos tecidos, sem efeitos prejudiciais a planta. Já o amônio, em elevados níveis nos tecidos pode gerar toxidez (BRITO; KRONZUCKER, 2001).

3.5.3 Nitrato

O excesso de NO3- tem ocasionado problemas no ambiente, tem levado a

regulamentação nos Estados Unidos e na Europa o controle de práticas agrícolas, para limitações nas dosagens de adubos nitrogenados orgânicos e minerais em áreas sensíveis (NOVAIS et al., 2007).

O íon nitrato (NO3-) constitui ânions formados pelo ácido nítrico HNO3, é

facilmente solúvel em água e estão quase que exclusivamente em formações geológicas recentes, geradas em desertos continentais quentes. É formado por reações de oxidação geralmente associados à ação de nitrobactérias em solos, podendo formar, ainda, pela ação de descargas elétricas, especialmente em planícies elevadas (TROEH; THOMPSON, 2007).

O processo de absorção de NO3- pelas plantas é muito mais complicado em

relação ao NH4+, por causa de pH e o das diferenças de potencial eletroquímico, entre

o meio interno da celulas das raízes absorventes da planta e o meio externo, com isso o gasto de energia é muito maior em comparação com absorção de NH4+ (EPSTEIN;

BLOOM, 2006).

3.5.4 Amônio

O amônio é um cátion, é um íon poliatômico, formado por protonação do amoníaco (NH3). Os sais de amônio são geralmente compostos solúveis em água,

formando soluções incolores. Por aquecimento, os sais de amônio decompõem-se em amoníaco e no ácido correspondente. O ácido não sendo volátil, os sais podem ser

19

quantitativamente removidos de misturas secas por aquecimento (NOVAIS et al., 2007).

O amônio, por ser um composto de fácil reação, pode sofrer perdas no sistema por ser muito volátil. A perda de amônio ocorre pela desprotonação do íon NH4-, que é

convertido em amônia (NH3) composto altamente volátil que, em seguida, é dissipado

para a atmosfera. Perdas no solo dependem de pH, em condições de pH ácido, a espécie química predominante é o NH4+. Já em solos alcalinos ou com pH maiores

que 7, qualquer fertilizante nitrogenado que contenha nitrogênio amoniacal está sujeito a perdas de NH3 por volatilização, mas no Brasil é muito baixa a ocorrência de solos

com essas características (TROEH; THOMPSON, 2007).

Apesar de ser fácil absorção e assimilação pelas plantas, a sua presença em grandes doses nas células das plantas pode ser tóxico para planta, para algumas plantas, bastam pequenas doses de NH4+ para ser tóxico. Embora as plantas, às

vezes, consigam metabolizar grandes quantidades do NH4+ liberadas pela

fotorrespiração, sem mostrar sinais de toxidez, a nutrição de plantas com NH4+ via

sistema radicular pode afetar negativamente o metabolismo vegetal, quando comparadas às plantas sob nutrição com NO3- (TAIZ & ZEIGER, 2009).

3.6

Fixação biológica de nitrogênio

Nos ecossistemas naturais as fontes de N é a matéria orgânica, atmosfera e solo, na atmosfera embora o nitrogênio molecular (N2) contribui em 78%, mais nessa

forma as plantas não conseguem absorver, devido a sua estabilidade química. Porém, algumas plantas conseguem estabelecer uma simbiose com algumas bactérias fixadoras de nitrogênio e essa associação é capaz de suprir em até 90% das necessidades da planta (VALARINI; GODOY, 1994).

Os diazotróficos compreendem uma ampla gama de de microorganismo procariotos, incluindo as arquebacterias, cianobactérias, bactérias gram positivas e gram negativas, podendo ser de vida livre, associativas ou em simbiose com algumas gramíneas. Tal diversidade garante não só a continuidade dos processos de fixação biológica de nitrogênio em um determinado ecossistema, como também a ocorrência do mesmo, nos mais diferentes habitats terrestres (MOREIRA et al., 2010).

O tipo mais comum de simbiose, é entre membros da família também conhecida como fabaceae e bactérias diazotróficas do solo (Rhizobium, Brayrhizobium, sinorhizobium e photorhizobium), (EPSTEIN, 2001). Nestas simbioses as bactérias colonizam os tecidos internos das raízes, promovendo a formação dos

nódulos, sendo estas estruturas altamente especializadas, responsáveis pela fixação do nitrogênio atmosférico. Uma vez formados os nódulos funcionais esses finam N atmosférico e os transfere para nutrir a planta hospedeira em troca de fotoassimilados (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

As bactéria associativas são consideradas rizobactérias promotoras do crescimento vegetal, assumindo importante papel tanto na fixação biológica de nitrogênio quanto na produção de hormônios vegetais (ácido indol acético e outros compostos indólicos), solubilização do fosfato, antagonismo com espécies patogênicas além de influenciar no metabolismo do nitrogênio, auxiliando no crescimento radicular, sendo considerada como bactérias promotoras do crescimento das plantas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006, MOREIRA et al., 2010).

Em relação às bactérias diazotróficas de vida livre, somente há um caso, de que um diazotrófo de vida livre, Azotobacter paspali, contribua para a acumulação de nitrogênio na planta (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

Os estudos com bactérias diazotróficas são de grande importância tanto por sua contribuição para a fixação biológica de nitrogênio como pela produção de hormônios que auxiliam no crescimento radicular, permitindo uma maior interação do sistema radicular das plantas com a água e nutrientes presentes na solução do solo, promovendo o crescimento vegetal, redução do uso de adubos nitrogenados, diminuindo custos de produção e gerando ganhos em qualidade e produtividade das culturas.

3.7

Inoculantes agrícolas

Os inoculantes podem ser definidos como produtos ou formulações microbianas, podendo ter umas ou várias estirpes que são benéficas, esses microoganismos precisam de um veículo suporte que pode ser sintético ou orgânico e assim disponibilizados para as plantas específicas (BASHAN, 1998). De acordo com Vessey (2003), inoculante refere-se a um insumo biológico que contém microrganismos vivos, sendo estes benéficos e capazes de promover o crescimento de plantas de forma direta ou indireta.

A legislação brasileira por meio do ministério da agricultura pecuária e abastecimento (MAPA) estabelece que os inoculantes comerciais devem apresentar concentração mínima de 1,0 x 109 _{células viáveis por grama ou mililitro de produto até}

a data do seu vencimento, de modo a propiciar no mínimo 600.000 células bacterianas viáveis por cada semente, sendo a dose recomendada por fabricantes de 250g de

21

inoculante turfoso para cada 50 kg de sementes, no caso do feijão caupi (MAPA, 2004).

Para que os inoculantes possam ser comercializados no pais eles devem seguir algumas especificações: devem ser elaborados com suporte estéril e livre microrganismos contaminantes segundo os limites estabelecidos, o suporte ou veículo deverá oferecer nutrição ou sobrevivência ou ambas as coisas, podendo este suporte ser sólido ou fluido ou com outra característica, tendo um prazo de validade de seis meses a partir da data de fabricação (MAPA, 2004).

Segundo Silveira (2008) o uso de inoculantes biológicos se mostra como uma tecnologia eficiente para reduzir ou até mesmo substituir os métodos radicais de adubação com fertilizantes nitrogenados a base de úreia, sendo que atualmente ele é muito empregado em culturas de leguminosas, nas quais tem se observados resultados satisfatórios.

A produção e uso de inoculante no Brasil, a maior parte é produzida na forma sólida, em pó da combustão de turfa (72%) ou na forma granular, meio líquido (18%), caldos ou pó molhável (10%). A inoculação depende do inoculante adquirido; quando em pó e líquido aplicado na semente, aplicação via solo no sulco são os granulados (BEN REBAH et al., 2007; DEAKER; ROUGHLEY; KENNEDY, 2004; MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

Os tipos de inoculantes comercializados atualmente no Brasil são os turfosos e os líquidos. Segundo Freire e Vernetti (1999), os inoculantes turfosos são os mais vendidos desde a década de 50 representando uma tecnologia muito eficiente e de grande aceitação por parte dos produtores rurais.

Os inoculantes líquidos se destacam uma vez que são muito adequados a aplicação em grandes plantios, pois por sua natureza fluida a adesão dos micro-organismos e a aplicação em sementes e no campo torna-se facilitada, além de facilitar a semeadura mecanizada. O problema é que a sobrevivência de bactérias nesse tipo de inoculante e nas sementes vai depender das condições edafoclimaticas do ambiente de inoculação, pois não se encontram protegidas do estresse ambiental, devendo-se fazer a inoculação a sombra e a semeadura deve ser feita nos mesmo dia, mantendo a semente inoculada protegida do sol e do calor excessivo (TITTABUTR et al., 2007).

Conto o uso de bactérias diazotróficas tem se mostrado muito eficiente em gramíneas, leguminosa e outras culturas de interesse econômico, apresentando resultados significativos em relação a ganhos no acumulo de matéria seca, massa de raízes, aumento do sistema radicular, aproveitamento de água, absorção de nitrogênio

e de outros nutrientes e efetividade fotossintética promovendo ganhos na produtividade e qualidade dos produtos agrícolas.

3.7.1 Gênero azospirillum e suas associações com as plantas

As bactérias do gênero Azospirillum ganharam grande importância mundialmente a partir da década de 70 (DOBEREINER et al., 1976), com a descoberta pela pesquisadora da Embrapa, Dra. Johanna Döbereiner (1924-2000), da sua capacidade de fixação biológica do nitrogênio dessas bactérias quando em associação com gramíneas. O aumento da produtividade devido à inoculação com Azospirillum sp nos ensaios realizados no Brasil foi correlacionado não só com o aumento do nitrogênio, mas também com outros nutrientes, como o K e P, isso relatado também em outros países (BASHAN; HOLGUIN, 1997; STEENHOUDT; VANDERLEYDEN, 2000; BASHAN et al., 2004).

Segundo Dobbelaere et al. (2002), o Azospirillum sp são aeróbicas típicas, podendo ser caracterizado como uma bactéria Gram-negativa, com forma de bastonete, medindo 0,8 a 1μm de diâmetro e de 2 a 4μm de comprimento, com grânulos intracelulares de poli-hidroxiburitrato e movimento ativo.

O gênero Azospirillum sp compreende bactérias diaztróficas associativas endofiticas amplamente encontradas em solos de clima tropical e subtropical, estas caracterizam-se como bactérias endofiticas obrigatórias pois necessitam de um hospedeiro para desenvolverem seu ciclo de vida (BALDANI et AL.,1996).

Dentre as espécies descritas as mais estudadas são a A. lipoferum e A.brasilense, sendo que a A. lifofenum se encontra associada ao córtex de milho, sorgo e gramíneas enquanto que a A. brasiliense se apresenta preferencialmente associada a raízes de cereais (centeio, cevada, aveia, trigo etc.), normalmente encontradas em áreas tropicais associadas a raízes de forrageiras, cereais e gramíneas (DOBEREINER, 1995).

No solo as bactérias do gênero Azospirillum sp podem ser encontradas no mucigel rizosférico das plantas ou crescendo endofiticamente nos espaços intercelulares das células das raízes (BALDANI et al., 1996).

Sendo estes muito influenciados pelas condições do meio (fatores bióticos e abióticos), e principalmente pela especificidade da associação planta-bactéria. Esta interação vai definir sua multiplicação, estabelecimento e colonização, na rizosfera e tecidos vegetais dentro da planta hospedeira (HUERGO, 2006).

23

3.7.2 Colonização

As bactérias diazotróficas, endofiticas podem colonizar desde os espaços intercelulares intracelulares do córtex das raízes, sendo que algumas podem colonizar vasos condutores do xilema, mas com menor frequência (HUERGO, 2006). A localização da bactéria endofitica dentro da planta hospedeira vai depender diretamente do tipo de associação que ela apresenta com a mesma, sugerindo que se trata de um tipo de interação especifica planta-bactéria.

O processo colonização e estabelecimento e sobrevivência destas bactérias na rizosfera pode ser dividido em cinco fases: na primeira ocorre a atração química das bactérias, mediante a liberação de exsudatos e lisados na rizosfera promovendo a seleção dos mesmos, essa fase é essencial para a multiplicação e o estabelecimento destas bactérias na rizosfera. A segunda fase e a terceira fase se referem a possível aderência dessas bactérias a superfícies das raízes e a colonização de espaços intercelulares das células das raízes. Na quarta fase ocorre a liberação de bacteriocinas inibindo a presenças de outras bactérias competitivas e em caso de condições desfavoráveis do meio ocorre a formação de uma quinta fase, sendo esta mais relacionada a sobrevivência da bactéria, trata-se da formação de estruturas de proteção como produção de melanina, polissacarídeos e cistos (HUERGO, 2006).

Os principais efeitos morfológicos e fisiológicos provocados pela colonização com Azospirillum em associação com as raízes de plantas hospedeiras são marcantes, sendo observadas alterações na densidade e no comprimento dos pelos radiculares, incremento na velocidade de crescimento de raízes laterais, alteração da respiração das raízes, alterações de atividade de enzimas da via glicolídica, produção de nitritos, produção de hormônios (auxina, giberilina e etileno),aumento na absorção de água, nutrientes e sais minerais (RIGGS et al.,2001).

Atualmente observa-se o emprego de novas tecnologias com o objetivo elucidar o local de colonização dessas bactérias, principalmente através do uso de técnicas de marcação bacteriana. Esta técnica consiste na utilização de soros monoclonais, policlonais proteínas fluorescentes, sondas moleculares além do emprego de genes marcadores ou genes repórteres como assim são denominados. Essas técnicas podem representar um novo marco tecnológico rumo a elucidação dos mecanismos de interação planta-bactéria diazotrófia associativa endofítica.

3.7.3 Produção de fitormônios

Os fitormônios são substâncias orgânicas capazes de desempenhar importantes funções na regulação do crescimento e desenvolvimento vegetal, dentre os quais, se destacam as auxinas, giberilinas, citocianinas, etilino, ácido abscísico e principalmente o ácido indol-3-acético (AIA), o qual é produzido em maior escala. (KENDE; ZEE-VAART, 1997; TAIZ & ZEIGER, 1998).

O AIA, é um hormônio pertencente ao grupo das auxinas, cujo grupo é capaz de promover o crescimento de raízes e caules, mediante ao alongamento das células formadas nos meristemas. Segundo Arshad e Zahir (2004), há evidencias que as principais rotas de biossíntese de AIA, são dependentes do aminoácido triptofano, sendo este o precursor fisiológico para a biossíntese de auxina em plantas e bactérias. Os exudatos radiculares são as principais fontes naturais de triftofano, contribuindo assiduamente para o incremento da biossíntese de auxina na rizosfera.

Segundo Creus et al. (1998), observou que Azospirillum sp era capaz de promover a produção de giberilinas, cujo fitormônios é muito importante nos primeiros estágios de crescimento de gramíneas, através da sua capacidade de reduzir os efeitos negativos do déficit hídrico em sementes de cereais, sob estresse osmótico e salino.

De acordo com Drogue et al. (2012), a produção de fitormônios, se apresenta como um mecanismo de interação planta-bactéria, cujo efeito pode ser variável de acordo com o genótipo da planta hospedeira ou em função do próprio genótipo do microrganismo.

3.7.4 Principas fatores que afetam a sobrevivência e o crescimento da

população de bactérias associativas endofíticas

De acordo com Sousa et al. (2003) as condições físicas e químicas do solo além das sustâncias liberadas na rizosfera pelas raízes e a interação microrganismos benéficos-microrganismos predadores são fatores que podem afetar a sobrevivência e crescimento da população de bactérias diazotróficas associativas endofiticas e de vida livre.

Já por outro lado a escolha do inóculo, bacteriano, o estado fisiológico da estirpe, o tipo de interação específica bactéria-planta, o genótipo da planta e o tipo de espécie cultivada podem constituir fatores essenciais para a melhoria da expressão dos benefícios proporcionados pelas bactérias diazotroficas endofiticas (BALDANI,1994; DÖBEREINER, 1995; WANI, 1990; REIS et al., 2012).

25

De acordo com Tarrand (1978) em estudo para avaliar formas de melhorar a sobrevivências de bactérias diazotroficas endofiticas do gênero Azospirillum, foi observado que estas são capazes de acumular oili-hidroxiburirato (PHB) que se trata de um material de reserva que confere a essas bactérias resistências ao estresse ambiental.

3.7.5 Aspectos qualitativos gênero azospirillum

Os efeitos observados no Azospirillum, as ideias mais aceitas seguem esta linha: estimulação do crescimento radicular, aumento da água e absorção mineral, melhor estado da água, plantas saudáveis. Por sua vez, estimulação do crescimento de raiz pode ser associado com a atividade bacteriana com capacidade de produzir substâncias de crescimento vegetal diferentes, tais como auxinas, citocininas e giberilinas e para induzir a transformação de inativo para fitormônios ativa.

Além de ser um colonizador geral da planta Bashan et al. (2004), Azospirillum é extremamente versátil. Sua versatilidade, não é só capaz de corrigir N atmosférica (DÖBEREINER; DIA, 1976). Mas também a mineralizar nutrientes do solo, para sequestrar Fe, para sobreviver a condições ambientais adversas, e favorecer benéficos associações micorrízicos de plantas (BASHAN et al., 2004). Além disso, Azospirillum pode ajudar as plantas minimizar os efeitos negativos de stress abiótico.

Na cenoura Azospirillum brasilense Sp245-inoculado (Daucus carota cv. 'Beatriz INTA') sementes foram tratadas de acordo com o mesmo protocolo descrito para a alface (BARASSI et at, 2006). Efeitos semelhantes de A. brasilense em aliviar síndrome de estresse salino em ambos germinação e crescimento de planta em cenoura (D. carota), foram observados (AYRAULT, 2002). Esta bactéria também foi capaz de aliviar o estresse salino em grão-de-bico (Cicer arietinum) plantas (HAMAOUI et al., 2001).

4

MATERIAL E MÉTODOS

4.1

Localização e classificação climática e pluviométrica da área

experimental

O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Federal do Mato Grosso-UFMT, campus de SINOP no setor de olericultura nas coordenadas 11º50’53”S e de 55º38'57"O, e a sua altitude em relação ao nível do mar é de 384 metros com chuvas bem caracterizadas no verão e o inverno considerado seco e quente. A média pluviométrica anual é de 1800 a 2200mm (IBGE Cidades 2009, ATR).

4.2

Caracterização do solo

O solo é do tipo Latossolo Vermelho-Amarelo de textura argilosa (EMBRAPA, 2006), apresentando as seguintes características químicas e físicas na camada 0-20 cm, conforme a tabela 1 a seguir:

Tabela 1: Resultado da análise química e física do solo.

4.3

Preparo do solo

A área foi previamente calcareada com base a recomendação, 1.400 kg.ha-1 _de

calcário dolomítico (PRNT: 100%, 32% CaCO3 e 20% de MgCO3) para fins de

elevação da saturação de base a 70%. A adubação de base seguiu a recomendação de 140 kg há-¹ de P; 90 kg.ha-¹ de K2O e 30 kg.ha¹ de N, segundo (PAULA JUNIOR;

VENZON, 2007). Como fonte foram usados superfosfato simples (20% P2O5), KCI

(60% K2O) e Uréia (45%), ambos distribuídos a lanço e incorporado com o auxílio de

uma enxada rotativa, 60 dias antes do transplante das mudas no canteiro.

pH pH P K K Ca Mg Al H H + Al C M.O

(H2O) (CaCl2)

0 – 20 5,9 5,4 8,14 74 0,19 3,35 1,41 0 4,13 4,13 NS 28,15

S T V m Areia Silte Argila

(Soma de bases) (CTC pH 7.0) (Satur.Bases)

% % K Ca Mg H Al 0 – 20 4,95 9,08 54,43 0 2,09 36,9 15,6 45,5 0 264 220 516 0 - 20 mg/dm³ Amostra 8,98 Amostra 100,09 Mn 18,54 B 0,13 Amostra Zn 1,82 Cu 0,18 cmol/dm³ g/dm³ Micronutrientes Fe S Macronutrientes mg/dm³ cmol/dm³ g/dm³

27

4.4

Delineamento experimental

O delineamento experimental utilizado foi um DIC em esquema fatorial 2x4 (2 modos: com e sem inoculação; 4 doses de Nitrogênio: 50, 100, 150 e 200 kg.ha-1_{) com}

4 repetições.

4.5

Material vegetal, implantação e condução do experimento

Sementes de alface americana cultivar Lucy Brown foram semeadas no dia 13/08/2015 em bandeja de popliestireno expandido de 288 células, contendo substrato comercial Vivatto®, cultivadas em casa de vegetação por cerca de 25 dias. As mudas foram submetidas a um stress hídrico por 12 horas, sendo posteriormente reidratadas com água para o tratamento controle e com uma solução contendo o Azospirillum sp. As bandejas contendo as mudas foram colocadas em inoculação utilizando-se o sistema “floating” que caracteriza por utilizar da capilaridade no sistema de molhamento. O inoculante utilizado foi o líquido a base de azospirillum sp (Masterfix® gramíneas), com as estirpes Ab-V5 e Ab-V6 de Azospirillum brasiliense, o inoculante utilizado apresenta 2x108 _{células viáveis por grama de produto. A dose utilizada foi de}

200ml do PC há-¹. O inoculante foi diluído no sistema floating. As mudas foram deixadas em repouso por 24 horas em repouso em pré-plantio e após transplantadas para o local de plantio definitivo.

4.6

Adubação de cobertura

As doses de Nitrogênio e potássio em cobertura foram aplicadas em intervalos de 7, 14, 21 e 28 DAT (dias após transplante) utilizando-se como fonte a Uréia e o KCl. As doses de uréia foram de 50, 100, 150, 200 kg/ha de nitrogênio) e a de KCL foi de 40kg de K2O ha-1.

Cada parcela de avaliação foi constituída de área de 1m² com a cultura transplantada no espaçamento de 25x25cm totalizando 16 plantas totais. Como objeto de análise foi colhido as 4 plantas centrais sendo contabilizada como a área útil da parcela. Em cada parcela foi utilizado duas linhas de tubo gotejador, com emissores espaçados a cada 30 cm e com vazão de 1,2 L.ha-1_.

Durante a condução do experimento foram feitos capinas manuais em intervalos de 15 dias, e a utilização de herbicidas com ingrediente ativo e dose respectivamente, FLUAZIFOPE-P-BUTÍLICO dose 250 g.ha-1_{, com o objetivo de}

eliminar as plantas espontâneas nas entrelinhas e diminuir a competição com a cultura principal além do uso de outros defensivos agrícolas como, inseticidas com ingrediente

ativo IMIDACLOPRID dose 150 ml.ha-1_{, MALATIONA dose 250 ml.ha}-1 _{e fungicidas}

com ingrediente ativo DIFENOCONAZOL dose de 75 g.ha-1_{, OXICLORETO DE}

COBRE dose 200 g.ha-1 _{mais MANCOZEBE dose 160 g.ha}-1_{, de modo a evitar}

excessos, seguiu os intervalos de segurança recomendados pelo fabricante de cada produto, objetivando manter a população de pragas e doenças a baixo do nível de dano econômico para a cultura.

4.7

Colheita

A colheita foi realizada no dia 20 de outubro aos 44 dias após o transplante (DAT), de forma manual, durante o período de máximo desenvolvimento vegetativo da alface americana, antes de se iniciar o seu período reprodutivo (pendoamento), sendo que esta foi realizada em um único dia, na qual foram colhidas as 4 plantas da área útil de parcela, de forma que estas foram cortadas rente ao solo, logo abaixo das folhas basais e em seguida encaminhadas para os laboratórios para fins de análises. Como objeto de análise foram retirados de cada planta folhas externas, intermediárias e internas a cabeça e destas utilizando-se 02 folhas adjacentes de cada parte. Para a leitura colorímetrica foram utilizadas 02 leituras sendo uma adaxial e abaxial das folhas totalizando 06 leituras das três porções de folhas. Já para a variável clorofila fez-se uma dilaceração mecânica com o auxílio de facas e as mesmas misturadas e compostas como amostra composta.

4.8

Variáveis analisadas

4.8.1 Teor de clorofila na folha

O teor de clorofila foi quantificado pelo método descrito por Arnon (1949), aproximadamente 1g de folhas de alface trituradas foram dissolvidas em 10ml de acetona e incubadas em Shaker sob agitação a 4ºC durante 4 horas. Após esse período os tubos foram centrifugados a 4ºC durante 10 minutos a 5000 rpm. O sobrenadante foi retirado e submetido a análise por espectrofotometria com os respectivos comprimentos de onda conforme a descrição da fórmula abaixo, onde A é a absorvância no comprimento de onda utilizado. Os resultados obtidos foram expressos em miligramas de clorofila por grama de matéria fresca.

Clorofila total= Ca= 12,7.A663nm – 2,64.A645nm (mg L-1) _{Cb= 22,9.A645nm – 4,68.A663nm (mg L}-1₎

29

Onde Ca: clorofila A; Cb: clorofila B; Ct: clorofila Total

4.8.2 Colorimetria da folha

A análise de cor foi realizada utilizando-se o colorímetro Minolta CR400 no sistema com iluminante D65 no sistema L*a*b. As folhas para a análise foram retiradas da região externa, intermediária e no interior da planta. Foram realizadas 2 leituras por folhas tanto da parte abaxial como adaxial. Para cada planta avaliada fez-se 6 leituras.

A coordenada L* representa quão mais clara ou mais escura está a folha, com valores entre 0 (totalmente preto) e 100 (totalmente branco); a coordenada a* pode assumir valores entre -80 a +100, em que os extremos correspondem, respectivamente, ao verde e ao vermelho; a coordenada b* pode variar de -50 a +70, com intensidade do azul ao amarelo.

A saturação, ou Chroma, (C*), define a vivacidade (próximo de 60) ou a opacidade da cor (próximo de zero) (COLOR GLOSSARY, 2011; KONICA MINOLTA, 2011). Ela é calculada por meio da equação C* = (a*2 + b*2)1/2 (ARIAS et al., 2000).

O Hue, ou ângulo Hue, também foi calculado e este está relacionado às diferenças de absorbância em diferentes comprimentos de onda, permitindo distinguir colorações de mesma luminosidade, sendo calculado a partir de tan-1 (b*/a*), quando a*>0 e b*≥0, e 180 + tan-1 (b*/a*), quando a*<0 (ARIAS et al., 2000). O valor hue de 180º representa o verde puro e o de 0º, vermelho puro; quanto mais próximo de 180° for este valor, mais verde será a cor do alimento (COLOR GLOSSARY, 2011; KONICA MINOLTA, 2011).

Para melhor interpretar os resultados, na Figura 1 é apresentado o diagrama de cromaticidade. L* indica a luminosidade com valores variando de 0 (preto) a 100 (branco), enquanto a* e b* representam as coordenadas cromáticas. A tonalidade (Hue) é o termo utilizado para a classificação de vermelho, amarelo, azul, etc. Por definição, o ângulo Hue se inicia no eixo de croma a* e é expresso em graus, em que 0º seria +a* (vermelho), 90º seria +b* (amarelo), 180º seria - a* (verde) e 270º seria -b* (azul) (KONICA MINOLTA, 1997).

Figura 1: Diagrama de cromaticidade a* e b* (KONICA MINOLTA, 1997)

4.9

Análise estatística

Os dados foram submetidos a análise de variância pelo teste F com p<(0,05) e quando significativos foram submetidos ao teste de médias para variáveis qualitativas e para as variáveis quantitativas submetidas a análise de regressão.

31

5

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tabela 2: Resumo da análise de variância pelo teste F

Tratamentos

L*

a*

b*

Chroma

Hue

Clorofila

(mg/g)

Controle

58,50

_-10,81

_22,56

_25,31

_116,82

_21,31

Azospirillum

58,06

-11,00

22,00

24,69

116,82

20,69

Dose de N (kg/ha)

50

59,12

_-11,00

_22,75

_22,50

_116,00

_19,62

100

58,62

-10,50

21,62

24,37

117,13

22,50

150

58,00

-10,87

22,75

25,25

116,50

19,12

200

57,37

-11,25

22,00

24,87

117,63

22,75

Modo

0,41

_0,09

_0,89

_0,59

_0,00

_0,10

Dose

1,24

_0,24

_0,89

_0,36

_0,71

_0,88

Modo x Dose

0,39

_0,09

_0,17

_0,13

_0,04

_0,47

CV(%)

3,3

-16,49

7,89

9,21

-3,77

27,08

Tabela 2 são apresentados os resultados da análise de variância e o teste de médias referentes a Modo, Dose e a interação entre Modo x dose.

Para variável L* não houve diferença significativa, para modo, dose e interação entre ambos. Os valores de modo apresentaram na presença de azospirillum foi de 58,06 e sem a inoculação foi de 58,50. Fasciglione et al. (2015) utilizando a cultivar Elisa obteve resultado significativo para variável L* com inoculação com valor de 57,40 e no tratamento controle de 54,8. Observa-se que os valores estão abaixo dos encontrados nesse estudo com a cultivar Lucy Brown mostrando que existe uma diferença nessa variável em função da cultivar. Outro fator que possa atribuir um valor de L* maior na cultivar Lucy Brown pode estar relacionado a metodologia que foi utilizada pois as folhas internas desse material são mais claras que as folhas externas. Em relação a adubação nitrogenada para variável L* a dose de 50 kg.ha-¹ obteve a maior média 59,12 e a menor média verificada na dose de 200 kg.ha-¹ com 57,37.

Para a variável a* também não houve diferença significativa, para modo, dose e interação entre ambos. Os valores de modo apresentaram na presença de azospirillum foi de -11,00 e sem a inoculação foi de -10,81. Segundo Cassetari (2012) utilizando cultivares americanas (Rubete, Salinas 88, Bálsamo e Winslow) sem o uso

de inoculante verificou média de -10,91 bem próximo da cultivar utilizada Lucy Brown, evidenciando que o uso de inoculante aumenta a pigmentação do verde, comparado-se a cultivar Elisa (folha lisa) o valor foi de -15,00 comparado-sem o uso de inoculante. Escomparado-se valor corrobora para a afirmação que a cultivar Elisa apresenta uma tonalidade do verde maior que a cultivar Lucy brown. Em relação a adubação nitrogenada para variável a* a dose de 100 kg.ha-¹ obteve a maior média -10,50 e com a dose 200 kg.ha-¹ obteve a média mais baixa, -11,25.

Não houve diferença significativa para variável b*, para modo, dose e interação entre ambos. Os valores de b* a na presença de azospirillum foi de 22,00 e sem a inoculação foi de 22,56. Já para Cassetari (2012) utilizando cultivares tipo americana (Rubete, Salinas 88, Bálsamo e Winslow) e a cultivar Elisa tipo lisa, sem o uso de inoculante, as cultivares tipo americana apresentaram média de 13,18 e a cultivar tipo lisa 18,14, valores maiores em relação a Lucy Brown que obteve 22,56 isso implica que quanto mais negativo o valor b* representa cor com tendência ao azul a provável explicação pode ser de ordem nutricional e/ou características da própria cultivar. Em relação a adubação nitrogenada para variável b* a dose de 50 e 150 kg.ha-¹ obtiveram a mesma média, ou seja, 22,75 e com a dose 100 kg.ha-¹ obteve-se o registro da média inferior, ou seja, 21,62.

Já para variável Chroma os valores de C* na presença de azospirillum foi de 24,69 e sem a inoculação foi de 25,31. Segundo Fasciglione et al. (2015) sem à utilização de inoculante usando a cultivar Elisa verificaram para o valor de C* de 23,54. Esse valor está abaixo do encontrado para a cultivar Lucy Brown que foi de 25,31, isso representa que a cultivar Lucy Brown apresenta maior intensidade na cor, já que os valores de C* variam de 0 (para cores neutras), e 60 (para cores vivas). Em relação a adubação nitrogenada para variável C* a dose de 150 kg.ha-¹ obteve a maior média 25,25 e com a dose 50 kg.ha-¹ obteve a média mais baixa, ou seja, 22,50.

O ângulo Hue, outro parâmetro importante de coloração foi verificado valores na presença e/ou ausência de de azospirillum de 116,82. Já Fasciglione et al. (2015) testando a cultivar Elisa encontraram valores de ausência e presença de azospirillum de 122 e 124 respectivamente, valores acima da cultivar testada no experimento. As prováveis explicações para tal discrepância é que a cultivar Lucy Brown forma cabeça então a incidência de sol é menor do que a cultivar Elisa que é “aberta” ou seja, não forma cabeça, isso implica na melhor distribuição dos pigmentos nas folhas. Em relação a adubação nitrogenada para variável Hue a dose de 200 kg.ha-¹ obteve a maior média 117,63 e com a dose 50 kg.ha-¹ obteve a média mais baixa 116,00.

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Para a variável Clorofila os valores da presença ou ausência de azospirillum foi de 20,69 e 21,31 respectivamente. Fasciglione et al. (2015) encontraram valores bem superiores com a cultivar Elisa, com valores de 86,9 e 76,9 mg g-¹ na presença e ausência respectivamente. No estudo destes autores visualiza-se um grande aumento na quantidade de clorofila nas folhas, a provável explicação pode ser na forma de inoculação que foi realizada, ou seja, fez-se a aplicação foliar e não a inoculação pelas raízes e as peculiaridades da cultivar como a Lucy Brown forma cabeça a incidência de luz é muito menor, implicando na menor produção de clorofila pela planta.

Já para adubação nitrogenada para variável clorofila a dose de 200 kg.ha-¹ obteve a maior média 22,75 mg.g-¹ e com a dose 150 kg.ha-¹ obteve a média mais baixa 19,12 mg.g-¹ não sendo significativo, assim não sendo possível ajustar e obter a equação de melhor dose a ser aplicada. Porto et al. (2006) testando a cultivar Elba tipo americana utilizando as doses (30, 60, 90, 120 e 150 kg.ha-¹), obteve ganhos significativos aumentando o teor de clorofila para 54,88 mg.g-¹ com dose máxima obtida de 104,88 kg.ha-¹ de nitrogênio. As diferenças observadas podem ser devido aos diferentes cultivares ou as condições edafoclimáticas.

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CONCLUSÕES

A inoculação de azospirillum via sistema de floating e a adubação nitrogenada nas doses avaliadas não altera o comportamento colorimétrico e também o teor de clorofila da alface americana Lucy brown.

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