A re ação e m cade ia da po lim e rase na de te cção da
resistência à penicilina em
Streptococcus pneumoniae*
Po ly m e rase chain re actio n use d to de te ct
Stre pto co ccus pne um o niae resistance
to pe n icillin
EDUARDO WALKER ZETTLER (TE SBPT) ROSANE M. SCHEIBE, CÍCERO A. G. DIAS, PATRÍCIA SANTAFÉ,
JOSÉ DA SILVA MOREIRA, DIÓGENES S. SANTOS, CARLOS CEZAR FRITSCHER
Intrdodução: O Streptococcus pneumoniae é o mais freqüente agente etiológico de infecções respiratórias adquiridas na comu n idade e su a resistên cia aos an timicrobian os tem aumentado nos últimos anos. A determinação da resistência é feita rotineiramente por método lento que depende do crescimento em cultura e determinação da concentração inibitória mínima (CIM). A reação em cadeia da polimerase (PCR) detecta os genes responsáveis pela resistência do Streptococcus pneumoniae a penicilina em cerca de 8 horas.
Objetivo: Comparar a PCR com o método da CIM no diagnóstico da resistência da Streptococcus pneumoniae a penicilina.
Método: Foram estudadas 153 amostras de Streptococcus pneumoniae, isoladas de diferentes sítios anatômicos, usando-se para detecção de mutações nos genes que codificam as proteínas ligadoras de penicilina 1a, 2b e 2x, responsáveis pela resistência à penicilina. A ocorrência das mutações foi correlacionada com a CIM de penicilina, determinada pelo teste de difusão em ágar.
Resultados: A resistência global à penicilina do Streptococcus pneumoniae foi de 22,8% (16,3% de resistência intermediária e 6,5% de resistência alta). Em proporções estatisticamente significativas, as amostras sensíveis à penicilina não tinham mutações, as intermediárias apenas uma, geralmente na proteína ligadora de penicilina 2x, e as altamente resistentes tinham mutações nas três proteínas investigadas.
Conclusão: A PCR é um método rápido para a detecção da resistência à penicilina do Streptococcus pneumoniae, que poderá vir a ser utilizado na prática clínica.
J Bras Pneumol 2004; 30(6) 521- 27.
Descritores: St rept ococcu s pn eu mon iae. Resist ên cia à penicilina/métodos. Reação em cadeia por polimerase.
Backg ro und: St rept ococcu s pn eu m on iae is t h e m o st common etiologic agent of community- acquired respiratory infections. In recent years, S. pneumoniae resistance to antimicrobial agents has increased. Minimum inhibitory concentration (MIC) is routinely used to determine resistance. Polymerase chain reaction (PCR) detects the genes responsible for Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin within approximately 8 hours.
Objective: To compare t he PCR an d MIC met hods in d et erm in in g St rept ococcu s pn eu m on iae resist an ce t o pen icillin .
Method: A total of 153 Streptococcus pneumoniae samples, isolated from various anatomical sites, were evaluated in order to detect mutations in the genes encoding pbp1a, pbp2a and pbp2x, which are responsible for Streptococcus pneumoniae penicillin resistance. A correlation was found between mutations and penicillin MIP, as determined by the agar diffusion method.
Results: Overal Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin was 22.8% (16.3% intermediate resistance and 6.5% high resistance). In a statistically significant finding, we observed no mutations in the penicillin-sensitive samples and only one mutation, typically in the gene encoding pbp2x, among the samples with intermediate resistance, whereas mutations in all three genes studied were observed in the high-resistance samples.
Conclusion: For determining Streptococcus pneumoniae
resistance to penicillin, PCR is a rapid method of detection that could well be used in clinical practice.
* Trabalho realizado n o Laborat ório de Biologia Molecu lar do In st it u t o de Pesqu isas Biomédicas da Pon t ificia Un iversidade Cat olica do Rio Gran de do Su l, PUCRS
En dereço para correspon dên cia:Edu ardo Walker Zet t ler - Ru a Gen eral Ibá Mesqu it a Ilha Moreira, 180/ 1401 - Boa Vist a. CEP: 91340- 190 - Port o Aleg re, RS - Tel: 5 5 - 11 3 0 2 9 1 2 01 - E- m a il: ezet t ler@ p u crs.b r
Receb id o p a ra p u b lica çã o , em 1 9 / 2 / 0 4 . Ap ro va d o , a p ó s revisã o , em 1 2 / 5 / 0 4 .
INTRODUÇÃO
Em todo o mundo, o Streptococcus pneumoniae é o mais freqü en t e agen t e et iológico de in fecções adquiridas na comunidade que acometem o sistema respirat ório e est á associado com 3 a 5 milhões de m ort es por an o(1). Nos EUA, é respon sável por
500.000 casos anuais de pneumonia, 50.000 casos de bact eremia, 3.000 casos de men in git e e cerca de 7 milhões de casos de ot it e média agu da(2,3).
A resistência do pneumococo à penicilina vem aumentando de forma significativa nos últimos anos, particularmente em países europeus como Espanha, Fra n ça e Hu n g ria , o n d e a lca n ça a t é 71 % d e resistência(4,5). Nos EUA, ela chega a atingir 44% em
alguns estados(6,7). Já na Ásia, podemos encontrar
alarmantes índices de 70% a 78% de resistência
em Hong Kong, Coréia do Sul e Taiwan(8- 10).
No Brasil, alguns estudos mostram níveis de
resistência próximos a 20%(11- 13), mas um trabalho
recente detectou resistência à penicilina em 42,1% (26,8% de resistência intermediária e 15,3% de alta resistência) dos isolados oriundos de três países latino- americanos (Argentina, Brasil e México)(14).
A resistência do S. pneumoniae aos antibióticos beta- lactâmicos deve- se exclusivamente a mutações nas proteínas ligadoras de penicilinas (PLP), que são o seu alvo natural, que impedem a ligação e as tornam indiferentes aos beta- lactâmicos, ou seja, diminuem a afinidade de ligação com essas drogas. Em isolados alt am en t e resist en t es ocorre u m a redução da capacidade de ligação às moléculas de antibióticos em pelo menos 3 das 5 PLP existentes: PLP 1a, PLP 2x e PLP 2b(15- 17).
A d et erm in a çã o d a resist ên cia é rea liza d a rotineiramente utilizando- se testes de mensuração d a co n cen t ra çã o in ib it ó ria m ín im a (CIM) d o a n t ib ió t ic o t e s t a d o , a t r a vé s d e m é t o d o s laborat oriais como o t est e de dilu ição em ágar, qu e é o recomen dado pelo Nat ion al Comit t ee for Clin ica l La b o ra t o ry St a n d a rd s. Esses m ét o d o s apresentam como principal inconveniente o tempo n e c e s s á r io p a r a a o b t e n ç ã o d o r e s u lt a d o , geralmen t e su perior a 48 horas(18).Ut ilizan do- se a
reação em cadeia da polimerase (PCR) é possível d e t e c t a r- se a s m u t a ç õ e s re sp o n sá ve is p e la resist ên cia do pn eu mococo à pen icilin a em t empo bem mais cu rt o, próximo a 8 horas(19) .
Com o at u al crescim en t o da resist ên cia do pneumococo, torna- se imperioso o desenvolvimento de uma técnica diagnóstica rápida e confiável, capaz
d e p ro p o rcio n a r u m a t e ra p ê u t ica p re co ce e a d e q u a d a a o s ca so s d e in f e cçã o p o r ce p a s resistentes. Assim, este estudo tem como objetivo principal comparar a PCR com o teste de diluição em ágar e determinação da CIM no diagnóstico da
resistência do S. pneumoniae à penicilina.
MÉTODO
No período de janeiro de 1997 a setembro de 2000, n o Laboratório de Biologia Molecu lar do In stitu to de Pesqu isas Biomédicas da Pon tifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, foi realizado este estudo transversal de prevalência. Fo ra m est u d a d a s 1 9 7 a m o st ra s clín ica s d e S. pneumoniae, identificadas pelas técnicas laboratoriais convencionais, isoladas de qualquer sítio anatômico nos laboratórios de microbiologia de sete hospitais de Porto Alegre (RS), representativos da comunidade local, escolhidos por conveniência, e que colaboraram com o estudo (Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, Hospital da Criança Santo Antônio, Hospital Mãe Deus, Hospital Moinhos de Vento, Hospital Nossa Senhora da Conceição e Hospital São Lucas da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul)(18). Foram
consideradas amostras coletadas de um mesmo paciente, simultaneamente ou em tempos distintos. Am ost ras n ão iden t ificadas com o pn eu m ococo através dos métodos convencionais padronizados pelo National Comittee for Clinical Laboratory (18), e
amostras sem a identificação do gene lytA pela PCR, conforme técnica descrita a seguir, foram excluídas do estudo.
A CIM de penicilina foi medida através do teste de diluição em ágar em meio Mueller- Hinton (Oxoid Unipath Ltd.; Hampshire, Inglaterra) contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Os pontos de corte foram aqueles publicados pelo National Comittee for Clinical Laboratory (18): sensíveis (CIM £ 0,06 mg/mL),
resistência intermediária (CIM de 0,12 a 1,0 mg/mL), e alta resistência (CIM ³ 2,0 mg/mL). A cepa de S. pneumoniae ATCC 49619 foi empregada para controle de qualidade do teste de susceptibilidade(18).
As amostras isoladas nos meios de cultura foram simultaneamente submetidas à PCR para detecção
do gene lytA do S. pneumoniae, conforme descrito
p o r Ub u ka t a e t a l.(1 9 ), p a ra co n f irm a çã o d a
Co lô n ias iso lad as d e S. p n eu m o n iae fo ram ret iradas do meio de cu lt u ra at ravés de raspagem com alça de plat in a e colocadas em t u bo com 50 ml de águ a bidest ilada, para a ext ração do DNA bact erian o. A segu ir, eram adicion ados 50 ml de proteinase K. O material era então incubado a 50°C d u ra n t e 1 6 h o ra s. Em se g u id a , e ra f e it a a inativação da proteinase K, a 95°C por 10 minutos. P a r a a s e le ç ã o d o s in ic ia d o r e s, f o r a m u t ilizados oligon u cleot ídeos in iciadores (primers) d erivad o s d o g en e lyt A d o S. p n eu m o n iae, e d o s g e n e s q u e co d ifica m a s PLP 2 b e 2 x d e S. p n eu m o n iae sen síveis à p en icilin a e a PLP 1 a d e S. p n e u m o n ia e re sist e n t e à p e n icilin a , q u e a p resen t a va m a s seq ü ên cia s a seg u ir:
Código Gene Sequ ên cia (5’- 3’)
B1 PLP 2 b ACT CAG GCT TAC GGT CAT T
B2 PLP 2 b ACG AGG AGC CAC ACG AAC AC
X1 PLP 2 x GTC ATG CTG GAG CCT AAA TT
X2 PLP 2x AAC CCG ACT AGA TAA CCA CC
A1 PLP 1a AGG TCG GTC CTA GAT AGA GCT
A2 PLP 1a GAG CTA CAT AGC CAG TGT CTC
SPN1 lyt A TGA AGC GGA TTA TCA CTG GC
SPN2 lytA GCT AAA CTC CCT GTA TCA AGC G
Foram preparadas duas misturas para as reações, uma contendo os primers para amplificação dos genes das PLPs 2b e 2x e a outra contendo os prim ers dos gen es da PLP 1a e do gen e lyt A, conforme descrição a seguir: 5 ml tampão específico
para a Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl2, 1U Taq
DNA polimerase 5 U/ml (Gibco), 200 mM mistura equimolar dos nucleotídeos trifosfatados, 50 pmol de cada um dos dois pares de primers.
Para a preparação da amostra a ser amplificada e dos controles negativo e positivo, misturavam- se 2 ml do DNA extraído de S. pneumoniae com 48 ml da mist u ra- mest ra. Como con t role n egat ivo da reação u t ilizavam- se 2 ml de águ a bidest ilada adicionados a 48 ml da mistura de reação. Como controle positivo, na mistura 1, utilizavam- se 2 ml de DNA extraído da amostra de S. pneumoniae já identificada previamente como sensível à penicilina e, na mistura 2, 2 ml de DNA extraído de amostra identificada como resistente, adicionados a 48 ml de cada mistura de reação.
Com relação aos ciclos de am plificação, as amostra preparadas com os respectivos controles positivo e negativo eram colocadas no termociclador e submetidas a 35 ciclos, após uma desnaturação
inicial a 94°C por três minutos. Cada ciclo consistia de desn at u ração a 94°C du ran t e 30 segu n dos, anelamento a 60°C durante 30 segundos e extensão a 72°C durante dois minutos. Após os 35 ciclos de amplificação, os tu bos eram su bmetidos a u ma extensão final a 72°C durante sete minutos.
Para a elet roforese, separavam - se 20 m l da solu ção resu lt an t e, qu e eram aplicados n o gel de a g a ro se 2 % (SIGMA), co n t e n d o 2 m g / m l d e brom et o de et ídio (SIGMA). A elet roforese era r e a liz a d a a 1 5 vo lt s / c m , c o m d u r a ç ã o d e a p r o x im a d a m e n t e 3 0 m in u t o s . O g e l e r a visu alizad o so b lu z u lt ravio let a e g ravad o n o GELDOC 1000, utilizando- se o software Molecular Analyst (Biorad). As amostras positivas produziam u m a ban da visível com os segu in t es t am an hos: PLP 2b: 359 pares de bases, PLP 2x: 277 pares de bases, PLP 1a: 423 pares de bases, gen e lyt A: 273 pares de bases (Figu ra 1).
A análise estatística foi realizada relacionando-se in icialmen t e o n ú mero de mu t ações em cada amost ra, det ermin ado pela PCR, com o grau de resistência das mesmas, determinado pela sua CIM. Em ca d a g ru p o d e a m o st ra s co m d ife re n t e s n ú m ero s d e m u t a çõ es (n en h u m a m u t a çã o , 1 mutação, 2 mutações ou 3 mutações), foi feita uma comparação pareada en t re os grau s de resist ên cia das mesmas (sen síveis x in t ermediárias, sen síveis x resist en t es e in t erm ed iá ria s x resist en t es), u t iliz a n d o - se o t e st e d o Qu i- q u a d ra d o p a ra comparação en t re proporções (het erogen eidade), com um grau de liberdade, aplicando- se a correção de Yates, considerando- se um nível de significância est at íst ica de 95% (p < 0,05). A segu ir foi feit a a relação en t re as mu t ações em cada u ma das t rês PLP est u d ad as co m o g rau d e resist ên cia d as amost ras det ermin ado pela CIM. Em cada gru po de amostras com mu tação n u ma determin ada PLP (PLP 1a, PLP 2b ou PLP 2x) foi realizada u ma comparação pareada en t re o grau de resist ên cia das mesmas (sen síveis x in t ermediárias, sen síveis x resistentes e intermediárias x resistentes), também se em pregan do o t est e do Qu i- qu adrado para comparação en t re proporções (het erogen eidade), com um grau de liberdade, aplicando- se a correção de Yat es, sen do igu almen t e con siderado u m n ível de sign ificân cia de 95% (p < 0,05).
RESULTADOS
Das 197 amost ras iden t ificadas in icialmen t e c o m o S. p n e u m o n ia e n o s la b o r a t ó r io s d e microbiologia dos hospitais de origem, 34 (17,2%) foram exclu ídas do est u do por n ão crescerem n o meio de cu lt u ra após t erem sido descon geladas (mort e bact erian a), ou por n ão se con firmar a iden t ificação da espécie bact erian a at ravés dos t est es microbiológicos.
Rest aram 163 amost ras qu e foram su bmet idas simu lt an eamen t e aos t est es de det ermin ação da CIM e à PCR para det ecção das mu t ações n as PLP 1a, 2b e 2x e amplificação do gen e lyt A, para co n f irm a çã o d a id e n t if ica çã o b a ct e ria n a . A p resen ça d o g en e lyt A fo i verifica d a em 1 5 3 amost ras. As 10 amost ras qu e n ão apresen t aram est e gen e foram exclu ídas da an álise fin al.
A dist ribu ição da resist ên cia do S. pneumoniae n as 153 amost ras rest an t es n o est u do, t est adas at ravés do mét odo de dilu ição em ágar de acordo com a su a CIM é most rada n a Tabela 1.
In icia lm e n t e , re la cio n o u - se o n ú m e ro d e m u t a çõ e s e m ca d a a m o st ra co m o g ra u d e resist ên cia das mesmas, det ermin ado pela CIM. Obt eve- se a proporção de amost ras sen síveis, de resist ên cia in t ermediária e de alt a resist ên cia com determinado número de mutações e verificou- se a sign ificân cia est at íst ica das diferen ças(Tabela 2).
Não ocorreram amost ras resist en t es n o gru po de amost ras sem mu t ações. A comparação en t re amost ras sen síveis e in t ermediárias most rou - se sign ificat iva (
χ
2 = 33,89; p < 0,0005).Não ocorreram amostras com alta resistência no grupo de amostras em que havia uma mutação. A com paração das am ost ras sen síveis com as de resistência intermediária mostrou-se significativa, com predomínio das sensíveis (
χ
2 = 16,277; p < 0,0005).Co m rela çã o à s a m o st ra s co m d u a s e t rês mu t ações, n ão hou ve amost ras sen síveis, e hou ve d if e r e n ç a s ig n if ic a t iva c o m p a r a n d o - s e a s resistências intermediária e alta. Houve predomínio de cepas com resist ên cia in t ermediária n o gru po
com du as mu t ações (
χ
2 = 0,006; p = 0,942) e decepas com alt a resist ên cia n o gru po com t rês mu t ações (
χ
2 = 21,843; p < 0,0005).A seguir, correlacionou- se a presença de mutação em cada uma das três PLP isoladamente com os ín d ices d e resist ên cia d et erm in ad o s p ela CIM, aplican do- se o t est e est at íst ico para an alisar a significância das diferenças encontradas (Tabela 3). A mu t ação n a PLP 2b det ermin ou au sên cia de am o st ras sen síveis. Ho u ve p red o m ín io d e alt a resist ên cia em relação à resist ên cia in t ermediária (
χ
2 = 18,308; p < 0,0005).Quanto à mutação na PLP 2x, a comparação entre amostras sensíveis e intermediárias foi significativa:
χ
2= 25,304 (p < 0,0005); a comparação entre amostras
sensíveis e resistentes também foi significativa: Qu i-qu adrado = 18,388 (p < 0,0005); e a comparação entre amostras intermediárias e resistentes não foi significativa:
χ
2 = 0,572 (p = 0,4539).Com relação à mu t ação n a PLP 1a, n ão hou ve amostras sen síveis. Ela determin ou predomín io de alt a resist ên cia (in t ermediárias x resist en t es:
χ
2 =21,843 (p < 0,0005) (Tabela 3).
DISCUSSÃO
A resistência do S. pneumoniae à penicilina em Porto Alegre aumentou consideravelmente nos últimos anos. No estudo de Chatkin et al.(21), de 1989, era de
apenas 3,2%, e atingiu 22,8% no período de nosso estudo. Este índice é semelhante aos encontrados por Sessegolo et al.(11) e Levin et al.(12) no Estado de São
Paulo na década de 1990 (24%). Mais recentemente,
Mendes et al.(14) estudaram amostras pneumocócicas
isoladas em três países da América Latina (Argentina, Brasil e México) e encontraram níveis ainda mais elevados de resistência (42,1%).
É im p o rt a n t e ressa lt a r q u e en t re a s cep a s resistentes que encontramos, a maioria apresentou resistên cia in termediária à pen icilin a (16,3%), e apenas 6,5% demonstraram alta resistência. Conforme já descrito por diversos autores, as amostras com resist ên cia in t erm ed iária t êm ap resen t ad o b o a resposta clínica à penicilina em altas doses(22,23),
enquanto que as altamente resistentes podem causar uma maior morbi- mortalidade(24,25).
Em comparação com levantamentos realizados em outros países, a resistência do pneumococo em nosso meio ainda permanece em níveis inferiores. Nos EUA, por exemplo, o mais recente relatório
epidemiológico, publicado por Karlowsky et al.(6),
in vest ig a n d o 2 7 .8 2 8 cep a s d e S. p n eu m o n iae isoladas em vários estados norte-americanos, revelou 18,4% de alta resistência à penicilina.
No presente estudo, encontramos uma associação significativa entre a presença de mutações nos genes que codificam as PLP do S. pneumoniae e os índices de resistência à penicilina in vitro, determinados pela CIM. As amostras sensíveis caracterizaram- se, em proporção estatisticamente significativa dos casos (p < 0,05), pela ausência de mutações nas PLP, as de resistência intermediária pela ocorrência de apenas uma mutação, geralmente na PLP 2x, e as altamente resistentes pela presença de mutações nas três PLP. A presença de mutação isolada na PLP 1a ou na PLP 2b ocorreu em número significativamente maior de
amostras com alta resistência do que naquelas com resistência intermediária. Já a mutação na PLP 2x não foi capaz de ser discriminada entre amostras com resistência intermediária ou alta. A associação de mutações em duas ou três PLP correlacionou- se significativamente com a expressão de alta resistência à penicilina. Estes resultados estão em concordância com outros estudos que têm demonstrado que as mutações no genoma da PLP 2x isoladamente resultam em baixo nível de resistência à penicilina, enquanto que a alta resistência à penicilina requer alterações genéticas também nas PLP 1a e 2b(26-30).
TABELA 1
Níveis de resist ên cia das amost ras de S. pn eu mon iae
Nível de resist ên cia Nú mero de amost ras (%) Sen sível (CIM ≤ 0,06 m g/ mL) 118 (77,2%) In t ermediária (CIM 0,12 a 1,0 mg/ mL) 25 (16,3%) Alt a (CIM ≥ 2,0 mg/ mL) 10 (6,5%)
To t al: 153
CIM: con cen t ração in ibit ória mín ima.
TABELA 2
Relação en t re o n ú mero de mu t ações e o n ível de resist ên cia
Sen sível In t ermediária Alt a Sem mu t ações 86 (73%)* 2 (8%) 0 (0%) 1 mu t ação 32 (27%) 18 (72%)* 0 (0%) 2 mu t ações 0 (0%) 4 (16%)** 1 (10%) 3 mu t ações 0 (0%) 1 (4%) 9 (90%)***
Total 11 8 2 5 10
* co m p a ra çã o se n síve is x in t e rm e d iá ria s: p < 0 ,0 5 . ** co m p a ra çã o in t e rm e d iá ria s x a lt a re sist ê n cia : p = n ã o s ig n if ic a t ivo . *** c o m p a r a ç ã o in t e r m e d iá r ia s x a lt a resist ên cia: p < 0,05
TABELA 3
Relação en t re as mu t ações em cada PLP e o n ível de resist ên cia
Sen sível In t ermediária Alt a PLP 2b 0 (0%) 7 (28%) 10 (100%)* PLP 2x 32 (27%) 21 (84%)** 10 (100%)*** PLP 1a 0 (0%) 1 (4%) 9 (90%)****
Total 118 25 10
* comparação in t ermediárias x alt a resist ên cia: p < 0,05 ** comparação sen síveis x in t ermediárias: p < 0,05 *** co m p a ra çã o se n síve is x a lt a re sist ê n cia : p < 0 ,0 5 ; co m p a ra çã o in t e rm e d iá ria s x a lt a re sist ê n cia : p = n ã o sig n ifica t ivo
Ub u kat a et al.(1 9 ) est u d aram a p resen ça d e
mu t ações em gen es da PLP 2b de 1.062 amost ras clín ica s d e S. p n e u m o n ia e a t ra vé s d a P CR, en con t ran do correlação com os achados da CIM de pen icilin a em 98,9% das amost ras sen síveis e 70,3% das resist en t es.
Nagai et al.(30) avaliaram a presença de mutações
n os gen es das PLP 2b e 2x em 218 amost ras de S. pn eu mon iae isoladas de crian ças n o Japão. As mutações na PLP 2x foram observadas em diversas cepas com resist ên cia in t ermediária à pen icilin a. Em 41,3% das amost ras sensíveis ao cefot axime en con t raram- se mu t ações n os gen es da PLP 2x, o qu e su gere qu e o mecan ismo de resist ên cia pode o c o r r e r m e s m o e m c e p a s s u s c e t í ve is a o s an t imicrobian os, e p ode preceder a resist ên cia det ect ada in vit ro. Em n osso est u do, est e achado reproduziu- se, tendo sido encontradas em 84% das amostras com resistência intermediária à penicilina a presen ça de mu t ação n a PLP 2x, o qu e most ra qu e est e pode ser u m marcador de men or n ível de resistência. Assim, não foi possível a discriminação e n t re a m o st ra s in t e rm e d iá ria s e a lt a m e n t e resist en t es à pen icilin a u t ilizan do- se as alt erações n a P LP 2 x iso la d a m e n t e , m a s f o i p o ssí ve l diferen ciar sign ificat ivamen t e as cepas sen síveis das qu e apresen t avam algu m grau de resist ên cia (intermediária ou alta).
A d et ecçã o d a PLP 1 a a t ra vés d a PCR fo i u t iliza d a p o r d u Pleiss et a l.(2 9 ) em 1 8 3 iso la d o s
clín ico s d e S. p n eu m o n ia e, q u e o b t ivera m u m a co n co rd â n cia d e 9 8 ,3 % en t re o s resu lt a d o s d a PCR e o s d a d o s d e CIM d e p en icilin a . Os va lo res p re d it ivo s p o sit ivo e n e g a t ivo d e st a t é cn ica m o le c u la r f o ra m d e 1 0 0 % n a d e t e c ç ã o d e a m o st ra s co m CIM ³ 1 m g / m L. Sim ila rm en t e, e m n o ssa s a m o st ra s co m a lt a re sist ê n cia à p en icilin a , en co n t ra m o s a p resen ça d e m u t a çã o n a PLP 1 a em 9 0 % d o s ca so s (9 / 1 0 ca so s). Em a p e n a s u m a a m o s t r a , c l a s s i f i c a d a c o m o alt am en t e resist en t e à p en icilin a p elas d iret rizes do Nat ion al Comit t ee for Clin ical Laborat ory,n ão se d et ect o u a lt era çã o n a PLP 1 a . Essa a m o st ra a p resen t a va CIM = 2 ,0 m g / m L, va lo r q u e se en con t ra exat am en t e em cim a do pon t o de cort e q u e d ivid e a s a m o st ra s en t re in t erm ed iá ria s o u a lt a m en t e resist en t es à p en icilin a . No en t a n t o , essa d iferen ça en t re o s m ét o d o s fen o t íp ico s e g en o t íp ico s n est e ca so iso la d o n ã o a fet o u a efet ivid a d e d o m ét o d o .
O único estudo prévio que analisou a presença d e m u t a çõ e s n a s t rê s P LP (1 a , 2 b e 2 x), simultaneamente, relacionando- as com a resistência bacteriana, foi o de Jalal et al.(20), que, estudando
230 isolados clínicos de S. pneumoniae, identificou 93% das amostras sensíveis, 85% das intermediárias e 100% das altamente resistentes através da PCR. No entanto, as mutações na PLP 1a não tiveram boa correlação com a resistência in vitro e foram excluídas da análise de dados, que se limitou à avaliação das PLP 2b e 2x. Mesmo assim, os resultados alcançados f o ra m co n sid e ra d o s p o t e n cia lm e n t e ú t e is clinicamente, apesar de não ter sido feita uma análise estatística mais aprofundada.
Um fator muito importante na abordagem de um paciente com infecção pneumocócica é a introdução precoce da terapêutica antimicrobiana, o que pode ser decisivo na evolução e prognóstico da doença(31,32).
Através dos métodos microbiológicos convencionais leva- se, no mínimo, 24 horas para o crescimento e identificação do germe nos meios de cultura e mais 2 4 h o ra s p a ra a re a liz a çã o d o s t e st e s d e suscetibilidade(18).Todas as etapas da técnica da PCR
descritas no presente estudo podem ser realizadas em até 8 horas, e há a con firmação do agen te etiológico e a identificação do seu nível de resistência simultaneamente, o que possibilita um início de tratamento muito mais rápido e adequado.
De st a fo rm a , a t ra vé s d o p re se n t e e st u d o pretendemos demonstrar a potencial aplicabilidade clín ica da t écn ica da PCR n a det ecção precoce da resist ên cia bact erian a do S. pneumoniae, devido à s u a r a p id e z e f a c ilid a d e d e e x e c u ç ã o e m laborat órios adequ adamen t e equ ipados.
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