Obtenção e isolamento de células osteoblásticas

As condições experimentais utilizadas na obtenção da cultura primária de células osteoblásticas, obtidas através do método de explante, permitiram o isolamento de uma população de células aderentes, com aparência osteoblástica que apresentou adequada taxa de proliferação celular, com formação de colônias dispersas no substrato de cultura durante o processo de migração celular a partir do fragmento ósseo e, após subcultivo. Este comportamento está de acordo com os anteriormente descritos (DECLERCQ et al., 2005; MOURA et al., 2008).

Durante a realização dos experimentos de interação biológica entre as células osteoblásticas e superfície dos arcabouços de PLDLA antes e após enxertia do grupo funcional carboxila e imobilização do colágeno tipo I, as células osteoblásticas mantiveram morfologia e comportamento celular característico e semelhante durante o subcultivo celular, apresentando morfologia alongada com prolongamentos citoplasmáticos que gradualmente evoluíram para uma

forma tetraédrica, também observada por Baptista (2009). Não foi observada qualquer alteração morfológica significativa até o término dos experimentos, sendo que os mesmos não ultrapassaram a 13a passagem de subcultivo.

Figura 14. Comportamento e morfologia da cultura primária de osteoblastos obtida pelo método de explante. (A) Migração celular a partir do fragmento ósseo após 10 dias de cultura. (B e C) Colonização celular. (D) Formação da monocamada celular e confluência durante subcultivo. Microscopia de luz (10X).

A escolha do tipo celular exerce fundamental influência na avaliação do comportamento e diferenciação celular bem como no estudo de aplicação das mesmas. O uso de linhagens celulares em estudos in vitro, tais como a MG63 e SAOS-2 têm proporcionado uma maior reprodutibilidade e planejamento de ensaios voltados a interação de biomateriais e células, principalmente, devido à inerente estabilidade, facilidade de comparação de resultados e ilimitado

número de passagens celulares durante o processo de subcultivo (CHARLES-HARRIS et al., 2008).

Embora as linhagens celulares proporcionem benefícios durante o cultivo celular, as células obtidas por extração primária, apresentam a inerente vantagem de exibirem comportamento celular mais próximo ao encontrado in vivo (CHARLES-HARRIS et al., 2008) possibilitando também seu uso em estudos de regeneração tecidual contendo implantes cultivados com células autógenas ou alógenas, justificando, portanto, a escolha do tipo celular e método de obtenção por explante utilizado no presente estudo para futura aplicação engenharia tecidual óssea.

4.2.2 Adesão Celular Inicial

O fenômeno da adesão celular é uma etapa fundamental no processo de interação célula- biomaterial e está, comumente, associada à capacidade das células em reconhecer, se ligar e interagir com um substrato, portanto, apresentarem afinidade celular. Somente depois de aderidas, as células iniciam seu processo de espraiamento, proliferação, produção de matriz extracelular nova e manutenção do fenótipo celular (YANG et al., 2002; SANTOS et al., 2004; BARBANTI

et al., 2005).

Após 2 horas de cultivo celular, todas as amostras apresentaram as médias dos valores de absorbância significativamente superiores ao controle negativo (fenol 1%) (p<0,01). Os arcabouços de PLDLA e PLDLA-AAc apresentaram os índices de absorbâncias muito semelhantes entre si e ao controle positivo (placa de poliestireno), confirmando a citocompatibilidade e a capacidade de promover a adesão celular (p>0,01). Após a imobilização do colágeno, pode-se observar que os arcabouços de PLDLA-Col apresentaram uma maior capacidade de estimular o processo de reconhecimento e adesão celular quando comparado ao controle positivo e as amostras de PLDLA puro e PLDLA-AAc (p<0,01).

Figura 15. Adesão de células osteoblásticas cultivadas após 2h de cultivo sobre os arcabouços de PLDLA puro, modificados pela enxertia do ácido acrílico (PLDLA-AAc) e imobilizados com colágeno tipo I (PLDLA-Col). Controle negativo (fenol 1%) e controle positivo (placa de poliestireno). Os arcabouços de PLDLA-Col apresentaram as médias do índice de absorbância superiores a todas as demais amostras (p<0,01).

A adesão celular à matriz extracelular é governada, primariamente, por uma família de receptores transmembrânicos denominada de integrinas, as quais se ligam a seqüências específicas de aminoácidos presentes nas macromoléculas que constituem a MEC tais como, fibronectina, vitronectina e colágeno (YANG et al., 2002; BACAKOVÁ, et al., 2004; von der MARK, et al., 2010).

A seqüência peptídica Arginia-Glicina-Ácido aspártico (RGD), também conhecida como ―sítio universal de reconhecimento celular‖, é amplamente explorada no desenvolvimento de superfícies biomiméticas devido a capacidade de serem reconhecidas e se ligarem a diversas classes de integrinas (HERSEL et al., 2003). A sua influência sobre o processo de adesão de vários tipos celulares e mecanismo de ligação biológica tem sido demonstrado por diversos trabalhos (HERSEL et al., 2003; ELLIS & TANENTZAPT, 2009).

Zhao et al. (2006) avaliaram as taxas de adesão e proliferação de células fibroblásticas da linhagem L929 cultivadas sobre membranas do homopolímeros poli(D,L-ácido lático)-PDLLA após o tratamento de modificação da superfície com plasma NH3 e, após o tratamento com plasma seguido da imobilização de colágeno tipo I. Os autores observaram que as membranas poliméricas imobilizadas com colágeno apresentaram índices de absorbância significativamente superiores aos encontrados pelas membranas tratadas a plasma, demonstrando, portanto, que a presença de sítios de reconhecimento naturais presentes na molécula do colágeno influenciam diretamente o processo de reconhecimento biológico (ZHAO et al., 2006). Estes resultados são condizentes aos encontrados no presente estudo.

Cheng & Theo (2004) sugerem ainda, que a melhora significativa das taxas de adesão e proliferação de fibroblastos cultivados sobre superfícies poliméricas imobilizadas com colágeno pode estar relacionada a uma fração de grupos amina (-NH2), presente na molécula do colágeno, que se tornam carregados positivamente quando em pH fisiológico (característico do meio de cultura), promovendo a melhora na interação das células (carregadas com cargas negativas) com a superfície do material (carregada com cargas positivas) (CHENG & TEOH, 2004).

O aumento da hidrofilicidade, energia de superfície e rugosidade superficial obtido através da enxertia de grupos químicos funcionais na superfície de substratos poliméricos têm demonstrado exercer uma fundamental influência sobre a adesão e proliferação de condrócitos e fibroblastos (CHENG &THEO, 2004; MA et al., 2007). No presente estudo, pode-se observar que embora os arcabouços de PLDLA-Col e PLDLA-AAc não tenham apresentado um aumento expressivo da concentração de grupos (-COOH e -NH2) e, consequentemente, uma variação significativa da hidrofilicidade do material, demonstrado anteriormente pelas análises de XPS e medidas de ângulo de contato, o método empregado viabilizou uma melhora da interação entre as células osteoblásticas e a superfície do PLDLA-Col >PLDLA-AAc durante as primeiras horas de contato. Estes resultados ressaltam ainda, a importância da matriz biomimética de colágeno sobre processo de reconhecimento e interação biológica.

Segundo Shen et al. (2009) a presença de monômeros residuais provenientes da reação de copolimerização enxertiva do ácido acrílico ocasionam a mudança da composição química da superfície do material e acidificação do micro ambiente celular e, portanto, resultam em uma discreta diminuição da viabilidade celular durante os primeiros estágios de cultivo em estudos in

vitro. É importante ressaltar que este resultado inconveniente não deve apresentar qualquer

impacto negativo sobre a aplicação do método de copolimerização enxertiva, pois, durante a manutenção do cultivo celular a acidez e resíduos monoméricos são naturalmente neutralizados e removidos através da troca periódica do meio de cultura (pH=7,4).

A adsorção de proteínas provenientes do meio de cultura à superfície do material durante as primeiras horas de contato exerce fundamental influência sobre as taxas de adesão e proliferação celular. A mesma é governada por forças eletrostáticas não específicas tais como Van der Waals e formação passiva de ligações ligante-receptor (ANSELME et al.,2002). Pode-se inferir que a presença dos grupos funcionais livres (- COOH) e (-NH2) na superfície dos arcabouços de PLDLA-AAc e PLDLA-Col, respectivamente, promoveu a adsorção de proteínas através da interação polar desses grupos com o hidrogênio, presente nas moléculas do meio de cultura (YANG et al., 2002).

A boa integração dos arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col com as células osteoblásticas pode estar relacionada ainda, à própria estrutura física do arcabouço empregado. Alguns autores relatam que a presença de porosidade adequada e específica do tipo celular em arcabouços poliméricos podem modular as taxas de adesão e proliferação celular uma vez que, promovem o aumento na superfície de contato para com as células e beneficiam a vascularização e difusão de nutrientes para o interior do dispositivo (KOSE et al., 2003; CUNHA et al., 2005; KARAGEORGIOU & KAPLAN, 2005). Os mesmos ressaltam a importância dessas propriedades sobre o processo de osteogênese.

4.2.3 Citotoxicidade Direta

Os resultados de citotoxicidade obtidos através do ensaio colorimétrico do MTT para os arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col são apresentados na figura 16. Verifica-se que todas as amostras mostraram-se atóxicas às células osteoblásticas após o período de 24 horas de cultivo, quando comparados ao controle positivo (fenol 1%) (p<0,01). Em relação ao controle negativo (placa de poliestireno), os arcabouços de PLDLA e PLDLA-AAc não apresentaram índices de absorbância estatisticamente diferentes entre si (p>0,01). Pode-se observar que após o processo de imobilização do colágeno os arcabouços de PLDLA-Col apresentaram as médias do índice de absorbância superiores não apenas ao controle negativo, mas também, aos arcabouços de PLDLA e PLDLA-AAc (p<0,01). Este resultado sugere que a presença do colágeno sobre a superfície dos arcabouços promoveu uma melhora significativa da afinidade celular e interação das células osteoblásticas com a superfície dos arcabouços.

Figura 16. Citotoxicidade direta dos arcabouços de PLDLA puro, modificados pela enxertia do ácido acrílico (PLDLA-AAc) e imobilização do colágeno (PLDLA-Col) às células osteoblásticas após 24h de cultivo celular. Controle negativo (fenol 1%) e controle positivo (placa de poliestireno). Os arcabouços de PLDLA-Col apresentaram as médias do índice de absorbância superiores a todas as demais amostras (p<0,01).

De acordo com as normas de padronização internacional (International Standard Organization - ISO 10993-5) os testes que visam avaliar a citotoxicidade celular representam a etapa inicial do estudo e caracterização de biomateriais voltados à aplicação biomédica (JAHNO, 2009). Os mesmos possuem a vantagem de serem sensíveis, facilmente reproduzidos e de baixo custo (JAHNO, 2009).

O teste do MTT é amplamente utilizado em estudos que visam avaliar a citocompatibilidade de biomateriais aplicados na engenharia tecidual. O método baseia-se na oxidação metabólica do 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil brometo de tetrazólio (MTT) (MOSMANN, 1983). Esse composto é absorvido dentro das células e através de uma redução da reação mitocondrial-dependente, produz o Formazan que se acumula dentro da célula. Impossibilitado de passar pelas membranas, esse composto apenas é liberado após a adição de algum solvente adequado e assim quantificado por colorimetria. Essa habilidade celular de reduzir o MTT indica integridade e viabilidade mitocondrial e, portanto, está diretamente relacionado à viabilidade celular (MOSMANN, 1983; DI TORO et al., 2004; BHATIA & YETTER, 2008).

Sabe-se que polímeros biorreabsorvíveis e hidrolíticamente degradáveis exibem comportamento variável em sistemas biológicos em razão de diversas propriedades tais como, massa molecular, hidrofobicidade, monômeros residuais e pH dos produtos de degradação (LUCCHESI et al., 2008). Embora uma substância tóxica não afete apenas uma estrutura molecular, mas sim várias funções celulares, considera-se que a imediata avaliação da atividade mitocondrial pode ser o suficiente para validar a citocompatibilidade de um biomaterial e viabilidade do estudo do emprego do mesmo (LUCCHESI et al., 2008).

O histórico de aprovações do emprego de poliésteres (-hidróxi ácidos) na área biomédica pela Food and Drug Administration (FDA) é condizente com a citocompatibilidade de uma ampla gama de homopolímeros e copolímeros desenvolvidos e sintetizados a partir dos monômeros do ácido lático e glicólico tais como o PLDLA avaliado no presente estudo. Não obstante, o sucesso da aplicação de dispositivos produzidos a partir do colágeno nas áreas de cirurgias vasculares e

estéticas sugerem que a combinação de ambos os materiais agregaria, apenas, benefícios do ponto de vista biológico (HERSEL et al., 2003; CHEUNG et al., 2007; PRESTWICH, 2007; YU et al., 2010).

Ignatius e Claes (1996) avaliaram a citocompatibilidade de células osteoblásticas cultivadas sobre filmes do copolímero PLDLA e constataram que o mesmo apresenta-se atóxico. Resultados semelhantes foram obtidos por (BARAÚNA et al., 2007; ESPOSITO et al., 2008; MÁS et al., 2008) nos estudos de interação de células nervosas, fibrocondrócitos e osteoblastos, respectivamente, com superfície do copolímero PLDLA . No presente estudo, nota-se que o método empregado para promover a imobilização de colágeno sobre a superfície dos arcabouços de PLDLA promoveu o aumento significativo de citocompatibilidade do material quando comparado ao material sem tratamento.

4.2.4 Sirius Red - quantificação de colágeno

Os arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col foram submetidos à análise de quantificação de colágeno pelo método colorímétrico Sirius Red (Figura 17). O princípio do método consiste na determinação da absorbância, correspondente à intensidade de coloração gerada pela ligação seletiva do corante Sirius Red a grupos aniônicos presentes na molécula do colágeno. O resultado das amostras de 2h, 24h, 5, 10 e 20 dias de cultura mostram que os arcabouços de PLDLA-Col possuem índice de absorbância significantemente diferente em relação ao controle (p<0,01) e arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc (p<0,05).

Cerca de 95% da matriz extracelular orgânica do tecido ósseo é composta por fibras colágenas e pequena quantidade de proteoglicanas e glicoproteínas. A síntese de colágeno tipo I pelos osteoblastos pode ser entendida como a fase inicial da formação óssea (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; DECLEQUE et al., 2005). Diante disso, no presente estudo optou-se pela imobilização de colágeno tipo I sobre a superfície dos arcabouços de PLDLA, baseando-se no

principio do reconhecimento biológico específico e de que forma a presença de macromoléculas comuns ao tecido ósseo in vivo poderiam atuar sobre os processos de interação célula/biomaterial.

Figura 17. Síntese de colágeno das células osteoblásticas cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col, obtidos pela análise colorimétrica Sirius red. Controle (placa de poliestireno). Os arcabouços de PLDLA-Col apresentaram as médias do índice de absorbância superiores ao controle (p<0,01) e arcabouços de PLDLA e PLDLA-AAc (p<0,05).

Como descrito anteriormente, o processo de adesão inicial e a forma como células interagem com a superfície do biomaterial durante as primeiras horas de contato com o mesmo, desempenham papel fundamental sobre as etapas seguintes de proliferação, espraiamento e diferenciação celular. O último pode ser avaliado através da síntese e expressão de proteínas inerentes de cada tipo celular (SCHOFER et al., 2009).

Como parâmetro do potencial osteoindutor do biomaterial, células osteoblásticas são constantemente avaliadas a partir dos níveis de expressão de fosfatase alcalina (ALP), síntese de colágeno (inicio da diferenciação celular) e potencial de mineralização (marcador ―tardio‖), sendo o último parâmetro, utilizado para avaliar a diferenciação de células osteoblásticas e a formação

de matriz extracelular calcificada (DECLEQUE et al., 2005). Embora existam diferentes marcadores correlacionados à expressão do fenótipo de células osteoblásticas, no presente estudo considerou-se suficiente a análise de síntese de colágeno como indicador da integridade funcional das células osteoblásticas em cultivo.

A capacidade de estimular a atividade osteogênica de células osteoblásticas cultivadas sobre polímeros sintéticos biorreabsovíveis e hidrolíticamente degradáveis tem sido avaliada por diversos pesquisadores (YANG et al., 2002; YANG et al., 2003; GARCIA & REYES, 2005; WAN et al., 2007, von der MARK et al., 2010). Embora se reconheça a citocompatibilidade dos mesmos e a influência das diferentes estratégias utilizadas pela engenharia tecidual (porosidade, tamanho e distribuição dos poros, rugosidade, hidrofilicidade e energia de superfície) sobre os processos de adesão e proliferação, estes materiais têm demonstrado não suportarem a manutenção do fenótipo celular após longos períodos de cultivo (DE BARTOLO et al., 2007; LIU et al., 2007; GARCIA & REYES, 2005; SCHOFER et al., 2009) .

Schofer et al. (2009) avaliaram a influência de arcabouços de nanofibras de PLLA e PLLA-colágeno sobre os níveis de expressão genética para os genes da fosfatase alcalina, osteocalcina e síntese de colágeno de células mesenquimais diferenciadas em osteoblastos. Os autores constataram que os níveis de expressão obtidos a partir de células cultivadas sobre os arcabouços de PLLA-colágeno foram significativamente superiores aos encontrados pelos arcabouços de PLLA. Os autores atribuíram estes resultados a ligação específica entre as integrinas 21, expressada pelas células osteoblásticas e responsáveis pela adesão e diferenciação celular, à seqüência dos aminoácidos Arg-Gly-Asp (RGD) presente na molécula do colágeno imobilizado (SCHOFER et al., 2009).

Substâncias mineralizadoras tais como a dexametasona, ácido ascórbico e β- glicerophosphate, presentes na composição dos meios de cultura frequentemente utilizados no estudo in vitro de células osteoblásticas, podem alterar a síntese de colágeno após períodos prolongados de cultivo. Tullberg-Reiten & Jundt (1999) verificaram que a combinação de ácido ascórbico e β-glicerophosphate estimulam a síntese de colágeno, e que a dexametasona reduz a

síntese após 14 dias de cultura. Schofer et al. (2009) relacionaram a diminuição dos níveis de expressão da síntese de colágeno à instabilidade e mudança das propriedades bioquímicas da superfície do material, uma vez que in vitro o início do processo de degradação do material bem como a diferenciação celular ocorrem como eventos isolados, sem qualquer influência do ambiente que estimule a transdução de sinais intracelulares e expressão de genes (MAZUR et al., 2005; SCHOFER et al., 2009). Embora os motivos pelos quais células osteoblásticas diminuam a síntese de colágeno após prolongado período de cultivo não sejam totalmente esclarecidos, no presente estudo possívelmente, ambos os fatores citados anteriormente podem estar relacionados aos resultados obtidos.

4.2.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A morfologia e processo de colonização de células osteoblásticas cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col foram analisadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), para os tempos de cultivo de 2h, 24h, 5 e 10 dias. O comportamento celular sobre os substratos foi avaliado e relacionado à diferença das proprieddes da superfície obtidas após a imobilização do colágeno. Os resultados obtidos através da análise da MEV demonstraram que a imobilização do colágeno sobre a superfície dos arcabouços de PLDLA estimulou o processo de adesão, proliferação e espraiamento celular quando comparado aos arcabouços de PLDLA e PLDLA-AAc.

Na presente análise, a superfície dos arcabouços de PLDLA-Col apresentou-se instável à metodologia de fixação das amostras. As figuras 18, 19, 20 e 21 (E e F) evidenciam que a camada estável de colágeno desenvolvida sobre a superfície dos arcabouços de PLDLA e, previamente mostrada no estudo de caracterização, apresentou diversas rupturas após a secagem das mesmas no ponto crítico. No entanto, considerou-se que os resultados obtidos sobre o comportamento e morfologia das células osteoblásticas não foi prejudicado.

As fotomicrografias da figura 18 mostram que após o tempo de cultivo de 2h as células osteoblásticas foram capazes de reconhecer e se ligar à superfície de todos os tratamentos. As mesmas apresentavam morfologia totalmente esférica ou arredondada, comuns no processo reconhecimento de um substrato. Nota-se que há um aumento (gradativo) da concentração de células presentes na superfície dos arcabouços de PLDLA-AAc (Figura 18 C e D) para os PLDLA-Col (Figura 18 E e F), confirmando que a presença de grupos funcionais carboxila e o colágeno estimularam o reconhecimento biológico durante as primeiras horas de contato.

Após 24 horas de cultivo (Figura 19), as células osteoblásticas iniciaram a colonização celular, apresentando morfologia achatada, alongada ou poligonal com projeções citoplasmáticas. Nos arcabouços de PLDLA (Figura 19 A e B) as células dispunham-se mais isoladas enquanto que nos arcabouços de PLDLA-AAc (Figura 19 C e D) observa-se a presença de agregados celulares e uma porcentagem visível de células osteoblásticas com morfologia arredondada, muito semelhante ao encontrado no tempo de 2h. As fotomicrografias revelam que as células cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA-Col (Figura 19 E e F) formaram regiões de confluência sobre a superfície do arcabouço.

As fotomicrografias da figura 20 mostram que após 5 dias de cultura as células cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA (figuras 20 A e B) recobriram regiões distintas da área da superfície. As fotomicrografias da figura 20 C e D evidenciam que a rugosidade e porosidade ocasionada pela copolimerização do ácido acrílico nos arcabouços de PLDLA-AAc promoveram o aumento da adesão e projeções citoplasmáticas direcionadas a outros grupos celulares.

Após 10 dias de cultivo (Figura 21), pode-se observar continuidade ao processo de colonização das células osteoblásticas cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA e PLDLA-AAc. No entanto, as fotomicrografias da MEV da superfície dos arcabouços PLDLA-Col (Figuras 21 E e F) evidenciam a formação de um espesso tapete celular sobre toda superfície do substrato. Este resultado é indicativo de que a presença do colágeno não apenas estimulou o processo de reconhecimento e adesão celular como também, estimularam o espraiamento e proliferação das células osteoblásticas.

Células exibem diferentes morfologias dependendo do substrato sobre os quais são cultivadas. A forma celular exerce influência direta sobre a proliferação, expressão de genes, o metabolismo celular e diferenciação. Dessa forma, o estudo da morfologia celular pode servir como parâmetro indicativo da integridade celular bem como auxiliar na determinação da citocompatibilidade de novos biomateriais (SHEN et al., 2009).

A morfologia característica de células osteoblásticas cultivadas sobre arcabouços poliméricos é demonstrada por diversos pesquisadores (KOSE et al., 2003; MAS et al., 2008).