TÍTULO: ELETROFORESE DAS PROTEÍNAS SÉRICAS E URINÁRIAS EM CÃES COM CINOMOSE TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: MEDICINA VETERINÁRIA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): PALOMA COUTINHO SILVA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): LEANDRO ZUCCOLOTTO CRIVELLENTI ORIENTADOR(ES):
RESUMO
A eletroforese em gel de policrilamida é um dos melhores métodos para obtenção das frações proteicas presentes tanto no sangue quanto na urina, seja em seres humanos como em animais. Foi proposto com o presente ensaio estudar as alterações renais túbulo-glomerular no âmbito da eletroforese sérica e urinária de 15 cães naturalmente infectados por cinomose. Para controle foram usados 10 animais saudáveis sem sinais clínicos e laboratoriais de doenças em conjunto de sorologia e reação em cadeia de polimerase (PCR) negativos para as doenças comumentes encontradas na região. Os animais foram advindos da rotina do Hospital Veterinário da Universidade de Franca (UNIFRAN), Franca-SP e do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel da UNESP, Jaboticabal-SP. Através desse experimento foi possível uma melhor compreensão das alterações renais neste grupo de pacientes tanto ao nível tubular quanto glomerular.
INTRODUÇÃO
A cinomose é uma doença infecciosa grave que afeta principalmente cães e outros canídeos. O agente causador é o virus da cinomose, que pertence ao género
Morbillivirus da família Paramyxoviridae (GREENE, 2006).
Vem provocando uma preocupação mundial, pelo potencial risco de infecção em humanos, uma vez que o SLAM e Nectin-4 demonstram uma elevada similaridade em suas sequências de aminoácidos entre primatas (SAKAI et al., 2013), tornando assim, a cinomose um importante objeto de estudos futuros.
O animal poderá apresentar sinais clínicos como: anorexia, depressão, conjuntivite, inflamação catarral dos brônquios e laringe, vômitos, diarreia, quando o sistema nervoso é afetado é possível notar sinais como: paraplegia, tetraplegia, atrofia muscular, vocalização, tremor, incontinência, coma e cegueira (CARVALHO, 2012). Os achados laboratoriais podem incluir linfopenia, além de trombocitopenia e anemia regerativa (GREENE e APPEL, 2006).
Outra característica ainda não estudada é da avaliação da proteinúria. Esse dado ainda se torna mais importante quando estudado por meio da eletroforese. Com essa metodologia é possível avaliar a carga e o tamanho das proteínas, dado esse importante para diferenciação de glomerulopatias seletivas e não-seletivas. Já, no caso da proteinúria tubular são encontradas proteínas de baixo peso molecular
decorrente da não reabsorção protéica nos túbulos (GRAUER, 2005; BARROS et al., 2006).
OBJETIVO
Objetivou-se avaliar as alterações glomérulo tubulares por meio de eletroforese das proteínas séricas e urinárias em cães com cinomose.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados no total, 36 cães, machos e fêmeas, divididos em dois grupos experimentais. O grupo controle composto por 20 animais, e o grupo doente,
Cinomose composto por 16 animais.
Foram excluídos os animais com sinais clínicos e/ou exames compatíveis com outas comorbidades (ex. endocrinopatias, neoplasia, dermatopatias, etc).
As amostras de sangue dos animais foram coletadas por venopunção jugular (5ml), e envasados em tubo sem anticoagulante. Após coagulação o sangue foi centrifugado a 800G durante 5 minutos para separação do soro, depois de separado o soro foi transferido em subaliquotas de 1-2 ml para microtubos.
As amostras de urina foram obtidas por cistocentese, sendo 10 mL para realização da urinálise. Após centrifugação, frações do sobrenadante foram acondicionadas e mantidas a -20º C para análise de eletroforese e da razão proteína creatinina urinária.
ELETROFORESE DE PROTEÍNA SÉRICA E URINÁRIA
O fracionamento eletroforético das proteínas do soro e urina foram realizados, e processados de acordo com a rotina do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária do Hospital Veterinário da UNESP, Jaboticabal-SP.
Após a prepararação do gel de poliacrilamida, este foi colocado entre as placas de vidro. Foram realizados poços de aplicação das amostras e para que ouvesse a polimerização, foi inserido também certa quantidade de água destilada, através de uma seringa de tuberculina, sobre a linha horizontal do gel impedindo a entrada de oxigênio. Na etapa seguinte a placa foi mantida por 45 minutos em repouso. Depois de polimerizado, a água foi retirada, e em seguida colocou-se o gel de empilhamento, da mesma forma como foi colocado o gel de poliacrilamida.
Em cada poço foi colocada uma amostra e o espaço que restou foi completado com tampão dos compartimentos eletrolíticos. A placa foi acomodada e fixada na cuba de eletroforese, conectando-se os cabos com a fonte geradora de voltagem. O processo eletroforético é desenvolvido do polo negativo para o positivo.
Após todos esses feitos, fica estabelecido o tempo necessário (150 volts por 2 a 3 horas). Depois de terminada a corrida eletroforética, o gel foi retirado cautelosamente das placas e mergulhado no local contendo a solução corante (Ponceau S, negro de amido ou azul de bromofenol) e a descoloração foi feita com ácido acético a 7%.
Uma vez obtido o traçado, este ficou caracterizado pela migração das frações protéicas (albumina, alfa, beta e gamaglobulinas) no gel de poliacrilamida. Após foram realizadas leituras densitométricas através do programa SDS-60, cujos valores absolutos e relativos, de cada fração, foram obtidos.
RESULTADOS
Os principais sinais clínicos e alterações observadas ao exame físico nos cães portadores de cinomose (n=16) foram secreção oculonasal (n=15; 93,75%), hiporexia (n=11, 68,75%), paresia de membros pélvicos, evoluindo para torácicos (n=9, 56,25%), ataxia (n=8, 50%), tosse (n=6, 37,5%), hiperqueratose dos coxins (n=6, 37,5%), ausência de propriocepção (n=5, 31,25%), vocalização (n=5, 31,25%), convulsões (n=3, 18,75%), nistagmo (n=1, 6,25%) (Figura 1).
Figura 1. Principais sinais clínicos e alterações observadas ao exame físico dos cães portadores de cinomose. Franca, 2016.
Hemograma 0,00% 20,00% 40,00% 60,00% 80,00% 100,00%
Todos os parâmetros hematológicos apresentaram diferença estatística entre os animais doentes e controle (tabela 1). Dos dezesseis animais os achados laboratoriais foram linfopenia (n=10, 62,5%), leucocitose (n=5, 31,25%), eosinopenia (n=11, 68,75%), trombocitopenia (n=5, 31,25%), anemia moderada (n=12, 75%), trombocitose (n=5, 31,25%) e monocitopenia (n=3, 18,75%).
Tabela 1 – Valores médios e desvios padrões obtidos para variáveis hematológicas dos animais controle (n=20) e animais com Cinomose (n=16). Franca-SP.
Controle Cinomose Valor de P Hemácias(x106 μL)* 6,7±0,8 4,5±1,2 <0,0001 Hematócrito(%)* 44,08±3,72 29,1±7,9 <0,0001 Hemoglobina(g/L)* 15,41±1,44 9,9±2,41 <0,0001 Leucócitos(x10μL) * 10,6 ± 2,4 16,6 ± 10,0 0,0205 Plaquetas(x103 μL) 381,1±160,3 324,5 ±254,7 0,4204 Eosinófilos(x103μL)†* 0,5(0,2-2,2) 0,1(0,1-0,3) <0,0001 Monócitos(x103 μL) 2,95±2,6 3,1±1,7 0,8802 Linfócitos(x103 μL)†* 22,5(8-44) 5,5(2-62) <0,0001 * Diferença estatística significativa.
† Dados não paramétricos.
Variáveis Bioquímicas séricas
Com relação aos exames bioquímico-séricos, um animal apresentava-se com importante azotemia, o que causou a elevação das concentrações séricas de ureia e creatinina e o desvio padrão do grupo cinomose.
Outras alterações observadas nos parâmetros bioquímicos foram à hipoalbuminemia (n=10; 62,5%) e hiperproteinemia (n=3; 18,75 %), evidenciando o aumento de globulinas circulantes.
Tabela 2– Valores médios e desvios padrões obtidos para variáveis bioquímico-séricas em animais controle (n=20) e naqueles acometidos por Cinomose (n=16). Franca, 2016.
Controle Cinomose Valor de P Creatinina(mg/dL)†* 0,9 (0,5±1,3) 0,65 (0,4±1,6) 0,0200
Ureia(mg/dL)† 27,0 (14,0-46,0) 30,0 (9,5-355) 0,6010 ALT(U/L)†* 26,5 (14,0-90,0) 50,0 (18,0-99,0) 0,0122 FA(U/L) * 99,95±44,0 149,3 ±72,5 0,0176 Proteína total (g/L) 6,2±0,76 5,9±1,22 0,3865 Albumina (g/L) * 3,04±0,29 2,4±0,66 0,0004 Globulinas(g/L) * 3,14±0,67 3,73±0,92 0,0319 * Diferença estatítica significativa.; † Dados não paramétricos.
FA (fosfatase alcalina).; ALT (alanino-aminotranferase).
Frações proteicas séricas
Foi observado que os animais com cinomose apresentam maior concentração de globulinas quando comparadas com o controle (p=0,0319), sendo que as
principais globulinas aumentadas foram a, alfa-1-antitripsina (p=0.0185),
haptoglobina (p=0,0017) e dentro das imunoglobulinas a IgA (p=0,0002) e a IgG cadeia pesada (p=0,0402). Outras proteínas mensuradas como, ceruloplasmina, transferrina, alfa-1-glicoproteina ácida e proteínas de peso molecular de 44 e 23 KDa e a IgG cadeia leve, não tiveram diferença estatística (tabela 3). Em relação à proteína PM 44.000 não foram identificadas no grupo cinomose.
Tabela 3. Valores da média e desvio padrão para os valores paramétricos e medianos com valores mínimos e máximos das variáveis eletroforéticas séricas, analisadas do grupo controle e do grupo de Cinomose. Franca – SP.
Proteínas (mg/dL) Valor de P Controle Cinomose Proteína total 6,2±0,75 5,9±1,2 0,4677 Albumina 3701,0±557,0 3347,0±1020,0 0,2013 Globulina* 3,14±0,67 3,73±0,92 0,0319 Ceruloplasmina† 29,0 (6,2±47,9) 37,6 (7,9±199,1) 0,1962 Transferrina† 185,1(0-540,0) 218,0(27,2-917,0) 0,5973 Alfa 1 - Antitripsina* 197, 2,0±32,4 296,7±161,7 0.0185 Haptoglobina†* 18,6 (4,25 – 74,2) 66,0 (0 -489,2) 0,0017 Alfa 1 - Glicoproteína Ácida† 48,36 (4,13 – 296,6) 44,5 (5,42 – 513,2) 0,9349
PM 23.000 396,1±117,0 425,6±171,8 0,5449
PM 44.000 14,71±10,87 - -
IgA* 14,61±3,16 30,9±15,43 0,0002
IgG cadeia leve† 248,2 (46,75 – 475,6)
226,6 (115,0 –
877,0) 0,4221
IgG cadeia pesada* 613,4±288,9 820,0±280,4 0,0402 * Diferença estatística significativa.; † Dados não paramétricos
PM (peso molecular).
Proteínas da Urina
A razão Proteína/Creatinina Urinária (UPC) foi maior no grupo de animais com cinomose, em comparação com o grupo controle, (Tabela 4). No grupo controle nenhum animal apresentou proteinúria. Já no grupo com cinomose (n=16) nove animais (56,25%) apresentaram proteinúria significativa (> 0,5). A hiperestenúria foi observada em cinco animais (31,25%) enquanto que densidade inferior a 1,020 em dois animais (12,5%).
Tabela 4 – Valores médios e desvios padrões obtidos para densidade urinária, UPC e em animais controle (n=20) e naqueles acometidos por Cinomose (n=16). Franca, 2016.
Controle Cinomose Valor de P Densidade específica
urinária 1,032±0,014 1,036±0,016 0,3142
UPC†* 0,12 (0,06 – 1) 0,56 (0,16-2,78) <0,0001
* Diferença estatística significativa. UPC (razão proteína creatinina urinária) † Dados não paramétricos
1.1 Frações Proteicas Urinárias
n Frequência (%) Valor de P
Controle Cinomose
10 a 20* 8 1 (5%) 7 (43,75%) 0,0044
21 a 30 73 37 (85%) 36 (100%) 0,1111
41 a 50 41 20 (65%) 21 (100%) 0,2702 51 a 60* 48 21 (80%) 27 (93,75%) 0,0194 61 a 70 49 28 (90%) 21 (93,75%) 0,7239 71 a 80 26 14 (70%) 12 (56,25%) 0,6819 81 a 90* 20 12 (55%) 8 (50%) 0,7647 91 a 100 13 6 (30%) 7 (37,5%) 0,6055 101 a 110* 14 6 (30%) 8 (43,75%) 0,4047 111a 120 22 14 (70%) 8 (37,5%) 0,1699 121 a 130 2 2 (10%) 0 (0,00%) 0,2038 131 a 140 9 2 (10%) 7 (37,5%) 0,0857 141 a 150* 14 3 (15%) 11 (50%) 0,0174 151 a 160* 10 0 (0,00%) 10 (50%) 0,0004 161 a 170 3 3 (15%) 0 (0,00%) 0,1117 171 a 180 8 6 (30%) 9 (50%) 0,1609 > 181 33 16 (55%) 17 (62,5%) 0,4264
* Diferença estatística significativa.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os virus do gênero Mobillivirus, causam graves doenças em animais e humanos (SAKAI, et al.; 2012). O virus da Cinomose como relatado neste trabalho pode levar a morte dependendo do grau de infecção, analizando as proteínas séricas e urinárias é possivel relatar alguns dados que possam auxiliar no diagnostico da doença.
Em casos de proteinuria tubular são encontradas proteínas de baixo peso molecular decorrentes da não reabsorção proteica nos túbulos (GRAUER, 2005; BARROS et al., 2006). A literatura não apresenta dados suficientes que correlacionem a proteinuria dos animais com cinomose, as possíveis glomerulopatias, no presente estudo, foram encontradas proteínas de baixo, médio e alto peso molecular, sendo em maior quantidade nos animais com cinomose, o que sugere que esses animais apresentam lesão renal tanto a nível glomerular quanto tubular.
Estudos anteriores descrevem a excreção de transferrina e albumina na urina de cães saudaveis. Bandas de proteinas em intervalos de 10-20 e 20-30 kDa foram encontradas com maior frequência em animais com piometra (ZARAGOZA et al., 2004). No presente estudo o grupo cinomose apresentou maior quantidade de proteínas com o mesmo intervalo o que pode sugerir que animais infectados tenham maior liberação dessas proteínas na urina devido a possível lesão tubular assim como os intervalos entre 151-160 kDa estavam ausentes nos cães saudáveis e presente em oito animais do grupo doente.
Os padrões de eletroforese dos cães saudáveis neste estudo apresentaram se representativos de amostras de urina normais e resultados semelhantes foram obtidos por outros autores (ZINI et al.2004; YALCIN et al.2004; VINGE et al.2010). Tem sido relatado que os cães sem comprometimento da função renal regularmente mostram uma banda de albumina, que é considerada fisiológica fornecendo UPC do animal baixo (SCHAEFERH et al., 2011). No presente estudo os cães controle apresentaram UPC inferior aos cães com cinomose.
Foi relatado que cães com babesiose apresentam uma diminuição na concentração de albumina que pode ser associada à presença de azotemia, a explicação mais provável para esta descoberta seria perda urinária de albumina associada à insuficiência renal (CAMACHO et al.; 2005). No grupo cinomose um dos animais foi constatado com azotemia e hipoalbuminemia, provavelmente importante lesão renal tenha ocorrido neste animal visto que a densidade urinária também estava baixa (1,020). Talvez a desidratação ou ainda hemorragia gastrointestinal tenha contribuido para essa alteração.
Ao analisar alguns trabalhos ficou claro que as doenças infecciosas, assim como a piometra, causam aumento no número de bandas de proteína urinária de animais doentes quando comparados com os animais controle, foi relatado que animais que têm a passagem de IgG através da barreira de filtração glomerular demonstram sinais de insuficiência renal (ZARAGOZA et al., 2004; CÉRON et al., 2005). A lesão renal é correlacionada a fatores inflamatórios sendo identificada neste estudo pela presença principalmente das globulinas haptoglobina e alfa 1 antitripsina que são proteínas positivas, outro fator importante é o é o aumento das imunoglobulinas A (IgA) e G (IgG) cadeia pesada que, provavelmente, estão correlacionadas com os anticorpos contra a Cinomose.
CONCLUSÃO
Conclui-se que pacientes caninos portadores de Cinomose apresentam indícios de lesão renal túbulo-glomerular, uma vez que manifestam proteinúria e aumento das frações proteicas urinárias, além do aumento de globulinas significativas lesão renal.
REFERÊNCIAS
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