Imobilização de colágeno em arcabouços de
poli (L-co-D,L ácido lático)
Área de Concentração: Materiais e Processos de Fabricação
Orientador: Profa. Dra. Eliana Aparecida de Rezende Duek
Campinas 2011
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado da Faculdade de Engenharia Mecânica da Universidade Estadual de Campinas, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Mecânica.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA - BAE - UNICAMP
M37i
Más, Bruna Antunes
Título Imobilização de colágeno em arcabouços de poli(L-co-D,L ácido lático) / Bruna Antunes Más – Campinas, SP: [s.n.], 2011.
Orientador: Eliana Aparecida de Rezende Duek Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica.
1. Biomateriais 2. Colágeno 3. Ácido lático I. Duek , Eliana Aparecida de Rezende. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Mecânica. III. Título. Imobilização de colágeno em arcabouços de poli(L-co-D,L ácido lático)
Titulo em Inglês: Collagen imobilization on poly(L-co-D,L lactic acid) Palavras-chave em Inglês: Biomaterials, Collagen, Lactic acid.
Área de concentração: Engenharia Materiais e Processos de Fabricação Titulação: Mestre em Engenharia Mecânica
Banca examinadora: Celia Marina de Alvarenga Freire; Sonia Maria Malmonge Data da defesa: 16/06/2011
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus queridos pais, Elizabeth e Valdemir, por acreditarem nos meus sonhos, pelo incentivo, orientação e carinho incondicional.
Agradecimentos
Este trabalho não poderia ser terminado sem a ajuda de diversas pessoas às quais presto minha homenagem:
Agradeço a Deus por ter me guardado e abençoado com saúde e sabedoria para que eu pudesse concluir mais essa etapa de minha vida;
A minha família, pelo apoio, voto de confiança, carinho e compreensão de minha ausência em grande parte do tempo;
A minha orientadora profa. Dra. Eliana Duek, por ter me acolhido, já na graduação, com tanto carinho em seu laboratório, ter acreditado no meu trabalho, pela paciência e pelas inúmeras vezes em que foi muito mais do que uma orientadora, foi como uma mãe;
A Cintia, Silvia, Kelly, Carol, André, Vinicius e todos os demais integrantes do laboratório de Biomateriais (Biomaterelândia) que estiveram do meu lado nos últimos dois anos. Não existem palavras que possam exprimir os momentos de risos, companheirismo e por toda a paciência que tiveram comigo;
A minha querida amiga Andrea, pelo incentivo, companheirismo e dedicação em me ensinar tudo que sabia sobre cultura de células. Por estar presente desde os momentos mais felizes e vitoriosos até os de maiores dificuldades;
Ao Diego, Marlon, Diego Coutinho, Gustavo Grillo (Auti), Roberto, Jéfiton, Filipe e a todos os demais amigos que estiveram presente nesses dois últimos anos e que torcem diariamente pelo meu sucesso;
A Claudinete pela disponibilidade e atenção em me receber e realizar as inúmeras análises de MEV.
Ao Lucas Moura, Adriano Lima e ao Laboratório de Dentística do Departamento de Odontologia Restauradora, da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, pelas análises de FTIR-ATR;
Ao Prof. Dr. Fábio de Lima Leite e sua aluna Gabriele da UFSCar- Sorocaba, pela realização e discussão das análises de microscopia de força atômica (MFA);
Ao Prof. Dr. Pedro A. P. Nascente, da UFSCar, pela realização das análises de espectroscopia de fotoelétrons excitados por Raios – X (XPS);
Ao Prof. Dr. Nilsson Cristino da Cruz, responsável pelo Laboratório de Plasmas Tecnológicos-LaPTec (UNESP/Sorocaba), pela realização das análises de ângulo de contato e energia de superfície;
A todos os professores que contribuíram de forma direta e indireta para com a minha formação acadêmica e conhecimento necessário para o desenvolvimento do presente trabalho;
Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biofabricação - BIOFABRIS pelo financiamento.
“São fúteis e cheias de erros as ciências
que não nasceram da experimentação, mãe de todo o conhecimento.”
(Leonardo da Vinci)
Resumo
Polímeros biorreabsorvíveis são amplamente empregados como arcabouços na engenharia tecidual. No entanto, devido à natureza hidrofóbica, técnicas de modificação de superfície embasadas na enxertia de grupos químicos funcionais e imobilização de moléculas bioativas são desenvolvidas no intuito de promover a biofuncionalização da superfície desses polímeros, ocasionando uma melhora significativa da interação célula /polímero. Este estudo teve por objetivo desenvolver e caracterizar uma superfície biomimética em arcabouços do copolímero poli (L-co-D,L ácido lático)- PLDLA, através da enxertia de grupos (-COOH) e imobilização de colágeno tipo I. Os arcabouços de PLDLA 70/30 foram obtidos pela técnica de lixiviação de porógenos e submetidos ao método de fotopolimerização oxidativa da superfície do material, seguido da copolimerização enxertiva do ácido acrílico (PLDLA-AAc) e imobilização do colágeno tipo I (PLDLA-Col). A superfície das amostras foi caracterizada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microscopia de Força Atômica (MFA), Espectroscopia de Reflectância Total Atenuada (FTIR-ATR), Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por raios-X (XPS) e ângulo de contato. As imagens da MFA e fotomicrografias da MEV demonstraram a formação de poros e rugosidade na superfície dos arcabouços de PLDLA-AAc e, deposição do colágeno com formação de uma estrutura fibrilar em pontos inespecíficos da superfície dos arcabouços do PLDLA-Col, resultando no aumento da rugosidade superficial de 149.5nm (PLDLA puro) para 295nm (PLDLA-Col). Os espectros de FTIR-ATR do PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col confirmaram a presença dos mesmos picos de absorção para todos os tratamentos e, a presença dos picos em 1662 e 1559cm-1, típicos de amida I e II nas amostras de PLDLA-Col. A citocompatibilidade dos arcabouços foi avaliada através do cultivo de células osteoblásticas primárias submetidas aos ensaios de citotoxicidade e adesão celular inicial, síntese de colágeno e observação da morfologia celular, obtidas pela MEV. Os resultados obtidos mostraram que a superfície biomimética dos arcabouços de PLDLA-Col melhora, significantemente, a taxa de adesão e proliferação celular bem como estimula a síntese de colágeno (p<0,01). Estes resultados são indicativos de que o método de modificação de superfície utilizado no presente estudo pode ser usado no desenvolvimento de arcabouços bioativos e biomiméticos com potencial aplicação na engenharia tecidual.
Palavras Chave: Biomateriais; polímeros biorreabsorvíveis; modificação de superfície; colágeno
Abstract
Bioreabsorbable polymers are widely used as scaffolds in tissue engineering. However, due to their hydrophobic nature, modification techniques based on graft of chemical functional groups and immobilization of bioactive molecules have been developed, in order to promote biofuncionalization of material surface, causing better interaction between cell / polymer. This study aimed at developing and characterizing a biomimetic surface on scaffolds of the copolymer poly (L-co-D, L lactic acid) (PLDLA 70/30), by grafting of chemical functional groups and immobilized with collagen type I. The scaffolds were obtained by porogen leaching, and submitted to photo-oxidation method of the material surface followed by grafting polymer polymerization of the acrylic acid solution (PLDLA-Acc) and immobilization of the type I collagen (PLDLA-Col). The sample surfaces were characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM), Atomic Force Microscopy (AFM) , Attenuated Total Reflectance Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR), X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) and contact angle. AFM images and SEM electromicrographs exhibited porous formation and roughness on the PLDLA-AAc surfaces and collagen deposition with net-like fibrillar structure in non-specific areas of the PLDLA-Col scaffolds, resulting an increase in surface roughness from 149.5 nm (PLDLA pure) to 295nm (PLDLA-Col). ATR-FTIR spectra of PLDLA, PLDLA-AAc and PLDLA-Col exhibited the same absorption peaks for all samples, as well as peaks of 1662 and 1559cm-1 , typical of amide I and II in PLDLA-Col samples. Scaffolds cytocompatibilty was evaluated by osteoblastic-like cell culture, submitted to cytotoxicity and initial cell adhesion assays, collagen synthesis and observation of cell morphology obtained by SEM. The result showed that biomimetic surface of PLDLA-Col scaffolds significantly improves adhesion and cell proliferation rates, as well as stimulates collagen synthesis (p<0,01). These results indicate that the surface modification method in the present study can be used in the development of bioactive and biomimetic scaffold with potential application in tissue engineering.
Key Words: Biomaterials; bioreabsorbable polymers; surface modification; collagen and tissue
Lista de Ilustrações
Figura 1. Representação esquemática da rota metabólica e processo de reabsorção dos poli (
hidroxi ácidos). 8
Figura 2. Fluxograma ilustrando a sequência de etapas utilizadas no processo de obtenção e caracterização físico-química da superfície de membranas e arcabouços de PLDLA antes e após a
imobilização do colágeno. 21
Figura 3. Representação esquemática do processo de foto-oxidação da superfície do PLDLA, seguido da copolimerização enxertiva do ácido acrílico e imobilização do colágeno tipo I. 23 Figura 4. Fluxograma da metodologia empregada no estudo in vitro da citocompatibilidade de células osteoblásticas cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA antes e após a imobilização do
colágeno. 28
Figura 5. Obtenção das células osteoblásticas. (A e B) Incisão e exposição da calota craniana de coelho, (C) Fragmentação da calota e (D) migração celular a partir do explante. 30 Figura 6. Fotomicrografias da morfologia da superfície das membranas de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col, obtidas a partir da microscopia eletrônica de varredura (MEV). 37 Figura 7. Fotomicrografias da morfologia da superfície de arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc
e PLDLA-Col. 38
Figura 8. Microscopia de Força Atômica (MFA). Imagens da morfologia da superfície de arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col, obtidas no modo não-contato. 40 Figura 9. Espectros de FTIR-ATR da superfície das membranas de PLDLA puro, PLDLA-AAc,
PLDLA-Col e Colágeno puro. 45
Figura 10. Espectro de XPS do nível C1s da superfície das membranas de PLDLA. (A)PLDLA,
(B) PLDLA-AAc, (C) PLDLA-Col e (D) Colágeno 49
Figura 11. Espectro de XPS do nível O1s da superfície das membranas de PLDLA. (A)PLDLA,
(B) PLDLA-AAc, (C) PLDLA-Col e (D) Colágeno. 49
Figura 12. Espectro de XPS do nível Si 2p da superfície das membranas de PLDLA. (A)
PLDLA, (B) PLDLA-AAc, (C) PLDLA-Col e (D) Colágeno. 49
Figura 14. Comportamento e morfologia da cultura primária de osteoblastos obtida pelo método
de explante. 51
Figura 15. Adesão de células osteoblásticas cultivadas após 2h de cultivo sobre os arcabouços de PLDLA puro, modificados pela enxertia do ácido acrílico (PLDLA-AAc) e imobilizados com
colágeno tipo I (PLDLA-Col). 53
Figura 16. Citotoxicidade direta dos arcabouços de PLDLA puro, modificados pela enxertia do ácido acrílico (PLDLA-AAc) e imobilização do colágeno (PLDLA-Col) às células osteoblásticas
após 24h de cultivo celular. 56
Figura 17. Síntese de colágeno das células osteoblásticas cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col, obtidos pela análise colorimétrica Sirius red. 59 Figura 18. Fotomicrografias da morfologia das células osteoblásticas após 2h de cultivo sobre os arcabouços de PLDLA (A e B), PLDLA-AAc (C e D) e PLDLA-Col (E e F). 64 Figura 19. Fotomicrografias da morfologia das células osteoblásticas após 24h de cultivo sobre
os arcabouços. 65
Figura 20. Fotomicrografias da morfologia das células osteoblásticas após 5 dias de cultivo sobre
os arcabouços. 66
Figura 21. Fotomicrografias da morfologia das células osteoblásticas após 10 dias de cultivo
Lista de Tabelas
Tabela 1. Efeito da modificação de superfície sobre o ângulo de contato 42 Tabela 2. Energias de ligação (em eV) dos principais picos fotoelétricos. As percentagens em parênteses referem-se às quantidades relativas de cada componente de um determinado pico. 46
Lista de Abreviaturas e Siglas
Letras Gregas
θ - Ângulo de contato
ys -Energia de superfície do material [mJ/m2]
...
Abreviações
Acc – Ácido acrílico Col – Colágeno
DMEM- Meio Eagle modificado por Dulbeco DMSO – Dimetil sulfóxido
EDTA – Etileno diamino tetra ácido acético
FTIR-ATR – Espectroscopia de Reflexão Total Atenuada no Infravermelho com Transformada de Fourier
hv – Energia do fóton KV – Quilovolts
MEC- Matriz extracelular
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
MTT - 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil brometo de tetrazólio MFA – Microscopia de Força Atômica
PLLA - Poli(L-ácido lático)
PLGA - Poli(L-co- ácido glicólico) PDLLA- Poli(D,L-ácido lático) PLDLA – Poli (L-co-D,L ácido lático) PCL – Policaprolactona
PBS- Solução tampão fosfato (PBS)
SFB- Soro fetal bovino UV - Ultravioleta
XPS – Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por raios-X CH2I2 – Diiodometano
H2O – Água
...
Siglas
ASTM – American Standart Testing Materials FDA – Food and Drug Administration
Sumário
1 INTRODUÇÃO ... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 3
2.1 BIOMATERIAIS ... 3
2.2 POLÍMEROS BIORREABSORVÍVEIS E HIDROLÍTICAMENTE DEGRADÁVEIS ... 6
2.3 ENGENHARIA TECIDUAL ... 9
2.4 MODIFICAÇÃO DE SUPERFÍCIE ... 13
2.5 COLÁGENO ... 18
3 MATERIAIS E MÉTODOS... 21
3.1 Obtenções das membranas e arcabouços de PLDLA ... 21
3.1.2 Copolimerização enxertiva de monômeros do ácido acrílico ... 22
3.1.3 Imobilização do colágeno em arcabouços de PLDLA ... 23
3.4 Obtenção das membranas de colágeno ... 24
3.1.5 Caracterização da superfície das amostras... 24
3.5.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 24
3.5.2 Microscopia de Força Atômica (MFA) ... 25
3.5.3 Ângulo de Contato e Energia de Superfície ... 25
3.5.4 Espectroscopia de Reflexão Total Atenuada no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR-ATR) ... 26
3.5.5 Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por raios-X (XPS) ... 26
3.6 Estudo in vitro ... 27
3.6.1 Meios de cultura celular ... 28
3.6.2 Obtenção e Isolamento de células osteoblásticas ... 29
3.6.3 Interação células-suporte ... 30
3.6.4 Adesão Celular Inicial ... 31
3.6.5 Citotoxicidade Direta ... 31
3.6.6 Sirius Red - quantificação de colágeno ... 32
3.6.8 Análise estatística ... 33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 34
4.1 Caracterização da superfície da amostras ... 34
4.1.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 34
4.1.3 Microscopia de Força Atômica (MFA) ... 39
4.1.4 Ângulo de Contato e Energia de Superfície ... 41
4.1.5 Espectroscopia de Reflexão Total Atenuada no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR-ATR) ... 44
4.1.6 Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios-X (XPS) ... 46
4.2 Estudo in vitro ... 50
4.2.1 Obtenção e isolamento de células osteoblásticas ... 50
4.2.2 Adesão Celular Inicial ... 52
4.2.3 Citotoxicidade Direta ... 56
4.2.4 Sirius Red - quantificação de colágeno ... 58
4.2.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 61
5 CONCLUSÕES ... 68
6 SUGESTÕES PARA PRÓXIMOS TRABALHOS ... 69
Referências ... 70
APÊNDICE A – Espectros de FTIR-ATR da superfície da membrana de PLDLA ... 87
APÊNDICE B – Espectros de FTIR-ATR da superfície da membrana de PLDLA-AAc ... 88
APÊNDICE C – Espectros de FTIR-ATR da superfície da membrana de PLDLA- Col ... 89
APÊNDICE D – Espectros de FTIR-ATR da superfície da membrana de Colágeno ... 90
1 INTRODUÇÃO
O grande desafio da Engenharia Tecidual e Ciência dos Biomateriais tem sido o de produzir e desenvolver biomateriais capazes de atuarem na interface com os tecidos receptores no organismo, interagindo com os mesmos de forma a elicitar o mínimo de respostas biológicas indesejáveis a curto e longo prazo (KOSE et al., 2003; BARBANTI et al., 2005).
Estima-se que no mundo todo 100 bilhões de dólares sejam investidos anualmente na indústria dos biomateriais. Atualmente, o crescimento desse setor tem sido estimulado, principalmente, pela melhora da expectativa de vida e condição sócio-econômica da população mundial acompanhadas de patologias geriátricas (degeneração tecidual, osteoporose, insuficiência cardíaca entre outras) e relacionadas diretamente ou indiretamente ao próprio estilo de vida (traumatismos, queimaduras, neoplasias, obesidade). Há de se ressaltar que, paralelamente a esta indústria bilionária, valores expressivos são investido em pesquisas de desenvolvimento, fabricação e aprovação da comercialização de novos biomateriais bem como no aprimoramento de terapias celulares e técnicas cirúrgicas que fazem uso dos mesmos (HUTMACHER, 2006).
Embora o sucesso clínico e aplicação dos mais diversos tipos de dispositivos médicos atualmente disponíveis, tenha proporcionado a melhora da qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo, existem ainda consideráveis melhorias a serem realizadas. Uma porcentagem considerável de dispositivos médicos, aplicados às mais diversas áreas da medicina, apresentam limitado período de vida útil, são propensos a sofrer desgaste e perda das propriedades mecânicas ou ainda, ocasionam respostas inflamatórias exacerbadas e estimulam a formação de cápsula fibrosa ao redor do dispositivo, a qual prejudica o processo de cicatrização e perda da propriedade funcional de vários tecidos.
Com o avanço científico-tecnológico e maior compreensão de como tecidos e órgãos funcionam a nível celular e molecular, uma nova abordagem tem norteado as pesquisas no campo da engenharia tecidual. Esta visa o desenvolvimento e manipulação de implantes artificiais, de
tecidos gerados em laboratório ou células e moléculas capazes de substituir ou estimular funcionalmente partes defeituosas ou lesadas do organismo (HASIRCI & YUCEL, 2007).
Condizente com esta abordagem, a fabricação de dispositivos poliméricos biorreabsorvíveis e hidrolíticamente degradáveis estão sendo amplamente investigados devido à inerente propriedade de sofrerem hidrólise no organismo, concomitantemente ao processo de regeneração tecidual. A vantagem da aplicação terapêutica desta classe de materiais deve-se ainda à adequada interação biológica, facilidade de processamento e modulação das propriedades mecânicas. No entanto, a ausência de sítios de reconhecimento natural das células e baixa hidrofilicidade de uma considerável parcela de polímeros atualmente utilizados, têm limitado o sucesso clínico da aplicação dessa classe de materiais.
Algumas estratégias têm sido desenvolvidas pela engenharia tecidual no intuído de promover uma maior afinidade e interação celular com substratos poliméricos, dentre elas, a imobilização de macromoléculas que mimetizem a matriz extracelular e estimulem a adesão, proliferação e diferenciação celular têm mostrado desempenhar fundamental importância sobre a interação célula-material de diversos tipos celulares. No entanto, o mecanismo de atuação dessas macromoléculas sobre o comportamento biológico é pouco compreendido e, portanto, sugere a necessidade de uma maior investigação.
Diante destas perspectivas, o objetivo do presente estudo foi promover a funcionalização de arcabouços do copolímero poli (L-co-D, L ácido láctico) (PLDLA) através do desenvolvimento de uma superfície biomimética, obtida pela enxertia de grupos funcionais carboxila ( -COOH) e imobilização de colágeno tipo I, capaz de estimular as respostas biológicas envolvidas no processo de interação célula/biomaterial bem como atuarem como uma matriz extracelular sintética temporária, visando portanto, o desenvolvimento de biomateriais poliméricos com maior sucesso clínico de aplicação na engenharia tecidual.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 BIOMATERIAIS
O emprego de biomateriais visando aplicações terapêuticas data de cerca de 2000 anos atrás. Relatos históricos evidenciam que civilizações romanas, chinesas e astecas possuíam como prática comum, o emprego de materiais tais como ouro na odontologia, olhos de vidros, dentes de madeira e ungüentos no processo de reparo tecidual e inflamatório da pele (RATNER & BRYANT, 2004).
Durante os séculos XVIII e XIX um vertiginoso avanço científico, advindo da Revolução Industrial e I Guerra Mundial, proporcionaram a ascensão do conhecimento nas áreas de anatomia e fisiologia bem como, uma maior compreensão de conceitos importantes relacionados à infecção e respostas biológicas do tecido aos biomateriais. Dessa forma, tornou-se necessária a criação e desenvolvimento de novas áreas do conhecimento científico, tais como a Engenharia e Ciência dos Materiais e padronização dos princípios e técnicas empregados pela mesma (RATNER & BRYANT, 2004; JANDT, 2007; RATNER, 2007).
Em 1987, uma conferência promovida pela Sociedade Européia de Biomateriais estabeleceu a definição de biomateriais como sendo ―um material não viável usado em um dispositivo médico, destinado a interagir com o sistema biológico‖. Concomitantemente, alguns pesquisadores, contrários a definição, argumentaram a relação entre o emprego do prefixo ―bio‖ de biomateriais e sua real definição, postulando então, uma outra definição de biomateriais como sendo ― um material sólido que ocorra e seja produzido por organismos vivos, tais como fibrina, quitina ou osso‖ (WILLIAN, 2009). No entanto, o crescente avanço da tecnologia de fabricação e produção de novos materiais, munido dos conhecimentos físico-químicos e biológicos no âmbito interdisciplinar, tem ocasionado uma constante reformulação da definição inicialmente proposta.
Diante das atuais perspectivas, Williams (2009) propõe uma definição mais refinada ao paradigma dos biomateriais. Tal definição é apresentada como: ―Um biomaterial é uma substância projetada para ter uma forma que, isoladamente ou como parte de um sistema complexo, é usado para direcionar, através do controle das interações com os componentes dos sistemas vivos, a curso de qualquer procedimento terapêutico ou diagnóstico, em medicina humana ou veterinária.‖ (WILLIAMS, 2009).
Quanto ao tipo de material, quatro classes de materiais são amplamente utilizadas e disponíveis comercialmente, sendo eles: metais, cerâmicas, polímeros sintéticos e naturais, e compósitos que são manufaturados ou processados para se adequarem à utilização em dispositivos médicos que entrem em contato íntimo com os sistemas biológicos (HASIRCI & YUCEL, 2007; JANDT, 2007).
A maneira pela qual uma coexistência de biomateriais e tecidos mutuamente aceitáveis são desenvolvidos e sustentada baseia-se no paradigma da biocompatibilidade. Tal paradigma funciona como um norteador dos estudos que visam à obtenção de biomateriais capazes de fornecer o melhor desempenho em dispositivos biomédicos e, portanto, tem sido o foco da Ciência e Engenharia dos Biomateriais há muitos anos (WILLIAMS, 2008).
Biocompatibilidade refere-se à capacidade de um biomaterial em executar sua função desejada com relação a uma terapia médica, sem suscitar quaisquer efeitos indesejáveis locais ou sistêmicos no destinatário ou beneficiário daquela terapia, gerando a mais adequada resposta benéfica celular ou tecidual naquela situação específica, otimizando assim, o desempenho clinicamente relevante daquela terapia (WILLIAMS, 2008). Condizente com esta abordagem, o critério de seleção e desenvolvimento de materiais voltados à aplicações médicas devem satisfazer algumas exigências relacionadas às propriedades intrínsecas do próprio material. Os mesmos devem apresentar-se não-tóxicos, não-imunogênicos, não-trombogênicos ou cancerígenos (VERT, 2007; WILLIAMS, 2008).
fisiológicos, físicos ou outros se tornam operacionais no sistema in vivo, quais as condições altamente específicas associadas ao contato íntimo entre biomateriais e os tecidos do organismo e ainda, quais são as conseqüências dessas interações (WILLIAMS, 2008). Para dispositivos médicos implantáveis, as características do indivíduo no qual os mesmos serão implantados, são de importância considerável e há que se antecipar a existência de uma ampla variabilidade de paciente para paciente tais como: idade, sexo, estado de saúde e doenças concorrentes, mobilidade física, estilo de vida e status farmacológico (PORTER et al., 2005).
Embora o sucesso clínico e aplicação dos mais diversos tipos de dispositivos médicos atualmente disponíveis, tenha proporcionado a melhora da qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo, existem ainda consideráveis melhorias a serem realizadas. Ratner (2007) ressalta que o desenvolvimento e aprimoramento de novos dispositivos deve estar fundamentado no princípio de que a natureza biológica é altamente específica, reativa, degradativa, cinética e dinâmica. Diante desta pespectiva, o autor propõe uma lista de idéias centrais ―causa/efeito‖ na qual a nova geração de biomateriais deve buscar atender a especificidade e funcionamento biológico dos tecidos, visando o desenvolvimento de biomateriais que proporcionem uma melhora satisfatória na forma de atuação com o organismo dos pacientes que necessitam desses dispositivos. (RATNER, 2007).
2.2 POLÍMEROS BIORREABSORVÍVEIS E HIDROLÍTICAMENTE
DEGRADÁVEIS
Materiais poliméricos bioreabsorvíveis e hidrolíticamente degradáveis aplicados na Engenharia Tecidual podem ser definidos como sendo estruturas macromoleculares que ao entrarem em contato com o fluído corpóreo são passíveis de sofrerem hidrólise e os produtos gerados, absorvidos e eliminados pelas vias metabólicas naturais do organismo (VERT, 2005; HUTMACHER, 2000).
Convencionalmente, todas as classes de polímeros sintéticos aplicados na Engenharia Tecidual e suscetíveis a sofrerem quebra de ligações primárias da cadeia principal, redução da massa molar e conseqüentemente uma mudança das propriedades físico-químicas são denominados de polímeros biodegradáveis. No entanto, a nomenclatura amplamente empregada, não reflete os reais mecanismos de degradação nos sistemas biológicos, pois sugere que o processo de degradação dos materiais é promovido por células e não por hidrólise. E ainda, sugere que o fato de um polímero ser biodegradado enzimaticamente sob condições ambientais, ocorrerá in vivo. Os Polihidroxialcanoatos e a Policaprolactona são naturalmente biodegradados no meio ambiente, enquanto que no organismo, a degradação ocorre apenas pelo processo de hidrólise (VERT, 2005).
O emprego de materiais poliméricos hidrolíticamente degradáveis visando aplicações terapêuticas deve-se às inúmeras vantagens inerentes da própria natureza química dos mesmos, dentre elas: apresentam adequada interação biológica, são fáceis de serem processados e moldados de acordo com o modelo de dispositivo e aplicação almejada, apresentam comportamento viscoelástico e valores de módulo de elasticidade próximos aos dos tecidos em questão, são resistentes a corrosão e, principalmente, são passíveis de sofrerem degradação, o que viabiliza o processo de reconstrução tecidual (GUNATILLAKE & ADHIKARI, 2003; SABIR et
Poliésteres alifáticos são membros de uma grande família de polímeros os quais podem ser obtidos naturalmente em processo de síntese bacteriana tais como os poli (hidroxi alcanoatos) (PHAs), ou via síntese química, pela policondensação de hidroxí ácidos, diácidos e diálcools ou/bem como, polimerização de heterodímeros do tipo lactonas e glicolídeos. Os últimos representam uma versátil classe de materiais poliméricos, denominada de Poli (-hidroxi ácidos), que possuem estrutura química linear com assimetria quiral do átomo de carbono em cada unidade de repetição, os monômeros. (VERT., 2005; MOTTA et al., 2007). Conforme a escolha da proporção e tipo do monômero e ainda, a configuração espacial da estrutura molecular, estes polímeros exibem diferentes formas químicas estéreo-isoméricas que proporcionam a obtenção de materiais com diversas propriedades físicas e mecânicas as quais são fundamentais, na resposta biológica quando aplicados a dispositivos biomédicos (YI et al., 2009).
Dentre os principais polímeros biorreabsorvíveis e hidrolíticamente degradáveis atualmente estudados e utilizados na área biomédica, encontram-se os poli(ácido lático)-PLA, poli(ácido glicólico)-PGA, poli(ácido lático-co-ácido glicólico)-PLGA, poli(ε-caprolactona)-PCL e seus copolímeros (BARBANTI et al., 2004; WAN et al., 2005; KARAGEORGIOU E KAPLAN, 2005; MOTTA et al., 2007; ESPOSITO et al., 2008). Sendo os poliésteres produzidos a partir dos monômeros do ácido lático e glicólico mais amplamente utilizados devido à superior biocompatibilidade, maior controle sobre a taxa de degradação e histórico de aprovação pela Food and Drug Administration (FDA) (WAN et al., 2005; YU et al., 2010).
Quando tais polímeros, sintetizados à base de ácido lático, entram em contato com o fluído corpóreo, a água penetra na amostra e inicia-se a cisão hidrolítica de ligações ésteres bem como autocatálise de regiões amorfas da cadeia polimérica, originando, portanto, produtos na forma de oligômeros (ou monômeros) solúveis e não tóxicos (BARBANTI et al., 2005; VERT, 2005; HASIRCI & YUCEL, 2007).
A taxa da degradação hidrolítica de biomateriais poliméricos é influenciada por múltiplos fatores, entre eles: local de implante, solicitação mecânica, massa molar, distribuição da massa molar, composição química/esterioisomérica, cristalinidade, morfologia, geometria do dispositivo
desenvolvido, porosidade, rugosidade da superfície, energia livre de superfície, carga da superfície, pH e presença de aditivos na composição do material (BARBANTI et al., 2005).
A biorreabsorção pelo organismo ocorre quando o processo de hidrólise e autocatálise gera produtos e subprodutos com as características dos metabólitos orgânicos, especificamente os ácidos do Ciclo de Krebs. Terminada a hidrólise do material a degradação segue o processo de oxidação a ácido láctico (para o PLA) e conversão das unidades de PGA em glicina, que por sua vez são convertidos em ácido pirúvico. Na presença da acetil coenzima A, ocorre a liberação de CO2 e, conseqüentemente, a decomposição em citrato. O citrato é então incorporado no Ciclo de Krebs, resultando em CO2 e H2O, podendo ser eliminado através da urina e da respiração (BARBANTI et al.,2005).
Figura 1. Representação esquemática da rota metabólica e processo de reabsorção dos poli ( hidroxi ácidos) (BARBANTI et al., 2005).
O poli (L-co-D,L ácido lático)-PLDLA na proporção 70:30 caracteriza-se por ser um polímero amorfo com massa molar na ordem de 105g/moL, temperatura de transição vítrea de
aquoso e uma nítida degradação do material pode ser observada após o período de 16 semanas (BARAÚNA et al., 2007; MOTTA et al., 2007).
Estudos prévios sobre a citocompatibilidade e a capacidade em estimular adesão, proliferação e síntese de matriz extracelular de células osteoblásticas e fibrocondrócitos cultivados sobre arcabouços de PLDLA apresentaram resultados promissores (ESPOSITO et al., 2008; MÁS et al., 2008; ESPOSITO et al., 2009). Freire et al. (2010) avaliaram a influência de arcabouços de PLDLA, previamente cultivados com células osteoblásticas, sobre a regeneração óssea de defeitos bilaterais da calotas cranianas de ratos Wistar. Os mesmos constataram que os arcabouços promoveram formação e maturação do neo tecido ósseo (FREIRE et al., 2010). Esposito (2010) demonstrou que a regeneração do menisco, uma importante estrutura fibrocartilaginosa, pode ser alcançada utilizando arcabouço de PLDLA/PCL-T e células alógenas dentro dos princípios da engenharia tecidual.
2.3 ENGENHARIA TECIDUAL
A engenharia tecidual constitui uma área de pesquisa interdisciplinar cuja abordagem mais ampla de seus objetivos inclui o desenvolvimento e manipulação de implantes artificiais, de tecidos gerados em laboratório ou células e moléculas capazes de substituir ou estimular funcionalmente partes defeituosas ou lesadas do organismo (PLACE et al., 2008; LENAS et al., 2009; CARVALHO et al., 2010). Para tanto, existem três fatores fundamentais a serem considerados no sucesso do desenvolvimento tecidual: (i) a escolha apropriada do tipo celular, (ii) a escolha das propriedades físico-químicas e estrutural do material o qual desempenhará a função de suporte celular, (iii) a compreensão das interações célula/material (HASIRCI & YUCEL, 2007; MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2007) .
Células, naturalmente, estão inseridas no tecido nativo em um complexo microambiente tridimensional cuja composição consiste de moléculas solúveis (citocinas e fatores de crescimento) e fatores não-solúveis (matriz extracelular - MEC). O microambiente fornece não apenas, a integridade estrutural do tecido como também, controla e viabiliza inúmeros processos de transdução de sinais, progressão do ciclo celular e expressão de diferentes fenótipos (SHIN et
al., 2007).
A escolha do tipo celular, compreensão do mecanismo biológico de atuação no organismo a nível celular e molecular e exigências nutricionais e fisiológicas exercem influência direta sobre o grau de sucesso obtido na criação de novos tecidos e avaliação de biomateriais (SALTZMAN et
al., 2000; KIRKPATRICK et al., 2007; SABIR et al., 2009).
Devido a questões éticas, células de origem humana não estão prontamente disponíveis aos centros de pesquisa e ainda, apresentam o inerente problema da variabilidade biológica de individuo para individuo (KIRKPATRICK et al., 2007; WILLIAN, 2008). Usualmente, células primárias obtidas a partir da digestão enzimática ou explante do tecido de um modelo animal, linhagens celulares, também denominadas de células imortalizadas e, mais recentemente, células embrionárias animal são submetidas as mais diversas linhas de pesquisa científica inseridas no contexto da Engenharia Tecidual e Ciência dos Materiais (CHAN & MOONEY, 2008; SABIR et
al., 2009). Portanto, a necessidade de obtenção de dados fidedignos que ofereçam o mais alto
nível de segurança dos dispositivos biomédicos, a curto e longo prazo no organismo, é reflexo da ampla gama de experimentos e reprodutibilidade dos mesmos, disponíveis no meio acadêmico-científico mundial (RATNER, 2007; WILLIANS, 2009; von der MARK et al., 2010).
Sendo assim, a reprodutibilidade e desenvolvimento de um modelo in vitro ideal devem sumarizar as principais características do tecido nativo de interesse tais como, propriedades física, mecânicas e fisiológicas adequadas (CHARLES-HARRIS et al., 2008; TORTELLI & CANCEDDA, 2009).
Métodos instrumentais têm sido desenvolvidos e aplicados na Engenharia Tecidual visando à otimização dos sistemas já empregados no sentido de mimetizar as reais condições do tecido ou órgão. A incorporação de fatores de crescimento e macromoléculas específicas no meio de cultura e superfície do biomaterial, marcação molecular e sistemas de cultura tridimensional e dinâmica, auxiliado pelo uso de biorreatores têm proporcionado o avanço significativo do conhecimento relacionados a condições do microambiente tecidual, fatores biomecânicos, mecanotransdução, pressão hidrostática e tensão de cisalhamento do material (MARTIN et al., 2004; HOLTORF et al., 2006; KIRKPATRICK et al., 2007).
Devido à natureza tridimensional dos tecidos, células são envolvidas em uma complexa matriz extracelular cuja micro-morfologia se apresenta disposta em fibras, poros e sulcos (MURUGAN et al., 2007; SHIN et al., 2007). Sendo assim, a fabricação de suportes tridimensionais também denominados de arcabouços (―scaffolds‖ do inglês), representa a forma estrutural mais adequada e freqüentemente empregada nos dispositivos aplicados na Engenharia Tecidual (MURUGAN et al., 2007; SHIN et al., 2007; GRAYSON et al., 2009).
Arcabouços são definidos como estruturas tridimensionais que desempenham a função de atuarem como suporte temporário no processo de cultivo de células e tecidos e, portanto, devem sumarizar as características de uma matriz extracelular celular (MEC) nativa bem como, atuarem de forma semelhante sob condições fisiológicas viabilizando a formação de um tecido específico com funções apropriadas, semelhantes às encontradas no organismo (MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2007).
Embora o desenvolvimento de arcabouços capazes de mimetizar, fidedignamente, a complexicidade, especificidade de cada tecido e dinamismo da MEC nativa ainda possa ser considerado um processo desafiador, estudos recentes sugerem que o modelo ideal de arcabouço a ser aplicado na engenharia tecidual óssea deve conter algumas características básicas tais como, ser osteocondutor e osteindutor, ou seja, promover uma passiva neo vascularização seguida da deposição neo tecidual e estimular o processo de adesão, proliferação e diferenciação celular, respectivamente (KROESE et al., 2009). O arcabouço deve ser ainda, biorreabsorvível e
biodegradável, apresentar arquitetura que viabilize a difusão de nutrientes e oxigênio às células transplantadas e direcione o crescimento celular para o interior do dispositivo e por fim, apresentar propriedades mecânicas e taxa de degradação adequada ao tempo específico de regeneração do tecido (KOSE et al., 2003; SHIN, 2007; SABIR et al., 2009) .
Sabe-se que a escolha do material a ser empregado como arcabouço na engenharia tecidual depende, primeiramente, do tipo de tecido a ser reconstruído e fatores relacionados ao local de aplicação, tais como, desgaste mecânico e cisalhamento (MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2007; SABIR et al., 2009). Por exemplo, cerâmicas e compósitos são amplamente usados como arcabouços voltados a reconstrução de tecidos duros, enquanto que, polímeros são empregados na reconstrução de tecidos moles (MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2007; SABIR et al., 2009).
Devido às propriedades funcionais e flexibilidade do implante, polímeros representam uma classe de materiais que tem recebido atenção especial e aumento significativo de sua aplicação na engenharia tecidual (CHAN & MOONEY, 2008; FREED et al., 2009; PLACE et al., 2009). Uma ampla gama de técnicas de fabricação são desenvolvidas e adaptadas no intuito de se obter arcabouços poliméricos com porosidade controlada, tamanho e distribuição dos poros compatíveis com aplicações específicas e adequadas propriedades mecânicas (LAVIK & LANGER, 2004). Dentre as principais técnicas encontram-se: evaporação do solvente e lixiviação de porógenos, separação de fase, injeção de gás, sinterização à laser, deposição por fusão e prototipagem (SHIN et al., 2005; ESPOSITO, et al., 2007; LUCCHESI et al., 2008; ESPOSITO et al., 2008; FREED et al., 2009).
O estudo das interações biológicas célula-célula, bem como a influência e viabilidade do emprego do biomaterial sobre o desempenho celular são, freqüentemente, avaliados através de técnicas de cultivo celular. Embora experimentos in vitro não reproduzam uma completa gama de respostas celulares observadas a nível sistêmico in vivo, os mesmos proporcionam uma considerável compreensão sobre os mecanismos básicos de reconhecimento e interação célula-substrato (SALTZMAN et al., 2000).
O processo de interação célula-biomaterial é altamente dinâmico e depende de vários parâmetros que influenciarão a neoformação tecidual (ANSELME et al., 2000; BAKAKOVÁ et
al., 2004; MEYER et al., 2005; von der MARK et al., 2010). Todo o processo de
bioreconhecimento pode ser dividido em dois eventos distintos e que se intercedem: acelular (evento físico) e celular (evento biológico). A adsorção de proteínas é tida como o primeiro evento que ocorre após o contato de fluídos corpóreos à superfície do material e é governada por forças eletrostáticas não específicas tais como Van der Waals e formação passiva de ligações ligante-receptor. O segundo evento caracteriza-se pela ativa reorganização celular no qual o recrutamento de receptores e sítios específicos viabilizam o processo de adesão celular e subseqüente processo de proliferação, migração e diferenciação celular (ANSELME et al., 2000; BAKAKOVÁ et al., 2004; MEYER et al., 2005; von der MARK et al., 2010).
O grau de afinidade e desempenho celular, ou seja, a biocompatibilidade obtida no processo de interação célula/biomaterial é dependente de fatores relacionados à natureza do material, propriedades físico-químicas da superfície do mesmo e por fim, a própria estrutura física aplicada no dispositivo (LAVIK & LANGER, 2004; MURUGAN et al., 2007).
2.4 MODIFICAÇÃO DE SUPERFÍCIE
Sabe-se que as interações entre células e o micro ambiente no qual estão inseridas são mediadas por diversos processos de ―bioreconhecimento‖, ligações específicas entre receptores presentes na superfície da membrana celular e ligantes correspondentes. Para tanto, ao entrar em contato com o fluído corpóreo ou meio de cultura, a supefície do biomaterial deve viabilizar o processo de adsorção de proteínas sobre sua superfície, para que então, as células interajam com o biomaterial através de uma camada estável de proteínas adsorvidas e formada sobre a superfície dos mesmos (MA et al., 2007).
A micro estrutura física e composição química da superfície de dispositivos aplicados na Engenharia Tecidual são fundamentais para que uma série de reações a nível celular e molecular ocorram na interface dos biomateriais com tecidos receptores. Alguns parâmetros são freqüentemente avaliados: hidrofilicidade do material, adsorção de proteínas, presença de grupos químicos funcionais e microtopografia (JIAO & CUI, 2007).
Poliésteres alifáticos são amplamente conhecidos por apresentarem adequada biocompatibilidade, cinética de degradação próxima ao tempo da neoformação tecidual, produtos da degradação biocompatíveis e, principalmente, por apresentarem-se não tóxicos. No entanto, a ausência de sítios de reconhecimento natural das células e baixa hidrofilicidade de uma considerável parcela de polímeros atualmente utilizados, têm limitado o sucesso clínico da aplicação dos mesmos quando considerados e inseridos no atual paradigma da biocompatibilidade (GODDARD & HOTCHKISS, 2007; JIAO & CUI, 2007; RATNER, 2007; WILLIAMS, 2009).
Baseado nos princípios e domínios que regem o processo de biorreconhecimento celular, duas estratégias principais na Engenharia de Superfície de biomateriais são adotadas com freqüência. Na primeira, as propriedades da superfície do material, tais como composição química, hidrofilicidade/hidrofobicidade, energia superficial e rugosidade devem ser moduladas a um estado no qual a adsorção de proteínas seja admitida de forma a manter sua atividade biológica normal. Este método, no entanto, pode não induzir um comportamento celular específico, devido à adsorção de proteínas inespecíficas. Na segunda, biomoléculas ou compostos bioativos de origem natural ou sintéticos, são imobilizados à superfície do material no intuito de elicitar uma resposta celular específica (GODDARD & HOTCHKISS, 2007; JIAO & CUI, 2007). Dentre os métodos físicos e químicos de funcionalização da superfície de biomateriais comumente adotados para introduzir grupos funcionais a superfície de poliésteres alifáticos incluem, tratamentos a plasma (ESPOSITO, et al., 2007; LUCCHESI et al., 2008), irradiação ultravioleta (UV) (YANG et al., 2002; MA et al., 2005), hidrólise da superfície, enxertia química de grupos funcionais ( CHENG & THEO, 2004; MA et al., 2005) , adsorção física e imobilização
química de biomoléculas (GODDARD & HOTCHKISS, 2007; JIAO & CUI, 2007; SHEN et
al.,2009).
A inserção de grupos funcionais à superfície de polímeros hidrolíticamente degradáveis através de métodos físicos tais como, tratamento a plasma, irradiação UV ou pela passiva adsorção de grupos funcionais ativos ou macromoléculas estabelece-se através de interações intermoleculares fracas e não específicas, envolvendo ligações de hidrogênio, forças de van der Waals, interações hidrofóbicas e eletrostáticas (CHENG & THEO, 2004). Embora o emprego desses métodos seja amplamente adotado e reconheça-se a eficiência de atuação dos mesmos sobre as respostas celulares, há de se ressaltar que eles apenas promovem uma transitória modificação da superfície do material uma vez que são facilmente removidos na presença de água e ainda, não permitem um total controle sobre a composição, orientação e acessibilidade de macromoléculas sobre a superfície interna e externa do biomaterial (LEE & LAURENCIN, 2008).
Métodos químicos são preferencialmente utilizados no processo de modificação de superfície de materiais poliméricos por promoverem a enxertia de grupos funcionais e imobilização de biomoléculas à superfície do biomaterial através da formação de ligações covalentes. Na área biomédica, essa metodologia tem como intuito prolongar o tempo de vida útil de uma biomolécula bem como, impedir o seu metabolismo (como em compostos que proporcionem atividade anti-tumoral quando aplicados localmente, ao passo que ao serem metabolizados apresentam-se tóxicos), ou ainda, permitirem a manutenção da bioatividade de dispositivos de longa permanência como no caso de dispositivos ortopédicos, vasculares e cateteres (GODDARD & HOTCHKISS, 2007; JIAO & CUI, 2007).
A enxertia de grupos químicos funcionais à superfície de biomateriais através da copolimerização de um monômero ou composto químico cuja estrutura química viabilize a ligação covalente de grupos funcionais de interesse ao biomaterial, têm sido amplamente empregada devido ao baixo custo operacional do método, condições moderadas de reação e
principalmente, por não alterar as propriedades intrínsecas dos polímeros ao passo que preserva a estrutura modificada da superfície (CHENG & THEO, 2004; MA et al., 2007).
A escolha do grupo funcional a ser incorporado à superfície do biomaterial e a forma como o mesmo influenciará a resposta celular dos mais variados tipos celulares tem sido o foco de estudo de vários pesquisadores (KUBIES et al., 2003; CHENG & THEO, 2004; MA et al., 2005; ARIMA & IWATA, 2007; ROACH et al., 2008). Os grupos hidroxila (OH), metil (-CH3), carboxila (-COOH) e amida (-CONH2) podem ser encontrados naturalmente na superfície dos componentes do sistema biológico bem como, na superfície dos receptores transmembrânicos celulares, portanto, a afinidade química de grupos funcionais presentes na superfície do material pelos grupos funcionais característicos de cada tipo celular ou tecido exercerá influência direta sobre as respostas celulares (ROACH et al., 2008).
Materiais cujas superfícies contém grupos metil e hidroxila induzem a propriedade hidrofóbica e hidrofílica, respectivamente. Portanto, os mesmos são geralmente incorporados ao material no intuíto de promover e aumentar as taxas de adesão e proliferação celular através da adsorção de proteínas à superfície do material. O grupo amida e carboxila são carregados negativa e positivamente, respectivamente, sendo que o emprego dos mesmos visa , geralmente, uma atuação direta sobre a manutenção do tipo celular.
Cheng & Theo (2004) avaliaram a influência do grupo funcional amida sobre a citocompatibilidade de fibroblastos cultivados sobre membranas de PCL. Os autores relacionaram a melhora significativa da viabilidade e taxa de adesão celular à presença do grupo funcional amina (-NH2), proveniente do colágeno imobilizado sobre a superfície das membranas de PCL. Os mesmos sugerem que uma fração dos grupos amina presentes na amostra tornam-se carregados positivamente quando em pH fisiológico (característico do meio de cultura), o que permite a melhora da interação das células (carregadas com cargas negativas) e da superfície do material (carregada com cargas positivas) (CHENG & TEOH, 2004). Outros estudos ressaltam ainda, que a presença do grupo amina sobre a superfície de biomateriais poliméricos estimula, significativamente, a síntese e expressão de proteínas da matriz extracelular de células ósseas,
além de promover a mineralização (KESELOWSKY et al., 2004; KESELOWSKY et al., 2005; ROACH et al., 2008).
Macromoléculas naturais tais como proteínas, polissacarídeos, proteoglicanos e seus derivados são conhecidos por atuar como sinalizadores biológicos às células aderentes, sendo portanto, frequentemente imobilizadas sobre a superfície de biomateriais poliméricos no intuito de se obter uma superfície biomimética ativa e osteoindutoras (HERSEL et al., 2003). No entanto, para que ocorra a imobilização covalente de moléculas de proteínas à superfície de biomateriais poliméricos quimicamente inerte , grupos funcionais reativos tais como hidroxila, carboxila e amino devem ser, previamente, introduzidos na superfície do material afim de que atuem como sítios de ligação (MA et al., 2007).
Uma prática comumente empregada nos processos de modificação de superfícies que visem a imobilização de macromoléculas naturais e/ou formação de camadas estáveis de proteínas sobre substratos poliméricos baseia-se na combinação de um ou mais métodos de polimerização enxertiva a reagentes químicos heterobifuncionais que proporcionem a formação de ligações covalente entre a biomolécula de interesse e a superfície funcionalizada (LEE & LAURENCIN, 2008). Cheng & Theo (2004) combinaram tratamento de superfície à plasma com a fotopolimerização enxertiva do ácido acrílico e imobilização de colágeno para modificar a superfície de filmes de PCL, enquanto que Ma et al. (2005) combinaram o método de foto-oxidação e polimerização enxertiva de grupos peróxidos, seguida da copolimerização de ácido acrílico e imobilização de colágeno sobre membranas de PLLA (CHENG & THEO, 2004; MA et
al., 2005).
O princípio da técnica de imobilização de peptídeos sobre a superfície de materiais poliméricos baseia-se na formação de ligações covalentes estáveis entre a terminação nucleofílica de grupos amino, presente nas moléculas de proteínas e grupos funcionais ativados presente na superfície do material (LEE & LAURENCIN, 2008). Para tanto, o grupo funcional carboxila têm sido freqüentemente introduzido sobre a superfície dos poli(-hidróxi ácidos) através da enxertia do ácido acrílico via processos de copolimerização, os quais são ativados pelo uso de um reagente
químico heterobifuncional denominado cloridrato de carbodiimida. Este promove a formação de ligações peptídicas estáveis a partir de grupos ácidos do ácido carboxílico e grupos amina do peptídeo (LEE & LAURENCIN, 2008).
2.5 COLÁGENO
O colágeno é um polímero natural, de natureza proteica que representa cerca de 25% das proteínas totais dos mamíferos, sendo o maior constituinte da MEC de vários tecidos tais como a pele, ossos, cartilagens, ligamentos e tendões. No organismo, exerce a importante função estrutural mantendo as células unidas para oferecer sustentação mecânica das mesmas e integridade estrutural de vários tecidos (BAREIL et al., 2010),
A unidade estrutural básica do colágeno apresenta uma massa molar de aproximadamente 300.000 Daltons e consiste em 3 cadeias polipeptídicas do mesmo tamanho. Sua composição depende do tipo de colágeno. Estas proteínas são compostas em sua maioria de três cadeias , formando uma tripla hélice devido à presença de um resíduo de glicina a cada três aminoácidos em toda a extensão da cadeia (uma unidade tripeptídica repetitiva de Gly-X-Y). Prolina e hidroxiprolina são normalmente os aminoácidos X e Y, mas qualquer outro pode fazer parte da unidade tripeptídica, exceto a cisteína e triptofano (MOREIRA, 2005).
Existem, aproximadamente, 27 diferentes conformações de cadeia , cada uma sendo expressa por um único gene. A combinação dessas cadeias, em conjuntos de três, se reúnem para formar os 29 tipos de colágenos conhecidos atualmente os quais são classificados de acordo com a sua estrutura polimérica ou características estruturais (BAREIL et al., 2010). Embora muitos tipos de colágeno tenham sido descritos, apenas alguns deles, tais como o colágeno tipo I, são intensamente empregados na produção e desenvolvimento de biomateriais aplicados na engenharia tecidual (BAREIL et al., 2010).
Os dispositivos biomédicos produzidos a partir da proteína colágena na engenharia tecidual, apresentam várias vantagens: são biocompatíveis e biorreabsorvíveis, apresentam excelente resistência mecânica e baixa antigenicidade, são passíveis de serem reticulados visando adquirir as propriedades físico-estruturais moduladas próximas às exigências do tecido específico e, principalmente, são reconhecidos naturalmente e capazes de elicitarem respostas específicas nos sistemas biológicos, portanto, são bioativos (LIU et al., 2010).
Diversos tipos de receptores celulares estão envolvidos no processo de reconhecimento de sinais proveniente dos componentes da MEC (von der MARK et al., 2010). Integrinas são uma família de receptores transmembrânicos, heterodímeros, compostos por duas subunidades: alfa e beta que estão ligadas de forma não covalente e, dependente de cátions bivalentes. Estes heterodímeros medeiam sinais intra e extracelulares envolvidos na reorganização do citoesqueleto, formação de complexos focais e junções celulares e, ativam importantes cascatas de sinalização que regulam a proliferação, diferenciação e manutenção do fenótipo celular (von der MARK et al., 2010) .
Algumas integrinas reconhecem seqüências específicas de proteínas, enquanto outras reconhecem seqüências presentes em grupos de proteínas. Dentre as seqüências de aminoácidos mais freqüentes nas proteínas que compõem a MEC encontra-se a seqüência tripeptídeca Arginia-Glicina-Ácido aspártico (RGD), também conhecida como ―sítio universal de reconhecimento celular‖ encontrada, por exemplo, na fibronectiva, vitronectina, lamina e colágeno (HERSEL et
al., 2003).
Diversos tipos de integrinas já foram descritas e, dependendo da composição de suas subunidades, elas reconhecem não só a seqüências RGD, mas outras seqüências e domínios. As integrinas 11 e 21 são as principais responsáveis pelo reconhecimento do colágeno tipo I e sua interação com as células (MOREIRA, 2005).Osteoblastos superexpressam a integrina 21, que após reconhecimento e ligação ao colágeno, induz a diferenciação dos osteoblastos e o processo de mineralização (GARCIA & REYES, 2005; MOREIRA, 2005).
Embora diversos estudos tenham demonstrado inúmeras vantagens na aplicação dessa proteína na área biomédica, o elevado custo de obtenção e processamento da mesma, alta taxa de degradação e perda das propriedades mecânicas do material incompatíveis ao tempo de regeneração de vários tecidos são tidos, ainda, como fatores limitantes na aplicação dessa classe de material na área biomédica (HERSEL et al., 2003; KYLE et al., 2007; BAPTISTA, 2008).
Algumas estratégias têm sido desenvolvidas e adotadas pela engenharia tecidual no sentido de superar essas desvantagens. Essas estratégias incluem, por exemplo, a adição de fatores de crescimento e outras macromoléculas como a elastina e fibronectina à molécula do colágeno e associação, física ou química, do colágeno a outras classes de materiais tais como metais, cerâmicas e polímeros sintéticos (GOODARD & HOTCHKISS, 2007; JIAO & CUI, 2007).
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Neste capítulo serão abordadas a sequência de metodologias empregadas na obtenção e caracterização físico-química da superfície das membranas e arcabouços de PLDLA bem como, no estudo da citocompatibilidade antes e após o processo de funcionalização da superfície das amostras através do processo de enxertia do grupo funcional carboxila, obtida pela copolimerização do ácido acrílico AAc) e imobilização do colágeno tipo I (PLDLA-Col) sobre a superfície dos dispositivos poliméricos (Figura 2).
Figura 2. Fluxograma ilustrando a sequência de etapas utilizadas no processo de obtenção e caracterização físico-química da superfície de membranas e arcabouços de PLDLA antes e após a imobilização do colágeno.
3.1 Obtenções das membranas e arcabouços de PLDLA
Com o intuito de viabilizar a caracterização física e química do material antes e após o tratamento de modificação de superfície, foram preparadas membranas lisas e arcabouços de
PLDLA obtidos pela técnica de evaporação do solvente. Soluções de PLDLA 70/30 sintetizado no Laboratório de Biomateriais – PUC/SP (MOTTA & DUEK, 2007) foram preparadas por diluição do copolímero, em cloreto de metileno (Merck) (10% m/v) a temperatura ambiente. Para obtenção das membranas, a solução de PLDLA foi vertida em um molde de teflon (350 x 120 mm) e após completa evaporação do solvente, as amostras foram secas à vácuo e armazenadas em um dessecador. Para realização dos experimentos, a membrana foi cortada nas dimensões 2,0mm x 3,0mm. Para a obtenção de arcabouços, adicionou-se sacarose (Synth) (75% m/v) com granulometria controlada entre 200 e 800 μm à solução de PLDLA. A solução foi vertida em um molde cilíndrico de silicone com 7 mm de diâmetro. Após evaporação do solvente e remoção da sacarose em solução de PVA 1% (Poli Álcool Vinílico), os arcabouços foram secos a vácuo e armazenados em um dessecador.
3.2 Copolimerização enxertiva de monômeros do ácido acrílico
A enxertia do grupo funcional carboxila na superfície das amostras foi desenvolvida através da adaptação do método de foto-oxidação, seguido da copolimerização do ácido acrílico proposto por (MA et al., 2005). Com a finalidade de introduzir grupos -OOH à superfície do material, membranas e arcabouços de PLDLA foram colocados, separadamente, em um tubo pirex contendo 10mL de solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) (30 v%). Os tubos contendo as amostras foram expostos à irradiação UV (lâmpada de alta pressão de mercúrio,1000W) a 50°C por 40min, em um reator de fotodegradação desenvolvido segundo o modelo proposto por (CAMPOS et al., 2000). Após a reação de foto-oxidação, os arcabouços foram lavados em água deionizada para que o excesso de H2O2 fosse removido e então, imersas em solução contendo 10mL de solução de ácido acrílico (10v%) e 1mL de sulfato ferroso (0,015M) em um tubo de quartzo, com purga de nitrogênio. A copolimerização enxertiva do ácido acrílico ocorreu a 37°C sob constante agitação. Após a copolimerização, as amostras foram lavadas em água deionizada com o intuito de remover monômeros que não se ligaram a superfície do material durante o
Figura 3. Representação esquemática do processo de foto-oxidação da superfície do PLDLA, seguido da copolimerização enxertiva do ácido acrílico e imobilização do colágeno tipo I. Inicialmente o grupo funcional hidroxila e oxigênio radicalar, provenientes da reação de foto-degradação do H2O2, são introduzidos na superfície das amostras poliméricas. Em seguida, a enxertia do grupo funcional carboxila (-COOH) é obtida pela copolimerização da solução do ácido acrílico (10%) os quais, são pré-ativados pela solução de cloridrato de carbodiimida que estabelece a ligação covalente entre a terminação nucleofílica da proteína colágeno e a superfície do PLDLA.
3.1.3 Imobilização do colágeno em arcabouços de PLDLA
Com a finalidade de pré-ativar os grupos carboxílicos do poli (ácido acrílico) enxertado na superfície das amostras, as membranas e arcabouços de PLDLA foram imersos em solução tampão fosfato (PBS) contendo 10mg/mL de cloridrato de carbodiimida (1-etil-3-(3-dimethylaminopropyl) por 1 hora à 4°C. Em seguida, as amostras foram tratadas com uma solução de Colágeno I (calf skin, Sigma)/PBS na concentração de 3 mg/ mL durante o período de 4 horas à mesma temperatura. Após a imobilização, as amostras foram imersas e lavadas em PBS por 1 hora à temperatura ambiente para a remoção do colágeno não adsorvido pela superfície do
material. As membranas e arcabouços de PLDLA imobilizados por colágeno (PLDLA-Col) foram secos à vácuo e armazenados em geladeira.
3.4 Obtenção das membranas de colágeno
Membranas de colágeno foram preparadas no intuito de auxiliar os ensaios de caracterização de FTIR-ATR e XPS. Uma solução de colágeno tipo I(calf skin, Sigma)/PBS na concentração de 3 mg/ mL foi vertida em um molde de teflon (350 x 120 mm) e congelada por 24h a -20oC. Em seguida, as amostras foram liofilizadas a -80 oC por 4h. As membranas obtidas foram armazenadas em um freezer/congelador até o instante de sua utilização.
3.5 Caracterização da superfície das amostras
3.5.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A MEV foi utilizada para investigar a morfologia da superfície das membranas e arcabouços de PLDLA, antes e após o tratamento de imobilização de colágeno sobre a superfície do material, modificadas pela enxertia do grupo funcional carboxila (-COOH) através da copolimerização do ácido acrílico e imobilização de colágeno. Nesta análise as amostras foram fixadas em um suporte metálico e recobertas com uma fina camada de ouro, utilizando-se um metalizador de amostras BAL-TEC SCD 050. As membranas foram observadas ao MEV (JEOL JXA 860A).
3.5.2 Microscopia de Força Atômica (MFA)
A superfície topográfica das membranas de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col foram analisadas em um equipamento digital, o Microscópio de Força Atômica da marca Veeco modelo diMultiMode V. As imagens foram obtidas no modo contato, empregando-se um cantiléver com constante elástica de aproximadamente 0.06N/m (valor nominal) e uma ponta com raio de aproximadamente 12nm (modelo SNL-10). A taxa de varredura foi de 1Hz. As análises de MFA foram realizadas no Laboratório de Nanociência e Nanoscopia da Universidade Federal de São Carlos- Campus Sorocaba.
3.5.3 Ângulo de Contato e Energia de Superfície
Esta análise mostra a variação na hidrofilicidade/hidrofobicidade ou molhabilidade das amostras e a energia de superfície, antes e após o processo de enxertia de grupos funcionais carboxila e imobilização do colágeno. As medidas foram realizadas no Laboratório de Plasmas Tecnológicos-LaPTec (UNESP/Sorocaba). O ângulo de contato das amostras foi medido em atmosfera normal (ar), por meio de um Goniômetro NRL C.A.Goniometer Modelo 100-00 da Ramé-Hart, inc. Imaging System e a aquisição de imagens foi realizada utilizando o software Rame-Hart Imaging 2001. Para análise da hidrofilicidade das membranas de PLDLA antes e após a modificação da superfície, gotas de água desmineralizada e diiodometano foram adicionadas às superfícies e os respectivos ângulos de contato foram mensurados. As medidas dos ângulos de contato foram realizadas em quintuplicatas e a cada amostra foram adicionadas 3 gotas em diferentes regiões as quais, foram obtidas as médias dos valores relativo de ângulo de contato para cada tratamento.
3.5.4 Espectroscopia de Reflexão Total Atenuada no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR-ATR
)
A espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) é uma importante técnica de caracterização, sendo muito utilizada na identificação da natureza química de vários tipos de materiais. A técnica baseia-se no fato de que as ligações químicas das substâncias possuem freqüências de vibração específicas, as quais correspondem a níveis de energia da molécula (chamados de níveis vibracionais). Tais freqüências dependem da forma da superfície de energia potencial da molécula, da geometria molecular, das massas dos átomos e, eventualmente, do acoplamento vibrônico (SILVERSTEIN et al., 1991). No presente estudo, espectros de absorção na região do infravermelho das membranas de PLDLA, PLDLA-AAc, PLDLA-Col e colágeno tipo I puro foram obtidos a partir de um espectrofotômetro ATR-FTIR (FTIR-ATR), Perkin-Elmer 100S. As análises foram realizadas no Laboratório de Dentística da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP).
3.5.5 Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por raios-X (XPS)
A presença do colágeno imobilizado na superfície das membranas de PLDLA foi analisada pela técnica de espectroscopia de fotoelétron excitados por raios-X (XPS). O princípio da técnica baseia-se em incidir um feixe de raios X com energia h sobre a amostra promovendo a ejeção de elétrons de orbitais com uma energia cinética, EC, dada pela relação de Einstein, EC = h - EL, onde EL é a energia de ligação do elétron emitido em relação ao nível do vácuo. Como a energia dos raios X é bem definida, os fotoelétrons ejetados têm uma distribuição de energia cinética constituída por picos discretos. Os caminhos livres médios destes fotoelétrons nos sólidos são de apenas 0,5 a 3,0 nm, ou seja, apenas a superfície do material está sendo analisada (BRIGGS & SEAH, 1990). A identificação dos elementos presentes na superfície é feita
