O fluxograma abaixo (Figura 4) ilustra a sequência de metodologias empregagadas no estudo da citocompatibilidade e influência da superfície biomimética de colágeno tipo I sobre o comportamento de células osteoblásticas cultivadas sobre arcabouços de PLDLA, PLDLA-AAc e PLDLA-Col durante diferentes tempos de cultura.
Figura 4. Fluxograma da metodologia empregada no estudo in vitro da citocompatibilidade de células osteoblásticas cultivadas sobre os arcabouços de PLDLA antes e após a imobilização do colágeno.
3.6.1 Meios de cultura celular
O meio DMEM padrão (Meio Eagle modificado por Dulbeco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) foi utilizado na manutenção do cultivo celular. O meio puro contém em sua composição 50 g/mL de gentamicina e 5 g/mL de anfotericina B. Para realização dos experimentos utilizou-se o meio DMEM osteogênico (SCHOETERS et al., 1988), que consiste no meio DMEM com 10% de SFB acrescido de antibióticos, 50 g/mL de ácido ascórbico e 10 mM de -glicerofosfato.
3.6.2 Obtenção e Isolamento de células osteoblásticas
As células osteoblásticas foram obtidas por explante (Figura 5) de fragmentos ósseo da calvária de 3 coelhos Nova Zelândia com 20 dias de idade, entre 250 e 300 g ,de acordo com (DECLERCQ et al., 2004). Para isso os animais foram sacrificados com overdose de halotano. Realizou-se a tricotomia da região cranial, seguida da retirada das calotas cranianas. Estas foram imersas em meio de cultura DMEM puro com concentrações maiores de antibiótico e antimicótico, 150 g/mL de gentamicina e 15 g/mL de anforicina B. Em ambiente estéril, as calotas foram raspadas com bisturi e lavadas em PBS estéril, eliminando-se o máximo possível de tecido mole, para então serem fragmentadas (pedaços de cerca de 1 mm2). Os fragmentos foram divididos e semeados em 5 frascos de cultura de poliestireno contendo meio DMEM suplementado com 20% de SFB, mantidos em estufa umidificada com atmosfera de 5% de CO2 a 37°C por um período de 10 dias, no qual pode-se observar o processo de descelularização do fragmento ósseo, seguido da adesão e proliferação celular das células osteoblásticas no frasco de cultura. O meio de cultura foi trocado cerca de 2 vezes na semana e os subcultivos foram realizados quando a os frascos atingiram cerca de 80% de confluência com tripsina EDTA 0,25%. O protocolo experimental empregado no presente estudo está em conformidade com as normas da Comissão de Ética da Universidade do Vale do Paraíba de acordo com os princípios éticos de Diretrizes Nacionais e Internacionais de pesquisas envolvendo animais sob número de A01/CEP/2009.
Figura 5.Obtenção das células osteoblásticas. (A e B) Incisão e exposição da calota craniana de coelho, (C) Fragmentação da calota e (D) migração celular a partir do explante.
3.6.3 Interação células-suporte
Com intuito de avaliar a interação entre os arcabouços de PLDLA e as células osteoblásticas, foram realizados experimentos em placas de cultura de poliestireno de 96 poços (TPP – Techno Plastic Products, Suíça). As amostras do compósito tridimensional foram colocadas nos poços e imersas em meio de cultura DMEM puro suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e, mantidas na estufa de cultura a 37°C por 24 horas antes da semeadura de acordo com as normas (ISO 10993-5, 1999). Para todos os experimentos, uma concentração de 106 cel/mL foi semeada sobre os arcabouços poliméricos.
3.6.4 Adesão Celular Inicial
O teste de adesão celular consiste no mesmo procedimento da análise de citotoxicidade, onde o substrato de poliestireno é designado agora como controle positivo e o fenol usado como controle negativo. Após 2h de cultivo, o meio de cultura foi retirado e os poços repetidamente lavados, retirando então, as células que não sofreram adesão. Em seguida, 100 μL de DMEM e 10 μL de MTT (5mg/mL) foram adicionados a cada poço de cultura contendo a suspensão celular previamente semeada, as quais foram incubadas nas mesmas condições de cultivo durante 4 horas. Após este tempo, a solução foi substituída por 200 μL de DMSO e 25 μL de tampão Glicina/Sorensen. Em seguida, alíquotas de 100 μL das soluções contidas nos poços foram transferidas para uma nova placa. A absorbância das alíquotas foi medida em um leitor de microplacas Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA), a 570 nm.
3.6.5 Citotoxicidade Direta
Para os testes de citotoxicidade e adesão celular empregou-se o método de oxidação metabólica do MTT (MOSMANN, 1983). As mitocôndrias de células vivas, por meio da enzima succinato de hidrogenase, são capazes de reduzir a substância amarelada solúvel em água MTT convertendo-a em um composto insolúvel em água, o formazan, o qual é solubilizado pelo DMSO (IGNATIUS & CLAES, 1996). A quantidade de formazan produzida, medida por espectrofotometria, é diretamente proporcional a atividade metabólica e ao número de células vivas. Na presente foram utilizados como controle negativo a própria placa de poliestireno e como controle positivo, a placa de poliestireno contendo fenol 1%. Uma concentração de 106 cel/mL foi semeada sobre os suportes e controles em meio DMEM padrão e posteriormente incubadas durante 24 horas em estufa (5% de CO2 a 37°C). Após o tempo de cultivo o meio foi retirado e os poços foram lavados de 3 a 4 vezes rapidamente com tampão PBS a 0,1M. Após a lavagem, foi adicionado a cada poço, 100 μL de meio DMEM contendo 10 μL de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil brometo de tetrazólio MTT (5mg/mL), seguindo-se um período de
incubação de 4 horas a 37°C, no escuro. Após esse tempo, a solução contendo MTT foi substituída por uma solução de 200 μL de dimetil sulfóxido (DMSO), e 25 μL de tampão Glicina/Sorensen. Em seguida, 100 μL das soluções contidas nos poços foram transferidas para uma nova placa, e a absorbância do MTT foi lida em leitor de microplacas Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA) a 570 nm.
3.6.6 Sirius Red - quantificação de colágeno
O método é baseado na ligação seletiva do Sirius Red, um corante aniônico, com proteínas colágenas e tem sido aplicado na mensuração estimada da disposição do colágeno em culturas de células (TULLBERG-REINERT & JUNDT, 1999). Quanto maior a absorbância, maior a quantidade de colágeno existente. Células osteoblásticas foram cultivadas sobre os arcabouços por 2h, 24h, 5, 10 e 20 dias. Após cultivo, o meio foi retirado e os poços lavados três vezes com PBS 0,1M. Foram adicionados 100 μL de Fluído de Bouin (ácido pícrico, formaldeído e ácido acético glacial) para fixação durante 1 h. As amostras foram lavadas com PBS, em seguida, adicionado o corante Sirius Red. Após o tempo de 1 h, foi removido o máximo do corante e procedendo-se á lavagem com 150 μL de solução de ácido hidroclórico 0,01M por 30 seg para remoção do corante que não se ligou ao colágeno. Em seguida, o corante foi retirado das camadas celulares com a adição de solução de NaOH 0,1M durante 30 min. Alíquotas de 100 μL das soluções contidas nos poços foram transferidas para uma nova placa. A absorbância foi medida em um leitor de microplacas Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA) a 570 nm.
3.6.7 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As amostras foram fixadas durante 30 min a temperatura ambiente em solução fixadora contendo 2,5% paraformaldeído, 2,5% glutaraldeído, 0,06% ácido pícrico, 1% ácido tânico em água ultrapura. As amostras foram lavadas três vezes em água ultrapura e pós-fixadas com OsO4 a 1% por 15 min e desidratadas em concentrações crescentes de etanol. As amostras foram secas em Ponto Crítico (Balzers CTD 030), recobertas por ouro (Balzers SCD 050) e observadas em microscópio eletrônico de varredura (JEOL JXA-840A), no Laboratório da Faculdade de Engenharia Mecânica da Universidade Estadual de Campinas/SP – UNICAMP. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
3.6.8 Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em quintuplicatas. Os valores de absorbância obtidos a partir dos testes de citotoxicidade, adesão celular e Sirius red foram apresentados como média ± erro padrão da média. Esses dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), complementados pelo teste de Turkey com nível de significância de 5% (p< 0,05).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo serão apresentados os resultados obtidos pelas análises de caracterização físico-químicas e citocompatibilidade de células osteoblásticas cultivadas sobre a superfície das amostras de PLDLA antes e após o processo de enxertia do grupo funcional carboxila (PLDLA- AAc) e imobilização do colágeno tipo I (PLDLA-Col).